DE1768821B2

DE1768821B2 - Anorganische, freie hydroxylgruppen aufweisende, polymere gebundene enzyme und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE1768821B2
Application number: DE19681768821
Authority: DE
Inventors: Eric Mitchell; Kay Garth; London Crook
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1967-07-03
Filing date: 1968-07-03
Publication date: 1976-05-06
Also published as: US3619371A; DE1768821A1; FR1571241A; SE379766B

Description

oder

NWN
C

I γ

-NH-CH₂-COOH

-S-CH₂-COOH

-NH-C₂H₄-SO₃H

-0-C₄H₈-N(C₂H₅).,

-NH-C₁₁H₄-SO₃H

— O — Q₁H₄-COOH
-S-Q₁H₄-COOH
-NH-C₂H₄-OH

— O — C₂H₄- OH

— NH — C₃H* — NH(C₂H₄OH)₂

erfolgt, wobei Y

bedeutet, mit einem proteolytischen Enzym, einer Hydrolase, einer Dehydrogenase, einer Kinase, einer Oxydase, oder einer Amidase, in an sich bekannter Weise umsetzt und anschließend den jeweils verbleibenden Rest X in üblicher Weise desaktiviert.

-NH₂

—O — CH₂- COOH

-NH-CH₂-COOH

-S-CH₂-COOH

nl H \~2 *M S O3 H

— O — C₄H₈- N(C₂H₅I₃ -NH-QH₄-SO₃H

— O — Q₁H₄- COOH -S-Q₁H₄-COOH
-NH-C₂H₄-OH

— O — C₂H₄- OH

— NHC₃H₆ - NH(C₂H₄OH)₂

bedeutet.

2. Verfahren zur Herstellung eines an ein natürliches oder snythetisches, organisches, freie OH-Gruppen aufweisendes Polymeres chemisch gebundenen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man ein natürliches oder synthetisches, organisches, freie OH-Gruppen aufweisendes Polymeres, das einen Rest der allgemeinen Formel

N X

C Y

aufweist, wobei X Chlor oder Fluor und Y einen der Reste

-NH₂

— O — CH₂- COOH

Die Erfindung betrifft ein an ein natürliches oder synthetisches, organisches, freie OH-Gruppen aufweisendes Polymeres chemisch gebundenes proteolytisches Enzym, oder eine gleichermaßen gebundene Hydrolase, Dehydrogenase, Kinase, Oxydase oder Amidase und ein Verfahren zu deren Herstellung gemäß den vorstehenden Patentansprüchen.

Es ist bekannt, Enzyme chemisch an in Wasser unslösliche Polymere zu binden oder physikalisch in semipermeablen Membranen einzuschließen, um Handhabbarkeit und Verwendung von Enzymen zu erleichtern, da in der Regel die Stabilität der mit einem festen Träger verbundenen Enzyme größer ist als diejenige der freien Enzyme. So wird in Nature, 214, S. 1302/1304 die chemische Bindung von Peptiden und Proteinen über Cyanohalogene an Polysaccharide beschrieben; unter anderem wird dort festgestellt, daß Chymotrypsin, welches über Bromcyan an ein bekanntes vernetztes Dextran gebunden ist, noch 20% der Aktivität des freien Enzyms aufweist.

In der Zeitschrift »Biokhimiya«, 31 (1966), S. 387 bis 389, sind Verbindungen auf Basis Cyanurcellulose mit gebundenem Enzym, z. B. Trypsin, mit hoher enzymatischer Aktivität bekannt. Nach dem in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren ist .es indes nicht möglich, ein kovalent gebundenes Präparat aus Cellulose und Cyanurchlorid herzustellen, das aktive Chloratome für die nachfolgende Umsetzung mit einem Enzym enthält.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Enzyme bereitzustellen, welche an einen festen Träger chemisch gebunden sind und hohe enzymatische Aktivität aufweisen.

Der Träger für das gebundene Enzym besteht aus einem natürlichen oder synthetischen, organischen, freie OH-Gruppen aufweisenden Polymeren; solche Polymere sind in der Regel hydrophil. Geeignete Polymere sind beispielsweise Cellulose Stärke, Dextran, vernetztes Dextran, Proteine, wie etwa Wolle, und Polyvinylalkohol.

