DE2619451A1

DE2619451A1 - Verfahren zur bindung von hoch- und niedermolekularen liganden an polymere traeger

Info

Publication number: DE2619451A1
Application number: DE19762619451
Authority: DE
Inventors: Thomas Gribnau; Dietrich Dr Hildebrand
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1976-05-03
Filing date: 1976-05-03
Publication date: 1977-11-24
Also published as: JPS52134689A; BE854201A; FR2350358B1; IL51977A; FR2350358A1; NL7704805A; SE7705062L; IL51977A0; GB1527974A; US4144128A

Description

Bayer Aktiengesellschaft

Zentralbereich Patente. Marken und Lizenzen

SOO Leverkusen. Bayerwerk

Er-by

3 Q. AprG 1976

Verfahren zur Bindung von hoch- und niedermolekularen Liganden an polymere Träger

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bindung von hoch- und niedermolekularen Substanzen (Liganden oder Effektoren) an polymere Träger sowie verfahrensgemäß hergestellte Träger-Liganden-Reaktionsprodukte .

Es ist bereits bekannt geworden, daß man hydroxylgruppenhaltige Träger mit Bromcyan aktivieren und nachfolgend mit geeigneten Effektoren bzw. Liganden über freie Aminogruppen dieser Effektoren kuppeln kann. (Verfahren von R.Axen, J. Porath und S. Ernback, Nature 1967, 214/ 1302 - 1304. Dieses vorgenannte Verfahren hat jedoch, wie Tesser et al zeigen konnten ,den Nachteil, daß die hier vorliegende Isoharnstoffbindung des Effektors an dem Träger nicht hydrolysestabil ist (G.I. Tesser et al FEBS Letters (1972) 23_, 56) sowie G.I. Tesser et al HeIv. Chem Acta 57, 1718-1730/(1974).

Le A 17 177

709847/0043

2619A51

Ein anderes Verfahren, das auf E.Katchalski, Biochem. 1954V 2/1905-1919 zurückgeht,benutzt Polymere mit Anhydridgruppen. Bei diesen Harztypen beruht die Enzymbindung auf der rascheren Umsetzung der Aminogruppen des Enzyms mit den Anhydridgruppen des Harzes gegenüber der konkurrierenden Reaktion mit dem umgebenden Wasser.

Wieder andere Verfahren benutzen z.B. die Reaktion von Epoxydgruppen an Polymeren mit Aminogruppen, (L.Sundberg a J. Porath, J. Chromatogr. 1974 90, 87 - 98) jedoch werden hierbei pH-Werte von 8,5 - 11, und Reaktionszeiten von 15 bis 48 Stunden benötigt, die für zahlreiche Enzyme denaturierend wirken.

Eine Zusammenfassung der zahlreichen Möglichkeiten gibt z.B. C. Zaborsky in Immobilized Enzymes, CRC-Press, Cleveland 1973.

Cyanurchlorid und andere Triazinderivate wurden von G.Kay und M. Lilly schon 1967 zur Aktivierung von Zellulose und zur Kupplung von Enzymen verwendet. (G.Kay a. E.M. Crook, Nature 1967 216 514; G.Kay, M.D. Lilly, A.K. Sharp a R.J.H. Wilson, Nature 1968 217,641) . Die Bindungsstabilität erfüllte nicht alle Erfordernisse.Der Übergang zu Derivaten des Trichlor-

triazins (S. Kay a. M.D. Lilly Biochim, Biophys. Acta (1970) 198, 276-285 brachte eine bessere Handhabung der Reaktion mit sich, jedoch keine Verbesserung der beobachteten Instabilität der Bindungen.

Le A 17 177 - 2 -

709847/0043

Es wurde nun gefunden, daß man eine äußerst stabile Bindung eines OH, NH₂, NHR (R=Alkyl (C₁-C₄)), CONH₂,CONHR oder SH-Gruppen-haltigen Liganden an polymere Träger, welche ebenfalls die vorgenannten Gruppen enthalten, erreichen kann, wenn man

a) einen aktivierten polymeren Träger der Formel

(I)

12 3 4

in welcher die Substituenten R , R , R und R unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben können: Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C₄), Alkoxy (C₁-C₄), Alkylthio (C₁-C₄), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano, Carbonamido, Alkylsulfonyl (.C^-C.) , Alkoxycarbonyl (C₂-C,), Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl sowie T-X,wobei T-X für einen Trägerrest eines polymeren Trägers und X für Sauerstoff, Schwefel, NH, NR (R=Alkyl (C₁-C.)), CONH steht, wobei mindestens ein

14 oder höchstens zwei der Reste R bis R für T-X steht

1 4 und wobei zwei der Reste R und R für einen bivalenten Trägerrest Τ<Γ"* stehen können, mit einem eine oder mehrere OH, NH₂, NHR (R=Alkyl (C₁-C₄)), CONH, CONHR oder SH-Gruppen-haltigen Liganden gegebenenfalls in Gegenwart von Basen umsetzt, oder indem man

b) einen durch Kondensationsreaktion mit einem Pyrimidinderivat der allgemeinen Formel

Le A 17 177 - 3 -

709847/0043

(II)

in welcher die Reste R , R , R und R unabhängig voneinander eine der folgenden Bedeutungen haben können:

Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C₄), Alkoxy (C₁-C₄), Alkylthio (C₁-C₄), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano, Carbonamido, Alkylsulfonyl (C₁-C₄ carbonyl (C₂-C₆), Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl; und wobei mindestens zwei der Reste R bis R für Halogen stehen, aktivierten Liganden mit einem OH NH₂, NHR (R=Alkyl (C₁-C₄)), CONH₂ , CONHR oder SH-Gruppen-haltigen Träger, gegebenenfalls in Gegenwart von Basen umsetzt, und falls es sich bei dem aktivierten Liganden um einen reaktiven Farbstoff handelt, das Kondensationsprodukt aus Träger und reaktiven Azofarbstoff gegebenenfalls isoliert, gegebenenfalls das Kondensationsprodukt mit einem geeigneten Reduktionsmittel zur freien Aminoverbindung reduziert, diese mit Natriumnitrit und Säure diazotiert und anschließend mit einem geeigneten Kupplungsreagenz umsetzt.

Die neuen erfindungsgemäßen Umsetzungsprodukte, welche gemäß Verfahrensvariante a) oder Verfahrensvariante b) hergestellt worden sind, sind beispielsweise zur Durchführung adsorptionschromatographischer Trennungen oder, falls der Ligand beispielsweise für ein Enzym steht, auch für die Durchführung enzymatischer Reaktionen geeignet.

Le A 17 177 - 4 -

709847/0043

Trägergebundene Enzyme sind stabilisiert und könneTr* IvH O I direkt zu Umsetzungen eingesetzt und auf einfache Weise nach der Umsetzung zurückgewonnen und wieder verwendet werden. Neue Zusammenfassungen der zahlreichen Literatur sind R.A. Messing, "Immobilized Enzymes for Industrial Reactors" Acad. Press, N.J. 1975 und O.R. Zaborsky "Immobilized Enzymes" CRC-Press Cleveland 1973.

Mit löslichen Substanzen wie Dextranen umhüllte Enzyme sind trotz ihrer Löslichkeit thermisch stabilisiert und können z.B. als Waschmittelzusatzstoffe Verwendung finden.

Niedermolekulare Effektoren an Trägern dienen durch spezifische, adsorbierende Eigenschaften zur Reinigung vor Proteinen
(Shaltiel, Methods Enzymol (1974) 3_£, 126).

Spezifische, trägergebundene Effektoren wie z.B. Inhibitoren dienen zur Reinigung von Proteinen durch Affinitätschromatographie. Eine neuere Zusammenfassung der Literatur von J. Porath a. T. Kristiansen findet sich in Neurath, Hill ed. "The Proteins" Vol. 1_, 3^rd ed. Acad. Press 1975.

Falls in einer vereinfachten Darstellungsweise ein Halogenatom des eingesetzten Pyrimidinderivates mit jeweils einer hydrophilen Gruppe des Liganden oder des Trägers reagiert, kann der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens durch folgend* Reaktionschema verdeutlicht werden:

Le A 17 177 - 5 -

709847/0043

a) aktivierter Träger als Ausgangsprodukt

Cl

T-OH +
(Träger)

(Pyrimidinderivat)

(-HF)

Cl

T-O

(aktivierter Träger)

L-NH,

\/ (Ligand)

(-HF)

Cl

T-O

^s

NH-L

Le A 17 177

709847/QCU3

JO

b) aktivierter Ligand als Ausgangsprodukt: 2619451

L-NH₂
(Ligand)

Cl

V (-HF)

(Pyrimidinderivat)

Cl

L-NH

(aktivierter Ligand)

+ T-NH,

(Träger) (-HF)

Cl

L-NH

NH-T

(ümsetzungsprodukt)

Le A 17 177

709847/0043

Die Darstellungsweise ist stark vereinfacht, u.U. tritt bereits bei der Herstellung des aktivierten Trägers und ggf. Liganden ein Austausch zweier Halogenatome mit Quervernetzung auf. überraschenderweise sind die neuen erfindungsgemäßen Umsetzungsprodukte, welche gemäß VerfahrensVariante a) oder Verfahrensvariante b) hergestellt worden sind, außerordentlich hydrolyse.stabil ^un^ wesentlich hydro Iy s es tab il als die in der Literatur beschriebenen Träger - Liganden - Kupplungsprodukte.

Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Bereitstellung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Umsetzungsprodukte stellen eine große Bereicherung der Technik dar.

