DE2413963A1 - Verfahren zur herstellung von 2-ketol-gulonsaeure und deren salzen auf mikrobiologischem wege - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 2-ketol-gulonsaeure und deren salzen auf mikrobiologischem wege

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Description

" Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen auf mikrobiologischem Wege "
Priorität: ' 22. März 1973, Japan, Nr. 32 842/1973
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen auf mikrobiologischem V/ege.
2-Keto-L-gulonsäure ist ein wertvolles Zwischenprodukt zur Synthese von Ascorbinsäure und wurde bisher großtechnisch nach dem sogenannten Reichstein-Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren umfaßt jedoch eine Anzahl von komplizierten Stufen, so daß lediglich geringe Ausbeuten erreicht werden. Es ist sehr schwierig, wenn nicht vollständig ausgeschlossen, die Gesamtausbeute bei diesem Verfahren zu verbessern.
Bisher wurden eine Anzahl von Vorschlägen gemacht,.die sich damit befassen, die Anzahl der einzelnen Stufen zu vermindern und bzw. oder die Gesamtausbeute zu verbessern. Beispielsweise wurde ein biochemisches Verfahren vorgeschlagen, bei dem 5-Keto-D-
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gluconsäure selektiv zu L-Idonsäure reduziert wird, welche anschließend zu 2-Keto-L-gulonsäure oxidiert wird. Ferner ii;t ein mikrobiologisches Verfahren zur direkten Umwandlung von L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure und ähnlichen Produkten bekannt.
Durch die vorgenannten Verfahren wurde die.Anzahl der Stufen, die zur Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure nötig sind» zusiincicst theoretisch verringert. Diese Verfahren konnten jedoch ausnahmslos die Gesamtausbeute nicht verbessern. Außerdem sind sie nur mit Schwierigkeiten durchzuführen, dies gilt insbesondere i'ür kontinuierliche Verfahren. Schließlich haben diese Verfahren den Nachteil, daß Nebenprodukte in großer Menge und Αηζέ-hl entstehen, die aus dem erhaltenen Gemisch nur unter Schwierigkeiten abzutrennen sind. Die vorgenannten Verfahren eignen.sich also nicht zu einer wirtschaftlichen, großtechnischen Herstellung von 2-Keto-L~gulonsäure.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure zur Verfugung zu stellen, durch das die Anzahl der bei den bekannten Verfahren nötigen Stufen vcr-iiürcert
großtechnisch wird und nachdem sich 2-Keto-L-gulonsäure in guten Ausbeuten / herstellen läßt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen 2-Keto-L-gulonsäure bildenden Hikroorganismenstarnm der Gattungen Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Staphylococcus, Micrococcus oder Pseudomonas oder ein aus den
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entsprechenden Mlkroorganismenzellen erhaltenes Produkt in Kontakt mit 2,5-Diketo-I)~gluconsäure oder deren Salzen bringt und die gebildete 2-Keto~L«gulonsäure oder deren Salze aus dem Gemisch isoliert.
Das im erfindungsgeraäßen Verfahren verwendete Ausgangsmaterial, d.h. 2,5-Diketo-D-gluconsäure', deren Salze'oder Fermentationsprodukte, die diese Säure oder deren Salze enthalten, können in guten Ausbeuten beispielsweise durch Oxidation von D-Glucose auf -mikrobiologischem Wege erhalten v/erden. Im folgenden werden Substanzen, die die 2,5-Diketo-D-gluconsäure oder deren Salze enthalten, einfach als Substrate bezeichnet.
Bevorzugte Beispiele für 2-Keto-L-gulonsäure bildende Stämme sind folgende im Verlauf dor Entwicklungsarbeiten für das erfin dungsgemäße Verfahren aus Boden- und Abwasserproben isolierte Stämme: Brevibactorium ketosoreductum- nov, sp. ASM-1005 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute unter der Nummer FERIu-P 1905 und bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC--2191*0, Arthrobacter simplex ASM-10 (FKRM-P 1902; ATCC 21917), 'Bacillus megaterium ASM-20 (FLRM-P 1903; ATCC 2I9I6) und Staphylococcus aureus ASM-30 (FERM-P 1904, ATCC
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich beispielsweise auch mit folgenden beim Institute of Fermentation, Osaka (IFO), hinterlegten und auf Anfrage erhältlichen Stämmen durchführen: Microooccus denitrificans IFO 12442', Micrococcun rubens JFO J376O, IlLcrococcus roseus IFO 3764 und Pseudomonas chloro-
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raphis IFO 3904.
Die im Verlauf der Untersuchungen aus Bodon- und Abwasserproben isolierten Mikroorganismen werden im folgenden taxonomisch näher beschrieben.
I. Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. ASM-1005 A. Beobachtungen:.
(1) Gestalt der Zellen (3 Tage bei 300C auf Bouillon-Agar-Schrägkulturen und Bouillon-Brühe):
Stäbchen mit den Abmessungen 0,4 - 0,7 u χ 0,8 » 1,4 υ. und abgerundeten Enden treten einzeln und paarweise auf. Schnappende Teilung tritt auf, aber es wird keine Verzweigung beobachtet.
(2) Beweglichkeit: bsweglich mit peritrichen Geißeln.
(3) Sporen: keine Bildung.
(4) Gram-Färbung (7 Tage bei 300C auf Bouillon-Agar-Schrägkultüren): positiv.
(5) Säxiref es t.i gkeit: negativ.
auf verschiedenen Medien^
(1) Bouillon-Agar-Kolorsien (24 bis 48 Std. bei 300C):
-flächig,
kreisförmig, glatt/ glattrandig, konvex, glänzend, durchscheinend, orange-gelb.
(2) Eouillon-Agar-Schrägkultur ( 24 bis 72 Std. bei 300C): mäßiges Wachstum, fadenförmig und "butterartig, orange-gelb bis orange,, aber das Pigment wird nicht im JIo dium dispcr/^iert.