In allgemeiner Hinsicht können zur chemischen Bindung von Enzymen an freie OH-Gruppen aufweisende Polymere s-Triazinylreste der allgemeinen Formel

steht.

-NH₂-,

— O— CH₂- COOH-,

— NH — CH₂ — COOH-, -S-CH₂-COOH-, -NH-C₂H₄-SO₃H-,

-0-C₄H₈-N(C₂H₅J₃-, -NH-C₆H₄-SO₃H-,

— O — C₆H₄- COOH-, -S-C₆H₄-COOH-, -NH-C₂H₄-OH-,

— O — C₂H₄-OH-,

— NHC₃H,, — NH(C₂H₄OH)₂-Gruppe

0-C₄H,

N(C₂H₅),

NHC₃H₆ — NH(C₂H₄OH)₂

IO

verwendet werdsn, bei denen Y einen nukleophilen aliphatischen oder aromatischen Rest bedeutet Erfindungsgemäß werden solche s-Triazinylreste herangezogen, bei denen Y für die

20

35

40

Besonders gute Ergebnisse wurden mit der Gruppe — NHC₃H₆NH(C₂H₄OH)₂

als Substituent Y erzielt. .

Besondere Bedeutung kommt einer positiven Ladung zu, die an den Substituenten Y in wäßrigem Medium auftreten kann. Die Reste

55

besitzen bereits auf Grund des quartären Ammoniumions eine positive Ladung. Andere Substituenten, insbesondere die Zwitterionen bildenden Verbindungen können in wäßrigem Medium bei pH-Werten zwischen 2 und 10, insbesondere zwischen 5 und 9 und besonders bevorzugt bei etwa 7 durch Protonenwanderung eine positive Ladung aufweisen. Ferner kann an den angegebenen Substituenten in wäßrigem Medium auch durch Ladungstrennung und -verschiebung eine positive Teilladung auftreten. Obwohl die Zusammenhänge noch nicht in allen Einzelheiten geklärt sind, wird vermutet, daß die in wäßrigem Medium bei pH-Werten zwischen 2 und 10 am Substituenten Y auftretende positive Ladung die Konfiguration des Enzyms in günstiger Weise beeinflußt, so daß sowohl die Reaktion des Enzyms mit den reaktionsbereiten Resten X am Triazinylring glatt vonstatten geht, als auch das gebundene Enzym in einer die nachfolgende Umsetzung des Substrats begünstigenden Konfiguration vorliegt

Die erfindungsgemäß gebundenen oder umgesetzten Enzyme können tierischen, pflanzlichen oder mikrobiologischen Ursprungs sein; geeignet sind beispielsweise proteolytische Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin und Papain; Hydrolasen wie /ϊ-Galactosidase, Ribonuclease, Alkaliphosphatase, Amyloglucosidase und Dextranase; Dehydrogenasen wie Milchsäuredehydrogenase; Kinasen wie Creatinphosphokinase und Pyruvatkinase; Oxydasen wie Glucoseoxydase; Amidasen wie Amidase und Penicillinamidase.

Die erfindungsgemäß gebundenen Enzyme bzw. die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Präparate haben ein weites Anwendungsfeld. Hierzu gehören enzymatisch katalysierte Umsetzungen, oder solche Verfahren, bei welchen bisher lösliche Enzyme verwendet worden sind. Anwendungsmöglichkeiten sind ferner die Herstellung von Penicillinen, das Klären von Bier, die Herstellung von Glucose unter Verwendung von Amyloglycosidase, die Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren und die Bildung von 1-Alanin durch Transamination. Weitere Verwendungszwecke sind die enzymatische Hydrolyse von Kohlehydraten, die Aufarbeitung von Abfallmaterial, die Handhabung von großen natürlichen Molekülen, wie Steroiden, Alkaloiden, Chloramphenicol und Riboflavin, ferner die alkoholische und andere Arten der Fermentation, die Fixierung von Stickstoff, die Bestimmung von Luciferasesystemen, der Einsatz in biochemischen Brennstoffzellen, die spezifische Oxydation und Reduktion von organischen Stoffen und die Fixierung von Kohlendioxyd.

Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäß gebundenen Enzyme bietet die enzymatische Analyse, insbesondere die stufenweise Analyse von Proteinen, von RNS und von DNS. In diesen Fällen kann beispielsweise das Substrat durch ein permeables Blatt aus den oben beschriebenen enzymhaltigen Filterpapieren hindurchströmen, wobei gleichzeitig die gewünschte Umsetzung abläuft. Wenn der Umsetzung eine Chromatographie folgt, so kann man das Substrat über ein solches permeables, enzymhaltiges Blatt Chromatographieren. Ein wichtiges praktisches Anwendungsgebiet ist beispielsweise die enzymatische Analyse von Harn.

Praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen:

1. Die Herstellung der sym. Triazinylverbindungen der allgemeinen Formel

wobei X Chlor oder Fluor und Y einen der folgenden

Substituenten

- NH₂

Ο —CH₂-COOH
NH-CH₂-COOH
S-CH₂-COOH

-NH-C₂H₄-SO₃H

-Ο —C₄H₈-N(C₂H₅J₃
-NH-C₆H₄-SO₃H

Ο —C₆H₄-COOH

S-C₆H₄-COOH

NH-C₂H₄-OH

Ο —C₂H₄-OH

NHC₃H₆ — NH(C₂H₄OH)₂

bedeutet, kann teilweise nach an sich bekannten Verfahren oder anlog zu der nachfolgend detailliert beschriebenen Herstellung von 2,4-Dichlor-6-carboxymethylamino-s-triazin oder von 2,4-Dichlor-6-carboxymethoxy-s-triazin erfolgen.

A) 2,4-Dichlor-6-carboxymethylamino-s-triazin

Man löst 7,2 g Natriumbicarbonat in einer Mischung aus 60 ml n-Glycin-Lösung, 50 ml destilliertem Wasser und 50 ml Aceton. Diese Lösung gibt man zu einer Lösung von 3,4 g Cyanurchlorid in 100 ml Aceton. Man rührt die Mischung kräftig, wobei Kohlendioxyd freigesetzt wird. Nach einer Minute wird der pH-Wert durch Zugabe verdünnter Salzsäure auf 2,5 herabgesetzt. Das freigesetzte Kohlendioxyd wird mittels hindurchg«leitetem Stickstoff ausgetrieben. Anschließend wird das Aceton unter vermindertem Druok bei einer Temperatur unter 40⁰C entfernt Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit wenig destilliertem Wasser gewaschen, in einem Vakuum-Exsikkator 2 Stunden lang über Silicagel getrocknet und anschließend aus einem Lösungsmittelgemisch aus 50 Volumteilen Wasser und 50 Volumteilen Aceton umkristallisiert.

B)2,4-Dichlor-6-carbomethoxy-s-triazin

5 g Glycolsäure und 5 g Natriumbicarbonat werden mit 10 ml destilliertem Wasser so lange gerührt, bis beide Substanzen darin vollständig gelöst sind. Diese Lösung gibt man zu einer Lösung von 5 g Cyanurchlorid in 20 ml Aceton. Das Gemisch wird gerührt, und durch Zugabe kleiner Mengen von Eis wird die Temperatur unter 30° C gehalten. Nach 20 Minuten wird die erhaltene klare Lösung in einen Rotationsverdampfer überführt und das überschüssige Aceton bei vermindertem Druck unterhalb 30⁰C entfernt Das Produkt fällt als viskoses öl an, das mit 6 ml destilliertem Wasser gewaschen wird.

2. Herstellung der s-Triazinyl-Ausgangspolymeren: Die Umsetzung zwischen dem ausgewählten geeigneten Polymeren und dem in 6-Stellung entsprechend substituierten 2,4-Dihalogen-s-triazin erfolgt bevorzugt in wäßrigem Medium, wenn die s-Triazinyl-Verbindung darin löslich ist. Die ausgewählte s-Triazinyl-Verbindung ist in Wasser weitgehend löslich, wenn der Substituent Carboxy-, Sulfonsäure- oder n(alkyl)3-Gruppen enthält Ist die ausgewählte s-Triazinyl-Verbindung in Wasser nicht ausreichend löslich, so kann die Umsetzung in einem wasserhaltigen Lösungsmittelgemisch erfolgen. Die Umsetzung zwischen dem Polymeren und der s-Triazinyl-Verbindung kann leicht durch Verminderung des pH-Wertes im Reaktionsmedium beendet werden; am einfachsten erfolgt dies durch Waschen mit Wasser. Zweckmäßigerweise wird die Reaktion bereits dann beendet, nachdem ein Halogen

