DE2920963C2 - Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren

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DE2920963C2
DE2920963C2 DE2920963A DE2920963A DE2920963C2 DE 2920963 C2 DE2920963 C2 DE 2920963C2 DE 2920963 A DE2920963 A DE 2920963A DE 2920963 A DE2920963 A DE 2920963A DE 2920963 C2 DE2920963 C2 DE 2920963C2
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Description

20
Einige D-Aminosäuren, besonders D-Phenylglycin und D-p-Hydroxy-phenylglycin, sind wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von Verbindungen, die verbreitet in der pharmazeutischen Industrie angewandtwerden.
Die chemischen Verfahren, die bisher zur Trennung der optischen Antipoden angewandt wurden und die auf der Verwendung von Camphersulfonsäure beruhen, sind sehr teuer und führen zu geringen Ausbeuten.
Ein anderes Verfahren besteht in der Hydrolyse von D-Acylaminosäuren mit dem Enzym D-Acylase.
Diese enzymatischen Präparate enthalten jedoch C-NH
CH
N-C
X=-H, —OH, -OCH3
der enzymatischen Hydrolyse durch Hydropyrimidin-Hydrolase (E. C. 3.5.2.2) unterwirft, die aus Organen oder von Mikroorganismen extrahiert worden ist. Die Hydrolyse läuft entsprechend der folgenden Gleichung ab:
DL
Il
C —Ν —Η
N-C
I \
H O
COOH
<f V-CH-NH-CO-NH2
De
Il
C-NH
y ν CH
Racemisierung N-C
I \
H O
Anschließend wird das N-Carbamoylderivat durch Oxydation mit Nitrit zu der D-Aminosäure abgebaut (DE-OS 26 15 594).
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur einfachen stereospezifischen Herstellung von D-Aminosäuren zu entwickeln.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Anspruch gekennzeichnete Verfahren. Ausgehend von einem racemischen Gemisch des Hydantoins:
COOH R-CH-NH-CO-NH2
Enzym II
Il
c
Racemisierung R — CH NH
N-C
I V
H COOH
R-CH-NH2
De
Ausgehend von einem racemischen Gemisch des N-Carbamoylderivats:
H H
R-C-NHCONH3 - R_c_
COOH
DL
COOH
De
R-C-NHCONH2 COOH
wobei R jeweils ein aliphatischer oder aromatischer, substituierter oder nichtsubstituierter Rest sein kann.
Die erfindungsgemäß angewandten Enzyme haben, im Gegensatz zu denjenigen, die D-Acylase enthalten, keinerlei Aktivität gegenüber dem L-Enantiomer. Dadurch können D-Aminosäuren erhalten werden, die optisch absolut rein sind.
Das Agrobacterium NRRL B-II 291 besitzt die folgenden morphologischen und biochemischen Eigenschäften:
Mikroskopische Morphologie:
Diskrete Stäbchen, manchmal gepaart, gram-negativ, 0,8 χ 1,5 bis 2,0 μιη, keine Kapseln und Sporen, beweglich mit 4 bis 6 peritrichialen Geißeln.
Makroskopische Morphologie:
Kolonien auf Agar Nährmedien (Difco): aufgerichtet, glatte Kanten, cremfarben, transparent 0,5 bis 1 mm Durchmesser, glatte Oberfläche, reichliches Wachstum auf Calcium-glycerophosphat-Mannitol-nitrat-Agar, unter Braunwerden und Ringbildung.
Biochemische Eigenschaften:
Wachstum zwischen 4 und 39°C auf allen einfachen Labormedien auch ohne Wachstumsfaktoren und Aminosäuren unter Ausnutzung von NH4+, NO3*
oder Aminosäuren als einzige Stickstoffquellen.
Oxidase:
positiv (N. Kovacs, 1956, Natur, London, 178,703).
Catalase:
positiv (M. Levine, D. Q- Anderson. 1932, J. Bact. 23,
337-347).
Nitrit-Bildung aus Nitraten (C. E. Zobell, 1932, J.
Bact. 24,273).
Tween 80:
nicht hydrolysiert (C. Sierra, 1957. Antonie van
Leeuwenhoek, 23, 15-22).
Casein, Gelatine, Cellulose, Stärke, Agar:
nicht hydrolysiert. (V. B. D. Skermann, »A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria«, 2.
Aufl., The Williams & Wilkins Book Co.. Baltimore,
1967).
3-Ketoglycoside werden gebildet (M. J. Bernacrts. J.
De Ley, 1963, Nature 197,406).
