DE2659878B2

DE2659878B2 - Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase

Info

Publication number: DE2659878B2
Application number: DE19762659878
Authority: DE
Inventors: Narimasa Noda Saito; Masaru Kashiwa Suzuki
Original assignee: Noda Institute for Scientific Research
Current assignee: Noda Institute for Scientific Research
Priority date: 1975-04-05
Filing date: 1976-04-01
Publication date: 1979-03-01
Also published as: JPS51118884A; DE2659878C3; JPS528395B2; DE2659878A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase hoher Wirksamkeit unter Verwendung eines Stammes, der zu der Gattung Flavobacterium oder Gattung Corynebacterium gehörig ist und die Fähigkeit aufweist, Kreatinamidinohydro lase zu erzeugen.

Kreatinamidinohydrolase welches als Katalysator in teilnimmt:

stellt ein Enzym dar, der folgenden Reaktion

Kreatin + H₂O

Kreatinamidinohydrolase Harnstoff + Sarkosin

Derzeit wird in der klinischen Medizin die Diagnose von Muskel- und Nierenerkrankungen durch Bestimmung des Kreatins vorgenommen, welches im Serum und Urin vorliegt.

Derzeit wird die Kreatinbestimmung üblicherweise durch Analyse von Kreatinin mit Hilfe der nicht enzymatischen Jaffe-Reaktion auf Grundlage der charakteristischen Eigenschaft von Kreatin vorgenommen, daß Kreatin bei Erhitzung in saurem Medium eine Dehydratisierung zu Kreatinin erfährt.

Die vorstehend erwähnte Methodik der Bestimmung von Kreatin ist dadurch nachteilig, daß die Jaffe-Reaktion nicht spezifisch ist, und daß das Serum und der Urin eine erhebliche Menge anderer Substanzen enthält, die das Versuchsergebnis fehlerhaft gestalten können und

to hierdurch die Zuverlässigkeit des Meüergebnisses beeinträchtigen. Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren der enzymatischen Bestimmung von Kreatin unter Verwendung eines Enzyms zu entwickeln, welches Kreatin spezifisch zersetzen kann.

(,■> Es ist bekannt, daß Enzyme mit der Fähigkeit der Zersetzung von Kreatin in Mikroorganismen vorliegen, die zu der Gattung Pseudomonas (Journal of General Microbiology, Band 14, S. 351 [1957], Gattung

Arthrobacter (Molecular und Cellular Biochemisty, Band 3, S. 9,1974) und Gattung Alcaligenes (US-Patentschriften 38 06 416 und 38 06 420) zugehörig sind.

Jedoch ist die Verwendung von Kreatin-zersetzenden Enzymen, die aus den vorstehend erwähnten Mikroorganismen gewonnen werden, nachteilig, da diese im allgemeinen gegenüber Umwelteinflüssen, wie Temperatur, pH-Wert, Sauerstoff und dergleichen, labil sind und weiter, weil sie alle in Mikroorganismen aufgefunden werden, so daß ihre Gewinnung ein Zweistufenverfahren erfordert Dieses Zweistufenverfahren umfaßt einerseits eine Stufe des Anwachsens und der Kultivierung von Mikroorganismen und andererseits eine Stufe der Gewinnung der kultivierten Bakterien und der Extraktion der Enzyme aus den Zellen durch Vermahlung, chemische oder enzymatische Aufarbeitung, wodurch das Reinigungsverfahren ziemlich kornpliziert gestaltet und die Produktausbeute verringert wird.

Angesichts dieses Sachverhaltes wurde eine umfangreiche Suche nach Stämmen durchgeführt, die zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolase in hoher Ausbeute befähigt sind. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Kultivierung von Mikroorganismen, die induktive Produktion von Enzym und die Anreicherung des Enzyms in der Kulturlösung gleichzeitig erreicht werden kann, und deshalb Kreatinamidinohydrolase in hohen Ausbeuten in nur einer Stufe ohne Extraktion der Enzyme aus den kultivierten Zellen dadurch gewonnen werden können, daß man einen Stamm, der zu der Gattung Flavobacterium oder Gattung Corynebacterium gehörig ist, in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervor. kultiviert. Die Erfindung baut auf dieser Erkenntnis auf.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Kreatinamidinohydrolase und ein neues Verfahren zu deren Herstellung zu schaffen.

Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.

Das Enzym kann isoliert werden, indem man es auf eine Diäthylaminoäthylcellulosesäule, die zuvor mit einer 0,05 m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) equilibriert worden ist, aufbringt, wobei Kreatinamidinohydrolase hindurchtritt und aus dem unadsorbierten Teil gewonnen wird.