Zur Herstellung der Ausgangsprodukte der Verfahrensvarianten a) und b), der aktivierten Träger bzw. der aktivierten Liganden werden besonders bevorzugt folgende Pyrxmidxnderivate eingesetzt:

F _und

Tetrafluorpyrimidin

(TEP)
2,4,6-Trifluor- Tetrachlorpyrimidin

-5-chlorpyrimidin (PCP) (TCP)

daneben können aber auch . andere Pyrimidinderivate der allgemeinen Formel (I) eingesetzt werden.

Le A 17 177 - 8 -

7098^7/0043

Die Herstellung des TCP wurde von H.J. Schroeder et al in J. org. Chem. T1_, 2580-2584 (1962) beschrieben. Andere Herstellungsmethoden sind in den Patentschriften GB-PS 1 157 948 und GB-PS 1 158 300 zu finden.

Das Tetrachlorpyrimidin (TCP) kann leicht nach S.J.Childress und R.L. Mc Kee, J. Am. Chem. Soc. (1950) Jl, 4271-72 hergestellt werden.

Mit diesen beiden vorgenannten Halogenpyrimidinen lassen sich sämtliche Träger mit Hydroxylgruppen wie die wichtige, perlförmige Agarose und Dextran Derivate aber auch Zellulose und zellulosehaltige Naturstoffe wie Baumwolle umsetzen. Dabei ist es durchaus möglich, daß auch noch andere funktioneile Gruppen wie Carboxymethyl- oder Diäthylaminoacetyl-Gruppen vorhanden sind. Ebenso lassen sich auch Träger mit primären oder sekundären Aminogruppen und sogar mit Amidgruppen wie Polyacrylamid aktivieren. Andere Polymere auf Styrol-Acrylsäure-Methacrylsäure-Basis, und ihre Ester lassen sich aktivieren, sofern sie die genannten funktioneilen Gruppen enthalten.

Nach den beiden vorgenannten Pyrimidinen FCP und TCP sind auch noch weitere Pyrimidinderivate der allgemeinen Formel (I) einsetzbar. Beispielhaft seien die folgenden genannt:

2-Fluor-4,5,6-trichlorpyrimidin, 2,4-Difluorpyrimidin, 2_/4-Difluor-6-methylpyrimidin, 2,6-Difluor-4-methyl-5-chlorpyrimidin, 2,4,6-Trifluorpyrimidin, 2,4-Difluorpyrimidin-5-äthylsulfon, 2,6-Difluor-4-chlorpyrimidin, 2,4,5,6-Tetrafluorpyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5-chlorpyrimidin, 2,6-Difluor-4-methyl-5-brompyrimidin,

Le A 17 177 - 9 -

709847/0043

2,4-Difluor-5,6-dichlor- oder -dibrompyrimidin, 4,6-Difluor-2,5-dichlor- oder -dibrompyrimidin/ 2_#6-Difiluor-4-brompyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5~brompyrimidin, 2,4,6-Trifluor -5-brompyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5-chlormethylpyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5-nitropyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5-cyanpyrimdin, 2,4,6-Trifluorpyrimidin-5-carbonsäurealkylester oder -5-carbonsäureamide, 2,6-Difluor-5-methyl-4-chlorpyrimidin, 2,6-Difluor-5-chlorpyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5-methylpyrimidin, 2,4,5-Trifluor-6-methylpyrimidin, 2,4-Difluor-5-nitro-6-chlorpyrimdin, 2,4-Difluor-5-cyanpyrimidin,2,4-Difluor-5-methylpyrimidin, 6-Trifluormethyl-5-chlor-2,4-difluor-pyrimidin, 6-Phenyl-2,4-difluorpyrimidin, 6-Trifluormethy1-2,4-difluorpyrimidin, 5-Trifluormethyl-2,4,6-trifluorpyrimidin, 5-Trifluormethyl-2,4-difluorpyrimidin und weitere.

Bei der Herstellung der als Ausgangsmaterialien dienenden aktivierten Träger kommen folgende polymere Träger in Betracht:

polymere Trägersubstanzen, vorzugsweise Trägerharze, welche als funktionelle Gruppen folgende Gruppen enthalten:

Hydroxyl, primäres oder sekundäres Amino, Carbonamide» (CONH₂- bzw. CONHR - Reste (R=Alkyl)) oder Sulfhydril. Aus der Vielzahl der Möglichkeiten seien die folgenden beispielhaft aufgeführt:

Agaröse,Vorzugsweise perlförmige Agarose geliefert von Pharmacia Fine Chemicals unter der Handelsbezeichnung Sepharosev-' , Sorten 2 B, 4 B und 6 B, quervernetzte Sepharose^ - Gele, Sorten Cl-2 B, Cl-4 B und Cl-6 B sowie Dextrane und quervernetzte Dextrane (wie z.B.

Le A 17 177 - 10 -

709847/0043

Sephadex ^ geliefert von Pharmacia.- Fine Chemicals,Uppsala Schweden beispielsweise in den Sorten G-75, G-100, G-150 und G-200) weiterhin Zellulose (u.a. auch Baumwolle) und verschiedene Zellulosederivate, Polyacrylamidharze, Ionenaustauscher - Harze mit hydrophilen Gruppen wie z.B. aminomethylierte Polystyrolharze, Polyvinylalkohole, und andere. Polymere auf der Basis Styrol, Acrylsäure, Methacrylsäure, sowie deren Ester lassen.sich ebenfalls aktivieren sofern sie wenigstens einige der obengenannten funktioneilen Gruppen in ihrem Gerüst besitzen. So lassen sich z.B. schwach basische Anionenaustauscher mit primären oder sekundären Aminen aktivieren. Polyvinylalkohole und auch Polyacrylamide ließen sich ebenfalls aktivieren. Bei weiteren Polymeren kann man mit Hilfe von Sekundär-Reaktionen funktioneile Gruppen einführen und diese dann aktivieren. So kann man z.B. Polymere mit Anhydridgruppen (z.B. Äthylenmaleinsäureanhydrid-Harze) mit Polyalkoholen oder Polyaminen umsetzen und diese anschließend mit Halogenpyrimidinen aktivieren.Auch anorganische Träger,wie poröse Gläser, ("Glass "beads") können mit. Verbindungen mit geeigneten funktionellen Gruppen umgesetzt werden oder sind bereits im Handel erhältlich wie z.B. Glycophase-Gr^ von Corning. Sie sind dann ebenfalls zur Aktivierung mit Halogenpyrimidinen geeignet; auch lösliche Polyhydroxyverbindungen wie Dextran, lösliche Stärke, Polyalkohole und Polyamine können mit den halogenierten Pyrimidinen aktiviert werden.

Literatur bezüglich einiger der zitierten Träger:

(S)
Sepharose ^ aus Agarose: Hjerten, Biochimica,

Biophysica Acta T9,, 393-398 (1968) Sephadex® als quervernetztes Dextran: Dissertation von Per Flodin Uppsala 1962.

Le A 17 177 - 11 -

709847/0043

Die in den Beispielen u.a. verwendeten Ionenaustauscherharze NKZ 2 und NKZ sind makroporöse Harze aus Polyvinylbenzylamin und vernetztem Divinylbenzol, wobei NKZ 2 etwa 8 % und NKZ 4 rund 6 % Divinylbenzol enthält. Andere erfindungsgemäß einsetzbare Ionenaustauscher sind beispielsweise Amberlite ^ IR 45 (mit primärer Aminogruppe) sowie Lewatite ^ ,beispielweise Lewatit® MP 600.

Bei der Herstellung der im erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsprodukte eingesetzten neuen aktivierten Träger der Formel (I) aus hydrophilen Trägern und Pyrimidinderivaten der Formel (II) geht man so vor, daß man den Träger, das halogenierte Pyrimidin und sofern der Träger nicht selbst eine Base ist, auch noch eine Base zur Bindung des freiwerdenden Halogenwasserstoffs zusammenbringt. Dies kann in organischem Medium z.B. Dioxan, Xylol, Aceton oder Gemische hiervon, oder auch organisch-wäßrigen Medien erfolgen. Die Reaktionstemperatur liegt dabei zwischen -10 und +30⁰C, vorzugsweise zwischen -2 und +6⁰C.

Die von J. Warren, J.D. Reid und C.Hamalainen, Textile Res. Journal 1952, p. 584 - 590, für Arbeiten mit Cyanurchlorid verwendeten Gemische, insbesondere das System Xylol/Dioxan, lassen sich vorteilhaft verwenden.

Bei Verwendung von tetrahalogenierten Pyrimldinen und hydroxylgruppenhaltigen Trägern reagieren je nach den Reaktionsbedingungen 1 bis 2 Halogene mit dem Träger. Man kann damit eine Vernetzung des Trägers erzielen. Was sich z.B. im Falle der Agarose (Sepharose ^)äußerst günstig auswirkt, denn diese wird dadurch kochfest.

Le A 17 177 - 12 -

7098A7/O0A3

Auch die Wahl der Halogensubstitution ist für die Reaktions freudigkeit entscheidend. So steigt die Reaktivität vom Brom über Chlor zum Fluor an. Außerdem sind die tetrahalogenierten reaktiver als die tri- oder dihalogenierten Verbindungen. Andere Substituenten am Fyrimidin wie z.B. -OR, -NHR, -SR,wobei R für Alkyl steht, erniedrigen im allgemeinen die Reaktivität, können aber auch die Reaktivität erhöhen, wie z.B. die Alkylsulfonylgruppe oder die Nitrogruppe.