ίο abgespalten und statt dessen eine chemische Bindung zwischen Polymer und s-Triazinyl-Verbindung gebildet worden ist; hierdurch wird eine nennenswerte Vernetzung vermieden, und es verbleibt eine ausreichende Zahl reaktionsfähiger Halogenatome für die spätere Bindung des Enzyms. Die Reaktion zwischen dem ausgewählten Polymeren und der s-Triazinyl-Verbindung kann im wesentlichen analog zu den nachfolgenden, beispielhaften Reaktionsbedingungen erfolgen.

QCarboxymethylamino-chlor-s-triazinylcellulose

2,4-Dichlor-6-carboxymethylamino-s-triazin wird mit destilliertem Wasser versetzt und der pH-Wert der Mischung durch Zugabe einer 4 n-Natriumhydroxydlö-

Z5 sung auf 6 erhöht; bei diesem pH-Wert löst sich das Triazin vollständig. Die Lösung wird durch Zugabe von destilliertem Wasser auf !OmI aufgefüllt und anschließend 2 g Cellulosepulver zugesetzt. Durch tropfenweise Zugabe einer 4 n-Natriumhydroxydlösung wird der pH-Wert auf 11 erhöht und innerhalb einer möglichen Abweichung von ±0,2 bei diesem Wert gehalten. Die Umsetzung wird auf dem Wasserbad bei 25° C durchgeführt, und da die Reaktion exotherm verläuft, steigt die Temperatur des Gemisches innerhalb von 3 Minuten maximal auf 30⁰C an, worauf sie innerhalb von 10 Minuten wieder auf 26° C absinkt. Man pipettiert in 20 ml einer 20volumprozentigen Essigsäure, filtriert, wäscht mit entionisiertem Wasser, bis das Filtrat chloridfrei ist (Überprüfung mit Silbernitrat) und rührt anschließend über Nacht in 10 ml entionisiertem Wasser. Dann wird das Produkt in einem Vakuum-Exsikkator üoer Silicagel getrocknet.

D) Carboxymethoxy-chlor-s- triazinyl-cellulose

2,4-Dichlor-6-carboxymethoxy-s-triazin wird in etwa 25%iger Natriumbicarbonat-Lösung gelöst, mit 3 g Cellulosepulver versetzt und das Gemisch bei 25° C auf dem Wasserbad gerührt. Durch Zugabe einer 4 n-Lösung von Natriumhydroxyd-Lösung wird der pH-Wert auf 9 erhöht und bei diesem Wert gehalten; die Pufferwirkung der Carbonationen gestattet dies ohne Schwierigkeit 6 Minuten nach Beginn der Umsetzung wird in 20 ml einer 20volumprozentigen Essigsäure pipittiert, abfiltriert mit entionisiertem Wasser chlorid-

frei (Überprüfung mit Silbernitrat) gewaschen und dann über Nacht in 10 ml entionisiertem Wasser gerührt. Schließlich wird das Produkt erneut filtriert, mit 10 ml entionisiertem Wasser gewaschen und in einem Vakuum-Eksikkator über Silicagel getrocknet.

E)Amino-Chlor-s-triazinyl-dextran

0,2 g 2-Amino-4,6-dichlor-s-triazin werden in 10 ml Lösungsmittelgemisch aus gleichen Volumina Wasser und Aceton gelöst und darin 0,25 vorgequollenes vernetztes Dextran suspendiert Nach 5 Minuten bei 50⁰C werden 4 ml einer weiteren Lösung (wäßrige Lösung mit 15 Gewichtsprozent Na2CO₃, der 0,6 ml 1 η-Salzsäure zugesetzt worden war) zugegeben, mit

der vorgelegten Suspension vermischt und anschließend 5 Minuten lang bei 50°C gerührt. Zur Beendigung der Reaktion wird der pH-Wert mittels Salzsäure unter 7 abgesenkt. Das Produkt wird durch Filtrieren isoliert, anschließend mit einem Gemisch aus gleichen Volumenanteilen Aceton und Wasser und abschließend mit Wasser gewaschen.