Flavobacterium U-188, auf das vorstehend Bezug genommen worden ist (nachstehend Stamm U-188 genannt), stellt einen Stamm dar, der in Humuserde neu gefunden wurde. Seine bakteriologischen Eigenschaften sind nachstehend aufgeführt. Die Beschreibung der bakteriologischen Eigenschaften wird gemäß der Weise des »Manual of Microbiological Methods« (1957 durch McGraw-Hill-Book Company, Inc. veröffentlicht) vorgenommen. Das gleiche gilt für den anderen Stamm.

a Morphologie

Mikroskopische Beobachtungen (kultiviert in einem Bouillon-Agar-Medium bei 30°C während 48 Stunden)

(1) Form und Größe der Zellen:

Stäbchen einer Größe von 0,5 bis 0,7 χ 1,5 bis 1,7 μ (Micron).

(2) Polymorphisms der Zelle:

Während des Lebenszyklus kann kein Polymorphismus beobachtet werden, und die Zellen treten allein oder zu zweit auf.

(3) Motilität:

Motil, mit Hilfe von 3 bis 7 Peritrichous Flagella.

(4) Sporen: Es bildet keine Sporen aus.

(5) Gram-Färbung: Negativ.

(6) Säurefestigkeit: Negativ.

b Wachstumszustand in verschiedenen Nährlösungen:

(1) Boullion-Agar-PIattenkultur(2Tagebei 30°C). Die kreisförmigen Kolonien sind uneben, konvex, mit gewelltem Rand, schwachocker; Durchmesser

ίο von 2 bis 3 mm.

(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur (2 Tage bei 30° C). Gutes Wachstum, Ausbreitung, matter Glanz, Erzeugung eines wasserunlöslichen gelbbraunen Pigmentes.

is (3) Eingetauchte BouiIlon-Kultur(lTagbei30°C). Membranige Pellikeln mit schwerem Sediment.

(4) Bouillon-Gelatine-Stabkultur (1 bis 40 Tsge bei 20° C).

Gutes Wachstum auf der Oberfläche und in der oberen Schicht, keine Verflüssigung.

(5) Lackmusmilch (1 bis 14 Tage bei 30°C). Unverändert (pH 6,8). Keine Reduktion des Lackmus, keine Koagulation, keine Peptonisierung.

(6) Kartoffel-Kultur (2 Tage bei 30° C). Kein sichtbares Wachstum.

c Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitraten:Stark festgestellt

(2) Stickstoffentzugsreaktion: Nicht festgestellt.

(3) M R-Versuch !Negativ.

(4) VP-Versuch: Negativ.

(5) Indolbildung: Nicht festgestellt.

(6) Bildung von Schwefelwasserstoff: Festgestellt

(7) Stärkehydrolyse: Nicht festgestellt.

(8) Verwendung von Citronensäure: Nicht festgestellt. (Koser- und Christensen-Medisim werden in Kombination verwendet)

(9) Anorganische Stickstoffquelle: Nicht verwendet. (Ammoniumsalze, Nitrate.)

(10) Pigmentbildung: Es wird ein wasserunlösliches, ockergefärbtes Pigment gebildet.

(11) Urease: Nicht gebildet.

(12) Oxidase: Gebildet

(13) Katalase: Gebildet

(14) Bedingungen des Wachstumsbereiches. Optimale Wachsuimsbedingungen: 25 bis 35° C, pH 7 bis 9, aerob.

Bedingungen, die das Wachstum erlauben: Es kann unter aeroben bis geringfügig fakultativer anaerober Bedingung bei Temperaturen zwischen 5 und 40° C wachsen, wenngleich es bei 50° C (Bouillon-Schüttelkultur) kaum wächst Der pH-Bereich, der ein Wachstum erlaubt, liegt zwischen 6 und 11. Bei Erhitzung auf 80°C während 30 Minuten wird dieses ausgelöscht.

(15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: Aerob.

(16) O-F-Versuch (nach der Hugh Leifson-Methodik): Negäfiv.

(17) Koagulation der Milch: Keine Milchkoagulation.

(18) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen: Weder Säure noch Gas wird aus Kohlenstoffquellen, wie L-Arabinose, D-Glukose, D-Mannose, D-Fruktose, D-Galaktose, Maltose, Sukrose (Saccharose), Laktose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin, Stärke, Raffinose, Dextrin, Inulin, Glykogen, Cellulose und dergleichen gebildet.

d Physiologische Charakteristika

Stamm U-188 besitzt eine hohe Aktivität zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolyse in Gegenwart von Kreatinin und/oder Kreatin. Im Verlauf der Kultivierungszeit wird Harnstoff gebildet und in der Kuiturlösung angesammelt. Das Medium wird unter Ammoniakerzeugung alkalisch. Die Erzeugung der Enzyme und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak werden in üblichem Nährmedium, das weder Kreatinin noch Kreatin enthält, nicht festgestellt.

