DE2920764A1 - Glycerindehydrogenase-praeparationen, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Description

1. Anthony Atkinson, Salisbury, Wiltshire, England

2. Christopher John Bruton, Kew, Surrey, England

3. Michael James Comer, 8l2o Weilheim, BRD

4. Richard James Sharp, Salisbury, Wiltshire, England

Glycerindehydrogenas e-Präparationen,
ihre Herstellung und Verwendung

Die Erfindung betrifft verbesserte Glycerindehydrogenase-Präparationen, ihre Herstellung und Verwendung.

Glycerindehydrogenasen (GDH) werden beispielsweise für biochemische Tests wie etwa bei der Bestimmung von Serum-Triglyceriden zur klinischen Diagnose sowie etwa zur Herstellung von Dihydroxyaceton verwendet, das in
der kosmetischen Industrie verarbeitet wird.

Allerdings sind nur relativ wenige Quellen für
GDH bekannt, wobei sämtliche bisher bekannten und verwendeten derartigen Enzyme extrem instabil sind und
Halbwertszeiten in Lösung bei Raumtemperatur unter zwei Tagen besitzen. Auch in Form gefriergetrockneter Pulver

293-(JX/5367/04)-SF-rs

9 0 9 8 4 9 / 0 6 £ 7

müssen derartige Präparate bei niedrigen Temperaturen gelagert werden.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß bestimmte thermophile Mikroorganismen GDH-Enzyme erzeugen, die in Lösung bei Raumtemperatur sowie auch bei höheren Temperaturen über lange Zeiten stabil sind.

Die erfindungsgemäße Glycerindehydrogenase-Enzympräparation besitzt bei Lagerung bei 20 ⁰C in Form einer Lösung einer Konzentration von 3 mg/ml in einer Pufferlösung von pH 6,8, die eine Konzentration von 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM ß-Mercaptoäthanol und 0,1 mM Phenylmethyisulfonylfluorid (PMSF) aufweist, eine aktive Halbwertszeit von mehr als 4 Tagen. Derartige Enzyme werden im folgenden kurz als 'thermostabile GDH-Enzyme¹ bezeichnet.

Die erfindungsgemäßen Glycerindehydrogenasen können durch Kultivieren thermophiler Organismen des Stamms Bacillus Stearothermophilus RS93 oder von Derivaten oder

.nocfL

Mutanten davon, dxev'die Fähigkeit zur Erzeugung thermostabiler GDH-Enzyme besitzen, anschließende Zerstörung der Zellen und Abtrennung der Enzyme aus den zerstörten Zellen hergestellt werden. Zu den Beispielen für derartige Derivate bzw. Mutanten gehört der mit SC7 bezeichnete Stamm.

Diese Stämme sind bei der National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Aberdeen, Schottland, unter den Hinterlegungsnummern NCIB 11 400 und NCIB 11 401 hinterlegt.

909849/06^7

Sie können wie folgt identifiziert werden:

RS93 (NCIB 11 400) SC7 (NCIB 11 401)

Aussehen der Kolonien (auf TSB-Ägarplatten, die über Nacht bei 60 ⁰C inkubiert wurden)

durchscheinend, plan- wie RS93, jedoch konvex rund, weich Pigmentierung und ganz mit einem weniger ausgelachsartig rosafarbenen prägt granulären Zentrum
und einem klaren Rand

genetische Charakterisierung

mikroskopisches Aussehen

Pro Arg His Nie Thi Bio

(Defektmutante, leakymutant)

schwach färbbare, grammpositive Stäbe, 1,25 χ 0,25 μΐη. Sporenbildend mit vergrößertem Bacxlluskörper und subterminalen oder zentralen, oval geformten Sporen His Nie Bio

(Defektmutante,leaky mutant)

wie RS93

biochemische Tests

Wachstum bei

⁰C

⁰C

⁰C

⁰C

⁰C (1 Tag Inkubation)

-ve

+ve (langsam;

+ve

+ve

-ve wie RS93

-3d)

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Vergärung von: 1 d 3 d

Adonit	W W	■	— -	+ +
Aesculin	_ _	+ W	" - -
Arabinose	- -	. - -	- -
Dextrin	- -	- - "	- - -
Dextrose A/G	W W	w -	W W
Dulcit	- -		- -
Erythrit	- -	_ _	-- -
Galactose	- -	- w 1!	- -
Glycerin	+ +	+ +
Glycogen	- -	- -
Inosit	WW	W W
Inulin	- -	- -
Lactose	- -	■ """ - -
Laevulose	- -"	W W
Maltose	- -	- -
Mannose	W W	W W
Raffinose	- -
Rhamnose	_ -
Saccharose	+■ +
Salicin	- " _ _
Stärke	- -
Sorbit	W W
Threhalose	W W
Xylose	- -
Mannit	+ +

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Wachstum in Pepton + Wasser bei 60 ⁰C während 24 h ergab eine Toleranz gegenüber NaCl bis zu einer Endkonzentration von 5 Gew.-% NaCl.