Wie im folgenden gezeigt wird, ist es auch möglich, das ausgewählte, freie OH-Gruppen aufweisende Polymere zuerst unter solch schonenden Bedingungen mit Cyanurchlorid umzusetzen, daß am Trazinyl-Ring noch etwa 2 Halogenatome verbleiben, und anschließend dieses Zwischenprodukt mit einer den Substituenten »Y« liefernden Verbindung zur Reaktion zu bringen.

F)[N-(3-Aminopropyl)-diäthanolamin]-chlor-s-triazinyl-cellulose

a) 12 Blatt im wesentlichen aus Cellulose bestehendes Filterpapier mit einem Durchmesser von 2,5 cm werden 5 Minuten lang in I(n-Natriumhydroxyd-Lösung eingeweicht. Man entfernt das überschüssige Natriumhydroxyd und bewegt die Papiere 5 Minuten lang in 20 bis 30 ml Dioxan. Nach dem Herausnehmen aus dem Dioxan bringt man die Papiere bei Raumtemperatur in 20 ml Cyanurchlorid-Lösung (0,25 g/ml) und fügt sofort 25 ml Wasser und nach 5 Sekunden 20 bis 30 ml Eisessig zu. Man entfernt die Papiere aus der Lösung und bringt sie erneut in 20 ml Dioxan. Nach 2 Minuten werden 20 ml Wasser und wenig Eisessig zugesetzt. Nach weiteren 5 Minuten nimmt man die Papiere heraus, bringt sie auf einem Büchner-Trichter und wäscht sorgfältig zuerst mit Wasser und anschließend mit Aceton. Danach wurden die Papiere in einem Vakuum-Exsikkator getrocknet und bei 2° C aufbewahrt.

b) Eine Lösung von 3 g N-(-3-Aminopropyl)-diäthanolamin in 100 ml Wasser wird durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 gebracht. 10 ml dieser Lösung werden mit 10 ml Wasser versetzt und die Papiere in diesem Lösungsgemisch 7'/2 Minuten lang bei Raumtemperatur bewegt. Dann werden 10 ml 1 η-Salzsäure zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Anschließend werden die Papiere zuerst mit einer 5m Natriumchloridlösung, dann mit Wasser und abschließend mit Aceton gewaschen. Die Papiere, die im wesentlichen aus [N-(3-Aminopropyl)-diäthanolamin]-chlor-s-triazin-cellulose bestehen, werden wieder in den Exsikkator gebracht.

Die oben unter C, D, E und F hergestellten Präparate und weitere erfindungsgemäß einzusetzende, freie OH-Gruppen aufweisende Polymere mit chemisch gebundenen s-Triazinyl-Ring enthalten am Triazinyl-Ring stets noch ein Halogenatom. Die chemische Bindung des ausgewählten Enzyms an das Polymere erfolgt dadurch, daß die Triazin-Haloge.n-Bindung gelöst wird und statt dessen eine Triazin-Enzym-Bfldung gebildet wird. Hierzu kann das Polymer mit dem Enzym in wäßrigem Medium zur Reaktion gebracht werden, beispielsweise durch Zugabe des Polymers zu einer wäßrigen Lösung des Enzyms. Da entsprechende Enzyme oft wenig stabil sind, sollte die Temperatur bei der Umsetzung vorzugsweise niedrig gehalten werden, beispielsweise bei Raumtemperatur; ferner sollte der pH-Wert möglichst nahe am Neutralpunkt gehalten werdea Es kann über auch erforderlich sein, bei schwach alkalischem pH-Wert von beispielsweise 7 bis 8,6 zu arbeiten, da bei diesen pH-Werten die Umsetzung schneller verläuft als in einem neutralen Medium. Im einzelnen sind dem Fachmann die Reaktionsbedingungen für die Umsetzung des ausgewählten Enzyms mit dem s-Triazinyl-Reste enthaltenden Polymeren bekannt und entsprechen im wesentlichen den nachfolgend detailliert beschriebenen erfindungsgemäßen Umsetzungen. Nach der Bindung des Enzyms an den Träger wird das nicht in Reaktion getretene Halogen desaktiviert; beispielsweise durch Umsetzung mit Ammoniak oder einem aliphatischen Amin. ίο 3. Herstellung der eigentlichen erfindungsgemäßen Endprodukte