Durch Vergleich der vorstehend angeführten charakteristischen Eigenschaften des Stammes U-188 mit der Klassifikation, die in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl.(1974)«, erwähnt ist, kann festgestellt werden, daß Stamm U-188 zu der Gattung Flavobacterium zugehörig ist. Hinsichtlich der Spezies wird jedoch festgestellt, daß Stamm U-188 keinem der bisher bekannten bakteriellen Spezies entspricht. Daher kann Stamm U-188 aus den folgenden Gründen als neue Bakterienspezies angesehen werden:

Tabelle 1

Stamm U-188 ist ein gram-negatives, aerobes, nicht sporenbildendes, stäbchenförmiges Bakterium, das ein ockergefärbtes Pigment (wasserunlöslich) in üblL-hem Nährmedium ausbildet Es ist mit Hilfe von Peritrichous Flagella motil. Darüber hinaus erzeugt es weder Säure noch Gas aus Kohlenstoffquellen und verändert Lackmusmilch nicht. Es gehört daher zur Gattii-ig Flavobacterium. Es wird als analog zu Flavobacterium rigense angesehen, da es nicht aus Seewasser, sondern aus Erde gewonnen wird, da es motil ist und bei 37°C gut wächst, weil es kein NaCI erfordert und weil es Nitrate zu Nitriten reduziert.

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, gehört es jedoch zu einem unterschiedlichen Spezies von Flavobacterium rigense, weil das durch Stamm U-188 erzeugte Pigment eine Ocker-Farbe, unabhängig von den Kulturbedingungen aufweist und wasserunlöslich ist. weil es Gelatine nicht verflüssigt, weil es weder Säure noch Gas aus Glukose und anderen Kohienstoffquellen erzeugt, und weil es auf Kartoffel nicht wächst.

Art des Stammes

Flavobacterium U-188 Flavobacterium rigense

1. Pigmentbildung

2. Wachstum bei 37°C

3. Verflüssigung auf Gelatine

4. Peptonisierung von Casein

5. Ausnutzung von Zucker
(Bildung von Säure)
Glukose

Sukrose
Maltose

6. Bildung von Schwefelwasserstoff

7. Reduktion von Nitraten

8. Wachstum auf Kartoffel

Ocker (wasserunlöslich)

gut

nicht festgestellt

nicht festgestellt nicht festgestellt nicht festgestellt festgestellt
festgestellt
nicht festgestellt anfänglich gelb, was später zu orange
umgewandelt wird (löslich)

gut

trichterförmige Verflüssigung

nicht festgestellt

festgestellt

unbekannt

nicht festgestellt

festgestellt

gut

Flavobacterium U-188 ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, als FERM-P Nr. 2922 und in American Type Culture Collection (USA) als ATCC 31200 hinterlegt.

Corynebacterium U-41 (nachstehend als Stamm U-41 bezeichnet) stellt einen Stamm dar, welcher in Humuserde durch die Erfinder neu aufgefunden worden ist. Seine bakteriologischen Eigenschaften sind nachstehend aufgeführt:

a Morphology

Mikroskopische Beobachtung (kultiviert in einem Bouillon-Agar-Medium bei 30°C während 6 Stunden)

(1) Form und Größe der Zelle: Kurze Stäbchen einer Größe von 0,3 bis 0,5 χ 1,0 bis 1,3 μ (micron),

(2) Polymorphismus der Zelle: Es wird ein Polymorphismus in Abhängigkeit von dem Lebenszyklus festgestellt.

(3) Motilitäi." ht motil.

(4) Sporen: K.c ic

(5) Gram-Färbung: Positiv.

(6) Säurebeständigst: Negativ.

b Wachstumszustand in verschiedenen Medien

(1) Bouillon-Agar-Plattenkultur(2Tagebei30°C).
Die kreisförmigen Kolonien sind ganz, glatt, weisen eine gelbe Farbe auf, 2 mm Durchmesser matt.

(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur(2Tagebei30°C).
Gutes Wachstum, Fadenform, Erzeugung eines wasserunlöslichen, mattgelben Pigmentes.

(Z) Untergetauchte Bouillon-Kultur (2 Tage bei 30⁰C). y> Geißeiförmige (flagile) Häutchen mit Rand.

(4) Bouillon-Gelatine-Stäbchenkultur (1 bis 40 Tage bei 20⁰C).

Trichterförmige Verflüssigung.

(5) Lackmusmilch (1 bis 14 Tage bei 30⁰C).

M> Reduktion von Lackmus zu rot (pH 7,9). Keine

K&agulierung, jedoch Peptonisierung.

c Physiologische Eigenschaften

hi (I) Reduktion von Nitraten: Festgestellt.

(2) Stickstoffemzug: Nicht festgestellt.

(3) MR-Versuch: Negativ.

(4) VP-Versuch: Negativ.

(5) Indolbildung: Nicht festgestellt.

(6) Schwefelwasserstoffbildung: Festgestellt.

(7) Stärkehydrolyse: Festgestellt.