A nilin-Blau-Mannitol-Agar:
Wachstum unter Absorption des Farbstoffs (A. A.
Hendrickson. J. L. Baldwin, A. J. Riker. 1934. J. Bact.
28.597-618).
Lackmus-Milch:
grau-braun.
Verwertung von Kohlenhydraten:
oxydativ (R. Hugh, E. Leifson, 1953, J. Bact. 66, 24-26).
Die folgenden Verbindungen werden als einzige Kohlenstoffquelle ausgenutzt (R. Y. Stanier et AL, 1966, J. Gen. Microbiol 43, 159-271): D( + )Glucose, L( + )Arabinose, D( + )Xylose, D( + )Threose,
D( + )Ti.-ealose, D(-)Rinose, L( + JRhamnose, Lactose, Cellobiose, Maltose, Citrat, Acetat, Lactat, Propionat, L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Histidin, L-Alanin, L-Arginin.
Die Mikroorganismen der Art Agrobacterium werden unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium gezüchtet, das Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff, Phosphor sowie Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur zwischen 2O0C und 400C, zweckmäßig zwischen 25 und 35°C und zwar 10 bis 48 h, zweckmäßig 20 bis 30 h bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8.0, zweckmäßig von 7 bis 7,5. Glucose, Lactat, Acetat, Maisquellwasser und Lactose können als Kohlenstoffquelle angewandt werden.
Fleischhydrolysate, Hydrolysate von Casein und Sojabohnen, Ammoniumsalze und Harnstoff, Hydantoine und N-Carbamoylderivate von Aminosäuren sind als Stickstoffquellen geeignet.
Ein geeignetes Kulturmedium besitzt z. B. die folgende Zusammensetzung: jo
Beispiel 1
Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Fleischpepton 5g
Fleischextrakt 5g
Glucose 5g
Destilliertes Wasser 100 ml
pH 7,0-7,2
35
D( — )Aminosäuren werden direkt in dem Fermentationsmedium gebildet, das DL-Hydantoine oder DL-N-Carbamoylderivate von Aminosäuren enthält, und zwar beide als einzige Stickstoffquelle und zusammen mit üblichen Stickstoffquellen.
D( — )Aminosäuren können auch direkt hergestellt werden, indem man die mikrobiologische Zellaufschlämmung oder Auszüge davon verwendet.
Die Extraktion der erfindungsgemäß einsetzbaren Enzymkompiexe findet nach üblichen in der Enzymologie angewandten Verfahren statt. so
Zu diesem Zweck werden die Zellen mit entsprechenden Vorrichtungen aufgebrochen (mit Zellmühlen sowie mit Ultraschallvibratoren).
Die Hydrolyse der Hydantoine oder der N-Carbamoylderivate der Aminosäuren kann durchgeführt werden durch Zugabe des Enzyms zu dem Reaktionsgemisch in den folgenden Formen: Frische Zellen, gefriergetrocknete Zellen, toluolisierte Zellen, acetonhaltiges Pulver oder roher oder gereinigter Auszug bzw. Extrakt.
Eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung kann erreicht werden, indem man die Enzyme immobilisiert durch Zusammenbringen mit makromolekularen Verbindungen, unter Bildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder Ionenuindungen oder physikalische Immobilisierung.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Fleischpepton 5 g
Fleischextrakt 3g
Glucose 5g
Destilliertes Wasser 1000 ml
Der pH-Wert wurde mit Soda auf 7,2 eingestellt und das Kulturmedium in Mengen von jeweils 100 ml in 500 ml Kolben gegeben.
Nach 30 min langem Sterilisieren bei 1100C wurden die Kolben mit einer Kultur des Stammes NRRL B-11 291 beimpft, der von Schrägen gewonnen worden war, die das gleiche Medium, zusammen mit 2% Agar enthielten und 24 h bei 300C unter kreisförmigem Schütteln mit 220 UpM inkubiert worden waren.
Aus dieser Vorkultur (optische Dichte bei 550 nm: 0,250; Verdünnung 1 : 10) wurde 1 ml in fünf 500-ml Kolben, enthaltend 100 ml des gleichen Mediums, gegeben und die Kultur bei 300C unter kreisförmigem Schütteln (220 UpM) 24 h inkubiert (optische Dichte bei 550 nm = 0,250; Verdünnung 1 : 10).
Die Zellen wurden anschließend gewonnen, mit einer physiologischen Lösung gewaschen und in 100 ml Pyrophosphat-Puffer (0,1 m; pH 7,7), enthaltend 10 g D,L-5-Phenylhydantoin bei 40° C unter Stickstoffschutzatmosphäre aufgeschlämmt.