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(3) Bouillon-Brühe ( 7 Tage bei 30°C):
mäßig trüb; membranartiges Oberflachenwachsturn, viskoses Sediment; kein Geruch.
(4) Bouillon-Gelatinesfcich:
Verflüssigung; bei- 200C ist nach 2 Tagen eine leichte Verflüssigung feststellbar; nach 7 Tagen sackförmige
tiefung
ver~/(Durchmesser etwa 4 ram und Tiefe etwa 7 mm); bei 25 und 300C wird·eine ausgeprägtere Verflüssigung beobachtet .
(5) Lsctenusmilch (14 Tage bei 300C):
sauer; leicht.koaguliert.
(6) Kartoffel-Schrägkultur (14 Tage bei 30°C): geringes Wachstum; blaß orange-gelb glänzend.
(7) Bouillon-D-gluconat-Agar-Schrägkultur (72 Stunden bei 300C): · reichliches Wachstum; fadenförmig;viskos hell orange-gelb glänzend.
Phv Biologische Eigensch? f. ten
(Sofern nicht anders angegeben beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14-tägiger Züchtung bei 300C):
(1) Nitrit: Iceine Bildung aus Nitrat.
(2) Denitrifikationi In einem mit Paraffin verschlossenem Nährboden aus Bouillon-Brühe, der 1 Prozent KNO-, ent-' hält, wird weder Wachstum noch Gasbildung beobachtet.
(3) Methylrot-Test: positiv.
(4) Voges-Proskauer-Reaktion: negativ.
(5) Indol: koine- Bildung
(6) iJchvjefe.lv/3Sserstoff: wird gebildet.
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(7) Ammoniak: geringfügige Bildung.
(8) Stärke: keine Hydrolyse.
(9) Wachstum auf Citrat-Medium:
(I) Koser-Medium: spärliches Wachstum
(II) Christensen-Mediura: Wachstum.
Gegenwart von
(10) Wachstum in/ anorganischen Stickstoffquellen:
(I) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium): kein VachstuK·,
(II) Nitrat (Glucose-Dimmick-Mediurn): Das Medium färbt sich leicht gelblich.
(11) Farbbildung: orange-gelb bis orange auf Bouillon-Agar-Schrägkultur, keine Diffusion.
(12) Urease: positiv.
(13) Catalase: positiv.
(14) Oxidase: (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 18 bis 24 Stunden, .Tetramethylphenylendiamin): leicht positiv.
(15) Temperatureinfluß:
(I) Wachstum im Temperaturbereich 10 bis 400C; kein Wachstum bei 40C und bei 45°C.
(II) Optimales Wachstum bei 28 bis 35°C
(16) pH-Einfluß:
(I) Wachstum bei pH-Wert 5,0 bis 10,0.
(II) Optimales Wachstum bei pH-Wert 6,0 bis 8,0.
(17) Sauerstoffbedarf: Fakultativ (mit Paraffin verschlossene Stichkultur färbt sich einheitlich gelb).
(18) O-F-Test (Hugh-Leifson-Verfahren):
Unter anaeroben Bedingungen wird Säure aus D-Glucose gebildet, während aus Lactose weder Säure noch Gas gebildet wird.
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(19) Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):
(I) Aus D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Mannit und Glycerin (schwach) wird Säure aber kein Gas gebildet.
(II) Aus L-Arabinose, Lactose, D-Sorbit, Inosit und Stär ke wird weder Säure noch Gas gebildet.
(20) Cellulose (Peptonwasser + mikrokristalline Cellulose): keine Hydrolyse.
(21) Methylenblau (Bouillon-Brühe, 18 bis 24 Stunden): Reduktion.
(22) D-Gluconsäure: Verwertung.
(23) 2-Keto-D-gluconsäure: geringfügige Verwertung.
D. Herkunft: Bodenproben.
Beim Vergleich der vorstehenden taxonomisehen Eigenschaften mit den Ausführungen in Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage (im Folgenden als "Manual" bezeichnet) gelangt man zu dem Schluß, daß der genannte Stamm zur Gattung Brevibacteriun gehört, da er wahlweise aerob oder anaerob ist, aus gram-positi-· ven kurzen Stäbchen besteht, keine Sporen bildet und eine schnappende Zellteilung aber keine Verzweigungen aufweist.
Der Stamm zeigt gewisse Übereinstimmungen mit den Angaben des Manual für Brevibacterium acetylicum. Auf Grund der folgenden Beobachtungen wird angenommen, daß eine enge Verwandtschaft zur letztgenannten' Species besteht: beweglich, Gelatineverflüssigungj
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orange-gelbe bis orange Färbung auf Bouillon-Agar-Schrägkultür und schwaches V.Tachstum unter blaß orange-gelber Färbung auf Kartoffel-Agar-Schrägkultur. ' "
Jedoch unterscheidet sich der erfindungsgemäße Stamm auf Grund der nachstehenden taxonomisehen Eigenschaften stark von der im Manual angegebenen Beschreibung für Brevibacterium acetylicum: Eigenschaften der Kolonien und der Kulturen auf Bouillon-Brühe; saure Reaktion mit IacJonusmilch und schwache Koagulierung desselben; keine Peptonisierung; keine Stärkehydrolyse; relativ hohes Temperaturoptimum von 28 bis 35 C und negative Voges-Froskauer-Reaktion.
Da die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes auch nicht mit denen von anderen bekannten Species dieser Gattung übereinstimmen, wird er als neuer Stamm angesehen und mit Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. bezeichnet.
tt* Arthrob3^cJ:_er siniplex .ASM-IΌ:
A. Beobachtungen:
(1) Gestalt der Zellen:
Bei 300C in Bouillon-Brühe haben die Zellen während der induktiven Wachstumsperiode, d.h. zu Beginn der Inkubation, die Form von kurzen Stäbchen mit den Abmessungen 0,8 - 1,Ou χ 1,5 - 2,0 u und abgerundeten Enden. Während der logarithmischen Wachstumsph.ase v/erden die Stäbchen langer (0,8 - 1,0 u χ 6,0- 8,0 u). Mit fortschreitender Züchtung werden sie während der stationären Phase kok,kenförmig.