(8) Ausnutzung von Citronensäure: Festgestellt. (Koser- und Christensen-Medium werden in Kombination verwendet.)

(9) Anorganische Stickstoffquelle: Nicht verwendet. (Ammoniumsalze, Nitrate.)

(10) Pigmentbildung: Ein wasserunlösliches, schwachgelb gefärbtes Pigment wird gebildet.
(1!) Urease: Nicht gebildet.

(12) Oxidase: Gebildet

(13) Katalase: Gebildet.

(14) Bedingungen des Wachstumsbereiches:
Optimale Wachstumsbedingungen: 25 bis 35°C, pH 6 bis 9, aerob.

Bedingungen, die das Wachstum erlauben: Es kann unter aernhen bis srhwaeh-falciiltativ anaprnhpn Bedingungen bei Temperaturen zwischen 5 und 40⁰C wachsen, es wächst jedoch kaum bei 45° C (Bouillon-Schüttelkultur). Der pH-Bereich, der ein Wachstum gestattet, liegt bei 6 bis II. Bei Erhitzung auf 80°C während 30 Minuten wird dieses ausgelöscht

(15) Verhaken gegenüber Sauerstoff: Aerob.

(16) OF-Versuch (Hugh Leifson-Methodik): Negativ.

(17) Milchkoagulierung: Nicht festgestellt.

(18) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen: Weder Säure noch Gas werden aus Kohlenstoffquellen, wie L-Arabinose, D-Glukose, D-Mannose, D-Fruktose, D-Galaktose, Maltose, Sukrose, Laktose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin, Stärke, Raffinose, Dextrin, Inolin, Glykogen, Cellulose und dergleichen gebildet.

d Physiologische Charakteristika

Stamm U-41 besitzt eine hohe Aktivität zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolase in Gegenwart von Kreatinin und/oder Kreatin. Im Verlauf der Kultivierungszeit wird Harnstoff gebildet und in der Kulturlösung angesammelt. Das Medium wird unter Ammoniakerzeugung alkalisch. Die Erzeugung der Enzyme und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak werden in üblichem Nährmedium nicht festgestellt, das weder Kreatinin noch Kreatin enthält

Durch Vergleich der vorstehend erwähnten charakteristischen Eigenschaften des Stammes U-41 mit der Klassifikation, die in »Bergey's Manual of Determinative and Bacteriology, 7. Aufl. (1957) und 8. Auflage (1974)« erwähnt ist, kann die Entscheidung getroffen werden, daß Stamm U-41 zu der Gattung Corynebacterium gehörig ist Hinsichtlich der Spezies wird jedoch festgestellt daß Stamm U-41 zu keinem der bekannten bakteriellen Spezies zugehörig ist Daher kann Stamm U-41 als neue Bakterienspezies aus den folgenden Gründen angesehen werden:

Stamm U-41 wird als zu der Gattung Corynebacterium zugehörig angesehen, weil es Polymorphismus in Abhängigkeit von dem Lebenszyklus zeigt die Gram-Färbung immer positiv und auf keine Weise negativ ist es ein nicht Sporen ausbildendes, stäbchenförmiges Bakterium darstellt und im üblichen Nährmedium wächst weil es bei einer Temperatur oberhalb 50° C nicht wächst und daher keine Hitzebeständigkeit aufweist und weil es keine Fähigkeit zur Zersetzung von Cellulose besitzt

Es wird als analog zu Corynebacterium rathayi angesehen, weil es nicht aus tierischem Ursprung isoliert wird, weil es Nitrate zu Nilriten reduziert, und weil e: Gelatine verflüssigt. Stamm U-41 wird aus Erde gewonnen, stellt kein pathogenes Bakterium füi Gemüse dar und verflüssigt darüber hinaus in intensivei

-, Weise Gelatine und nutzt Kohlenstoffquellen, wie ir Tabelle 2 gezeigt ist, nicht aus. Es unterscheidet sich daher erheblich von Corynebacterium rathayi, so daß ei als neue Spezies angesehen werden muß.

Corynebacterium U-41 ist im Fermentation Research

κι Institute, Agency of Industrial Science and Technology Chiba, Japan, als FERM-P No. 2923 und in der Americar Type Culture Collection als ATCC 31201 hinterlegt.

Tabelle 2

Art des Stammes Corynebac- Corynebacterium terium U-41 rathayi

stark

mild und langsam

gut

festgestellt nicht festgestellt

1. Fähigkeit zur
^:" Verflüssigung

von Gelatine

2. Wachstum in
Nährmedium

3. Ausnutzung
von Zucker
(Saurebil.^Mng)
Glukose
Laktose
Sukrose
4. Ausnutzung
von Citronensäure

Zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase unter Verwendung der vorstehend erwähnten Stämme können herkömmliche feste Kulturen herangezogen werden. Es ist jedoch bevorzugt flüssige Kulturen anzuwenden.

