DE2413963B2 - Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen auf mikrobiologischem Wege - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen auf mikrobiologischem Wege

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Description

35
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-K.eto-L-gulonsäure und deren Salzen auf mikrobiologischem Wege.
2-Keto-L-gulonsäure ist ein wertvolles Zwischenprodukt zur Synthese von Ascorbinsäure und wurde bisher großtechnisch nach dem sogenannten Reichstein-Verfahren hergestellt Dieses Verfahren umfaßt jedoch eine Anzahl von komplizierten Stufen, so daß lediglich geringe Ausbeuten erreicht werden. Es ist sehr schwierig, wenn nicht vollständig ausgeschlossen, die Gesamtausbeute bei diesem Verfahren zu verbessern.
Bisher wurden eine Anzahl von Vorschlägen gemacht, die sich damit befassen, die Anzahl der einzelnen Stufen zu vermindern und bzw. oder die Gesamtausbeute zu verbessern. Beispielsweise wurde ein biochemisches Verfahren vorgeschlagen, bei dem 5-Keto-D-gIuconsäure selektiv zu L-Idonsäure reduziert wird, welche anschließend zu 2-K.eto-L-gulonsäure oxidiert wird. Ferner ist ein mikrobiologisches Verfahren zur direkten Umwandlung von L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure und ähnlichen Produkten bekannt.
Durch die vorgenannten Verfahren wurde die Anzahl der Stufen, die zur Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure nötig sind, zumindest theoretisch verringert Diese w) Verfahren konnten jedoch ausnahmslos die Gesamtausbeute nicht verbessern. Außerdem sind sie nur mit Schwierigkeiten durchzufahren, dies gilt insbesondere für kontinuierliche Verfahren. Schließlich haben diese Verfahren den Nachteil, daß Nebenprodukte in großer Menge und Anzahl entstehen, die aus dem erhaltenen Gemisch nur unter Schwierigkeiten abzutrennen sind. Die vorgenannten Verfahren eignen sich also nicht zu einer wirtschaftlichen, großtechnischen Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure,
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure zur Verfügung zu stellen, durch das die Anzahl der bei den bekannten Verfahren nötigen Stufen vermindert wird und nach dem sich 2-Keto-L-gulonsäure in guten Ausbeuten großtechnisch herstellen läßt Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst
Gegenstand der Erfindung ist das in den Patentansprüchen 1 —3 gekennzeichnete Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ausgangsmaterial, d.h. 2^-Diketo-D-gluconsäure, deren Salze oder Fermentationsprodukte, die diese Säure oder deren Salze enthalten, können in guten Ausbeuten beispielsweise durch Oxidation von D-GIucose auf mikrobiologischem Wege erhalten werdn. Im folgenden werden Substanzen, die die 2^-Diketo-D-gluconsäure oder deren Salze enthalten, einfach als Substrate bezeichnet
Bevorzugte Beispiele für 2-Keio-L-güiuii5äure bildende Stämme sind folgende im Verlauf der Entwicklungsarbeiten für das erfindungsgemäße Verfahren aus Boden- und Abwasserproben isolierte Stämme: Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. ASM-1005 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute unter der Nummer FERM-P 1905 und bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC-21914), Bacillus megaterium ASM-20 (FERM-P 1903; ATCC 21916) und Staphylococcus aureus ASM-30 (FERM-P 1904, ATCC 21915).
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich beispielsweise auch mit folgenden beim Institute of Fermentation, Osaka (IFO), hinterlegten und auf Anfrage erhältlichen Stämmen durchführen: Micrococcus denitrificans IFO 12442, Micrococcus rubens IFO 3768, Micrococcus roseus IFO 3764 und Pseudomonas chlororaphis IFO 3904.
Die im Verlauf der Untersuchungen aus Boden- und Abwasserproben isolierten Mikroorganismen werden im folgenden taxonomisch näher beschrieben.
I. Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. ASM-1005
A. Beobachtungen:
(1) Gestalt der Zellen (3 Tage bei 300C auf Bouillon-Agar-Schrägkulturen und Bouillon-Brühe):
Stäbchen mit den Abmessungen
0,4—0,7 μ χ 0,8—1,4 μ und abgerundeten Enden treten einzeln und paarweise auf. Schnappende Teilung tritt auf, aber es wird keine Verzweigung beobachiet.
(2) Beweglichkeit: beweglich mit peritrichen Geißeln.
(3) Sporen: keine Bildung.
(4) Gram-Färbung (7 Tage bei 300C auf Bouillon-Agar-Schrägkulturen): positiv.
(5) Säurefestigkeit: negativ.
B. Wachstum auf verschiedenen Medien:
(1) Bouillon-Agar-Kolonien (24 bis 48 Std. bei 30°C): kreisförmig, glattflächig, glattrandig, konvex, glänzend, durchscheinend, orangegelb.