Beispiel 1

Eine kleine Probe der oben unter C) hergestellten Carboxy-methylamino-chlor-s-triazinyl-ccllulose wird 5 Minuten lang in 0,01 η-Salzsäure gerührt, abfiltriert und anschließend chloridfrei gewaschen. Der gewaschene Rückstand wird in 1 ml chymotrypsinhaltige Enzymlösung gebracht und anschließend 1 ml Phosphatpuffer-Lösung zugesetzt. Dieses Gemisch wird bei 25⁰C etwa 15 Stunden lang gerührt und anschließend überschüssiges Enzym ausgewaschen. Hierzu wurde das Reaktionsgemisch auf einen Büchner-Trichter gebracht, und die überschüssige Flüssigkeit sanft abgesaugt und der Rückstand mit einer Lösung gewaschen, die Natriumchlorid in Im Lösung und Harnstoff in 2m Lösung enthält. Mit diesem Verfahren, das im einzelnen in R.I.I. Biol. Chem., 193,265 (1951) beschrieben ist, werden etwa 95% des absorbierten Enzyms entfernt. Aus der Differenz zwischen eingesetztem und wieder ausgewaschenem Enzym wird das chemisch an die Cellulose gebundene Enzym bestimmt. Nach der anschließenden Trocknung und Wägung enthielten 0,275 g Produkt 0,0082 g Chymotrypsin.

Beispiel 2

Eine kleine Probe der oben unter D) hergestellten Carboxy-methoxy-chlor-s-triazinyl-cellulose wird 5 Minuten lang in 0,01 η-Salzsäure gerührt, abfiltriert und anschließend chloridfrei gewaschen. Der gewaschene Rückstand wird in 1 ml Chymotrypsin-Lösung gebracht,

1 ml Phosphatpuffer-Lösung zugesetzt und anschließend wird das Gemisch bei einer Temperatur von

2 ±0,5° C etwa 15 Stunden lang gerührt Das überschüssige Enzym wurde, wie oben in Beispiel 1 angegeben, entfernt, und nach der anschließenden Trocknung und Wägung festgestellt daß 0,291 g Produkt 0,0082 g Chymotrypsin chemisch gebunden hatten. An dieser Probe wurde die Aktivität des gebundenen Enzyms

so halbquantitativ wie folgt bestimmt:

5 ml einer Lösung aus 0,5 n-Natriumchlorid unc 0,00112 n-Natriumphosphat wurden bei einen· pH-Wert von 8,00±0,02 die Enzym-Cellulose bzw 0,1 ml freies Enzym enthaltende Enzym-Lösung züge setzt und nach erneuter Einstellung des pH-Werte: 0,25 ml einer 6,02-10-³molaren N-Acetyl-i-tyrösin äthylester-Lösung (ATEE) in Dioxan/Wasser zugesetzt Anschließend wurde die Umsetzung in üblicher Weisi titrimetrisch verfolgt, wobei als Titriermittel 0,01 n-Natriumhydroxyd-Lösung verwendet wurde, Mittel dieser Untersuchung ergab sich für die chymotrypsin haltige Cellulose eine Aktivität von 46% der Aktivitä des freien Enzyms.

Beispie] 3

Das oben unter E) hergestellte Amino-chlor-s-triazii dextran wird mit 4 ml Enzym-Lösung, welche 80 m Chymotrypsin enthält, versetzt, 2 ml Boratpuffer-Lf

609519/5C

sung (pH 8,75) hinzugefügt und das Gemisch anschließend 18 Stunden lang bei 23°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, der Rückstand mit 2,5 m Natriumchlorid-Lösung und Boratpuffer gewaschen, anschließend getrocknet und gewogen. Das Produkt enthielt pro Gramm Trockengewicht Dextran 200 mg Enzym. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte an Acelyltyrosin-äthylester als Substrat in einer Reaktionsmischung, die 5% Dioxan, 0,2molaren Phosphatpuffer (pH 7) und 0,3molare Natriumchlorid-Lösung enthielt. Das Reaktionsprodukt mit gebundenem Chymotrypsin wies 39% der Aktivität des freien, gelösten Enzyms auf.