Für den speziellen Fall des Trifluorchlorpyrimidins (FCP) wurde folgende Reihenfolge des Abreagierens der Halogene gefunden:

Das letzte Halogen und das Chlor nehmen unter den im folgenden geschilderten Bedingungen an der Reaktion nicht teil.

Bei der Aktivierung des Trägers kann die Reaktion auch durch die Menge des zur Neutralisation notwendigen Alkalis begrenzt werden, da bei pH-Werten unter 5 die Reaktion nicht fortschreitet. Eine mögliche Ausnahme bilden hierbei die reaktivsten Pyrimidine wie z.B. das Tetrafluorpyrimidin. Bei den übrigen läßt sich insbesondere nach dem Abreagieren eines Fluoratoms die Reaktion durch Zugabe von Säuren, z.B. Essigsäure oder Phosphorsäure bzw.

Le A 17 177 - 13 -

7Q98A7/QO43

Phosphatpuffer pH 5 unterbinden. Man kann das benötigte

(R) Alkali mit dem Träger z.B. Sepharose vorgeben und dann das Halogenpyrimidin zugeben, dabei reagieren dann bei Verwendung von Trifluorchlorpyrimidin (FCP) im Alkali-Überschuß zunächst 2 Fluoratome unter Bildung von

(R) Vernetzungen, die z.B. bewirken, daß die Sepharose gegen Siedetemperaturen stabil wird. Will man einen möglichst hoch aktivierten Träger ohne Vernetzungen, so gibt man entweder Träger und Alkali zusammen zu einem Überschuß des Halogenpyrimidins oder man gibt eine abgemessene Menge Alkali zu dem Gemisch aus Träger und Halogenpyrimidin. In der Wahl der Base ist man nicht gebunden. Neben den Hydroxiden der Alkalimetalle kommen z.B. auch tertiäre oder quarternäre Ammoniumverbindungen infrage. Die für die Aktivierung günstigsten Temperaturen hängen von der Reaktivität des Halogenpyrimidins und der Art der funktioneilen Gruppe am Träger ab. Bei FCP arbeitet man vorteilhaft bei Temperaturen um O⁰C , bei dem träger reagierenden Tetrachlorpyrimidin geht man bis Raumtemperatur, wobei natürlich auch die Reaktionszeit mit eingeht. Die Alkylierung der Hydroxylgruppen verläuft im allgemeinen etwas langsamer als diejenige primärer Aminogruppen.

Die aktivierten Träger werden am zweckmäßigsten sofort nach der Aktivierung mit dem zu bindenden Liganden (Effektor) umgesetzt. In vielen Fällen kann man jedoch den aktivierten Träger stabilisieren, so daß er nach Tagen oder sogar Monaten noch aktiv und verwendbar ist.

Le A 17 177 - 14 -

709847/0043

Bei Hydroxylgruppen-haltigen Trägern genügt eine gründliche Auswaschung bei niedrigen pH-Werten, etwa 5-6,um sie auch in» wasserfeuchten Zustand bei Temperaturen von O - 5°C

über Monate aktiv zu erhalten. So läßt sich z.B. eine mit

iR)
FCP aktivierte Sepharose nach 3 Monaten Lagerung mit Enzymen ohne Einbuße an Kopplungsfähigkeit umsetzen. Bei Trägern mit Aminogruppen ist ein rascherer Rückgang der Bindungsfähigkeit unter den obigen Bedingungen beobachtet worden. In vielen Fällen ist dann eine Trocknung im Vakuum und eine Aufbewahrung im getrockneten Zustand vorzuziehen.

Die erfindungsgemäße Umsetzung des aktivierten Trägers mit den Liganden gemäß Verfahrensvariante a)kann sowohl in rein organischen Medien als auch in wässrig gepufferten Systemen vorgenommen werden. Niedermolekulare Liganden (Effektoren) und insbesondere in Wasser sehr schwer lösliche Verbindungen werden vorzugsweise in organischen Medien wie z.B. Tetrahydrofuran, Dioxan, Toluol oder Xylol umsetzt, wobei als Base z.B. Triäthylamin in Frage kommt.

Sehr hydrophile Effektoren wie z.B. Proteine werden dagegen in wässrigen, gepufferten Systemen umgesetzt. Sehr wesentlich für diese Möglichkeit ist die erstaunlich geringe Hydrolyse-Empfindlichkeit der Halogenpyrimidin substituierten Träger. So können Enzyme in Phosphat-Borat oder Acetatpuffern im möglichen pH-Bereich 5-8, bei Temperaturen zwischen 0 und etwa 40 C mit den aktivierten Trägern umgesetzt werden. Von den funktioneilen Gruppen der Proteine sind es vor allem primäre Aminogruppen, wie

Le A 17 177 - 15 -

709847/0043

die -Aminogruppen des Lysins oder die Aminogruppen am Kettenende, -SH-Gruppen und die Imidazolgruppe des Histidine, die mit den aktivierten Trägern reagieren. (J. Shore, J. Soc. Dyers and Colourists 84, 408-412, 313-421, 545-555 (1968), S.Reinert et al Melliand Textilberichte £9_, 1313-1321 (1968)). Die Guanidinogruppen des Arginine und die OH-Gruppe des Tyrosins werden i.a. bei pH 10-14 gekuppelt.

Als bei der erfindungsgemäßen Umsetzung gemäß Verfahrensvariante a) und b) zu verwendende Liganden (Effektoren) kommen vor allem folgende Stoffe in Betracht: Effektoren für die Adsorptionschromatographie organischer Substanzen:

Hierzu ist eine Vielzahl von chemischen Agentien geeignet, aus der Vielzahl der Möglichkeiten seien die folgenden niedermolekularen Substanzen aufgeführt: Hexamethylendiamin, p-Aminobenzamidin, Äthylmercäptan^ -Aminocapronsäure, Benzylamin.

Proteine wie z.B. Albumin oder beliebige andere OH, NH₂, NHR, SH, CONH₂, CONHR-gruppenhaltige Proteine und Polypeptide vorzugsweise Enzyme wie z.B. Trypsien, Penicillinase, Subtilsn, Glucoseoxydasen, Aparaginase, Ribonuclease; Hormone wie z. B. Insulin oder Enzyminhibitoren wie beispielsweise der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor.

Weiterhin sind als Liganden auch Farbstoffe sowie Farbstoffderivate oder ggf. Kupplungsprodukte von Farbstoffderivaten geeignet.

Le A 17 177 - 16 -

709847/00A3

Zahlreiche dieser Halogenpyrimidinaktivierten Farbstoffe und ihre Verwendung sind bereits beschrieben worden (D.Hildebrand und G. Maier Textilpraxis 1971, Heft 8, S. 499 - 504 und Heft 9, S. 557-562; DOS 1 644 171). Diese Reaktivfarbstoffe lassen sich an die obengenannten Träger binden und als Effektoren zur Reinigung von Proteinen verwenden. Eine spezielle Verwendung können auf diese Weise an Träger gekuppelte Azofarbstoffe gewinnen,wenn man sie in an sich bekannter Weise mit geeigneten Reduktionsmitteln ^w^-^e Natriumdithionit zu den aromatischen Aminen reduziert, dann das noch am Träger befindliche Amin diazotiert und wiederum zur Kupplung von niedermolekularen Agenzien (z.B. ß-Naphthol) oder von bestimmten Proteinen benutzt. Proteine mit einem Gehalt an Tyrosin oder Histidin können auf diese Weise gebunden werden. Diese Verfahrensvariante zur Herstellung der Konzentrationsprodukte aus aktivierten Liganden und Träger ist eine notwendige Ergänzung des Kupplungsverfahrens für spezielle Proteine (Enzyme) gemäß Verfahrensvariante a). Das Reaktionsschema kann wie folgt verdeutlicht werden:

R -N=N-X- NH

reaktiver
Azofarbstoff

Cl F
F

Cl

R¹ - N = N - X - NH -

ζ _N

+ Agaröse

(Agaroserest)

Na₂S₂O₄-Reduktion

Le A 17 177

- 17 -

709847/0043

Cl F

X - NH -f ν

'¹K

(Agaroserest)

NaNO₂/H

N„ - X - NH

(Agaroserest)

OH

ß-Naphthol

Cl F

N=N-X-NH '

=j

Agaroserest

Besonders gut geeignet sind Reaktivfarbstoffe der allgemeinen Formel

Le A 17 177

- 18 -

709847/0041

in welcher B und E für aromatische , carbocyclische oder heterocyclische Reste und insbesondere B für den Rest einer carbocyclischen Diazokomponente der Behzol- oder Naphthalinreihe und in welcher E der Rest einer enolischen oder phenolischen Kupplungskomponente ist, z.B. ein 5-Pyrazolon, 5-Aminopyrazol, Acetessigsäurearylamid, Hydroxynaphthalin oder Aminonaphthalin; B und E können daneben noch andere Substituenten enthalten, R-J steht für eine Methylgruppe oder vorzugsweise für ein Wasserstoff atom und R₁ ' und R₂' stehen unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Halogenatome, z.B. Cl, Br oder F.

Als für die umsetzung einsetzbare reaktive Azofarbstoffe seien beispielsweise die folgenden aufgeführt!

Cl

H₂CO-/ V N=N

SO3H

OH

0 C,H_C-C-NH

D D

SO₃H

Le A 17 177

- 19 -

709847/00*3

2613451

N=N

CH

NH-/ N Cl

	SO	S	3^H	.N=N-/	CH ι ■ N	³N- "S-	F 7
HO₃			V= CH₃		Cl	Λ F

	Λ

Die vorgenannten Verbindungen und weitere einsetzbare Azofarbstoffe sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der GB-PS 1 169 254 zu finden.

Le A 17 177

- 20 -

Beispiel 1

/B)

Aktivierung von Sepharose ^ mit FCP.

25 g feuchte, perlförmige Agarose (Sepharose v^ 4 B ,Pharmacia) wurde In Wasser suspendiert und In eine Glasfllternutsche G gegossen, an deren Auslauf ein etwa 80 cm langer, nach unten hängender Schlauch eine leichte Absaugung des Wassers bewirkt. Eine an der Nutsche angebrachte Markierung gestattet, die Sepharose bis auf ein Volumen von 24 ml In die Nutsche einzufüllen. Die Sepharose wurde mit 250 ml destliiertem Wasser nachgewaschen. Die abgemessene, feuchte Sepharose wurde mit 50 ml 3M-Natronlauge versetzt und in einem Kolben 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Suspension wurde in derselben Nutsche wie oben abgesaugt und in einem silikonfeiertem Rundkolben mit Rührer oder Vibro-Mischer bei O⁰C in 40 ml eines Xylol-Dioxan-Gemisches (1:1, w/w) suspendiert. In diese Suspension läßt man eine Lösung von 2,5 ml Trifluorchlorpyrimidin (FCP, D:1,675;) in 4 ml Xylol/Dioxan-Gemisch so langsam zutropfen, daß die Temperatur nicht über + 0,5⁰C steigt. Es wurde hierfür eine Stunde benötigt. Nachdem alles FCP zugegeben worden war, wurde die Reaktion durch Zugabe von 4,2 ml konz. Essigsäure gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine Filternutsche gegossen und darin 4 mal mit je 50 ml Xylol/Dioxan-Gemisch, 4 mal mit je 50 ml Dioxan und anschließend mit 1 1 dest. Wasser ausgewaschen. Diese gewaschene, aktivierte Sepharose ist bei 4°C mindestens 3 Monate lagerfähig (siehe Beispiel 13).

Le A 17 177 . - 21 -

7098A7/00A3

2819451

Die FCP aktivierte Sepharose löst sich im, Gegensatz zur unbehandelten Sepharase beim Kochen nicht auf.

Zur Kontrolle der Aktivierung wurden Proben verschiedener Ansätze eleittentaranalytisch untersucht«

Präparat % K * Cl 1 F' «

a	4,16	5	—	2	—
b	4,43	5	-	2	-
C	4,56	6	,9t	2
d	4,72	,72	,83
e	4,58	,0O	,94

Die folgende Zusammensetzung C-Galactose-anhydrogalactase-) ,würde folgende Analyse ergebens

4,61 % K, 5,84 % Cl and 6,28 % F
BFP = Bdf luorchlorpyrimidiin-Rest

Der verminderte Gehalt an F läßt sich durch die Bildung von Quervernetzungen und eine teilweise Hydrolyse des Fluor erklären C 54 %). Der Rest von 4O t verbleibt als reaktives Fluor.

Beispiel t a

fm
Aktivierung voa Sepharose mit FCP

23 g Sepharose ^ vorbereitet und mit Alkali aach Beispiel t behandelt werden portionsweise zti einer auf Q - 3°C abge-

Le & ti 177 - 22 -

kühlten Lösung von 4 g FCP in 40 ml Xylol/Dioxan-Gemlsch (t i "I, w/w) zugegeben. Es wurde hierfür 45 MIn. benötigt. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 4_f2 ml konz. Essigsäure gestoppt und wie in Beispiel \ beschrieben weiter aufgearbeitet.

Elementaranalyses A) 5,69 % Vt 5,05 % F? 6,42 % Cl_v

Die folgende Zusammensetzung
{-Galactose-Anhydrogalactose} « CDFPl« würde folgende Analyse ergeben:

5,03 % K? 6,83 % F? 6,38 % Cl

Der etwas verminderte Gehalt an Fluor läßt sich durch die Bildung von Quervernetzungen und eine teilweise Hydroyse des Fluor erklären (24 %.). Der Rest von 76 % verbleibt als reaktives Flour.

Beispiel 2 Hexamethylendiamin an Sepharose *5/- FCP

2 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte mit FCP aktivierte Sepharose v-' 4 B wurde auf der Glasfritte mit Wasser gewaschen und in eine Lösung von 4OO mg Hexamethylendiamin (HMDA) in 2O ml Wasser eingetragen und gut durchgemischt« Die Suspension wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur rotiert Anschließend wurde die Sepharose mit 2OO ml Wasser, 1OO ml Q,1N-Natronlauge_r 25O ml Wasser und 1OO ml Methanol auf der Glasfritte gewaschen, abgesaugt und der Rückstand im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet»

Le A ί? 177 - 23 -

Analyse: 5,91, 6,95, 7,59 % N Dies entspricht folgender Zusammensetzung: (-Galactose-anhydrogalactose-)₃(CP)₂(HMDA)^₂ CP = Monochlörpyrimidinrest

Beispiel 3 Anilin an Sepharose ^ - fCP

2 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP- aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde auf der Glasfritte mit Wasser gewaschen und in eine Lösung von 50 mg Anilin in einem 1:1 Gemisch aus Dioxan und MC. Ilvain Puffer pH 7 gegeben. Die Kupplung und weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 2 angegeben. Die Analyse ergab folgenden Stickstoffgehalt: 5,72%,5,98%, 5,42 %

damit ergibt sich folgende Zusammensetzung: (-Galactose-anhydrogalactose-)^(CP) ο(Anilin^,

Beispiel 4

(R)

p-Aminobenzamidin - Sepharose 4 B

2,15 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, nit FCP aktivierte Sepharose 4 B wurde mit einer Lösung von 102 mg p-Aminobenzamidin-Hcl in 3 ml 0,1 M-Boratpuffer pH 7,0 und 0,5 ml lN-Natronlauge versetzt. Die Suspension wurde im Rundkolben bei Raumtemperatur 20 Stunden rotiert. Das Kupplungsprodukt wurde abfiltriert und mit 200 ml 0,1 M-Boratpuffer pH 7 gewaschen. Aus der spektralphotometrischen Bestimmung des p-Aminobenzamidins in den

Le A 17 177 - 24 -

709847/OCU3

Filtraten und Waschlösungen und der eingesetzten Menge ließ sich ein Substitutionsgrad von 86#u Mol Benzamidin pro g feuchte Sepharose errechnen.

Beispiel 5

"(R)
Äthylmercaptan - Sepharose ' 4 B

2 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP-aktivierte

(R)
Sepharose ' 4 B wurde mit 0,1 M-Boratpuffer pH 9,2 und 7 ml Äthanol und 1 ml Äthylmercaptan versetzt. Die Suspension wurde eine Nacht bei Raumtemperatur rotiert. Das Kupplungsprodukt wurde mit 200 ml Äthanol, 500 ml Wasser und 230 ml Äthanol/Wasser (1:1, v/v) in einer Säule gewaschen. Die Elementaranalyse ergäbe einen Gehalt von 2,77 % Schwefel. Zum Vergleich ergab eine nicht aktivierte aber

(R)

sonst gleich behandelte Sepharose 4 B einen Schwefelgehalt von weniger als 0,2 %.

Beispiel 6 Albumin - Sepharose^4 B

3 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP-aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde mit 0,1 M-Boratpuffer pH 9,2 kurz gewaschen und in einem Rundkolben mit einer Lösung von 400 mg Rinderserumalbumin in 4 ml 0,1 M-Boratpuffer pH 9,2 22 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abgesaut, mit obigem Puffer gewaschen, dann in 1M Äthanolaminlösung pH 9,1 suspendiert, nach 3 Stunden wieder abfiltriert und mit Puffer gewaschen. Sämtliche Filtrate und Waschlösungen wurden

Le A 17 177 - 25 -

709847/0043

vereinigt und in diesem der Proteingehalt bestimmt. Es wurden 280 mg gefunden. Danach waren an die Sepharose 120 mg Albumin gebunden worden.

Beispiel 7

8O0 mg Rinderserumalbumin wurden nach Beispiel 6 an 3 g fuechte, FCP-aktivierte Sepharose 4 B gebunden. Der Proteingehalt der Filtrate und Waschlösungen betrug 669 mg. Danach waren an die Sepharose 131 mg Albumin gebunden worden.

Beispiel 8

(R)
Insulin - Sepharose 4 B

3 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP-aktivierte Sepharose ' 4 B wurde mit o,1 M-Boratpuffer pH 9/2 kurz gewaschen und in einem Rundkolben mit einer Lösung von 8P mg Insulin (Rind) in 4,5 ml 0,1 M-Boratpuffer pH 9,2 versetzt und 22 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Kupplungsprodukt wurde mit obigem Boratpuffer gewaschen und zum vollständigen Abreagieren des aktiven Halogens 17 Stunden bei Raumtemperatur in 1 M-Äthanolamin pH 9,2 rotierten gelassen. Nach nochmaligem Waschen mit Wasser und Absaugen ergab sich aus der Aminosäure-analyse ein Substitutionsgrad von 8,54 mg Insulin pro g feuchte Sepharose. Das Präparat zeigt im Fettzell-Test eine Antilipolyse-Wirkung von 85 % der theoretischen Aktivität.

Le A 17 177 - 26 -

709847/0043

Der Verlust von gebundenem Insulin, bestimmt durch Radioimmunoaxxay, betrug nach 2,5 Stunden in Krebs, Ringer, Albuminlösung pH 7,4 bei 37°C 0,3°/oo.

Beispiel 9 Kalllkrein-Trypsin-Inhibitor Kallikrein-Trypsin-Inhibitor - Sepharose ^ 4 B

2,5 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte FCP-aktivierte Sepharose ^wurde in 30 ml 0,1 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und mit 25 mg Kallikrein-Trypsin-Inhibitor aus Rinderlunge (91 U) versetzt. Der Ansatz wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Sepharose -gebundene Inhibitor wurde mit schwachem Unterdruck abgesaugt und mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid gewaschen. Es wurden 2,48 g feuchte Sepharose ^R mit Inhibitor erhalten.

Hemmkapazität bestimmt durch die Inhibierung von Trypsin mit Benzoylarginin-p-nitroanilid (BAPNA) bei 25°C. Filtrat und Waschwasser 27 U

Inhibitor an Sepharose 13 U

d. s. 14 % der eingesetzten Hemmkapazität des Inhibitors.

Beispiel 10 Trypsin-Sepharose^ 4 B

2 g nach Beispiel 1 hergestellte FCP-aktivierte Sepharose

Le A 17 177 - 27 -

709847/0043

wurde bei 4°C in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und rait 20 mg Trypsin 18,6 U; 0,93 U/mg (Test mit Benzoylarginin-p-nitroanilid = BAPNA) versetzt. Es wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt und anschließend mit 100 ml des obigen Phosphatpuffers gewaschen, der noch 0,5 M-Natriumchlorid enthielt und nochmals mit 100 ml Phosphatpuffer, ohne Natriumchlorid. Das Harz wurde auf einer Glasfritte G 2 mit ganz schwachem Vakuum abgesaugt. Es wurden 1,59 g feuchtes Trypsin-Sepharose ^ erhalten.

Enzymatische Aktivität (BAPNA; 25°C)

im Filtrat und in den Waschpuffern <0,5 U

im Enzymharz 6,19 U (3,9 ü/g Feuchtgewicht)

d.s. 33 % der eingesetzten Aktivität.

Beispiel 11

Penicillinase-Sepharose ^(R) 4 B - FCP

2 g nach Beispiel 1 hergestellte FCP-aktivierte Sepharose wurde bei Raumtemperatur in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und eine Lösung von 2,5 mg Penicillinase aus B. cereus mit einer Aktivität von 250 ü (Benzylpenicillin als Substrat) zugegeben. Der Ansatz wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Enzymharz wurde bei leichtem Vakuum auf einer Glasfritte G 2 abgesaugt und anschließend mit 100 ml des obigen Phosphatpuffers, der noch 0,5 M-Natriumchlorid enthält, gewaschen. Nach einer weiteren Waschung mit 100 ml Phosphatpuffer, jedoch ohne Natriumchlorid, wurde wiederum abgesaugt.

Le A 17 177 - 28 -

709847/0043

Ausbeute an Enzymharz 1,50 g

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin; 25°C) Filtrat und Waschwasser 28 U

Enzymharz 218 U (145 U/g Feuchtgewicht)

d. s. 87 % der eingesetzten Aktivität oder 98 % der Aktivität des gebundenen Enzyms.

Ergänzung zu Beispiel 11

Zur Prüfung der Stabilität der Bindung sowie der Enzymaktivität wurde das Enzymharz in einer Säule mit 0,1 M-Phosphatpuffer pH 7,0, der 50 mg Thimerosal pro 1 enthielt, mit einer Geschwindigkeit von 17 ml/h bei Raumtemperatur durchströmt. Nach 68 und 116 Stunden wurden Proben entnommen und auf ihre enzymatische Aktivität geprüft. Nach 68 Stunden wurden 79 %, nach 116 Stunden noch 66 % der Ausgangsaktivität gefunden. In den Eluaten war keine Aktivität nachweisbar.

Beispiel 12 Penicillinase-Sepharose ^ 4 B - FCP

3 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte, FCP-aktive Sepharose^S/ 4 mi Boratpuffer pH 8,4 nach Paiitzsch und 18,7 mg Penicillinase mit einer Aktivität von 1650 U wurden 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Enzymharz wurde leicht abgesaugt und 3mal mit je 10 ml des obigen Puffers nachgewaschen. Zur Inaktivierung eventuell nach vorhandener FCP-aktivierter Sepharose wurde das Harz mit 10 ml auf pH 8,4 eingestellter 1 M-Äthanolaminlösung 5 Stunden bei Raumtemperatur rotieren gelassen. Das Harz wurde darauf in eine

Le A 17 177 - 29 -

709847/0043

kleine Säule überführt und mit 260 ml 1 M-Natriumchloridlösung mit 370 ml einer 0,05 %igen Natriumazidlösung nachgewaschen. Nach leichtem Absaugen überschüssiger Waschlösung wurden 4,25 g Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C)
Enzymharz 907 U (213 U/g Feuchtgewicht)

d. s. 55 % der eingesetzten Aktivität.

Beispiel 13

Penicillinase-Sepharose ^ 4 B - FCP
(Lagerungsfähigkeit aktivierter Sepharose)

Feuchte nach Beispiel 1 hergestellte FCP-aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde nach dem Auswaschen bei 4 C 3 Monate gelagert. Nach dieser Zeit wurde eine Probe von 1 g entnommen
und wie in Beispiel 11 beschrieben mit 110 U Penicillinase in Puffer bei pH 7 umgesetzt und gewaschen. Es wurden 1,71 g feuchtes Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C)
Filtrat und Waschwasser 1,8 U

Enzymharz 101 U (59 U/g Feuchtgewicht)

d. s. 92 % der eingesetzten Aktivität.

Beispiel 14 Subtilisin-Sepharose 4 B - FCP

1 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte, FCP-aktivierte
Sepharose 4 B wurde in 20 ml Phosphatpuffer· pH 8,0 suspen-

LeA 17 177 - 30 -

diert, mit 10 mg Substilisin (1980 U) versetzt und 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 11 für Penicillinase beschrieben. Es wurden 0,91 g Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Acetyltyrosinäthylester, 25°C) Filtrat und Waschwasser 1611 ü

Enzymharz 272 U (299 U/g Feuchtgewicht)

d. s. 14,1 % der eingesetzten Enzymaktivität oder 74 % der Aktivität des gebundenen Enzyms.

Beispiel 15 Glucoseoxydase Sepharose vJ FCP

1 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP-aktivierte Sepharose^5) 4 β wurde in 20 ml 0,1 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert, 10 mg Glucoseoxydase (1730 U) zugegeben und 18 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Enzymharz wurde abgesaugt und wie üblich mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid gewaschen. Ausbeute 0,89 g Enzymharz. Enzymatische Aktivität (Test mit Glucose und Peroxydase, bei 25°C) Filtrat und Waschwasser 1290 U Enzymharz 36 U

(32 ^ü/g Feuchtgewicht)

d. s. 2,1 % der eingesetzten Enzymaktivität oder 8,2 % des gebundenen Enzyms.

Le A 17 177 - 31 -

709847/0043

Beispiel ι ο Asparaginase - Sepharose^4 B

3 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde in einem Rundkolben zu einer Lösung von 98,5 mg Asparaginase (19 400 U) in Boratpuffer nach Palitzsch pH 8,4 gegeben und bei Raumtemperatur 17 Stunden rotiert. Nach der Kupplung wurde die Sepharose ^ in einer Glasfritte G 2 abfiltriert und 3 mal mit obigem Boratpuffer gewaschen. Anschließend wurde das Enzymharz in 1 M-Äthanolamin-HCL pH 8,4 5 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und in einer Säule mit 260 ml 1 M-Natriumchloridlösung und· 370 ml einer 0,05 %igen Natriumchloridlösung gewaschen. Nach dem Abfiltrierten wurden 5,21 g feuchtes Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (L-Asparagin 37°C) des Enzymharzes

850 U (163 ^ü/g Feuchtgewicht)

d. s. 4,4 % der eingesetzten Enzymaktivität.

Beispiel 17

Aktivierung von Sepharose ^ mit FCP

"Äquivalentverfahren"

24 g feuchte und wie in Beispiel 1 vorbereitete Sepharose ^/ 4 B wurde in 20 ml Xylol und 20 ml Dioxan suspendiert und dabei auf O⁰C abgekühlt. Man gibt 10,9 ml 3-N-Natronlauge (32,6 m Mol) zu und anschließend im Laufe von 1 Stunde eine Lösung von 2,99 ml (5,0 g) FCP (29, 7m Mol) zu. Man rührt noch

Le A 17 177 - 32 -

7Ö9847/D043

1 Stunde und arbeitet dann wie in Beispiel 1 beschrieben auf.

Elementaranalyse 2,8 % N

Beispiel 18

Penicilllnase - Sepharose ^ - FCP

1,17g feuchte nach Beispiel 17 mit FCP aktivierte Sepharose *£/ 4 B wurde in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und hierzu eine Lösung von 2,5 mg Penicillinase (aus B. cereus, 250 U) in 1 ml obigen Phosphatpuffers gegeben. Der Ansatz wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wie in· Beispiel 3 beschrieben aufgearbeitet. Es wurden 1,63 g feuchts Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschlösungen 118 U
Enzymharz 130 U

80 /g Feuchtgewicht

d. s. 52 % der eingesetzten Aktivität oder 98 % des gebundenen Enzyms.

Beispiel 19

Aktivierung von Sepharose ™ mit TFP

Perlförmige Agarose (Sepharose^4 B der Pharmacia) wurden analog Beispiel 1 vorbereitet und mit 3 M-Natronlauge behandelt. Die bis zum ursprünglichen Volumen von 24 ml abgesaugte alkalische Sepharose wurde mit einer Injektions-

Le A 17 177 - 33 -

709847/0043

spritze in etwa 12 Minuten in einer auf -3° bis O⁰C abgekühlte Lösung von 5,13 g TFP (Tetrafluorpyrimidin) in 40 ml Xylol/Dioxan (1:1, w/w) eingetragen. Der Ansats wurde insgesamt 30 Minuten gerührt und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 4,5 ml konz. Essigsäure abgebrochen. Die aktivierte Sepharose wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gewaschen und abgesaugt.

Die TFP-aktivierte Sepharose ist wie die FCP-aktivierte Sepharose so stark quervermetzt, so daß sie sich im Gegensatz zum Ausgangsmaterial beim Kochen nicht auflöst.

Elementaranalyse 7,29 % N

13.19 % F

Beispiel 19 a

Hexamethylendiamin an Sepharose TFP

2 g feuchte, nach Beispiel 19 mit TFP aktivierte Sepharose wurde im Rundkolben mit 5 ml 0,7 M-Hexamethylendiamin 20 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Produkt wurde abgesaugt, mit 250 ml Wasser, 100 ml 0,1 N-Natronlauge, 100 ml Wasser gewaschen und in einer Säule mit weiteren 500 ml Wasser eluiert. Das Produkt wurde abgesaugt. Mit Nitrin erhält man eine starke Färbung. Zur Elementaranalyse wurde das Produkt mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Analyse 6,24 %F
11,65 % N

Le A 17 177 - 34 -

709847/0043

Beispiel 19 b

Äthylmercaptan an Sepharose TFP

2 g feuchte nach Beispiel 19 mit TFP aktivierte Sepharose wurde mit Tetrahydrofaran gewaschen und in 3 ml Tetrahydrofaran, 1 ml Triäthylamin, 1-ml Äthylmercaptan gegeben. Der Ansatz wurde im Rundkolben 17 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abgesaugt, mit 100 ml Äthanol, 1OO ml Äthanol/Wasser (1:1) gewaschen und schließlich in einer Säule mit 300 ml Äthanol eluiert. Das Produkt wurde abgesaugt und im Vakuum getrocknet.

Lassaigne Test stark positiv
ElernentaranaIyse 6,51 % S

8,74 % F

Beispiel 19 c

Peniclllinase an Sepharose TFP

1 g feuchte nach Beispiel 19 mit TFP (Tetrafluorpyrimidin) aktivierte Sepharose 4 B wurde in 20 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und eine Lösung von 0,5 ml Penicillinase (110 U) zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden geschüttelt, dann abgesaugt und mit ogibem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid ausgewaschen. Nach dem Absaugen wurden 1,47 g feuchtes Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschlösungen 15 ü
Enzymharz 79 U

Le A 17 177 - 35 -

709847/00*3

(54 ^ü/g Feuchtgewicht)
d. s. 72 % der eingesetzten Enzymaktivität 85 % der Aktivität des gebundenen Enzyms

Beispiel 20

Aktivierung von Sepharose ^ mit TCP _%

Perlförmige Agarose (Sepharose ©4 B der Pharmacia) wurde analog Beispiel 1 vorbereitet und mit 3 M-Natronlauge behandelt. Die bis zum ursprünglichen Volumen von 24 ml abgesaugte, alkalische Sepharose wurde portionsweise in 12 Minuten bei Raumtemperatur in eine Mischung von 4,90 g Tetrachlorpyrimidin (TCP) in 40 ml Xylol/Dioxan (1:1 w/w) gegeben. Die Temperatur stieg hierbei bis auf 32°C. Der Kolben wurde durch einen Luftstrom gekühlt. Der Ansatz wurde noch 15 Minuten gerührt. Durch Zugabe von 4,2 ml konz. Essigsäure wurde die Reaktion gestoppt. Die aktivierte Sepharose^ wurde abgesaugt und 4 mal mit je 50 ml Dioxan/ Xylol-Gemisch, 4 mal mit je 50 ml Dioxan und 1 1 Hasser ausgewaschen und in feuchter Form aufbewahrt. Eine Probe wurde mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Sie ergab folgende Analyse: 5,71 % Cl

2,23 % N

Beispiel 21

Hexamethylendiamin - Sepharose TCP

1,3 g feuchte, nach Beispiel 20 hergestellte, mit TCP akti vierte Sepharose ^ wurde im Rundkolben mit 10 ml einer wäßrigen Lösung von 0,35 M-Hexamethylendiamin versetzt und

Le A 17 177 - 36 -

709847/0043

60 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Produkt wurde abgesaugt und in einer Säule mit 250 ml Wasser, 100 ml 1 M-Natronlauge und 250 ml Wasser ausgewaschen. Die substitu-

Cr) ierte Sepharose^wwurde abgesaugt, mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Analyse: 4,67 % Cl

3,27 % N Ninhydrin Test positiv.

Beispiel 22 Äthylenmercaptan - Sepharose TCP

1,3 g feuchte, nach Beispiel 20 hergestellte, mit TCP aktivierte Sepharose ^ wurde mit Tetrahydrofuran gewaschen, abgesaugt und in 3 ml Tetrahydrofuran, 0,5 ml Triäthylamin und 0,5 ml Äthylmercaptan gegeben. Der Ansatz wurde im Rundkolben 60 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abqesaugt, in einer Säule mit Äthanol gewaschen, abgesaugt und im Vakuum getrocknet.

Lassaigne Test positiv Analyse 4,82 % Cl 1,04 % S

Beispiel 23

Penicillinase - Sepharose 4 B - TCP

1 g feuchte nach Beispiel 20 hergestellte TCP (Tetrachlorpyrimidin) aktivierte Sepharose^4 B wurde in 20 ml 0,05

Le A 17 177 - 37 -

709847/0043

M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und eine Lösung von 1 ml Penicillinase (110 U) zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt und weiter wie in Beispiel 19 c beschrieben aufgearbeitet. Es wurden 1,36 g feuchtes Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschwasser 9 ü

Enzymharz 84 U (61 ü/g Feuchtgewicht)

d. s. 76 % der eingesetzten Enzymaktivität, 83 % der Aktivität des gebundenen Enzyms.

Beispiel 24

Aktivierung von Sephadex ^ mit FCP

Perlförmiges, vernetztes Dextran (Sephadex^G 50 der Pharmacia) wurde wie in Beispiel 1 für Sepharose beschrieben mit FCP aktiviert und aufgearbeitet. Die Elementaranalyse ergab einen Gehalt von 0,38 % N, 0,20 % F und 0,50 % Cl.

Beispiel 25

Hexamethylendiamin an Sephadex ^- FCP

2 g feuchtes, nach Beispiel 24 hergestelltes, FCP-aktiviertes Sephadex ^ wurde analog zu Beispiel 2 mit 200 mg Hexa methylendiamin umgesetzt und aufgearbeitet.

Elementaranalyse: N 0,71 %

F 0,10 %
Cl 0,59 %

Le A 17 177 ' - 38 -

7Q9847/OOA3

Beispiel 26 Äthylmercaptan an Sephadex - FCP

2 g feuchts nach Beispiel 24 hergestelltes, FCP-aktiviertes Sephadex wurde analog zu Beispiel 5 mit einer Lösung von 7 ml Äthanol und 1 m-Äthylmercaptan umgesetzt und aufgearbeitet. Die Elementaranalyse ergab einen Gehalt von 0,29 % Schwefel.

Beispiel 27 Penicillinase-Sephadex ^ G 50

O,20 g nach Beispiel 24 hergestelltes, getrocknetes, FCP-aktiviertes Sephadex ^G 5O wurde 1 Stunde bei 4° C mit 2 ml Wasser zur Quellung gebracht. Das gequollene Sephadex wwurde in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und mit 1 ml einer Lösung von Penicillinase mit einer Aktivität von 220 ü versetzt. Die Suspension wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Absaugen wurde das Harz mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid ausgewaschen. Es wurden 1,57 g (feucht) Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschwasser ^0,1 U

Enzymharz 79 U (62 U/g Feuchtgewicht)

d. s. 44 % der eingesetzten Aktivität.

Le A 17 177 - 39 -

709847/0041

Beispiel 28 Aktivierung von Zellulose mit FCP

4 g Zellulose (Whatman CF 11) wurde im Rundkolben mit 50 ml 3 M-Natronlauge versetzt und bei Raumtemperatur 18 Stunden rotiert. Die Zellulose wurde auf einer Glasfritte G 3 abgesaugt. Die Gesamtmenge wurde langsam zu einer auf 0 bis + 5°C gekühlten, mit einem Vibromixer gerührten Mischung aus Xylol und Dioxan (1:1, w/w) gegeben, die 7,19 g FCP enthält. Man läßt insgesamt 20 Minuten reagieren, und stoppt dann die Reaktion durch Zugabe von 5 ml konz. Essigsäure. Die aktivierte ZeI- · lulose wurde abgesaugt und 4 mal mit je 50 ml Xylol/ Dioxan (1:1), 4 mal je 50 ml Dioxan und 500 ml Wasser und Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum wurde folgende Elementaranalyse erhalten: N: 2,43 %, F: 2,43 %, Cl: 2,42 %

Beispiel 29

Hexamethvlendiamin an Zellulose.

1 g feuchte nach Beispiel 28 hergestellte, mit PCP aktivierte Zellulose wurde mit 5 ml 0,35 M-Hexamethylendiamin in Wasser versetzt. Der Rundkolben wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Produkt wurde abgesaugt und mit 250 ml Wasser, 100 ml ί N-Natronlauge, 250 ml Wasser und 100 ml Aceton gewaschen. Die Zellulose wurde im Vakuum getrocknet. Die Elementaranalyse ergab 3,99 %N, 0,36 % F, 2,51 % Cl

Le A 17 177 - 40 -

709847/0043

Beispiel 30 Äthylmercaptan an Zellulose

0,5 g feuchte, nach Beispiel 28 mit FCP-aktivierte Zellulose wurden mit 1 ml Tetrahydrofuran, 0,5 ml Äthylmercaptan und 3 Tropfen Triäthylamin 21 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Produkt wurde abgesaugt, mit 250 ml Äthanol, 50 ml Wasser, 50 ml Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Elementaranalyse: 0,90 % F

2,35 % S

Beispiel 31 Trypsin - Zellulose - FCP

150 g feuchte nach Beispiel 28 hergestellte, FCP aktivierte Zellulose (Whatmann cF-11) wurde bei 4°C mit einer Lösung von 50 mg Trypsin (54, 5 U) in 0,01 M-Benzamidin-HCl, Phosphatpuffer nach Sörensen pH 6,0 susoendiert und 24 Stunden bei 4°C in einem rotierenden Kolben durchmischt. Nach der Kupplung wurde die Zellulose abgesaugt und mit 50 ml der obigen Phosphat-Benzamidinlösung pH 6 gewaschen. Nach erneutem Absaugen wurde die Enzym-Zellulose in 5 ml 1 M-Äthanolamin-HCl 0,01 M-Benzamidin-HCl pH 6 36 Stunden rotiert. Erneutes Absaugen und Waschen mit 0,005 M-Benzamidin-Hd pH 5,5. Es wurden 1,90 g feuchtes Trypsin-Zellulose erhalten. Enzymatische Aktivität (BAPNA, 25°C) Filtrat und Waschlösung 26,4 U

Trypsin-Zellulose 2,9 U (1,53 U/g Feuchtgewicht) d.s. 5,3 % der eingesetzten Enzymaktivität

Le A 17 177 - 41 -

709847/0043

Penicillinase-Zellulose

0,40 g nach Beispiel 28 hergestellte, getrocknete, FCP-aktivierte Zellulose wurden 1 Stunde bei 4°C mit 2 ml Wasser stehen gelassen. Die gequollene Zellulose wurde in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und mit 1 ml einer Lösung von Penicillinase mit einer Aktivität von 220 ü versetzt. Die Suspension wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Absaugen wurde die Zellulose mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid gewaschen. Es wurden 0,76 g Feuchtgewicht Zellulosegebundenes Enzym erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Enzym; Zellulose-gebunden 95 ü (125 ü/g Feuchtgewicht) d. s. 43 % der eingesetzten Aktivität.

Beispiel 33 Aktivierung von Polyacrylamid mit FCP

1 g perlförmiges Polyacrylamid (Bio-Gel ^R P - 300, 100 200 mesh wet von Bio Rad) wurde 5,5 Stunden in Wasser gequollen, abfiltriert, im Rundkolben mit 80 ml 1 N-Natronlauge versetzt und bei Raumtemperatur 15 Minuten rotiert. Das Harz wurde abgesaugt und portionsweise zu einer Lösung von 4,72 g FCP in 40 ml einer Mischung von Xylol und Dioxan (1:1, w/w) zugefügt. Die Suspension wurde durch einen Vibromischer gerührt und von außen durch einen Luftstrom gekühlt. Das Gel wurde innerhalb von 10 Minuten eingetragen. Die Temperatur stieg hierbei von 23,5 auf 29°C. Nach weiteren 15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 3 ml konz. Essigsäure abgebrochen. Das Harz wurde 4 ml mit je 50 ml

Le A 17 177 - 42 -

709847/0043

Xylol/Dioxan-Gemisch, dann mit 250 ml Dioxan/Wasser (1:1) gewaschen. Eine dicke Suspension des Harzes in Dioxan/Wasser wurde unter gutem Rühren in Tetrahydrofaran gegossen, abfiltriert und mit Tetrahydrofuran gewaschen. Das Produkt kann im Vakuum getrocknet werden.

Beispiel 34 Äthylmercaptan an Polyacrylamid - FCP

2,5 g des Tetrahydrofuran-feuchten, nach Beispiel 33 mit FCP aktivierten Polyacrylamid wurden mit 3 ml Tetrahydrofuran, 1 ml Äthylmercaptan und 1 ml Triäthylamin versetzt und 14 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abgesaugt, mit Äthanol gewaschen und in einer Säule weiter mit 250 ml Äthanol extrahiert. Das gewaschene Produkt wurde abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Lassaigne Test positiv
Elementaranalyse: 0,44 % Schwefel

Beispiel 35 Penicilllnase an Polyacrylamid - FCP

100 mg trockenes nach Beispiel 33 mit FCP aktiviertes Polyacrylamid wurde in 20 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und 0,5 ml einer Lösung von Penicillinase (110 ü) zugegeben. Die Suspension wurde über Nach bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Enzymharz wurde abgesaugt und mit obigem Phospahtpuffer mit und ohne Zusatz von 0,-5 M-Natriumchlorid gewaschen. Es wurden 2,59 feuchtes Enzymharz erhalten. Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschlösungen 85 U
Enzymharz 22,4 U

(8,6 ü/g Feuchtgewicht)

Le A 17 177 - 43 -

709847/00 4 3

d.s. 20 % der eingesetzten Enzymaktivität oder 90 % des gebundenen Enzyms.

Beispiel 36 Aktivierung von Ionenaustauschern mit FCP

20 g mit Methanol und Wasser gewaschener schwach basischer, makroporöser Ionenaustauscher auf Basis Polytyrol mit primären Aminogruppen (NKZ-4) wurde in 150 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 6 suspendiert und das pH mit etwas 1 N-Salzsäure auf 6 eingestellt. Unter Rühren bei Raumtemperatur läßt man in

1 Stunde eine Lösung von 2 ml FCP in 20 ml Dioxan zutropfen. Der pH-Wert wurde hierbei durch Zugabe von 0,1 N-Natronlauge auf pH 6 konstant gehalten. Anschließend wurde das Harz noch 30 Min. gerührt, dann abgesaugt und mit einer Lösung von 0,1 M-Essigsäure, 0,5 M-Natriumchlorid und Wasser gewaschen. Ausbeute 2,2 g Harz. Das FCP-aktivierte Harz wird am besten gleich anschließend zur Kupplung verwendet. Bei der Lagerung im fuechten Zustand bei 4 C nimmt die Fähigkeit zur Enzymkupplung um etwa 10 % pro Tag ab.

Beispiel 37 Penicillinase am NKZ-4-FCP

2 g feuchte nach Beispiel 36 hergestellten, mit FCP aktiviertes Polystyrolharz (NKZ 4-FCP) wurde in 40 ml 0,05 M-Phosphatpuf fer pH 7,0 suspendiert und mit einer Lösung von 5 mg Penicillinase (44O U) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 28 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und wie in Beispiel 35 beschrieben aufgearbeitet. Es wurde 2,33 g Enzyharz erhalten.
Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Enzymharz 180 U

(77 ü/g Feuchtgewicht)

d.s. 41 % der eingesetzten Enzymaktivität. Le A 17 177 - 44 -

709847/0043

Beispiel 38

Aktivierung von Ionenaustauschern mit FCP- ■ .

Aminomethyliertes Polystyrolharz (NKZ-2) wurde 2 Tage bei 40⁰C und anschließend 2 Tage im Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet. 10 g trockenes Harz wurden bei 0-5 C zu einer Lösung von 10 g FCP in 50 ml Toluol gegeben. Das Harz wurde mit einem Vibromischer suspendiert und 5,55 ml Triäthylamin zugetropft. Nach insgesamt 1 Stunde wurde die Reaktion durch Zugabe von 3 ml konz. Essigsäure abgebrochen. Das Harz wurde abfiltriert, 5 mal mit je 50 ml Toluol, 5 mal mit je 50 ml Diäthylather gewaschen, abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Das trockene Harz wurde im Kühlschrank gelagert.

Beispiel 39 Äthylmercaptan an aminomethyliertes Polystyrol - FCP

2 g trockenes nach Beispiel 38 mit FCP aktiviertes aminomethyliertes Polystyrolharz (NKZ-2) wurde mit 3 ml Tetrahydrofuran, 1,5 ml Äthylmercaptan, und 1,6 ml Triäthylamin versetzt und 28 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abgesaugt und mit Äthanol und Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Elementaranalyse: 0,44 % Schwefel.

Beispiel 40

Penicillinase an NK Z-2-FCP

3 g nach Beispiel 38 hergestelltes, mit FCP aktiviertes, ge trocknetes Polystyrolharz (NKZ-2-FCP) wurde in 25 ml Phosphatpuffer pH 7,0 nach Sörensen suspendiert und eine Lösung von 10 mg Penicillinase (880 U) zugegeben. Das Reaktionsge-

Le A 17 177 - 45 -

709847/O0A3

misch wurde 28 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Harz wurde abgesaugt, mit obigem Puffer gewaschen und zur vollständigen Entfernung des reaktiven Halogens noch 1 Stunde in 25 ml einer 1 M-Äthanolaminlösung pH 8,0 bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Harz wurde abgesaugt und wie üblich mit Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid ausgewaschen. Es wurde 6,4 g Enzymharn erhalten. Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrate und Waschlösungen 13 U

Enzymharz 163 ü (25,5 ü/g Feuchtgewicht)

d.s. 18,5 % der eingesetzten Enzymaktivität.

Beispiel 41 Aktivierung von p-Aminobenzamidln mit FCP

1 g p-Aminoberizamidin 2 HCl (4,8 m Mol) wurden in 12,5 ml Wasser und 9 ml Dioxan gelöst. In einer auf 0,5 C gekühlten Vorlage am pH-Staten wurde durch Zugabe 1 N-Natronlauge pH 7,0 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 0,81 g FCP (4,81 m Mol) in 1 ml Dioxan getropft under der pH Wert durch Zugabe von Natronlauge konstant gehalten. Nachdem insgesamt

2 Äquivalente Natronlauge (9,62 ml 1 N-NaOH) verbraucht worden waren, wurde das Gemisch in eine gesättigte Natriumchloridlösung eingegossen. Es bildete sich ein Niederschlag der abzentrifugiert und weiter verarbeitet wurde.

Beispiel 42 Bindung des aktivierten p-Amino-benzamidin an Agarose

20 g feuchte, perlförmige Agarose (Sepharose '4 B) wurden in 30 ml Wasser suspendiert und hierzu 0,75 g feuchtes mit FCP nach Beispiel 41 aktiviertes p-Amino-benzamidin zugegeben. Der gerührte Ansatz wurde bei Raumtemperatur mit dem pH-Staten durch Zugabe von 0,1 N-Natronlauge auf pH 10 eingestellt

Le A 17 177 - 46 -

709847/0043

und 13 Stunden bei diesem pH-Wert gehalten. Die Suspension wurde in eine Säule gefüllt, und mit 0,1 M-Trispuffer pH 8 gewaschen.

Dieses Harz wurde zur Affinitätschromatographie von Trypsin verwendet. Trypsin gelöst in diesem Puffer wird von dem Harz absorbiert, Cytochrom c z.B. jedoch nicht. Das absorbierte Trypsin kann gewaschen und in sehr reiner Form mit 0,1 M-Glycin-Salzsäure-Puffer pH 2 wieder eluiert werden.

Zur Elementaranalyse wurde das Harz gründlich mit Wasser und Alkohol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurden folgende Werte gefunden: 5,69 % N, 0,89 % F, 4,12 % Cl.

Beispiel 43 Kupplung von FCP aktivierten Farbstoffen an Agarose

(R) 25 g perlförmige, feuchte Agarose (Sepharose 4 B) wurden in einer Lösung von 0,1 g Azofarbstoff in 11 ml Wasser suspendiert. Der Farbstoff hat folgende Konstitution:

ff Vco—ρ

N-N

Die Suspension wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde eine Lösung von 5 g Natriumchlorid in 15 ml Wasser zugegeben. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 M-Natronlauge mit dem pH-Staten auf 11,0 gebracht und 24 Stunden bei diesem pH-Wert gerührt. Die Sepharose^Vi wurde

(R)

abfiltriert, mit Wasser und Levapon -TH-Lösung gründlich gewaschen. Die intensiv gefärbte Sepharose* ' wurde bei 4°C in 0,05 % Natriumazidlösung aufbewahrt. Der spectrophoto-

Le A 17 177 - 47 -

709847/0043

metrisch bestimmte Substitationsgrad betrug 12 %.

Zur Prüfung der Stabilität der Anfärbung wurde 2 g Portionen des feuchten Harzes in kleine Säulen gefüllt, mit Puffern verschiedener pH-Werte gewaschen und unter diesen Puffern 66 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Darauf wurden 3 ml Eluate gesammelt und spektrophotometrisch gemessen. Die folgende Tabelle zeigt das Ergebnis:

Belastung % Transmission

Mc Ilvain-Puffer pH 2,50 5

Mc Ilvain-Puffer pH 4,12 ' 97

Mc Ilvain-Puffer pH 6,20 99

Mc Ilvain-Puffer pH 8,25 100

1 M-Ammoniak pH 11,71 82

(R) Innerhalb des Beständigkeitsbereichs der Sepharose erwies sich die Kupplung als völlig stabil. Eine Gelchromatographie der pH 2,5 Eluate zeigte neben dem Farbstoff auch hochmolekulare, gefärbte Agarosebruchstücke.

Beispiel 44

(R)

Bindung von Peni'cillinase an Sepharose '-Azofarbstoff-Derivate . . .

1 g feuchte nach Beispiel 43 angefärbte Sepharose wurde in 20 ml Wasser suspendiert und unter Rühren festes Natrium- dithionit zugegeben bis die Farbe in ein helles gelbliches

(R) Braun umgeschlagen war. Die reduzierte Sepharose ' wurde ab-

Le A 17 177 . - 48 -

709847/0043

gesaugt und mit Wasser gewaschen.

/p)

Zur Diazotierung i-jurde die reduzierte Sepharose in 3 ml 0,15 N-Salzsäure suspendiert und nach Abkühlung auf 0°C 5 Tropfen einer 1 M-Natriumnitritlösung zugegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten gerührt, dann abgesaugt und mit kaltem Wasser gewaschen.

Eine Probe dieser "Diazo-Sepharose" wurde mit ß-Naphtol gekuppelt und ergab ein tiefrotes Produkt.

Die Hauptmenge der "Diazo-Sepharose" wurde in 20 ml 0,05 M-"Phosphatpuffer pH 7 suspendiert und 0,5 ml einer Lösung von Penicillinase (110 U) zugegeben. Die Suspension wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde abgesaugt, mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne 0,5 M-Jiatriumchlorid gewaschen und abgesaugt. Es wurden 0,82 g Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschlösungen 12 U
Enzymharz 97 U

(118 ü/g Feuchtgewicht)

d.s. 88 % der eingesetzten Enzymaktivität oder 99 % der Aktivität des gebundenen Enzyms.

Le A 17 177 - 49 -

709847/0043

Claims

j Verfahren zur Bindung von hoch- und niedermolekularen Ligander
daß man

1y
- Liganden an polymere Träger, dadurch gekennzeichnet,

a) einen aktivierten polymeren Träger der Formel

12 3 4 in welcher die Substituenten R , R , R und R unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben können:

Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C₄), Alkoxy (C₁-C₄), Alkylthio (C₁-C₄), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano, Carbonamido, Alkylsulfonyl (C₁-C₄), Alkoxycarbonyl (C₂-Cg), Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl sowie T-X wobei T-X einen Trägerrest eines polymeren Trägers und X für Sauerstoff, Schwefel, NH, NR (R=Alkyl (C₁-C₄)), CONH oder CONR steht, wobei mindestens ein und

1 4 höchstens zwei der Reste R bis R für T-X

1 4 steht und wobei zwei der Reste R bis R für einen bivalenten Trägerrest T <^" stehen können,

Ji.

mit einem ein oder mehrere OH, NH₃, NHR (R=Alkyl (C₁-C₄)), CONH₂, CONHR oder SH-Gruppen haltigen Liganden gegebenenfalls in Gegenwart von Basen umsetzt, oder indem man

b) einen durch Kondensationsreaktion mit einem Pyrimidin der allgemeinen Formel

Le A 17 177 - 50 -

7Q9847/00A3

ORIGINAL HMSPECTfD

in welcher die Reste R¹, R¹¹, R¹¹¹ und R^IV unabhängig voneinander eine der folgenden Bedeutungen haben können:

Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C₄), Alkoxy (C₁-C₄), Alkylthio (C.-C ), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano, Carbonaraido, Alkylsulfonyl (C^-C^), Alkoxycarbonyl (C₂-Cg), Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl und wobei mindestens zwei der Reste R bis R für Halogen stehen, aktivierten Liganden mit einem OH, NH_, NHR-(R=Alkyl (C₁-C₄)), CONH₂, CONHR oder SH-Gruppenhaltige Träger, gegebenenfalls in Gegenwart von Basen umsetzt, und falls es sich bei den aktivierten Liganden um einen reaktiven Azofarbstoff handelt, das Kondensationsprodukt ans Träger und reaktiven Azofarbstoff gegebenenfalls isoliert, gegebenenfalls das Kondensationsprodukt mit einem geeigneten Reduktionsmittel zur freien Aminoverbindung reduziert, diesen mit Natriumnitrifc und Säure diazotiert und anschließend mit einem geeigneten Effektor umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, Verfahrensvariante a)/dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim aktivierten polymeren Träger der Formel (I) um mit 2,4,6-Trifluor-5-chlorpyrimidin (FCP), Tetrafluorpyrimidin (TFP) oder Tetrachlorpyrimidin(TCP)-aktivierte Agarose, quervernetztes

Le A 17 177 - 51 -

709847/0043

Dextran, Zellulose, Polyacrylamid, aminoxnethyliertes Polystyrol handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, Verfahrensvariante b) _u dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim aktivierten Liganden um mit 2,4,6-Trifluor-5-chlorpyrimidin (FCP), Tetrafluorpyrimidin (TFP) oder Tetrachlorpyrimxdin (TCP)aktiviertes p-Aminobenzamidin bzw. um einen mit einem der vorgenannten Pyrimidinderivate aktivierten Azofarbstoff handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, Verfahrensvariante b), dadurch gekennzeichnet, daß der mit FCP, TFP und TCP aktivierte Azofarbstoff an Agarose gekuppelt, anschließend mit Natriumdithionit reduziert, diazotiert und mit einem kupplungsfähigen Enzym gekuppelt wird.

Le A 17 177 - 52 -

■7Q9847/Q043