(2) Bouillon Agar-Schrägkultur (24 bis 72 Std. bei 30° C):
mäßiges Wachstum, fadenförmig und butterartig,
orangegelb bis orange, aber das Pigment wird nicht im Medium dispergiert
(3) BouUlon-Brühe(7Tagebei30°C):
mäßig trüb; membranartiges Oberflächenwachstum, viskoses Sediment; kein Geruch.
(4) Bouillon-Gelatinestich:
Verflüssigung; bei 200C ist nach 2 Tagen eine leichte Verflüssigung feststellbar; nach 7 Tagen sackförmige Vertiefung (Durchmesser etwa 4 mm und Tiefe etwa 7 mm); bei 25 und 30" C wird eine ausgeprägtere Verflüssigung beobachtet
(5) LackmusmUch(14Tagebei30oC): sauer; leicht koaguliert
(6) Kartoffel-Schrägkultur(14Tagebei30°C): geringes Wachstum; blaß orangegelb glänzend.
(7) Bouillon-D-gluconat-Agar-Schrägkultur (72 Stunden bei 300C):
reichliches Wachstum; fadenförmig; viskos hell orangegelb glänzend.
C "hysiologische Eigenschaften
(Sofern nichi anders angegeben beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach Htägiger Züchtung bei 300C):
(1) Nitrit: keine Bildung aus Nitrat
(2) Denitrifikation: In einem mit Paraffin verschlossenem Nährboden aus Bouillon-Brühe, der 1 Prozent KNO3 enthält, wird weder Wachstum noch Gasbildung beobachtet
(3) Methylrot-Test: positiv.
(4) Voges-Proskauer-Reaktion: negativ.
(5) Indol: keine Bildung.
(6) Schwefelwasserstoff: wird gebildet
(7) Ammoniak: geringfügige Bildung.
(8) Stärke: keine Hydrolyse.
(9) Wachstum auf Citrat-Medium:
(I) Koser-Medium: spärliches Wachstum
(II) Christensen-Medium: Wachstum.
(10) Wachstum in Gegenwart von anorganischen Stickstoffquellen:
(I) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium): kein Wachstum.
(II) Nitrat (GIucose-Dimmick-Medium): Das Medium färbt sich leicht gelblich.
(11) Farbbildung: orangegelb bis orange auf Bouiilon-Agar-Schrägkultur, keine Diffusion.
(12) Urease: positiv.
(13) Catalase: positiv.
(14) Oxidase: (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 18 bis 24 Stunden, Tetramethylphenylendiamin): leicht positiv.
(15) Temperatureinfluß:
(I) Wachstum im Temperaturbereich 10 bis 40° C; kein Wachstum bei 4° C und bei 45° C.
(II) Optimales Wachstum bei 28 bis 35°C.
(16) pH-Einfluß:
(I) Wachstum bei pH-Wert 5,0 bis 10,0.
(II) Optimales Wachstum bei pH-Wert 6,0 bis 8,0.
(17) Sauerstoffbedarf: Fakultativ (mit Paraffin verschlossene Stichkultur färbt sich einheitlich gelb).
(18) O-F-Test (Hugh-Leifson-Verfahren):
Unter anaeroben Bedingungen wird Säure aus D-Glucose gebildet, während aus Lactose weder Säure noch Gas gebildet wird.
(19) Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):
(I) Aus D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Mannit und Glycerin (schwach) wird Säure, aber kein Gas gebildet (II) Aus L-Arabinose, Lactose, D-Sorbit Inosit und
Stärke wird weder Säure noch Gas gebildet (20) Cellulose (Peptonwasser + mikrokristalline Cellulose): keine Hydrolyse.
(21) Methylenblau (Bouillon-Brühe, 18 bis 24 Stunden): Reduktion.
(22) D-GJuconsäure: Verwertung.
(23) 2-Keto-D-gluconsäure: geringfügige Verwertung.
D. Herkunft: Bodenproben.
Beim Vergleich der vorstehenden taxonomischen Eigenschaften mit den Ausführungen in Berg/s Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage (im folgenden als »Manual« bezeichnet) gelangt man zu dem Schluß, daß der genannte Stamm zur Gattung Brevibacterium gehört da er wahlweise aerob oder anaerob ist aus gram-positiven kurzen Stäbchen besteht keine Sporen bildet und eine schnappende Zellteilung, aber keine Verzweigungen aufweist
Der Stamm zeigt gewisse Übereinstimmungen mit den Angaben des »Manual« für Brevibacterium acetylicum. Auf Grund der folgenden Beobachtungen wird angenommen, daß eine enge Verwandtschaft zur letztgenannten Species besteht: beweglich, Gelatineverflüssigung, orangegelbe bis orange Färbung auf Bouillon-Agar-Schrägkultur und schwaches Wachstum unter blaß orangegelber Färbung auf Kartoffel-Agar-
Schrägkultur.