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~ 9 —
Ira Vergleich zur Züchtung auf Bouillon-Brühe treten bei Züchtung auf Bouillon-Agar-Schrägkulturen bei 300C kleinere Zellen in reichlichem Umfang auf. Diese haben zwar während der Anfangsphase der Züchtung die Form von Stäbchen mit den Abmessungen 0,5 - 0,8 u χ 1,4 - 1,8 u, werden aber mit fortschreitender Züchtung länger. Schließlicht herrscht in älteren Züchtungsansätzen (48 bis 72 Stunden)die Kokkenform vor.
Bei beiden Züchtungen variieren die Zellen in Ausmaß und Form, d.h. es' v/erden gekrümmte, angeschwollene und kokkeriförmige Zellen beobachtet.
(2) Beweglichkeit: b-.>v,reglich mit peritrichen Geißeln.
(3) Sporen: keine Bildung.
(4) Gram-Färbung: negativ bei jungen Kulturen. Später herrschen Kokkenformen vor, die positiv gefärbt werden können,
(5) Säurefestigkeit: negativ.
^aohgtum^ a^^y^rschj.odenen Medien^
(1) Bouillon-igar-Kolonien (24 bis 72 Stunden bei 300C):
Am Anfang der Züchtung kreisförmig, glattfläebig, glattrandig, erhaben, cremefarben, glänzend und undurchsichtig; mit fortschreitender Züchtung wird der Rand v;r llcnförmig.
(2) Bouillon-Aßar-Schrägkultur (2.4 bis 72 Stunden bei 30°C):
. V/achsturn mäßig, fadenförmig, cremefarben, butterartig und glänzend.
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(3) Bouillon-Brühe (7 Tage bei 30°ü):
mäßig trüb; kein Oberflächenwachstum; flockiges oder schuppenartiges Sediment ohne Geruch.
(4) Bouillon-Gelatinestich (21 Tage bei 200C):
2 oder 3 Tage später wird Verflüssigung beobachtet. Anschließend tritt nach 5 Tagen eine 1 bis 1,5 cm tiefe, ·
sackförmige Vertiefung auf; gutes Wachstum entlang der Einstichlinien.
(5) Bodenextrakt-Agar-Schrägkultür (24 Stunden bei 30°C): Wachstum mäi3ig, fadenförmig, glattflächig, flach, schv/achgelb und glänzend.
(6) Arginin-i.gar-Schrägkultur (48 Stunden bei 300C): kein Wachstum.
(7) Leritousmilch (14 Tage bei 300C):
Nach 3 Tagen saure Reaktion; am 7. Tag und später wird deutliche Koagulation beobachtet.
(8) Kartoffel-Agar-Schrägkultur (14 Tage bei 300C): Wachstum mäßig, glänzend; v/eiß bis cremefarben.
* Physiologische Eigenschaften
(Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen bei 300C):
(1) Nitrit: Bildung aus Nitrat.
(2) Denitrifikation: Wachstum aber keine.Gasbildung auf mit Paraffin verschlossener Bouillon-Brühe, die 1 Prozent KIiO3 enthält.
(3) Kethylrot-Test: positiv.
(4) Vogeo-Proskauer-Reaktion: negativ.
(5) Indol: keine Bildung.
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(6) Schwefelwasserstoff: Bildung.
-(7) Ammoniak: geringfügige Bildung,
(8) Stärke: keine Hydrolyse.
(9) Wachstum auf Citrat-Medien:
(i) Koser-Hedium: Wachstum.
(II) Christensen-Medium: Wachstum.
(10) Wachstum in Gegenvrart von anorganischen Stickstoff quellen:
(I) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium): Wachstum.
(II) Nitrat (Glucose-Dimmick-Medium): Wachstum. ,
(11) Bildung von Farbe: Cremefarben auf Bouillon-Agar-Schrägkultur, keine Diffusion,
(12) Urease: negativ.
(13) Catalase: positiv.
(14) Oxidase (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 18 bis 24 Stunden, Tetramethylphenylendiamin): leicht positiv. ■
(15) Temp eratüreinfluß:
(I) Wachstum bei 10 bis 37°C; kein Wachstum bei 4 und bei 40°C.
(II) Optimales Wachstum bei 25 bis 310C
(16) pH-Einfluß:
(I) Wachstum, bei pH-Wert 5,0 bis 9,0.
(II) Optimales Wachstum bei pH-Wert 6,0 bis 8,0.
(17) Sauerstoffbedarf: fakultativ (eine mit Paraffin verschlossene Stichkultur wird einheitlich gelb).
(18) O-F-Test: Unter anaeroben Bedingungen wird aus D-Glucose und Lactose Säure gebildet.
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(19) Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):
(I) Aus D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Saccharose, Lactose und D-Mannit wird Säure aber kei.n Gas gebildet.
(II) Aus L-Arabinose, Maltose, Trehalose, D-Sorbit, Stärke und Inulin wird weder .Säure noch Gas gebildet.
(20) Cellulose (Peptonwasser + mikrokristalline Cellulose): keine Hydrolyse.
(21) Methylenblau (Bouillon-Brühe, 18 bis 24 Stunden): keine Reduktion.
(22) D-Gluconsäure: Verwertung.
(23) 2-Keto--D~gluconsäure: Verwertung.
ft_:__ Bodenproben
Beim Vergleich der vorgenannten taxonomisehen Eigenschaften mit der Beschreibung im Kanual kommt man auf Grund folgender Feststellungen zu dem Schluß, daß der erfindungsgemäße Stamm zur Gattung Arthrobacter gehört: Kurze Stäbchen bei Beginn der Züchtung, die mit fortschreitender Inkubation länger und schließlich in alten Kulturen kokkenförmig werden; junge Kulturen sind gramT negativ, während alte Kulturen bei vorherrschender Kokkenform gram-positiv sind.