Das in der Erfindung verwendete Kulturmedium ist derart zusammengesetzt, daß eine oder mehrere Arten von Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Mais-Einweichflüssigkeit oder wäßrige Extrakte von Sojabohnen oder Weizenkleie mit einer oder mehreren Arten von anorganischem Salz, wie primärem Kaliumphosphat, sekundärem Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat Magnesiumchlorid, Ferrichlorid, Ferrisulfat oder Mangansulfat und, sofern erforderlich, weiter mit einem Zucker, wie Stärke, Vitaminen und dergleichen, in geeigneter Weise eingebracht wird bzw. werden.

Bei der Erfindung wird einer der vorstehend erwähnten Stämme in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder einem Gemisch hiervon kultiviert Die Kultivierung kann beispielsweise durch Inokulierung des Stammes in das vorstehend erwähnte Medium, das zuvor mit Kreatinin, Kreatin oder einem Gemisch hiervon versetzt worden ist, durchgeführt werden. In alternativer Weise kann sie auch durch Zufügung von Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon zu der Kultur innerhalb von 5 Stunden, nachdem die Kultivierung begonnen worden ist, nämlich nachdem der Stamm in das Medium inokuliert worden ist durchgeführt werden.

Die Menge an Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon, die zu dem vorstehend erwähnten Kulturmedium hinzugefügt werden soll, liegt im Bereich von 0,01 bis 5,0% (Gewicht/Volumen [G/V]), Vorzugs-

weise im Bereich von 0,1 bis 1,0% (G/V), bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums.

Es ist wünschenswert, den anfänglichen pH-Wert des Mediums auf 7 bis 9 einzustellen. Die Kultivierung wird in einem aeroben Zustand mittels einer belüfteten, bewegten Eintauchkultur oder mittels einer Schüttelkultur bei einer Temperatur zwischen 25 und 37°C, vorz.'jsweise etwa 30⁰C, während eines Zeitraumes von 10 bis 48 Stunden, vorzugsweise 15 bis 36 Stunden, durchgeführt. Durch die vorstehend erwähnten Stämme kann die Erzeugung und Ansammlung einer großen Menge an Kreatininamidohydrolase und Kreatinamidinohydrolase in der Kulturlösung mit hoher Effizienz durch eine einstufige Kultivierung erreicht werden.

Zur Gewinnung von Kreatinamidinohydrolase aus π der Kulturbrühe nach der Beendigung der Kultivierung gemäß der Erfindung können herkömmliche Verfahren der Enzymgewinnung herangezogen werden.

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der Kulturlösung vorliegt, kann eine Rohflüssigkeit, die das Enzym enthält, durch Entfernung der Zellen und unlöslichen Materialien aus der Kultivierungslösung erhalten werden. Die Rohflüssigkeit kann entweder direkt oder nach deren Umwandlung zu einem rohen Enzympulver mit Hilfe der Gefriertrocknung in Gebrauch genommen werden.

Sofern gewünscht ist, die Kreatinamidinohydrolase, die in dem Mikroorganismus in einer kleinen Menge noch verbleibt, zu extrahieren, werden diese nach Vermahlung der Zellen in üblicher Weise oder durch enzyr.iatische Aufarbeitung bzw. Verdauung extrahiert. In alternativer Weise werden die Zellen einer Autolyse durch Schüttlung oder durch Stehenlassen in Gegenwart von Toluol oder dergleichen zur Freisetzung des Enzyms unterworfen, wonach die Lösung von den Feststoffen durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt und, sofern erforderlich, von Nukleinsäuren durch Behandlung mit Streptomycinsulfat, Protaminsulfat oder Mangansulfat befreit wird, und sodann durch Zugabe von Ammoniumsulfat, Alkohol oder Aceton fraktioniert wird, die resultierende Ausfällung gesammelt wird, letztere gegen Wasser dialysiert wird, und schließlich unter Vakuum unter Erhalt von Rohenzympulver getrocknet wird.

Kreatinamidinohydrolase wird aus der rohen Enzymzubereitung isoliert entweder durch Adsorptions-Elutions-Methodiken mittels Ionenaustauschern, wie Diäthylaminoäthylcellulose, oder durch geeignete Kombination einiger der Gelfiltrationsmethodiken, der Adsorptions-Elutions-Methodik mittels Hydroxylapatit, >o und Elektrophorese-Methodik mittels Polyacrylamidgel und dergleichen. Dabei erhält man das hoch gereinigte Enzym.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der reinen Kreatinamidinohydrolase, die durch die vorstehend erwähnten Reinigungsverfahren erhalten wurden, sind nachstehend aufgeführt:

(1) Aktions- und Substratsspezifität

Dieses Enzym besitzt eine Fähigkeit, Kreatin zu _bo Harnstoff und Sarkosin zu hydrolisieren. Der K_n,-Wert (Michaelis-Konstan'e) beträgt für Kreatin 4,OxIO-² Mol (37° C, pH 7,7). Gegenüber Kreatinin übt es keine Wirkung aus.