Beispiel 4

Auf ein Filterpapier, das wie oben unter F) angegeben hergestellt worden war und im wesentlichen aus

[N-(3-Aminopropyl)-diäthanolamin]-chlor-s-triazin-Cellulose besteht, werden 0,1 ml jS-Galactosidase-Lösung, 0,025 ml einer 0,001m Äthylen-diaminatetraessigsäure-Lösung (EDTA) und 0,025 ml einer 0,01m Magnesiumsulfat-Lösung gegeben und 30 Minuten lang einwirken gelassen. Nach dem Waschen bewirkten drei dieser enzymhaltigen Filterpapiere eine deutliche Änderung der optischen Dichte um 0,5 Einheiten bei 420 ηιμ, wenn man o-Nitrophenylgalactosid in einer Menge von 4 ml/Min, damit reagieren ließ. Wenn die enzymhaltigen Papiere noch überschüssiges aktives oder gebundenes Chlor enthalten, so kann dies durch Einbringen der Papiere in eine N-(3-Aminopropyl)-diäthanoIamin-Lösung, welche geringe Mengen EDTA und Magnesiumsulfat enthält, entfernt werden.

Beispiel 5

0,25 ml einer Pyruvatkinase-Lösung (5,5 mg Enzym/ml) in Ammoniumsulfat werden bei 4°C über Nacht gegen 2 Liter einer Pufferlösung dialysiert, die 3 mM Kaliumphosphat mit einem pH-Wert von 7,4, 0,03 mM EDTA und 0,375 mM Magnesiumsulfat enthält. Das Dialysat (0,4 ml) wird mit 1 ml Kalium-phosphat-Lösung verdünnt. Anschließend werden 0,1 ml dieser Mischung und 10OmM des Kaliumphosphat-Puffers (pH 7,4) auf Filterpapiere gebracht, die, wie oben unter F) angegeben, erhalten worden waren. Nach dem Aufbringen des Enzyms werden die Papiere 50 Minuten lang bei etwa 25°C abgedeckt aufbewahrt. Sechs dieser enzymhaltigen Papiere werden anschließend in 12 bis 20 ml einer Lösung suspendiert, welche 30 mM N-(3-Aminopropy!)-diäthanolamin, 2 mM EDTA, 11 mM Magnesiumsulfat und 42 mM Kaliumphosphat enthält und einen pH-Wert von 7,8 aufweist. Die Papiere verbleiben einen Tag bei Raumtemperatur in dieser Lösung, werden anschließend herausgenommen, gewaschen und getrocknet und kühl gelagert. Bereits eines dieser Filterpapiere bewirkt eine deutliche Reaktion, wenn als Substrat Pyruvat mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Min, hindurchgeleitet wird.

Vergleichsbeispiele

Ein Vergleich der erfindungsgemäßen Präparate mit bekannten, an feste Träger gebundenen Enzymen zeigt, daß die erfindungsgemäß gebundenen Enzyme höhere Aktivität aufweisen als die bekannten. Als Bezugspunkt für die Aktivitätsbesiimmung dient hierbei die Aktivität von freiem gelöstem Enzym unter den gleichen Reaktionsbedingungen, welche als 100% zugrunde gelegt wird.

Quelle

Trägerbasis

Enzym

Aktivität

Beispiel 2
Beispiel 3

Bekannt¹)
Bekannt²)

Cellulose

vern.

Dextran

vern.

Dextran

vern.

Dextran

Chymotrypsin
Chymotrypsin

46
39

-20
20

') R. Axe η und J. Porath in Nature, 210, 367, 368(1966).

"),*· ^{A x} e η, J. P ο r a t h und S. E r η b a c k in Nature, 214, 1302, 1303 (1967).

Claims

Patentanrprüche:

1. An ein natürliches oder synthetisches, organisches, freie OH-Gruppen aufweisendes Polymeres chemisch gebundenes proteolytisches Enzym, oder eine gleichermaßen gebundene Hydrolase, Dehydrogenase, Kinase, Oxydase oder Amidase, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung über einen s-Triazinylrest der allgemeinen Formel: