DE1792773C3

DE1792773C3 - Rohrförmiger Formkörper aus einem unlöslichen Träger, der durchlässig oder undurchlässig ist, mit einem an den Träger über einen überbrückenden Rest chemisch gebundenem Enzym

Info

Publication number: DE1792773C3
Application number: DE1792773A
Authority: DE
Inventors: Garth Kay; Malcolm Douglas Lilly; Alister Kimball Sharp; Hugh Richard John Wilson
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1967-07-14
Filing date: 1968-07-12
Publication date: 1978-04-06
Also published as: DE1792773B2; JPS5030157B1; DE1792026A1; FR1577571A; DE1792773A1; SE351851B; US3824150A; DE1792026B2

Description

Träger

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enthält, wobei X einen reaktiven Rest und Y ein Halogenatom oder einen nukleophilen Substituenten bedeuten, mit dem Enzym umsetzt.

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Die vorliegende Erfindung betrifft die in den so Ansprüchen definierten Gegenstände.

Wasserunlösliche Enzymderivate, wobei das Enzym an ein wasserunlösliches Polymer absorbiert oder darin mechanisch eingeschlossen ist, sind bekannt. So werden in der deutschen Auslegeschrift 12 27 855 Enzymkörper beschrieben, die durch Einverleiben von Enzym oder enzymhaltigen Mikroorganismen in gelöstes semipermeables Material, wie Polyamid, Polyvinylazetat, Cellulosenitrat, Celluloseazetat, Äthylcellulose, Kautschukchlorid oder Lipoid und anschließende Formung ho unter Trocknung erhalten wurden. Da das Enzym innerhalb des semipermeablen Materials eingeschlossen ist, muß das umzusetzende Substrat dieses Material oder darin enthaltende Lücken durchdringen, bevor die enzymatische Reaktion erfolgen kann; dies bedingt (,_, relativ lange Umsetzungszeiten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, enzymhaltige Formkörper bereitzustellen, mit welchen enzymatische Reaktionen beschleunigt und über einen langen Zeitraum durchgeführt werden können.

Das erfindungsgemäße über einen überbrückenden Rest an den Träger gebundene Enzym steht bei Umsetzungen in direktem Kontakt mit der vorbeiströmenden, subslrathaltigen Lösung. Der unlösliche, rohrförmige Formkörper ist formbeständig, und das über einen überbrückenden Rest damit verknüpfte Enzym wird auch bei längerem Gebrauch nicht abgelöst oder in seiner Aktivität beeinträchtigt

Geeignete Trägermaterialien für die erfindungsgemäßen Formkörper dürfen sich in dem für die enzymatische Reaktion vorgesehenen Medium, beispielsweise Wasser, nicht lösen. Außerdem muß brauchbares Trägermaterial, gegebenenfalls nach einer Vorbehandlung, mit dem überbrückenden Rest chemisch reagieren, so daß der überbrückende Rest mittels einer chemischen Bindung an den Träger gebunden wird. Natüri;;he oder synthetische Polymere sind brauchbare Trägermaterialien, wobei hydrophile Polymere mit freien Hydroxylgruppen bevorzugt werden; geeignete Materialien sind beispielsweise Cellulose, modifizierte Cellulose, Stärke, Wolle, Nylon und synthetische Polyester. Der rohrförmige Träger aus solchen Materialien kann aus durchlässigem, filzartigem Gewebe oder einer undurchlässigen Schicht bestehen. Bei undurchlässigen Trägern kann das Enzym auf der Innenseite oder der Außenseite des Rohres vorgesehen sein. Bei durchlässigen Trägern können die Poren im Trägermaterial Durchmesser zwischen 10~⁵ bis 10-²cm aufweisen, was zu einer solchen Durchlässigkeit führt daß durch eine Fläche von 1 cm² pro Minute 0,01 bis 10 cm³ umzusetzende, substrathaltige Lösung hindurchströmt In der Praxis hat sich eine solche Durchlässigkeit als besonders wirksam erwiesen, da die umzusetzenden Substratmoleküle ohne sterische Hinderung durch solche Poren hindurchtreten können.