(2) Optimaler pH- und stabiler pH-Bereich

Der optimale pH-Wert beträgt 7,7 und der stabile pH-Bereich beträgt 5,0 bis 9,0.

(3) Verfahren der Messung der enzymatischen
Aktivität

Zu 0,8 ml 0,1 m Kreatinlösung werden 0,1 ml 0,3 m Phosphat-Puffer (pH 7,7) und 0,1 ml einer Lösung dieses Enzyms, die eine geeignete Konzentration aufweist, hinzugegeben und das resultierende Gemisch wird bei 37°C während 10 Minuten umgesetzt. Sodann werden 2 ml einer 2%igen (G/V) p-Dimethylaminobenzaldehydlösung (hergestellt durch Auflösung von 2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd in 100 ml 99,5%igem Äthanol, Zugabe von 15 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und Verdünnung des Gemisches mit destilliertem Wasser auf eine zweifach größere Menge) hinzugefügt und das resultierende Gemisch wird bei 25°C während 30 Minuten stehengelassen. Sodann wird seine Absorption (O.D.-Wert) bei 435 τημ mittels eines fotoelektrischen Colorimeters gemessen. Die Menge uc» gc'uiiueieii Harnstoffes wird durch Vergleich mit einer Kalibrierungskurve für Harnstoff, die zuvor ermittelt wurde, abgeschätzt. Die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 Mikromol Harnstoff pro Minute bei 37°C zu erzeugen, wird als Einheit herangezogen.

(4) Bereich der optimalen Temperatur

Er liegt im Bereich von 20 bis 45°C. Eine Temperatur von etwa 37° C ist besonders bevorzugt.

(5) Thermische und pH-Stabilität

Es verliert die Aktivität bei einem pH-Wert oberhalb 10. Es verliert seine Aktivität vollständig bei 50°C in 10 Minuten.

(6) Inhibierung, Aktivierung und

Stabilisierung

Es wird durch p-CMB und Quecksilberschlorid inhibiert. Es wird durch Glutathion (reduzierte Form), L-Cysteinhydrochlorid und 2-Mercaptoäthanol stabilisiert.

(7) Reinigungsmethodik

Nucleinsäure und Bakterien werden aus der Kulturflüssigkeit durch Zufügung von Mangansulfat und Hyflow-Super-Cel und Filtration des resultierenden Gemisches eliminiert Das Filtrat wird gegenüber Puffer A dialysiert, wonach die dialysierte Lösung auf eine Säule aufgebracht wird, die mit DEAE-Cellulose (DEAE = Diäthylaminoäthyl) gefüllt ist, welche zuvor mit Puffer A equilibriert worden war. Das unadsorbierte Enzym, das eine Kreatinamidinohydrolase-Aktivität aufweist, wird an DEAE-Cellulose adsorbiert, welches zuvor mittels des vorstehend erwähnten Puffers A equilibriert worden ist und sodann unter Ausnutzung eines linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 m eluiert, wobei das Enzym bei einer NaCl-Konzentration von 0,1 bis 03 m eluiert wird. Sodann wird das Eluat konzentriert, durch eine Sepharose 6B-Säure geführt und mit Puffer A unter Gewinnung der Fraktion eluiert, die die Enzymaktivität aufweist Die Fraktion wird konzentriert und lyophilisiert, wobei ein gereinigtes Enzympulver erhalten wird.

(8) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht dieses Enzyms wird durch Gelfiltration nach der Andrew's Methodik (P. Andrews, Biochem. J, 96, 595 [1965J bestimmt Es wird zu etwa 60 000 ermittelt Die Säule wird mit 0,05 m Phosphatpuffer (pH 8,0) equilibriert, welcher 0,1 m NaCI

und 1 Millimol 2-Mercaptoäthanol enthält und die Elution wird bei 5°C vorgenommen.

Im Gegensatz hierzu weisen Kreatinamidinohydrolasen, die bereits früher beschrieben worden sind, beispielsweise in (i) Journal of Genral Microbiology, Band 14, S. 351 bis 365 (1956) und (ii) US-Patentschriften 38 06 416 und 38 06 420, die vorstehend erwähnt worden sind, die folgendem physikalischen und chemischen Eigenschaften auf:

Km-Wert für Kreatin:	(i)	(>)	2,3xlO-²m
			(30°C,pH 7,8)
	(ü)	/;\	5,0xl0-^Jm
		*\'ß* (')	(25°C,pH7,6)
Relative Aktivität für Kreatin:	(ü)
	etwa 0,1 Einheiten/mg
	Protein
Ontimnlp Tpmnppofnr-	30° C
Optimaler pH:	7,8
	7,6