Folgende Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes fallen mit dem im Manual angegebenen Eigenschaften von Arthrobacter simplex zusammen: Verwertung von Nitraten und Ammoniumsalzen als Stick-
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stoffquellen; Verwertung von Citraten als organische Nährstoffe; ausreichendes Wachstum bei 370C.
Aus diesen Gründen wird der erfindungsgemäße Stamm als Arthrobacter simplex bezeichnet, wenngleich er sich in folgenden Punkten geringfügig unterscheidet: kein Wachstum auf Arginin-Agar-Schrägkulturen, cremefarbene Färbung von Kartoffel-Agar-■ Schrägkulturen, Koagulation von Lsckmusmilch und saure Redaktion sowie Wachstuüisternperatur.
III. Bacillus mefiaterium ASM-20
(1) Gestalt der Zellen (Bouillon-Agar-Schrägkultür, 8 bis 48 Stunden bei 3O0C):
Stäbchen mit den Abmessungen 1,0 - 1,2 u χ 2,5 - 4,0 u mit abgerundeten oder eckigen Enden treten einzeln oder paarweise und gelegentlich in Ketten auf. Häufig werden fadenartige und geschwungene Formen beobachtet.
(2) Beweglichkeit (Bouillon-Agar-Schrägkultür, 8 bis 24 Stunden bei 20 und 300C): nicht beweglich.
(3) Sporen (Bouillon-Agar-Schrägkultür, 300C): Ellipsoide mit den Abmessungen 0,8 - 1,0 u χ 1,4 - 1,6 yi, Ein Schwellen des Sporangiums v/ird .nicht beobachtet. Subterainal bis terminal und vielgestaltig in 48 Stunden.
(4) Gram-Färbung (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 8 bis 48 Stunden bei 300C): positiv*
(5) fiaurofeatlgkeit (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 3ü°C):
negativ.
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(6) Kapsel-Färbung: positiv.
B. Wachstum auf verschiedenen Medien:
(1) Bouillon-Agar-Kolonien (24 bis 72 Stunden bei 300C): Kreise von 1 bis 4 mm Durchmesser, rauh, wellenförmig, erhaben,konzentrische Ringe,
schwach glänzend, cremefarben und undurchsichtig.
(2) Bouillon-Agar-Schrägkultür (24 bis 48 Stunc3en bei 30°C): Wachstum reichlich, fadenförmig, cremefarben, viskos aber nicht haftend, schwach glänzend und leicht faltig.
(3) Bouillon-Brühe (8 Tage bei 300C):
nach 1 oder 3 Tagen flockige Trübung; Brühe relativ klar mit geringen Mengen an flockigem Sediment; kein Oberflächenwachstum und kein Geruch.
(4) Glucose-Eouillon-Schrägkultur (24 Stunden bei 30°C): Wachstum reichlicher und viskoser (klebend) als auf Bouillon-Agar-Schrägkultür; faltig; eintönig und cremefarben.
(5) Bouillon-Gelatinestich (12 Tage bei 30°C):
Nach 5 Tagen wird schichtförmige Verflüssigung beobachtet, während entlang der Stichlinie kein Wachstum und keine Verflüssigung beobachtet werden.
(6) Lsdsn lsmilch (13 Tage bei 300C): leicht saure Reaktion; Peptonisierung wird beobachtet.
(7) Gestrichene Milch-Agar-Platte (48 Stunden bei 30°C): große durchsichtige Hydrolysezone um die Kolonie.
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(8) Kartoffel-Agar-Schrägkultur (13 Tage bei 30°C): Wachstum reichlich, sich ausbreitend, cremefarben bis hellgrau, glänzend, grobfaltig; viskos und klebend; nach 6 Tagen wird das Medium gräulich braun gefärbt.
(9) Tyrosin-Agar-Schrägkultur (7 Tage bei 300C): Wachstum mäßig, keine Pigmentbildung.
Physiologische Eigenschaften
(Sofern nichts anderes angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen bei 3O0C):
(1) Nitrit: keine Bildung aus Nitrat.
(2) Denitrifikation: In einer mit Paraffin verschlossenen Bouillon-Brühe, die 1 Prozent KNO^ enthält, wird weder Wachstum noch Gasbildung beobachtet.
(3) Methylrot-Test: positiv.
(4) Voges-Proskauer-Reaktion: negativ.
(5) Indol: keine Bildung.
(6) Schwefelwasserstoff: geringfügige Bildung.
(7) Ammoniak: keine Bildung.
(8) Stärke: Hydrolyse.
(9) Wachstum auf Citrat-Medien:
(i) Koser-Medium: Wachstum.
(II) Christensen-Medium: Wachstum.
(10) Wachstum in Gegenwart von anorganischen Stickstoffquellen:
(I) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium): Wachstum. (IJ.) Nitrat (Glucose-Dimmick-Medium): Wachstum.
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-•16 - .- ■ :\-
c t t
• I ItII
(11) Bildung von Farbe: auf Bouillon-Agar-Schrägkultur keine oder cremefarbene Färbung, keine Diffusion.
(12) Urease: positiv.
(13) Catalase: positiv.
(14) Oxidase: negativ.
(15) Temperatureinfluß:
(I) Wachstum bei 20 bis 45°C ; kein Wachstum bei 1O°C.
(II) Optimales Wachstum bei 30 bis 35°C.
(16) pH-Einfluß:
(I) V/achstum bei pH-T/,rert 6,0 bis 9,0. ·
(II) Optimales tfachstun bei pH~V.rert 7,0.
(17) Sauerstoffbedarf: aerob (Wachstum nur an der Oberfläche der Stichkultur).