Erzeugung von

Catalase +

Oxidase +
Nitratreductase

Nitritreductase - .

Die Stämme können ferner durch die Erzeugung eines Bacteriocins weiter charakterisiert werden, das in der Lage ist, das Wachstum von Bacillus stearothermophilus NCIB 11 sowie anderer thermophiler Bazillen zu inhibieren; der Test wird wie folgt durchgeführt:

Es werden Verdünnungsplatten hergestellt, die etwa 10 bis 20 Kolonien pro Platte enthalten, und über Nacht inkubiert. Anschließend werden die Kolonien dadurch abgetötet, daß sie 2 h lang Chloroformdampf ausgesetzt werden, worauf die Platten zur Entfernung des Chloroforms ventiliert werden. Anschließend wird mit einer Suspension von NCIB 11 270 beimpft, die dick genug ist, daß sich ein mattenartiges Wachstum ausbildet, wonach über Nacht bei 60 ⁰C inkubiert wird. Einzelne abgetötete Kolonien von RS93 oder SC7 sind von einer klaren Zone ohne Wachstum in dem mattenartigen Bewuchs von NCIB 11 270 umgeben. Der Bacteriocinfaktor, der diese Inhibierung verursacht, wurde Thermocin genannt und erwies sich als ein thermostabiles

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Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 13 000.

Die Stämme enthalten ferner ein Plasmid mit einem. Molekulargewicht von etwa 3 000 000, von dem angenommen wird, daß es dieses Thermocin codiert.

Derivate und Mutanten, die noch zur Produktion von GDH befähigt sind, können nach üblichen Standardverfahren wie etwa dem Milieudruck-Verfahren (environmental pressure technique) hergestellt oder auch etwa durch Spontanmutation während des Kultivierens erhalten werden. Die Identifizierung kann durch Inkubation mit Propan-1· 2-diol (einem Substrat für GDH, jedoch nicht für Glycerokinase, die sonst im allgemeinen von thermophilen Bazillen erzeugt wird) und Chloramphenicol und anschließendes Färben mit Triphenyltetrazoliumchlorid identifiziert werden.

Diese Stämme bzw. ihre Derivate oder Mutanten erzeugen allgemein GDH auch in Medien ohne Anwesenheit von Glycerin oder Glycerinanaloga· Zur Erzielung einer maximalen Ausbeute enthält das Kulturmedium jedoch normalerweise mindestens 0,05 Gew.-% Glycerin oder Glycerinanaloga und vorzugsweise weniger als 4,0 Gew.-%. Das Kulturmedium enthält am günstigsten©,1 bis 1,0 Gew.-% Glycerin oder Glycerinanaloga. unter Glycerinanaloga im hier verwendeten Sinne werden beispielsweise polyfunktionelle C^-Alkohole verstanden, insbesondere solche mit zwei Hydroxylgruppen, beispielsweise Glycerinsäure, L- oder D-Glycerinaldehyd, Dihydroxyaceton, 3-Mercaptopropan-i.3-diol, Propan-1.3-diol oder Propan-1.2-diol.

§09849/0.6

Das Kulturmedium kann entweder ein komplexes Medium, das von Naturstoffen abgeleitete Nährstoffquellen wie etwa Peptone, Hefehydrolysate, Fleischextrakt, Caseinhydro lysate und dgl. enthält, oder ein Medium mit definierten Salzen sein, das anorganische und einfache organische Nährstoffquellen enthält.

Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einer Temperatur vorgenommen, bei der der Organismus wächst, typischerweise bei 40 bis 65 ⁰C, sowie insbesondere bei 50 bis 65 ⁰C, und bei einem pH von 5 bis 8. Die Kultivierung kann entweder unter aeroben oder unter anaeroben Bedingungen durchgeführt werden, wobei die aerobe Kultivierung bevorzugt ist. Es hat den Anschein, als ob hierbei eine optimale Kultivierungsdauer besteht, nach der die Ausbeute abfallen kann. Die optimale Kultivierungsdauer hängt von der Art des eingesetzten Stamms sowie den angewandten Kultivierungsbedingungen ab und muß experimentell ermittelt werden. Kultivierungsdauern von 10 bis 20 h erwiesen sich dabei als günstig.