Erfindungsgemäß ist das Enzym über einen überbrükkenden Rest an den unlöslichen, rohrförmigen Träger gebunden. Geeignete Enzyme werden aus Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen isoliert und bestehen aus gereinigten oder rohen Enzymen, Enzymgemischen oder Enzymsystemen. Brauchbare Enzyme sind beispielsweise proteolytische Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin oder Papain; Hydrolasen wie /7-Galactosidase, Ribonuclease, Alkali-Phosphatase, Amyloglucosidase oder Dextranase; Dehydrogenasen wie Milchsäure-Dehydrogenase; Kinasen wie Creatin-Phosphokinase oder Pyruvat-Kinase; Oxidasen wie Glucose-Oxidase; und Amidasen wie Amidase und Penicillin-An.idase.

Erfindungsgemäß sind derartige Enzyme über einen überbrückenden Rest an einen unlöslichen, rohrförmigen Träger gebunden, wobei der überbrückende Rest die chemische Bindung zwischen Träger und Enzym vermittelt. Sowohl die Bindung zwischen überbrückendem Rest und Träger wie die Bindung zwischen Enzym und überbrückendem Rest müssen auch in Gegenwart der substrathaltigen Lösung beständig sein, damit auch bei längerem Gebrauch der erfindungsgemäßen Formkörper das Enzym nicht von dem Träger abgelöst wird. Ein beispielhafter überbrückender Rest wird dadurch erzeugt, daß an einem unlöslichen Polymer wie Cellulose Carboxymethylgruppen gebildet, diese verestert und mit hydrazinsalpetriger Säure umgesetzt werden, um Azidogruppen zu bilden. Bei der anschließenden Umsetzung zwischen azidogruppenhaltigem Träger und Enzym wird das Enzym chemisch an den Träger gebunden, wobei die Azidogruppen als über-

brückender Rest wirken. Ein anderer, überbrückender Rest besteht aus Triazinylverbindungen der allgemeinen Formel

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wobei X einen reaktiven Rest, etwa ein Halogenatom, und Y ein Halogenatom, einen nukleophilen Substituen· ten wie insbesondere die Aminogruppe, einen aliphatischen Rest oder eint ^ aromatischen Rest bedeuten.

Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Formkörper gerichtet Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Formkörper mit einem Enzym ist dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mittels eines überbrükkenden Restes an den Träger gebunden wird, und anschließend der Formkörper gewonnen wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein freie Hydroxylgruppen enthaltender Träger zunächst mit einer Triazinylverbindung umgesetzt, und daraufhin das hierbei erhaltene Produkt, das Reste der allgemeinen Formel

Träger

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enthält, wobei X einen reaktiven Rest und Y ein Halogenatom oder einen nukleophilen Substituenten bedeuten, mit dem Enzym umgesetzt. Die Umsetzung von überbrückende Reste enthaltendem Träger mit dem Enzym wird unter solch milden Bedingungen durchgeführt, welche wohl eine chemische Bindung des Enzyms an den Träger gewährleisten, unter denen jedoch so wenig chemische Reaktionen wie möglich am Enzym selbst auftreten. Da die Einwirkung von Wärme die Aktivität von Enzymsystemen stark vermindern oder ganz aufheben kann, erfolgt die Trocknung der erfindungsgemäß hergestellten Formkörper zweckmäßig nach dem Gefriertrocknungsverfahren.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel I

Ein 65 cm langes Nylonrohr (Durchmesser 1,0 mm) wurde mit trockenem pulverförmigem Ammoniumchlo- fts rid gefüllt und I Std. lang auf 50⁰C erwärmt. Anschließend wurde das Rohr gespült, indem 5 ml Boratpufferlösung (pH 8,5) hindurchgepumpt wurden.

Anschließend wurde das Rohr mit einer Lösung aus 5% Glutardialdehyd in Boratpuffer (pH 8,5) gefüllt und 30 Minuten bei 1°C gehalten. Nach der Entfernung der Glutardialdehydlösung wurde das Rohr mit einer Lösung von Chymotrypsin (10 mg/ml) in Boratpuffer (pH 84) gefüllt und über Nacht bei 4° C gehalten. Anschließend wurde überschüssiges Enzym entfernt indem das Rohr mit Boratpufferlösung (pH 8,5) gespült wurde.

Die proteolytische Aktivität des an der Innenseite des Nylonrohrs gebundenen Chymotrypsin wurde mit der Casein-Bestimmung nach Hammersten (Methods in Enzymatic Analysis, Academic Press 1963, Seite 800) geprüft Die durch das Nylonrohr hindurchgeströmte Lösung wurde mit dem 2,5fachen Volumenanteil an 5%iger Trichloressigsäure versetzt und das Gemisch nach 30 Minuten filtriert Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Std. lag die Extinktion des Filtrate bei 280 nm um 0,22 über der Extinktion einer Casein-Vergleichslösung, welche nicht durch das Nylonrohr geleitet worden war, sondern direkt mit Trichloressigsäure behandelt worden war. Die höhere Extinktion entspricht einem Umsatz, der etwa 5μg freiem Chymotrypsin äquivalent ist

Beispiel 2

Eine zylindrische Pepierhülse aus durchlässigem Filterpapier wurde 5 Minuten lang in 1 n-Natriumhydroxid-Lösung eingeweicht anschließend das überschüssige Hydroxid entfernt, und die Hülse dann in ein Dioxanbad eingetaucht und 5 Minuten lang darin bewegt Daraufhin wurde die Hülse in ein Bad, das eine konzentrierte Lösung von Cyanurchlorid in Dioxan (25 g auf 100 ml) enthielt, eingetaucht nach 5 Sekunden Wasser und nach weiteren 5 Sekunden Essigsäure zugesetzt Die Papierhülse wurde aus diesem Gemisch herausgenommen und anschließend einige Minuten lang in reinem Dioxan bewegt dem anschließend gleiche Volumina Wasser und Essigsäure zug^etzt wurden. Nach 5 Minuten wurde die Hülse aus diesem Lösungsmittelgemisch herausgenommen, so lange mit einem Gemisch aus Aceton und Wasser gewaschen, bis der Cyanurchlorid-Geruch verschwunden war, und anschließend in einem Exsiccator getrocknet

Eine Lösung von 7,65 mg Penicillin-Amidase in 9 ml 0,01 molarer Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,2) wurde in ein rohrförmiges Glasgefäß eingebracht und die trockene Papierhülse vollständig in diese Lösung eingetaucht und 10 Minuten lang bei 20-25⁰C darin gehalten. Anschließend wurde die überschüssige enzymhaltige Lösung abgegossen, eine 1 η-Lösung von N-(3-Aminopropyl)-di-äthanolamin in 0,9 n-Salzsäure zugesetzt, und die Hülse mehrere Tage lang bei Raumtemperatur in dieser Lösung gehalten. Anschließend wurde die Hülse sorgfältig mit 1 n-Natriumchlorid-Lösung in Phosphatpuffer gewaschen. Die Bestimmung der Menge an gebundenem Enzym und dessen Aktivität ergab, daß an die durchlässige Hülse etwa 4 mg Enzym gebunden waren, und daß das gebundene Enzym etwa 30% seiner ursprünglichen Aktivität aufwies.

Die erfindungsgemäßen Formkörper können bei einer Vielzahl von enzym-katalysierten Reaktionen eingesetzt werden, insbesondere bei solchen Reaktionen, bei denen bislang lösliche Enzyme verwendet wurden. Geeignete Anwendungsgebiete sind etwa die Herstellung von Penicillin, das Klären von Bier, die Herstellung von Glucose unter Verwendung von

Amyloglucosidase, die Herstellung optisch aktiver Aminosäuren, die unter Transaminierung erfolgende Bildung von L-Alanin, die enzymatische Hydrolyse von Kohlehydraten und Proteinen, die alkoholische Fermentierung, die stufenweise erfolgende enzymatische Analyse von Proteinen, beispielsweise von RNS und DNS oder die Verwendung in biochemischen Brennstoffzellen. In all diesen Fällen lassen sich mit den erfindungsgemäßen Formkörpern die jeweiligen enzymatischen Reaktionen beschleunigt durchführen, wobei die Aktivität des Enzyms über einen langen Zeitraum erhalten bleibt.

Claims

Patentansprüche:

1. Formkörper aus einem unlöslichen Träger, der durchlässig oder undurchlässig ist, mit einem Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger rohrförmig und das Enzym über einen überbrückenden Rest chemisch an den Trägergebunden ist

2. Formkörper aus einem durchlässigen Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Formkörper Poren mit Durchmessern von 10~⁵ bis 10-²cm aufweist

3. Formkörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er eine solche Durchlässigkeit besitzt, daß eine Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von 0,01 bis lOcmVMia durch lern² seiner Fläche hindurchströmen kann.

4. Verfahren zur Herstellung eines Formkörpers nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym mittels eines überbrückenden Restes an den Träger chemisch bindet und den Formkörper gewinnt

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen freie Hydroxylgruppen enthaltenden Träger zunächst mit einer Triazinverbindung umsetzt und danach das hierbei erhaltene Produkt, das Reste der allgemeinen Formel