(18) O-F-Te&t: unter aeroben Bedingungen Säurebildung aus D-Glucose. Etwa 1/4 der oberen Schicht der Stichkultur wird gelb gefärbt. .
(19) Säurebildung (Hucker-Medium unter Zusatz eines Aramohiumsalzes)i nach 24 Stunden Säurebi.ldung aus Mannit.
(20) Säure- und Gasbildung aus Zuckern (Bars i ekow-Medium):
" (I) Aus L-Arabinose, D-XyIose*, D-Glucose*, Maltose, Saccharose*, D--Mannit*, Trehalose und Glycerin* Säure aber kein Gas gebildet.
(*: Nach der Säurebildung wird das Medium alkalisch
gemacht)-
(II) Aus D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Lactose, D-Sorbit, inosit und Stärke v/erden weder Säure noch Gas gebildet. - .
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(21) Cellulose (Peptonvasser + mikrokristalline Cellulose): Hydrolyse.
(22) Methylenblau (Bouillon-Brühe, 24 Stunden): schwache Reduktion.
(23) Salzverträglichkeit: In einer 9 Prozent NaCl enthaltenden Bouillon-Brühe wird nach 6 Tagen tfachstura beobachtet.
D* Herkunft^; Bodenproben
Auf Grund folgender Feststellungen kommt man beim Vergleich der vorgenannten taxonornisehen Eigenschaften mit aen Angaben .im Manual zu dem Schluß, daß·der erfindungsgemäßc Stamm zur Gattung Bacillus gehört: Catalase-positive, aerobe und grampositive Stäbchen und Sporenbildung.
Folgende Feststellungen lassen auf eine Ähnlichkeit mit den in' Manual beschriebenen Species Bacillus rnegaterium schließen: kein Schwellen des Sporangiums, große Zellen mit einem Durchmesser von mehr als 0,9 U, negative Voges-Proskauer-Reaktiorj und Säurebildung aus Mannit unter Verwertung von Arcrrioniums-.l ?:on.
Zusätzlich zu den vorgenannten Feststellungen ergibt sich eine auffallende Übereinstimmung mit einer Variante von Baccilus megaterium, die im Manual aufgeführt ist. Der Stamm wird daher als zur Species Bacillus megaterium gehörig .identifiziert und als Bacillus megaterium ASM-20 bezeichnet.
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IV. Staphylococcus aureus ASM-30?
A. Beobachtungen:
(1) Gestalt der Zellen (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 300C): kugelförmig mit einem Durchmesser von 0,9 "bis 1,2 u, einzelnes oder paarweises Auftreten und gelegentlich kurze Ketten und unregelmäßige Klumpen.
(2) Beweglichkeit (Bouillon-Agar-Schrägkulturen bei 20, 25 und 30°C): nicht beweglich.
(3) Sporen (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 300C): keine Bildung.
(4) Grara-Färbung (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 300C): positiv.
(5) Säurefestigkeit (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 30°C): negativ.
B. Wachstum auf verschiedenen Medien.
(1) Bouillon-Agar-Kolonien (24 bis 48 Stunden bei 300C): kreisförmig, glattflächig, glattrandig, undurchsichtig, orange-gelb und glänzend.
(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur (24 bis 48 Stunden bei 300C): Wachstum mäßig, fadenförmig, glänzend, butterartig, orange-gelb; das Pigment dispergiert nicht in das Medium.
(3) Bouillon-Brühe (7 Tage bei 300C): mäßige Trübung; kein Oberflächenwachstum; viskoses Sediment ohne Geruch.
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- 2A13963
(4) Bouillon-Gelatinestich (12 Tage bei 20 und bei 25°C): vom dritten Tag an schichtförmige Verflüssigung unter Bildung von gelben Häutchen und gelbem Sediment.
(5) Lecteusmilch (14 Tage bei 30°C): leicht saure Reaktion, keine Koagulation.
(6) Kartoffel-Agar-Schrägkultür (14 Tage bei 300C): mäßiges Wachstum (2 Tage lang), fadenförmig, weiß bis cremefar-
" ben und glänzend.
fSofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14.Tagen bei 30 C):
(1) Nitrit: keine Bildung aus Nitrat.
(2) Denitrifikation; Wachstum aber keine Gasbildung in einer mit Paraffin verschlossenen Bouillon-Brühe, die 1 Prozent KNO-j enthält.
(3) Methylrot-Test: positiv.
(4) Voges-Proskauer-Reaktion: negativ.
(5) Indol: keine Bildung.
(6) Schwefelwasserstoff: keine Bildung.
(7) Ammoniak: Bildung.
(8) Stärke: keine Hydrolyse.
(9) Wachstum auf Citrat-Medien:
(i) Koser-Medium: kein Wachstum. (II) Christensen-Medium: kein Wachstum.
(10) Wachstum in Gegenwart von anorganischen Stickstoffquellen:
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(I) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium): kein Wachstum.
(II) Nitrat (Glucose-Dimmick-Medium): kein Wachstum.
(11) Bildung von Farbe: orange-gelb auf Bouillon-Agar-Schrägkultur, keine Diffusion.
(12) Urease: schwach positiv.
(13) Cätalase: positiv.
(14) Oxidase: negativ
(15) Temperatureinfluß:
(I) Wachstum bei 10 bis 400C; kein Wachstum bei 4 und bei 450C
(II) Optimales Wachstum bei 35 bis 40°C.
(16) pH-Einfluß:
(I) Wachstum bei pH-Wert 5,0 bis 9,0.
(II) Optimales Wachstum bei pH-Wert 6,0 bis 7,0. ■
(17) Sauerstoffbedarf: fakultativ (Wachstum in allen Schichten einer mit Paraffin verschlossenen Stichkultur).
(18) O-F-Test: unter anaeroben Bedingungen Bildung von Säure aus D-Glucose.