Die Zerstörung der Zellen kann nach herkömmlichen Verfahrensweisen wie etwa durch Beschallung, Homogenisierung oder Enzymbehandlung erfolgen. Danach können herkömmliche Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Enzymen herangezogen werden, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie, Fraktionierung an Calciumphosphaten, Fällung mit Ammoniumsulfat oder einem organischen Lösungsmittel (zB Äthanol mit einer Konzentration von 10 bis 20 Vol.-%), Gelfiltration an Dextranen, Agarose oder Agarose-Polyacrylamid und/oder Affinitätschromatographie an nucleotidmodifizierten Matrizen oder an sulfonsauresubstituierten Chlortriazony!-Farbstoffen ("Procion" Qy ).

909849/0647

Die thermostabilen GDH-Enzyme, die von den oben beschriebenen Stämmen von Bacillus stearothermophilus erzeugt werden, weisen typischerweise eine Struktur auf, die sich aus vier identischen oder ähnlichen Untereinheiten zusammensetzt, die jeweils ein Molekulargewicht von etwa 60 000 besitzen, was ein Gesamt-Molekulargewicht von etwa 240 000 +_ 30 000 ergibt. Im homogenen Zustand besitzen derartige Präparate aufgrund des im folgenden beschriebenen Testverfahrens eine spezifische Aktivität von mindestens 5 und üblicherweise etwa 10 bis 30 Einheiten pro mg Protein bei 30 ⁰C und pH 8,5.

Beim Test unter ähnlichen Bedingungen ergaben sich für Analogsubstrate relativ zu Glycerin (100 %) folgende Aktivitäten (Vmax):

3-Mercaptopropan-i.3-diol 49 Propan-1.3-diol 16

Propan-1.2-diol 165

Dihydroxyaceton < ¹⁰ 1 aufgrund des Leer-

Glycerinsäure <10 J werts nicht genau

meßbar

Die Aktivität wird durch hohe Konzentrationen an NH.-Ionen inhibiert. Die Enzyme sollten vorzugsweise bei niederen Temperaturen (etwa 4 ⁰C) gereinigt werden, um einen Abbau durch Proteasen zu vermeiden; die Präparate werden jedoch nach der Reinigung vorzugsweise bei Raumtemperatur gelagert.

909849/06A⁵J

Die erfindungsgemäßen Enzympräparationen können rohe Zellextrakte oder teilweise oder hochjgereinigte Präparationen darstellen. Sie können dabei in gefriergetrockneter Form oder in anderen festen Formen oder auch als wäßrige Lösungen vorliegen, die je nach dem zu testenden oder zu bestimmenden Glyceringehalt eine Konzentration von 0,1 bis 50 Einheiten/ml aufweisen können.

Die Enzympräparationen können zur Bestimmung von Glycerin oder Glycerinanaloga herangezogen werden, die entweder als solche vorliegen oder durch alkalische Hydrolyse oder Enzymeinwirkung (beispielsweise durch Lipase) in einem weiten Bereich von Proben einschließlich Seren und Kulturmedien aus Glyceriden freigesetzt sind.

Die Erfindung gibt ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Glycerin oder Glycerinanaloga in Probenmaterialien an, bei dem die Probe mit einer Glycerindehydrogenase-Enzym-Präparation und NAD (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid) in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert von mindestens 7 und vorzugsweise 8 bis 8,8 gemischt und die Erhöhung der optischen Dichte bei oder etwa bei 340 nm gemessen wird. Die Glycerinbestimmung erfolgt anschließend durch Vergleich entweder der Geschwindigkeit der Erhöhung der optischen Dichte oder der am Ende resultierenden optischen Dichte mit der optischen Dichte einer Standardlösung.

Bei Verwendung der Bestimmung nach der Geschwindigkeit der Erhöhung der optischen Dichte (ΔΟϋ-,.«) sollten Probe und Standard vorzugsweise so verdünnt sein, daß ein Wert

§09849/0647

im Bereich von 0,06 bis 0,12 pro Minute erhalten

VS

Der Test geschieht nach folgendem Reaktionsschema:

NAD NADH

Glycerin ^ -^ ^ Dihydroxyaceton

GDH

Frühere Tests auf der Basis dieser Reaktion besaßen den Nachteil von üngenauigkeiten, die durch Autokatalyse bedingt waren, da Dihydroxyaceton bei dem verwendeten höheren pH-Wert (mindestens 9, normalerweise 10 bis 11) ein Eno!dimer bildet, das die chemische Reduktion des NAD unabhängig vom Enzym katalysiert.

Beim erfindungsgemäßen Test wird diese Autokatalyse durch Anwendung eines niedrigeren pH-Werts vermieden.

Darüber hinaus wurde festgestellt, daß das Puffersystem die Geschwindigkeit dieser Nebenreaktion beeinflußt. Aus diesem Grund wird erfindungsgemäß als Puffer vorzugsweise ein Aminpuffer, insbesondere ein Triäthanolamin/HCl-Puffer, verwendet, obgleich auch andere Puffer wie etwa Phosphatpuffer anwendbar sind. Auch Carbonat/ Hydrogencarbonat-Puffer sind verwendbar, eignen sich jedoch weniger. Freie Ammoniumionen sollten ferner aufgrund der oben erläuterten Inhibierungswirkung vermieden werden.

§098 49/0647

Die erfindungsgemäßen Enzympräparationen können demgemäß günstigerweise als Teil eines Testkits vorliegen, der das Enzym als getrocknetes, normalerweise gefriergetrocknetes Pulver oder in Form einer wäßrigen Lösung sowie ferner eine Pufferlösung von pH 8 bis 8,8 und eine Lösung von NAD enthält. Der Testkit kann ferner gegebenenfalls auch eine Standard-Glycerinlösung sowie entweder eine Alkalilösung (KOH) oder eine Lipaselösung zur Freisetzung von Glycerin aus Glyceriden enthalten.

Wenn das Enzym in Form einer wäßrigen Lösung vorliegt, kann seine Konzentration in weitem Bereich von 0,1 bis 50 Einheiten/ml je nach der angestrebten Verwendung des Testkits variieren, wobei auch zur Abdeckung verschiedener Glycerinspiegel in den zu untersuchenden Proben mehr als eine Enzymlösung vorgesehen sein können.

Der Puffer ist vorzugsweise ein Aminpuffer, insbesondere ein Triäthanolaminpuffer, und besitzt vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 8,5. Die NAD-Lösung kann irgendeine geeignete Konzentration, typischerweise 10 mg/ml, aufweisen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand typischer Ausführungsformen beispielhaft erläutert. In den Beispielen sind folgende Medien verwendet:

§09849/0647

Bacillus stearothermophilus-Medium (BS-Medium) g/ml

Tryptischer Fleischaufschluß	20
(Bacto tryptons)	10
Hefeextrakt	0,014
FeCl3.6H2O	0,03
MnCl2.4H2O	2,6
K2SO4	0,54
MgSO4.7H2O	0,64
Citronensäure	6,4
Na2HPO4.2H2O

Modifiziertes BS-Medium g/ml

wie oben mit folgenden Unterschieden:

Trypton 2,0

Hefeextrakt 50

K₂SO₄ 6,0

Antischaummittel (RD-Antifoam) 2,5

pH-Einstellung auf 7,1 +_ 0,1 mit 10 NjNj

TSB-Agar

2/1

Trypton (Oxoid L42) 17,0

Soya-Pepton (Oxoid L44) 3,0

Glucose 2,5

NaCl 5,0

K₂HPO₄ 2,5

Agar (Oxoid No. 1) 1,50

Der End-pH betrug 7,3.

§09849/064?

CC!-Medium g/1

NaH₃PO₄.2H₂O 3,12

NH₄Cl 5,04

KCl 0,37

Na₃SO₄-IOH₂O 3,22

Citronensäure-Monohydrat 0,42

ZnO 0,002

FeCl₃.6H₂O 0,027

MnCl₂.4H₂O 0,01

CuCl₂.2H₂O 0,00085

CoCl₂.6H₂O 0,0024

H₃BO₃ 0,00031

MgO 0,05

CaCO₃ 0,01

Na₃MoO₄.2H₂O 0,0024

gelöst in HCl (Endkonzentration 0,2 95 ml konzentrierte HCl pro 1 Medium); pH-Einstellung auf 7,3.

Als Ausgangs-Stamm wurde der Stamm RS93 (hinterlegt als NCIB 11 400) herangezogen. Davon abgeleitete Stämme wurden wie folgt erzeugt:

Aus 200 ml einer flüssigen Schüttelflaschenkultur von RS93 in BS-Medium mit einem GIyceringehalt von 0,4 g/100 ml, die bei 60 ⁰C und 150 U/min über Nacht in einem rotierenden Inkubator inkubiert worden war, wurden verschiedene Verdünnungsplatten auf TSB-Agar hergestellt. Unter Verwendung eines Samtkissens wurden Abdruckplatten

909849/064?

von Platten mit 50 bis 100 Kolonien hergestellt. Die Kolonien auf den Originalplatten wurden anschließend abgetötet, indem die Platten 2 h lang Chloroformdampf ausgesetzt wurden. Diese Platten wurden anschließend mit Feuchtagar (sloppy agar) beimpft, der eine Suspension von B. caldolyticus in ausreichender Konzentration enthielt, daß nach Inkubation über Nacht bei 60 ⁰C ein mattenartiges Wachstum erzielt wurde. Die Abdruckplatten wurden ebenfalls über Nacht bei 60 ⁰C inkubiert und anschließend mit einer wäßrigen Lösung mit 1 Vol.-% 1.2^propan-1.2-diol und 1,5 % (G/V) Chloramphenicol besprüht. Die Platten wurden im Anschluß daran weitere 4 h bei 60 ⁰C inkubiert und danach mit einer 10 %igen Lösung von Triphenyltetrazoliumchlorid in 1M Kaliumphosphat-Puffer pH 7,5 besprüht.

Die Platten mit den abgetöteten Kulturen sowie die Abdruckplatten (replicate^ wurden miteinander verglichen, wobei einzelne Kolonien mit dem größten Inhibitionszonen und einer tief/Lachsroten Färbung von den Abdrücken auf frische Platten übertragen und danach über Nacht inkubiert wurden. Aus diesen Platten in Salz-Normallösung hergestellte Suspensionen wurden in 200 ml BS-Medium eingeimpft, die 4 Vol.-% Glycerin enthielten, und bei 60 ⁰C und 150 U/min auf einer Schüttelmaschine über Nacht (16 h) inkubiert. Die Zellen wurden durch 20 min Zentrifugieren mit 13 000 g bei 4 ⁰C gewonnen, in 100 ml

§09849/064"?

100 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5, der ß-Mercaptoäthanol und PMSF enthielt, suspendiert und danach nochmals 20 min bei 13 00 gzentrifugiert. Nach nochmaligem Waschen mit 50 ml des gleichen Puffers wurden die Zellen in 20 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5 wie oben suspendiert und zweimal 1 min beschallt, wobei die Proben in einem Eisbad so kalt wie möglich gehalten wurden.

Jede Probe wurde im Anschluß daran auf ihre GDH-Aktivität sowie ihr Trockengewicht geprüft. Das isolierte Material mit der höchsten Aktivität und der größten Zellmasse wurde zurückbehalten und&ls SC7 bezeichnet (NCIB 11 401).

Mutanten mit beibehaltener Fähigkeit zur Erzeugung von GDH können durch herkömmliche Milieu druck-Verf ahren erzeugt werden; bei diesen Präparaten kann nachgewiesen werden, daß sie das oben beschriebene Enzym erzeugen.

In einem typischen Mutationsversuch wurde eine Probe des zur Kultivierung des Stamms SC7 verwendeten BS-Mediums der Aminosäureanalyse unterzogen. Dabei ergab sich, daß der Stamm im wesentlichen die Aminosäuren Asparaginsäure, Glutaminsäure, Alanin, Serin und Glycin umwandelt. Demgemäß wurde ein CCl-Medium hergestellt, das an diesen Aminosäuren außer Serin und Glycin 5 mM und an Serin und Glycin mM war und mit Biotin (1 mg/1) und Glycerin (2 g/l) ergänzt war.

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COPV

— ι y —

Nach einigen Reihenübertragungen von SC7 durch dieses Medium wurde festgestellt, daß eine morphologische Mutante auftrat, wenn die Kultur auf TSB-Agar aufgebracht wurde. Einzelne Kolonien wurden isoliert und erwiesen sich als zur Bildung von GDH befähigt, wobei allerdings die hohe Geschwindigkeit der Rückumwandlung in die SC7-Morphologie bei der Kultivierung in BS-Medium eine Abschätzung der Ausbeute erschwerte.

Testverfahren

Die Tests zur Bestimmung der GDH-Aktivität wurden nach der im folgenden erläuterten Verfahrensweise durchgeführt; sämtliche Hinweise auf Aktivitäten in Beschreibung und Ansprüchen beziehen sich auf dieses Verfahren zur Aktivitätsbestimmung.

Grundreagentien:

(i) O,25M Triäthanolamin-HCl (pH 8,5) (ii) 1M Glycerin
(iii) 10 mg/ml NAD

600 μΧ Wasser, 200 μΐ Triäthanolamin-HCl-Lösung 25 μΐ NAD-Lösung und bis 200/il der zu testenden Probe wurden in einer 1-cm-Küvett gemischt. Nach Voräquilibrierung auf 30 ⁰C wurden zur Auslöung der Reaktion 100 μΐ Glycerinlösung zugesetzt.

Die Reduktion des NAD wurde Spektralphotometrisch durch Messung der Absorption der Lösung bei 340 nm verfolgt. Dabei wurde entweder eine Leerprobe aus Wasser oder dem reinen Reagens verwendet; die Einheiten wurden

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COPY

als Mikromol bei 30 °C gebildetes NADII pro Minute ausgedrückt, wobei die Verdünnung so gewählt wurde, daß sich ein Wert .dOD₃₄₀ im Bereich von 0,06 bis 0,12 pro min ergab.

Zu Vergleichszwecken wurde das Verfahren mit einer 50-ul-Probe (etwa 0,5 Einheiten/ml) sowie mit 50 μΐ 0,5M Dihydroxyaceton ohne Enzym (zur Bestimmung des Leerwerts) in Triäthanolamin-, Phosphat- und Carbonat/ Hydrogencarbonat-Puffern bei pH 8, 8,5, 9 und 9,5 wiederholt.

Die erhaltenen Ergebnisse 1 aufgeführt.

sind in Tabelle

Tabelle 1

Lösung	Puffer	pH	4	8	4°D3	40	pH 9	36	pH	9,5 j I	I
Dihydroxyaceton	Carbonat/Hydro-			pH	8,5		,34
Cr\ it 1 f\ C AA	gencarbonat	0				o,		0,	94
DU JIX U, DrI	Phosphat	0		0	,31	0	21	0,	63
	Triäthanolamin-			0	,17
	HCl	0				o,		0,	48
Probe				0	,03
50 μΐ 0,52 E/ml	Phosphat	0,	49			-		-
	Triäthanol-			0	,54
	amin-HCl	0,	39
	0	,49

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß der Leerwert bei niederem pH sowie in Triäthanolamin-Puffer erheblich verringert ist. Die Probenwerte sind bei niederem pH verringert, jedoch bei pH 8 noch geeignet.

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Beispiel 1

B. stearothermophilus RS93 wurde in 100 ml des oben erläuterten BS-Mediums mit einem Glyceringehalt von 4 g/l in einer 400-ml-Flasche 12 bis 16h bei 60 ⁰C unter Schütteln mit 200 ü/min kultiviert. Das resultierende Zellmaterial wurde gesammelt und auf seine GDH-Aktivität geprüft. Die Enzymausbeute betrug 8 Einheiten (E)/g trockene Zellen, was 0,03 E/ml Kultur entspricht.

Beispiel 2

Die Kultur von Beispiel 1 wurde in Abwesenheit von Glycerin wiederholt; die Enzymausbeute betrug 2 E/g trockene Zellen (0,01 E/ml Kultur).

Beispiele 3 und 4

Die Beispiele 1 und 2 wurden unter Verwendung des Stamms B. stearothermophilus SC7 wiederholt. Die Ausbeuten betrugen 0,14 E/ml Kultur bzw. 0,03 E/ml Kultur.

Beispiel 5

In einem BS-Medium mit einem Glyceringehalt von 4 g/l wurde unter Rühren bei 60 ⁰C eine Impfkultur von B. stearothermophilus SC7 in einer Menge von 1 1 hergestellt, die zum Impfen einer ähnlichen Impfkultur in einer Menge von 20 1 verwendet wurde.

Ein 400-1-Kulturgefäß mit 400 1 modifiziertem BS-Medium ohne Glycerin wurde bei 60 ⁰C mit den erhaltenen 20 1 Impfkultur beimpft. Die Kultivierung wurde bei 60 ⁰C

'9 09849/0647

und einem auf 7,0 +_ 0,2 geregelten pH-Wert unter Belüftung mit 300 1 Luft/min und Rühren mit 250 ü/min fortgesetzt, bis die Kultur eine optische Dichte von 0,8 aufwies.

Anschließend wurden 20 1 einer wäßrigen Glycerinlösung mit einer Konzentration von 500 g/l in einer Geschwindigkeit von 1,5 bis 1,6 l/h zugesetzt, als die optische Dichte bei 600 nm 1,3 bis 1,4 erreichte. Nach 19h Gesamt-Kultivierungsdauer wurde die Kultur auf Raumtemperatur abgekühlt, worauf die Zellen in einer De Laval-Zentrifuge gewonnen wurden. Anschließend wurden die Zellen mit Phosphat-Puffer (534 g KH₂PO₄, 761 g Na₃HPO₄, aufgefüllt auf 200 1) gewaschen.

Die End-Gesamtausbeute an Zellen betrug etwa 16 kg feuchtes Material (4 kg Trockenmaterial); die spezifische Aktivität betrug 8,0 E/g feuchte Zellen (35 E/g trockene Zellen), die Gesamtausbeute 128 000 E/400 1 Kultur.

Beispiel 6 (Reinigung)

40 g eines feuchten Zellbreis von B. stearothermophilus RS93 wurden in 150 ml 40 mM Kaliumphosphat-Puffer (KP) (pH 6,8) suspendiert. Die Zellen wurden durch fünfmal 1 min beschallen bei einer Frequenz von 20 kHz zerstört. Die Zellreste wurden durch 20 min Zentrifugieren bei 30 000 g abgetrennt. Der Zellextrakt wurde an DEAE-Cellulose (DE52, Whatman Biochemicals) chromatographiert, die in 40 mM KP (ph 6,8) frisch voräquilibriert worden war. Der Zellextrakt wurde anschließend bei einem Durchsatz von 60 ml/h auf eine 110-ml-Säule (14x3, 2 cm) aufgegeben, wobei das Enzym mit einem linearen 800-ml-Phosphat-Gradienten von 40 bis 400 mM KP (pH 6,8) bei

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einem Durchsatz von 25 ml/h eluiert wurde.

Die Glycerindehydrogenase wurde zwischen 150 und 250 mM Phosphat eluiert.

Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen 10 mM KP (pH 6,8) dialysiert. Der so gewonnene aktive Pool wurde anschließend auf eine 50-ml (6 χ 32 cm)-Triazinfarbstoff-Agarose-Säule (beispielsweise in der GB-Patentanmeldung 3505/78 beschrieben) bei einem Durchsatz von 100 ml/h aufgegeben; die Säulenfüllung bestand entweder aus Procion Red HE-3B oder Procion Red HE-7B (Derivate von Procion Red, Colour Index No. C 118159), gebunden an Sepharose 4B in einer Menge von 1,0 bis 2,0 mg Farbstoff/g Sepharose (vgl. die GB-Anmeldung 3505/78). Die Säule wurde mit 200 ml 10 mM KP (pH 6,8) gewaschen, wobei das Enzym mit 100 ml 1M KCl in 10 mM EP (pH 6,8) eluiert wurde.

Alternativ dazu konnte die Glycerindehydrogenase auf Procion Green HE-4BD/Sepharose 4B oder auf Procion Red HE-3B/Sepharose 4B bei einer Ionenstärke von 10 mM KP bei pH 6,8 bzw. 7,5 adsorbiert werden. Nach Waschen der Säule mit dem Puffer konnte das Enzym mit 10 mM KP, pH 6,8 bzw. 7,5, eluiert werden, wobei der Puffer einen NAD-Gehalt von 4 mM aufwies.

Das aktive Enzym wurde gesammelt und an einer Ultrafiltrationsmembran (Amicon flatbed PM 10) auf ein.Volumen von 5 ml eingeengt. Das aufkonzentrierte Enzym wurde anschließend auf eine 500-ml-Säule (10 χ 2,5 cm) mit einem vernetzten Agarose-Polyacrylamid-Copolymer zur Gelfiltration (Ultrogel AcA 34, Hersteller LKB, Schweden) in einer Menge

909849 '

von 9 ml/h aufgegeben. Die Säule wurde danach mit 50 mM KP (pH 6,8) eluiert, wobei eine Glycerxndehydrogenase mit einem Molekulargewicht von 240 000 +_ 30 000 gesammelt wurde. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der gesammelten aktiven Fraktionen ergab eine einzige Proteinbande bei 58 000 +_ 5 000.

Das am Ende resultierende reine Enzym besaß eine spezifische Aktivität von 5 bis 10 E/mg.

Typische spezifische Aktivitäten in verschiedenen Stufen der Reinigung sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 3

Einheiten

spezifische Aktivität (E/mg)

Zellextrakt 94

DE5 2-Pool 73

Procion-Sepharose-Pool 65

ACA-34-Pool 55

0,03 0,23 2,1

7,8

Beispiel 7

Es wurde wie in Beispiel 6 verfahren, wobei ein feuchter Brei des Stamms SC7 (Beispiel 5) verwendet wurde. Die erhaltenen spezifischen Aktivitäten gehen aus Tabelle 3 hervor.

§09849/0647

Beispiel 8

Es wurde festgestellt, daß das Enzym an frisch suspendierter DEAE-CeIlulose gebunden wird, nicht jedoch an älteren Proben von DEAE-Cellulose oder DEAE-Dextrangel (Sephadex). Aus diesem Grund wurde Beispiel 7 mit dem Unterschied wiederholt, daß anstelle von DEAE-Cellulose der Zellextrakt mit 30 mM KP (pH 7,5) verdünnt und mit einem Durchsatz von 60 ml/min von oben nach unten durch eine 110-ml-Säule mit DEAE-Dextrangel (Sephadex A-50; Pharmacia) hindurchgeschickt wurde, die zuvor in 30 mM KP (pH 7,5) voräquilibriert worden war.

Die durch die Säule laufende aktive Enzymlösung wurde anschließend auf eine Triazin-Agarose-Säule wie in Beispiel 6 aufgegeben.

Die resultierenden spezifischen Aktivitäten sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Beispiel 7 Beispiel 8

Einheiten spezifische Einheiten spezifische Aktivität Aktivität

(E/mg) (E/mg)

Ze11extrakt	280	0,07	280	0,07
DE52/A-50-POO1	186	0,41	223	0,44
Procion-
Sepharose-Pool'	170	3,9	195	3,9
ACA-34-Pool	132	10,5	162	10,9

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— λ D —

Die Erfindung betrifft zusammengefaßt Glycerindehydrogenasen mit außergewöhnlich hoher thermischer Stabilität, die durch Kultivierung neuer Stämme von Bacillus stearothermophilus erhältlich sind; Herstellung und Identifizierung geeigneter Stämme sind oben erläutert.

Die Stämme werden in herkömmlichen Kulturmedien bei 40 bis 65 °C und pH 5 bis 8 kultiviert, die vorzugsweise 0,05 bis 4,0 Gew.-% und insbesondere 0,1 bis 1,0 Gew.-% Glycerin oder eines GIycerinanalogons enthalten.

Das Enzym wird durch herkömmliche Verfahren zur Zerstörung der Zellen und Abtrennung isoliert und besitzt typischerweise ein Molekulargewicht von 240 000 +_ 30 000; es besteht aus vier gleichen bzw. ähnlichen Untereinheiten und weist nach dem oben erläuterten Testverfahren eine spezifische Aktivität von über 5 E/mg Protein bei 30 °C auf.

Die erfindungsgemäßen Präparationen können sowohl in Form wäßriger Lösungen als auch in Form gefriergetrockneter Feststoffe gelagert werden.

Die Enzyme eignen sich beispielsweise zur Bestimmung von Serum-Triglyceriden nach herkömmlichen Testverfahren, vorzugsweise jedoch zum spektralphotometrischen Test mit NAD bei pH 7 bis 8,8. Der pH-Wert wird vorzugsweise mit einem Amin_wpuffer, insbesondere Triäthanolamin-HCl-Puffer, kontrolliert bzw. eingestellt.

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Claims (14)

Ansprüche

1. Glycerindehydrogenase-Präparation, gekennzeichnet durch eine Halbwertszeit der Aktivität von mehr als 4 Tagen bei· Lagerung bei 20 ⁰C als Lösung mit einer Konzentration von 3 mg/ml in einer Pufferlösung von pH 6,8 und 5C ncü/l KaMumphosphat, iOmol/1 ß-Mercaptoäthanol und O,1mol/1 Phenylmethylsulfonylfluorid.

2. GDH-Präparation nach Anspruch 1 mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 5 E/mg Protein bei 30 ⁰C.

3. GDH-Präparation nach Anspruch 1 oder 2 in Form einer wäßrigen Lösung mit einem Enzymaktivität von 0,1 bis 50 E/ml.

4. GDH-Präparation nach Anspruch 1 in gefriergetrockneter oder einer anderen festen Form.

5. GDH-Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie von Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400, NCIB 11 401 oder Glycerindehydrogenase produzierenden Derivaten oder Mutanten davon abgeleitet ist.

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6. Verfahren zur Herstellung der GDH-Präparationen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 durch Kultivieren mindestens eines zur Erzeugung von GDH befähigten Mikroorganismus in einem Kulturmedium, Aufbrechen der Zellen und Abtrennung des Enzyms von den Zellresten, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 oder NCIB 11 401 oder GDH produzierende Derivate oder Mutanten davon verwendet werden.

7. Testkit mit einer GDH-Präparation, einer NAD-Lösung sowie einer Pufferlösung,

dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung einen pH-Wert von 7 bis 8,8 und vorzugsweise 8 bis 8,8 aufweist.

8. Testkit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Puffer einen AminL_puff er, vorzugsweise Triäthanolamin-HCl-Puffer, enthält.

9. Bacillus stearothermophilus-Stämme, gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit zur Erzeugung von GDH.

10· Stämme von Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 und NCIB 11 401 als Stämme nach Anspruch 9.

11. Verfahren zur Herstellung von Stämmen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Stämme Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 und NCIB 11 401 Milieudruckverfahren unterworfen und die GDH erzeugenden Stämme aus den

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resultierenden abgeleiteten Stämmen selektioniert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Stämme dem Milieu-druckverfahren durch Kultivierung in einem definierten Medium unterworfen werden, das auch Serin, Glycin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin enthält.

13. Verfahren zur Bestimmung von Glycerin oder Glycerinanaloga in einer Testprobe durch Vermischen der Probe mit einer GDH-Präparation, einer Enzym-Präparation und NAD in einer Pufferlösung,

dadurch gekennzeichnet, daß eine Pufferlösung von pH 7 bis 8,8 und vorzugsweise 8 bis 8,8 verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,

daß als Puffer ein Amin^puffer, vorzugsweise ein Triäthanolamin-HCl-Puffer, verwendet wird.

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