Darüber hinaus werden die Inhibitoreneffekte für Kreatinamidinohydrolase, die durch den Stand der Technik beschrieben worden sind, mit denen der vorliegenden Erfindung nachstehend verglichen:

Inhibitor

Endkonzentration an
Inhibitor

(m)

Prozentuale Inhibition der Kreatinentfernung

gemäß d.
Erfindung

Stand der Technik

Borat (pH 9,1)

Azid

Jodoacetat

5 X 10"²
2 X ΙΟ"²
1(T²

40 0 0

80
18
20

Wie vorstehend erwähnt wurde, wird dieses Enzym

angesichts seiner enzymologischen und physiko-chemischen Eigenschaften als neue Kreatinamidinohydrolase angesehen, die sich von jeder der bekannten Kreatinamidinohydrolasen unterscheidet.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter, ohne diese einzuschränken. Die Einheit der Enzymaktivität, auf die in den Beispielen Bezug genommen worden ist, ist jene, die die Normalreaktion in Gegenwart von Kreatinin oder Kreatin als Substrat betrifft.

Beispiel 1

1 1 eines Nährmediums (pH 7,6), welches 0,5% (G/V) Kreatinin, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 036% (G/V) jfj sekundäres Kaliumphosphat, 0,04% (G/V) primäres

^- Kaliumphosphat, 0,02% (G/V) Magnesiumsulfat,

^ 0,001% (G/V) Mangansulfat und 0,001 % (G/V) Eisensulfat enthielt, wurde in eine Kulturvorrichtung geringer Größe eingebracht, die mit einem Rührer (hergestellt durch Iwashiya Co, Japan) ausgestattet war, und bei hohem Druck sterilisiert Sodann wurde das Medium mit 20 ml einer bakteriellen Samenlösung inokuliert, die durch Vorkultivierung von Flavobacterium U-188 (ATCC 31200, FERM-P Nr. 2922) in einem Nährmsdium, das die gleiche Zusammensetzung, wie sie vorstehend angegeben worden ist, aufwies, hergestellt worden war, und einer belüfteten-bewegten Eintauchkultur bei 30°C t iterworfen. Nach Kultivierung während 24 Stunden wurde eine Kulturlösung erhalten, die 2,2 Einheiten/ml Kreatinamidinohydrolase enthielt.

Die Kulturlösung wurde von Bakterien durch Zugabe von 15 ml einer 23,6%igen (G/V) Mangansulfatlösung unter Rühren, weiterer Zugabe von 15 g Hyflow Super CeI und Filtration des resultierenden Gemisches befreit. Somit wurden 970 ml einer rohen Enzymlösung erhalten, die 2,1 Einheiten/ml Kreatinamidinohydrolase

in enthielt.

Die hierdurch erhaltene rohe Enzymlösung wurde auf ein Volumen von 95 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde gegenüber 5 I 0,05 m Phosphat-Puffer (pH 8,0) welcher ein Millimol 2-Mercapto-äthanol (nachstehend

i) als Pulver A bezeichnet) aufwies während 24 Stunden dialysiert und sodann auf eine Säule (2 χ 30 cm) mit DEAE-Cellulose aufgebracht, welche zuvor mit Pufler A equilibriert worden war. Der nicht adsorbierte Teil wies eine Kreatinamidinohydrolase-Aktivität auf.

Kreatinamidinohydrolase wird dadurch erhalten, daß man den unadsorbierten Teil, der in der vorstehend angeführten DEAE-Cellulose-Säulenchromatografie erhalten worden war, an einer DEAE-Sephadex A-50-Säule, die zuvor mit dem gleichen erwähnten Puffer equilibriert worden war, absorbiert, und mit einem linearen NaCI-Gradienten von 0 bis 0,5 m eluiert. Kreatinamidinohydrolase wurde bei einer NaCl-Konzentration von 0,1 bis 0,3 m eluiert. Die aktive Fraktion des Eluates besaß eine spezifische Aktivität von 8,5

j» Einheiten/mg-Protein und eine Gesamtaktivität von 1530 Einheiten.

Nachfolgend wurde die vorstehend erwähnte aktive Fraktion auf ein Volumen von 2,0 ml mittels eines Collodiumsackes konzentriert und das Konzentrat

ι--, durch eine Sepharose 6B-Säule (2 χ 108 cm) geführt, welche zuvor mit dem gleichen Puffer A equilibriert worden war. Sodann wurde mit dem gleichen Puffer eluiert und die Fraktionen, die die Kreatinamidinohydrolase-Aktivität aufwiesen, wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden unter Erhalt eines gereinigten Kreatinamidinohydrolasepulvers konzentriert unu lyopholisiert. Die hierdurch erhaltene gereinigte Kreatinamidinohydrolase besaß eine spezifische Aktivität von 11,3 Einheiten/mg-Protein und eine Gesamtaktivität von 1050 Einheiten. Die Ausbeute betrug 51,6%.

Die Einheit der Kreatinamidinohydrolase-Aktivität, auf die hier Bezug genommen ist, wurde derart definiert, daß die Enzymmenge, die für die Zersetzung von 1 Mikromol Kreatin zu Harnstoff pro Minute in einem Phosphat-Puffer (pH 7,7) bei 37⁰C erforderlich war, als eine Einheit herangezogen wurde.

Beispiel 2

1 1 eines Nährmediums (pH 7,6), welches 04% (G/V) Polypepton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 036% (G/V) sekundäres Kaliumphosphat, 0,04% (G/V) primäres Kaliumphosphat, 0,02% (G/V) Magnesiumsulfat, 0,001 % (G/V) Mangansulfat und 0,001 % (G/V) Eisensulfat enthielt, wurde in einen Kultivierungskolben einer Kapazität von 5 I eingebracht und bei hohem Druck sterilisiert, wobei der Kolben mit Baumwolle zugestopft war. Das Medium wurde mit 10 ml einer Kulturlösung inokuliert, die durch Vorkultivierung von Corynebacterium CJ-41 (ATCC 31201, FERM-P No. 2923) während 24 Stunden in einem Nährmedium erhalten worden war. welches die gleiche Zusammensetzung, wie sie vorstehend angegeben ist, aufweist. Das inokulierte Medium

wurde bei 30⁰C unter Schuttlung kultiviert. Nach 5stündi^er Kultivierung wurden 100 ml sterilisierter, 5%iger (G/V) Kreatinlösung zu dem Medium hinzugegeben und die Kultivierung wurde während weiterer 24 Stunden fortgesetzt, wodurch eine Rohenzymlosung

erhalten wurde, die Kreatinamidinohydrolase (0,5 Einheiten/1 ml Kulturlösung) aufwies.

Die Rohenzymlösung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unter Erhalt von reiner Kreatinamidinohydrolase behandelt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase, dadurch gekennzeichnet, daß man Flavobacterium U-188 (ATCC 31200, FERM-P No. 2922) oder Corynebacterium U-41 (ATCC31201, FERM-P No. 2923), der die Fähigkeit zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolase aufweist, in einem Nährmedium in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder einer Mischung daraus kultiviert und Kreatinamiddinohydrolase aus der Kulturflüssigkeit gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium zumindest eine der Substanzen Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Mais-Weichflüssigkeit und wäßriges Sojabohnen- und Weizenkleieextrakt als Stickstoffquelle und zumindest eine Substanz, die unter primärem Kaliumphosphat, sekundärem Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat. Magnesiumchlorid, Ferrichlorid, Ferrisulfat und Mangansulfat als anorganisches Salz ausgewählt ist, enthält

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zuckermateriai oder Vitamin in das Nährmedium eingebracht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon im Bereich von 0,01 bis 5,0% (G/V), bezogen auf das gesamte Nährmedium beträgt

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ausgangs-pH-Wert des Nährmediums 7 bis 9 beträgt

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einer Temperatur von 25 bis 37° C durchführt

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung während 10 bis 48 Stunden durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung unter Belüftung durch eine Belüftungs-Bewegungs-Eintauchkultiir oder -Schüttelkultur durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung durch Inokulierung eines der beiden Bakterienstämme in ein Nährmedium durchführt, welches zuvor mit Kreatinin, Kreatin oder einem Gemisch hiervon versetzt worden ist

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Kreatinin, Kreatin oder ein Gemisch hiervon zu dem Nährmedium zu einer Zeit zugibt, die nicht später als 5 Stunden nach Beginn der Kultivierung durch Inokulierung eines der beiden Bakterienstämme in das Nährmedium liegt

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Kreatinamidinohydrclase in Form einer Rohenzymlösung durch Abtrennung und Entfernung der Zellen und unlöslichen Materialien aus der Kultivierungslösung oder in Form eines rohen Enzympulvers durch weitere Lyophilisierung der Rohenzymlösung gewinnt.

12. Verfahren nach Anspruch U, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rohenzymlösung oder das Rohenzympulver zu reiner Kreatinamidinohydrolase reinigt

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung durch die Adsorptions-Elutionsmethodik unier Verwendung eines lonenaustauschermaterials durchführt

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet daß man die Reinigung durch Kombination der Gelfiltrationsmethodik, der Adsorptions-Elutions-Methodik und der Elektrophorese-Methodik durchführt

15. Kreatinamidinohydrolase mit einem K_n,-Wert (Michaelis-Konstante) für Kreatin von 4,OxIO-² MoI (37°C, pH 7,7), stabilem pH-Bereich von 53 bis 9,0, optimalem pH-Bereich von 7,7, Aktionstemperaturbereich von 20 bis 45°C, optimaler Aktionstemperatur von 37°C und einem Molekulargewicht von 60 000, erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.