Nach 200 h langer Inkubation unter den angegebenen Bedingungen war eine vollständige Hydrolyse zu der Aminosäure D-Phenylglycin erreicht, wie sowohl aus der polarimetrischen Analyse des Reaktionsgemisches als auch durch Dünnschichtchromatographie (Suzuki in J. of Chromatography, 80, 1973, 199-204) gezeigt werden konnte.
Die Aminosäure wurde nach Ausfällen der Proteine mit Trichloressigsäure und Entfernung durch Abzentrifugieren isoliert durch Einstellen des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt (5,8).
Der Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Identität des D(-)Phenylglycins wurde durch das IR- und NMR-Spektrum bestätigt.
Die spezifische optische Drehung betrug [a]« = -154° (c= 1% in HCI 1 n) gegenüber einem Wert von — 157,8° wie er in der Literatur für die reine Aminosäure angegeben ist.
Beispiel 2
Entsprechend Beispiel 1 gebildete Zellen aus 100 ml Kulturmedium wurden in 10 ml Pyrophosphatpuffer (0,1 m, pH 7,7) aufgeschlämmt und 10 min bei 5°C beschallt. Das entstehende Produkt wurde zu 500 ml einer Lösung von D.L-N-Carbamoylphenylglycin 20 mM in Pyrophosphatpuffer (0,1 m pH 7,7) gegeben und bei 65°C inkubiert.
Der Reaktionsablauf wurde überwacht durch Beobachtung des bei der Hydrolyse von N-Carbamoyl freigesetzten Ammoniums nach dem Phenol-Hypochlorit-Verfahren.
Nach 40 h langer Inkubation war eine Konzentration an NH4 + -Ionen von 10 mMol pro Liter erreicht und es wurde im Laufe der Zeit keine weitere Zunahme beobachtet.
Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum bei 500C auf 100 ml eingeengt.
Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,8 mit konzentrierter HCI wurde der entstandene Niederschlag abfiltriert.
Der so erhaltene Niederschlag wurde in 1 η HCI gelöst und erneut mit NaOH bei einem pH-Wert von 5,8 ausgefällt.
Nach dem Trocknen wurde die spezifische optische Drehung bestimmt. Sie betrug — 153°. Das IR-Spektrum bestätigte die Identität des D( - )-Phenylglycins.
Aus dem Filtrat, das vorsichtig mit 3n HCI auf einen ι« pH-Wert von 2,5 eingestellt worden war, wurde auf dem Eisbad ein Niederschlag erhalten. Dieser wurde zur Trockne eingedampft und mit siedendem abs. Äthanol extrahiert. Beim Abkühlen der alkoholischen Lösung erhielt man einen kristallinen Niederschlag, der nach dem Trocknen der Dünnschichtchromaiographie und IR-Spektroskopie unterworfen wurde.
Diese Analysen bestätigen, daß chemisch reines L( + )-N-Carbamoylphenylglycin erhalten worden war.
Die spezifische optische Drehung betrug [α]"= 134° 2» (c=1% in In NaOH) gegenüber einem Wert von + 137°, wie er in der Literatur für das L-Enantiomer angegeben ist.
B e i s ρ i e 1 3
Aus einer entsprechend Beispiel 1 hergestellten Vorkultur wurden fünf 500 ml Kolben beimpft, die jeweils 100 ml eines Mediums enthielten, das ausschließlich aus einer 5%igen Lösung von Maisquellwasser bestand, die mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,8 gebracht und 30 min bei 121°C sterilisiert worden war.
Die Kultur wurde 24 h bei 30°C unter kreisförmigem Schütteln (220 UpM) inkubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) gewaschen und in 100 ml des gleichen Puffers, enthaltend 10 g 5-p-Hydroxy-D,L-phenylhydantoin, aufgeschlämmt und bei 40°C unter einer Stickstoffschutzatmosphäre inkubiert Nach 160h-langer Inkubation unter diesen Bedingungen war vollständige Hydrolyse zu der Aminosäure D( —)-p-Hydroxyphenyl-glycin eingetreten, was sowohl durch polarimetische Untersuchung des Reaktionsgemisches als auch durch Dünnschichtchromatografie nach Suzuki (J. of Chromatography, 80,1973,199 bis 204) bestätigt wurde.