(19) Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern
(BarsiekovMledium):
(I) Aus D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Mannit und Glycerin Säurebildung aber keine Gasbildung. Die Säurebildung aus D-Mannit ist gering.
(II) Aus L-Arabinose, D-Xylose, Maltose, D-Sorbit,
Inosit und Stärke werden weder SÄure- noch Gasbildung beobachtet.
(20) Cellulose (Peptonwasser + mikrokristalline Cellulose): keine Hydrolyse.
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(21) Methylenblau (Bouillon-Brühe, ?Λ Stunden): leichte Reduktion.
(22) D-Gluconat: Verwertung.
(23) 2-Keto-D-gluconat: schwache Verwertung.
(24) Coagulase (Bacto.-Coagulase-Plasma von Difco): positiv.
(25) Blut-Agar: ß-Häraolyse wird beobachtet.
(26) Salzverträglichkeit (NaCl enthaltende Bouillon-Brühe): gutes Wachstum bei 11 Prozent, Wachstum bei 13 Prozent und kein Wachstum bei 15 Prozent.
(27) Milchsäure: Bildung aus D-Glucose.
D. Herkunft: Abwässer.
Auf Grund folgender Feststeilungen kommt man beim Vergleich der vorgenannten taxonomischen Eigenschaften mit" den Angaben im Manual zu dem Schluß, daß der erfindungsgemäße Stamm zur Gattung Staphylococcus gehört: Kokken, die unregelmäßige Klumpen bilden; gram-positiv; keine Sporen? wahlweise aerob oder anaerob; Salzverträglichkeit; unter anaeroben Bedingungen Bildung von Säure aus D-Glucose.
Die physiologischen Eigenschaften des erfindungsgemäß verwendeten Stammes stimmen mit den Angaben im Manual für Staphylococcus aureus darin überein, daß aus D-Mannit Säure gebildet wird (wenn auch nur sehr schwach) und daß er koagulasepositiv ist.
Die geringfügigen Abweichungen ire Wachstum auf Bouillon-Brühe, Bouillon-Gelatinestich und Lochum-Hilch und in der Bildung von
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Acetoin werden nicht als sehr signifikant angesehen. Deshalb wird der Stamm als zur Species der Staphylococcus aureus zugehörig angesehen und als Staphylococcus aureus ASM-30 bezeichnet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch Mutanten der vorge-
durch nannten Mikroorganismenstämme verwendet werden, die/künstlicfc oder induktive Mutation erhalten worden sind. Beispielsweise kann die mutagene Behandlung durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder durch Behandlung mit mutagenen Substanzen,'-de Stickstofflost; durchgeführt werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die vorgenannten Stämme auf ein Nährmedium überimpft und darin inkubiert. Das verwendete Nährmedium enthält das vorgenannte Substrat. Die Zellen des gewählten Stammes, beispielsweise ruhende Zellen oder durch eine beliebige Behandlung dieser Zellen erhaltene Produkte} läßt man direkt auf das Substrat einwirken. Es können beliebige, bekannte Inkubationsverfahren angewendet werden, besonders bevorzugt sind aber Fermenter in Form von tiefen, belüfteten und gerührten Tanks. Besonders gute Ergebnisse v/erden durch Inkubation eines flüssigen Nährmediums erhalten.
Die Wahl des Nährmediums zur Züchtung der Mikroorganismen ist nicht kritisch. Besonders geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an anderen Nährstoffen enthalten.
Als Stickstoffquellen können anorganische oder organische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen ent-
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• * t t · 5 *
halten, verwendet werden. Beispiele sind Ammoniumsalze, Nitratsalze, Maisquellwasser, Pepton, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Hefe und Harnstoff.
Als Kohlenstoffquellen können neben der als Ausgangsmaterial verwendeten 2,5-Diketo-D~gluconsäure beispielsweise mehrwertige Alkohole oder Zucker verwendet werden, wie Glucose, Glycerin, Saccharose, Lactose, Dextrin, Maltose und Melassen.
Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Kalium, Zink, Kupfer, Eisen und anderen Metallen.
.Gegebenenfalls wird das Nährmedium mit Wachstumsfaktoren versetzt. ' .
Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt vom verwendeten MikroorganismGnstamm ab. Die Menge der als Ausgangsmaterial verwendeten 2,5-Diketo-D-glucönsäure sowie die Züchtungsbedingungen werden im Einzelfall festgelegt.
Im allgemeinen eignen sich zur Durchführung des erfindungsgomäßen Verfahrens 2,5-Diketo-D-gluconsäurekonzentrationen von etwa 1 bis 200 g/Liter, bevorzugt sind Konzentrationen von etwa 1 bis 50 g/Liter. · .
Wie bereits erwähnt, werden die Züchtungsbedingungen im Einzelfall so festgelegt, daß die bestmöglichsten Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei etwa 20 bis 35°C. Vorzugsweise wird das Medium dabei in einem pK-Be-
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reich von etwa 4 bis 9 gehalten. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von 10 bis 100 Stunden ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge des gewünschten Produktes im Medium an;
Um den pH-Wert des Mediums in einem Bereich zu haltern, der für die Aufrechterhaltung der gewünschten enzymatischen /.kt.iv.i it-t,
e i α η;: I; g ten i η t, die durch den Mikroorganismus-erzeugt wird, am ge-/ wird das Medium zum gegebenen Zeitpunkt mit Säuren oder Basen versetzt. Eine andere Möglichkeit zur Aufrechterhaltimg de.'; pH-Wertes besteht darin, das Medium zu Beginn der Inkubation mit einem entsprechenden Puffer zu versetzen.
Die erforderliche Menge der als Ausgangsmaterial verwendeten 2,5-Diketo-D-gluconsäure kann dem Nährmedium zu Beginn der Züchtung auf einmal oder während der Züchtung in mehreren Portionen zugegeben werden. .
Abgesehen von der vorbeschriebenen Inkubation der erfindurigsgemäß verwendeten Mikroorganismenstämme können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auch die Zellen des Mikroorganismus, d.h.
ruhende Zellen, ein durch Behandlung der zerkleinerten Zellen mit Aceton erhaltenes Produkt, Zellen von lyophilisiorten Stämmen, entsprechende zerkleinerte Produkte und ähnliche Produkte, in direkten Kontakt mit dem das als Ausgangsmaterial verwendete 2,5-Diketo-D~glucorisäure enthaltenden" Substrat gebracht v/erden.
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Im Fall des direkten Kontaktes der Zellen oder der durch eine Behandlung der Zellen erhaltenen Produkte mit dem Substrat können die Temperatur- und pH-Bedingungen und die übrigen Bedingungen ähnlich wie bei der Inkubation der Mikroorganismenstamme gewählt werden. Außerdem können zur Aufrechterhaitung eines konstanten pH-Werts des Substrats Pufferlösungen verwendet werden.
Die Henge der Zellen oder der entsprechenden Produkte wird bei diesem direkten Verfahren so gewählt, daß sie ausreicht, um die Gesamtmenge der im Substrat erhaltenen 2,5-Diketo-D-gluconßäure in die gewünschte 2~Keto-L»gulonsäure überzuführen.
Die gebildete und im Medium angereicherte 2~Keto-L-gulonsäure kann nach bekannten Verfahren abgetrennt und gereinigt v/erden. Die 2-Keto-L-gulonsäure kann als freie Säure oder als Natrium-, Kalium-, Calcium- öder /jnraoniumsalz isoliert werden.
"Wird die 2-Keto-L-gulonsäure als freie Säure erhalten, so kann sie nach bekannten Verfahren in die entsprechenden .Salze überführt werden» Gleichermaßen können die Salze in die freie Säure oder in andere Salze überführt v/erden.
Zur Abtrennung des gewünschten Produktes aus dem Medium können beliebige Verfahren verwendet v/erden. Beispielsweise können die folgenden Schritte.wiederholt· angewendet bzw. miteinander kombiniert werden:
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a) Entfernung der Mikroorganismenzellen aus der Gärmaische durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Behandlung mit /iktivkohle;
b) Fällung eines Rohproduktes in Form von Kristallen durch Einengen des Gärmaischefiltrats;
c) Gewinnung der ausgefällten Kristalle durch Filtrieren cder Zentrifugieren des eingeengten Filtrats.;
d) Umkristallisieren der rohen Kristalle;
e) Lösungsmittelextraktion;
f) chromatographische Auftrennung.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene 2-Keto-L-gulonsäure kann beispielsweise durch Elementaranalysc identifiziert werden. Ferner können dazu auch physikochemische Eigenschaften herangezogen v/erden, wie Schmelzpunkt, IR-Spektrurr.· und optische Drehung.
Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens näher beschrieben:
Aus einer wäßrigen Lösung von 2,5-Diketo-D-gluconsäure werden durch.Filtration eventuell vorhandene Mikroorganismen entfernt. Diese Lösung wird mit einer Flüssigkeit, die die übrigen erforderlichen Bestandteile enthält, versetzt. Wegen der geringen Viärmestabilität der Salze der 2,5-Diketo-D-gluconEäure werden dabei die verwendeten Flüssigkeiten gekühlt eingesetzt.
Zur großtechnischen Durchführung des erfindungsgemüßen Verfahrens sind wirksamere und sichere Verfahrensmaßnahmen zu empfehlen, beispielsv/eise kontinuierliche Hitzesterilisation
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oder Filtration durch Mikrofilter.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
600 ml eines sterilisierten Mediums, das 1,5 Prozent Calcium-2,5-diketo-D-gluconat, 0,3 Prozent Glycerin, 0,1 Prozent PoIypekton, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 0,1 Prozent Monokaliuniphosphat und 0,02 Prozent Magnesiumsulfat χ 7 H2O enthält und einen pH-Wert von etwa 6,3 bis 7 aufweist, werden in einen 1,5 Liter fassenden Fermenter gegeben. Dieses Medium wird mit 20 ml einer Suspension von Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. in sterilisiertem Wasser inokuliert; Der Mikroorganismus wurde vorher 2 Tage bei 30°C auf einem Bouillon-Agar gezüchtet.
o 1 Volumteil Flüssigkeit/min) Die Züchtung wird bei 30 C unter Belüftung α volumteil Luft/ und unter Rühren (300 U/min) durchgeführt. Zu gegebenen Zeitpunkten werden aus der Gärmaische Proben entnommen. Die Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure wird durch Papierverteilungschromatographie in Form eines roten Fleckens nachgewiesen. Dabei wird ein Gemisch aus Phenol:Wasser:Ameisensäure (75 : 25 : 4) als Laufmittel verwendet.
Nach quantitativer Bestimmung durch Gas-Flüsslg-Chromatographie (Siliconkautschuk-Säule SE-52 siIylierte Probe) erhält man folgende Ergebnisse:
Inkubationszeit (Stunden) 36 48 72 2-Keto-L-gulonsäure (y/ml 200 620 189o.
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Beispiel 2
15 Liter eines sterilisierten Mediums, das 1 Prozent Kalium-D-gluconat, 0,2 Prozent Polypepton, 0,2 Prozent Hefeextrakt, 0,1 Prozent Monokaliumphosphat und 0,02 Prozent Magnesiumsulfat χ 7 H2O enthält und einen pH-Wert von 6,7 bis 7 aufweist, wird in einen 30 Liter fassenden Fermenter gegeben. Dieses Medium wird mit einer wäßrigen Suspension von Brevibacterium ketosoreductum gemäß Beispiel 1 beimpft und bei 3O0C unter Fanhr.ltung einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/min und einer Belüftungsge-
Luft/1 Volumteil Flüssigkeit/fein ·
schwindigkeit von Ivolurateil / inkubiert. Während der logarithmischen Wachstumsphase werden Teile.der Mikroorganismenzellen aus der Gärmaische abgetrennt, zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 400 ml einer 0,1 m sterilisierten Phosphatpufferlösung von pH-Wert 6,86 suspendiert. Diese Zellsuspension wird mit 200 ml einer wäßrigen Lösung, die 3 Prozent 2,5-Diketo-D-gluconsäure enthält, und aus der gegebenenfalls vorhandene Mikroorganismen durch Filtration abgetrennt sind, zugegeben. Anschließend wird 48 Stunden bei 300C gerührt.
Während dieses Kontaktes werden zu gegebenen Zeitabständen Proben aus dem Gemisch entnommen. Diese Proben werden qualitativ durch Papierverteilungschromatographie und quantitativ durch Gas-Flüssig-Chromatographie untersucht. Dabei wird festgesteilt., daß sich mit. Beginn des Kontaktes 2-Keto-L-gulonsäure bildet. Nach einer Kontaktdauer von 48 Stunden wird die Flüssigkeit von den Zellen abzentrifugiert und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingeengt. Die eingeengte Flüssigkeit wird anschließend mit einem Ionenaustauscherharz (Amberlite IR-120) und mit Aktivkohle behandelt und sodann nach Filtration wieder
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eingeengt. Die Lösung wird über eine mit einem Ionenaustauscherharz (Amberlite CG 40O5 Formiatform) beschickte Säule gegeben, wobei die gebildete 2-Keto~L~gulonsäure adsorbiert wird. Die Säule wird mit einem Ameisensäuregradienten eluiert. Die mit 0,2 bis 1 η Ameisensäure eluierten Fraktionen v/erden gesammelt. Nach Entfernung der Ameisensäure durch Extraktion mit Diäthyläther und nach Eindampfen erhält man ein sirupöses Produkt. Man setzt eine kleine Menge Wasser zu und läßx/uber Kocht stehen, worauf man Kristalle von 2-Keto-L»gulonsäure erhält.
Die physikoohemischen Eigenschaften, d.h. der. Schmelzpunkt, die optische Drehung und das IR-Spektrum des umkristallisierter. Produktes, stimmen mit einer authentischen Probe von 2-Keton-L- . gulonsäure, die aus L-Sorbose hergestellt ist, vollkommen uboreiii«
Beispiel 3
Jeweils 80 ml eines sterilisierten Mediums, das 0,7 Prozent Calciun-- 2,5-diketo-D-gluconatj 0,1 Prozent Polypepton, Oy 1 Prozent Hefe extrakt, 0,05 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Ι-Ίοηο-kaliumphosphat und 0,02 Prozent Magnesiumsulfat χ 7 K?0 einhält und einen pH-lJert von 6,3 bis 7 aufweist, werden in Schüttelkolben von 500 ml Fassungsvermögen gegeben. In diese Kolben wird jeweils eine Öse von Bacillus megateriiun gegeben.
Der Bacillus ist aus Bodenproben isoliert und vorher auf einem
worden
Bouillon-Agar inkubiert/. Die Fermentation wird 96 Stunden bei 30°C in einem Rotationsschüttler mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 200 U/min durchgeführt. Gemäß Baispiel 1 werden aus der Gärmaischo Proben entnommen und quantitativ analysiert:
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~ 30 -
Inkubationszeit (Std.): 2-Keto-L-gulonsäure (y/ml)
48 55
72 68
96 44
Beispiel
Jeweils 15 ml des in Beispiel 2 verwendeten sterilisierten Nährmediuras werden in 70 ml fassende Reagensgläser gegeben. Anschließend wird jeweils eine öse der im folgenden aufgeführten Mikroorganismen überimpft. Die Mikroorganismen wurden aus Boden- oder Abwasserproben isoliert bzw. vom Institute of Fermentation, Osaka, erhalten. Vor dem Überimpfen wurden die Stämme auf einem Bouillon-Agar inkubiert.
Die Fermentation wird 72 Stunden bei 300C in einem Reagensglas schüttler (350 Schuttelbewegungen/min) durchgeführt. Man gelangt zu folgenden Ergebnissen:
Stamm 2-Keto-L-gulonsäure
Arthrobactor simplex ASM-10 Staphylococcus aureus x1SM-30 Hicrococcus denitrificans IFO 12442 Micrococcus rubens IFO 3768 Micrococcus roseus IFO 3764 Pseudomonas chlorolaphys IFO 3904
107 53 86 43
49
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Claims (4)

Patent a η s ρ r ü c h e
1. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto~L-gulonsäure und deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen 2-Keto-L-gülonsäur'e bildenden Mikroorganismenstamra der Gattungen Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Staphylococcus, Hicrococcus oder Pseudomonas oder ein aus den entsprechenden Mikroorganismenzelien erhaltenes Produkt in Kontakt mit 2,5-Diketo-D-gluconsäure oder deren Salzen "bringt und die gebildete 2-Xeto-L-gulonsäure oder deren Salze aus den; Gemisch isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch- 1, dadurch gekennzeichnet, daß'/jen 2-Keto~L-gulonsäure bildenden Stamm auf ein Medium; das 2,5~Biketo-D-glueonsäure oder deren Salze enthälts überimpft und darin inkubiert und die bei der Inkubation angereicherte 2-Keto-L-gulonsäure oder deren Salze isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikrooi-gani smenstämme Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. ASM-1005 (PERM-P 1905, ATCC 21914), Arthrobacter simplex ASM-10 (FERM-P 1902, ATCC 21917), Bacillus megaterium ASM-20 (FEIM-P 1903, ATCC 21916), Staphylococcus aureus ASH-30 (FERM-P 1904, ATCC 21915), Micrococcus denitrificans IFO 12442, Microccccus rubens IFO 3768, Micrococcus roseus IFO 3764 oder Pseudomonas chlororaphis IFO 3904 vervrendet.
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