Die Aminosäure wurde aus dem Reaktionsgemisch nach Ausfällen der Proteine mit Trichloressigsäure und Entfernung durch Zentrifugieren isoliert, indem man den pH-Wert auf den isoelektrischen Punkt (5,2) brachte. Der Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Identität der Aminosäure wurde durch das IR- und NMR-Spektrum bestätigt Die spezifische optische Drehung betrug [,x]S3= -156,5° (c= 1% in In HCI) gegenüber einem Wert von — 161,2°, wie er in der Literatur für die reine D-Aminosäure angegeben ist.
Beispiel 4
Es wurden Zeilen des Stammes NRRL B-11 291 aus 100 ml Kulturmedium auf Basis von Maisquellwasser, wie sie entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden waren, angewandt
Die gewaschenen Zellen wurden in 10 ml Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) aufgeschlämmt und 15 min unter Rühren bei Raumtemperatur mit Toluol behandelt
Die mit Toluol behandelte Aufschlämmung wurde zu 500 ml einer Lösung von 20 mMol N-Carbamoyl-D.L-phydroxyphenylglycin in Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) gegeben und bei 65°C unter einer Stickstoffschutzatmosphäre inkubiert.
Der Reaktionsverlauf wurde überwacht durch Beobachtung des bei der Hydrolyse des N-Carbamoylderi vats freigesetzten Ammoniums nach dem Phenol-Hypo chlorit-Verfahren wie im Beispiel 2 angegeben
Nach I8stündiger Inkubation hatten die NH4' -loner eine Konzentration von 10 mMol pro Liter erreicht unc im Laufe der Zeit wurde keine weitere Zunahme beobachtet.
In diesem Stadium wurde das Reaktionsgemisch in Vakuum bei 50°C auf ein Gesamtvolumen von 100 m eingeengt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,2 mi konzentrierter HCI wurde ein Niederschlag erhalten der abfiltriert wurde.
Entsprechend dem in Beispiel 2 angegebener Verfahren wurden die D-Aminosäure und das L-N-Carb amoyl isoliert und identifiziert. Die spezifische Drehung betrug -157.2° bzw. +171° gegenüber Werten vor — 161,2 bzw. + 175,4°C, wie sie in der Literatur für die reinen Produkte angegeben sind.
Beispiel 5
Zellen von in'RRL B-Il 291 wurden entsprechenc Beispiel 1 hergestellt. Einige g einer feuchten Zellauf schlämmung wurden in Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pf-7,7) aufgeschlämmt und in der Kälte mit Acetor behandelt
Nach Entfernen des Acetons durch Filtration wurdf das so erhaltene acetonhaltige Produkt im Vakuum be 35°C auf Gewichtskonstanz getrocknet. Das getrockne te Produkt wurde in einer Reibschale homogenisiert um das so erhaltene Pulver zur Untersuchung de Enzymaktivität angewandt.
Das acetonische Pulver wurde mit folgendei Substraten untersucht:
N-Carbamoyl-D-( - )-alanin,
N-Carbamoyl-D-( - )-valin,
N-Carbamoyl-D-( - ^glutaminsäure, N-Carbamoyl-D-(-)-p.-hydroxyphen> !glycin, N-Carbamoyl-D-( - )-p.-methoxyphenylglycin, N-Carbamoyl-D-( - )-phenylglycin, N-Carbamoyl-L-( + )-phenylglycin, N-Carbamoyl- D-( - )-phenylalanin, N-Carbamoyl-L-( + ^glutaminsäure und
N-Carbamoyl-D-( - )-(2-thienyl)-glycin.
Eine Lösung von 20 mMol jedes Carbamoylderivat in 0,1 m Pyrophosphat-Puffer (pH 7,7) wurde hergestell unu LU JcwcilS ium! uic.Scf LüSUHg Würde CiPn entsprechende Menge des acetonischen Pulvers, die fü jedes Substrat gleich war. zugegeben.
Die Inkubation wurde unter Stickstoffschutzatmo Sphäre unter Rühren bei einer Temperatur von 40°C durchgeführt. Nach 1 stündiger Inkubation wurde dii Menge der entstandenen Aminosäure gemessen, inden man die Konzentration an NH4 +-Ionen in den Reaktionsgemisch nach dem im Beispiel 2 angegebenei Phenol-Hypochlorit-Verfahren bestimmte.
Es zeigte sich, daß die höchste Aktivität de carbamo>lytischen Enzyms gegenüber N-Carbamoyl D-( — )-p-hydroxyphenylglycin erzielt wurde.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgendei Tabelle angegeben, wobei die hydrolytische Aktivitä gegenüber N-Carbamoyl-D-( -)-p.-hydroxyphenylgly ein gleich 100 gesetzt wurde.
Tabelle 1
Substrat
Aktivität
N-Carbamoyl-D-(- »-alanin 57,5
N-Carbamoyl-D(-)-valin 34,25
N-Carbamoyl-D( - Jglutaminsäure 21,7 N-Carbamoyl-LC+iglutaminsäure 0
N-Carbamoyl-Df-J-p-hydroxyphenylglycin 100,0
N-Carbamoyl-Di-J-methoxyphenylglycin 40,0
N-Carbamoyl-D(-)-phenylglycin 81,25 N-Carbamoyl-L(+)-phenylglycin 0
N-Carbamoyl-D(-)-(2-thienyl)glycin 40.7
N-Carbamoyl-D(-)-phenylalanin 50,0
Beispiel 6
Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt: 2«
25
30
Jeweils 100 ml des Mediums wurden in 500 ml Kolben gegeben und 30 min bei 116°C sterilisiert. Das Hydantoin wurde durch Filtration sterilisiert.
Aus einer entsprechend Beispiel 1 eihaltenen Vorkultur wurden 5 ml pro Kolben zugegeben und die neue Kultur bei 30 C unter kreisförmigen Schütteln mit 220 UpM 36 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und die Aminosäure aus der überstehenden Flüssigkeit nach Einengen und Einstellung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt gewonnen. Aus !0 I des so behandelten Kulturmediums erhielt man 11,2 g D-(-)-Phenylglycin mit der spezifischen optischen Drehung von [α]" = — 156° (c= 1% in In IK I) gegenüber einem Wert von — 157,8°, wie er in der 1 .iteratur für die reine D-Aminosäure angegeben ist.
Beispiel 7
Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:
MgSO4 · 7 H2O 0.2 g
Na2HPO4 ■ 12H2O bg
KH2PO4 3 £
NH4Cl 2g
NaCI 0,5 g
Glycerin 5g
5-Pheny!-D,L-hydantoin 2g
Hefe-Extrakt 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml
MgSO4 ■ 7 H2O 0,2 g
Na2HPO4 · 12H2O 6g
KH2PO4 3 g
5-Methyl-hydantoin 2g
NaCI 0.5 g
Glucose ig
Hefe-Extrakt 0.1g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH 7.1
jeweils 100 ml des Kulturmediums wurden in 500 ml Kolben gegeben und 20 min bei 116°C sterilisiert. Methylhydantoin wurde getrennt sterilisiert.
Von einer entsprechend Beispiel 1 hergestellten Vorkultur wurde 5 ml in jeden Kolben gegeben und die neue Kultur unter kreisförmigen Schütteln (220 UpM) 24 h bei 30°C inkubiert.
Die aus 1000 ml Kulturmedium durch Zentrifugieren erhaltene Zellaufschlämmung wurde in Phosphat-Puffer (pH 7.5) gewaschen und erneut in 100 ml des gleichen Puffers, enthaltend 4 g DL-5-(2-Thienyl)-hydantoin aufgeflammt.
Dieses Reaktionsgemisch wurde unter einer Stickstoffschutzatmosphäre bei 40°C inkubiert. Nach 30 h war die Hydrolyse zu der Aminosäure D-( —)-(2-thienyl)-glycin vollständig. Die Aminosäure wurde isoliert durch Einengen des Reaktionsgemisches auf ein Volumen von 20 ml und Einstellung des pH-Werts auf 5,6. Der so erhaltene Niederschlag wurde im Vakuum getrocknet. Die Identität der Aminosäure wurde durch IR- und NMR-Spektrum bestätigt.
Die spezifische optische Drehung betrug [«]«= -72,6° (c= 1% in H2O) gegenüber einem Wert von —73,7°, wie er in der Literatur für die reine D-Aminosäure angegeben ist.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren durch Hydrolyse von racemischen Gemischen der N-Carbamoylderivale oder der entsprechenden Hydantoine, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse mit Hilfe von frischen Zellen, gefriergetrockneten Zellen, toluolisierten Zellen, acetonhaltigem Pulver, einem rohen oder gereinigten Auszug bzw. Extrakt von Agrobacterium NRRL B-Il 291 durchführt.
    10 immer L-Acylase als Verunreinigung, was dazu führt, daß das erhaltene Produkt nur eine geringe optische Reinheit besitzt.
    Ein Verfahren zur enzymatischen Auftrennung von D1L-Aminosäuren oder deren Derivaten ist in der IT-PS 9 87 278, der DE-OS 28 11 303 und der DE-OS 26 31 048 angegeben.
    Dieses Verfahren besteht im wesentlichen darin, daß man die racemische Form von Verbindungen der Formel
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