Jedoch unterscheidet sich der erfindungsgemäße Stamm auf Grund der nachstehenden taxonomischen Eigenschaften stark von der im Manual angegebenen Beschreibung für Brevibacterium acetylicum: Eigen schäften der Kolonien und der Kulturen auf Bouillon- Brühe; saure Reaktion mit Lackmusmilch und schwache Koagulierung desselben; keine Peptonisierung; keine Stärkehydrolyse; relativ hohes Temperaturopiimum von 28 bis 35° C und negative Voges-Proskauer-Reak tion.
Da die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes auch nicht mit denen von anderen bekannten Species dieser Gattung übereinstimmen, wird er als neuer Stamm angesehen und mit Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. bezeichnet
II. Bacillus megaterium ASM-20 A. Beobachtungen:
(1) Gestalt der Zellen (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 8 bis 48 Stunden bei 30° C):
Stäbchen mit den Abmessungen 1,0-1,2 μ χ 2,5—4,0 μ mit abgerundeten oder eckigen Enden treten einzeln oder paarweise und gelegentlich in
Ketten auf. Häufig werden fadenartige und
geschwungene Formen beobachtet
(2) Beweglichkeit (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 8 bis 24 Stunden bei 20 und 30° C): nicht beweglich.
(3) Sporen (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 30° C):
Ellipsoide mit den Abmessungen 0,8-1,0 μ χ 1,4 —1,6 μ. Ein Schwellen des Sporangiums wird nicht beobachtet Subterminal bis terminal und vielgestaltig in 48 Stunden.
(4) Gram-Färbung (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 8 bis 48 Stunden bei 30°C): positiv.
(5) Säurefestigkeit (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 300C): negativ.
(6) Kapsel-Färbung: positiv.
B. Wachstum auf verschiedenen Medien:
(1) Bouillon-Agar-Kolonien (24 bis 72 Stunden bei 30"C): Kreise von 1 bis 4 mm Durchmesser, rauh, wellenförmig, erhaben, konzentrische Ringe,
schwach glänzend, cremefarben und undurchsichtig-
(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur (24 bis 48 Stunden bei 3O0C): Wachstum reichlich, fadenförmig, cremefarben, viskos aber nicht haftend, schwach glänzend und leicht faltig.
(3) Bouillon-Brühe (8 Tage bei 30° C):
nach 1 oder 3 Tagen flockige Trübung; Brühe relativ klar mit geringen Mengen an flockigem Sediment; kein Oberflächenwachstum und kein Geruch.
(4) Glucose-BouiUon-Schrägkultur (24 Stunden bei 3O0C): Wachstum reichlicher und viskoser (klebend) als auf Bouillon-Agar-Schrägkultur; faltig; eintönig und cremefarben.
(5) Bouil'on-Gelatinestich (12 Tage bei 30° C):
Nach 5 Tagen wird schichtförmige Verflüssigung beobachtet, während entlang der Stichlinie kein Wachstum und keine Verflüssigung beobachtet werden.
(6) Lackmusmilch (13 Tage bei 300C): leicht saure Reaktion; Peptonisierung wird beobachtet
(7) Gestrichene Milch-Agar-Platte (48 Stunden bei 300C): große durchsichtige Hydrolysezone um die Kolonie.
(8) Kartoffel-Agar-Schrägkultur (13 Tage bei 300C): Wachstum reichlich, sich ausbreitend, cremefarben bis hellgrau, glänzend, grobfaltig; viskos und klebend; nach 6 Tagen wird das Medium gräulichbraun gefärbt.
(9) Tyrosin-Agar-Schrägkultur (7 Tage bei 300C): Wachstum mäßig, keine Pigmentbildung.
C. Physiologische Eigenschaften
(Sofern nichts anderes angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen bei 30° C):
(1) Nitrit: keine Bildung aus Nitrat.
(2) Denitrifiketion: In einer mit Paraffin verschlossenen Bouillon-Brühe, die 1 Prozent KNO3 enthält, wird weder Wachstum noch Gasbildung beobachtet.
(3) Methylrot-Test: positiv.
(4) Voges-Proskauei-Reaktion:negativ.
(5) Indol: keine Bildung.
(6) Schwefelwasserstoff: geringfügige Bildung.
(7) Ammoniak: keine Bildung.
(8) Stärke: Hydrolyse.
(9) Wachstum auf Citrat-Medien:
(I) Koser-Medium: Wachstum.
(II) Christensen-Medium: Wachstum.
(10) Wachstum in Gegenwart von anorganischen Stickstoffquellen:
(I) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium): Wachstum.
(II) Nitrat (Glucose-Dimmick-Mediuni): Wachstum.
(11) Bildung von Farbe: auf Bouillon-Agar-Schrägkultur keine oder cremefarbene Färbung, keine Diffusion.
(12) Urease: positiv.
(13) Catalase: positiv.
(14) Oxidase: negativ.
(15) Temperatureinfluß:
(I) Wachstum bei 20 bis 45"C; kein Wachstum bei
10° C.
(I I) Optimales Wachstum bei 30 bis 35° C.
(16) pH-Einfluß:
(I) Wachstum bei pH-Wert 6,0 bis 9,0.
(II) Optimales Wachstum bei pH-Wert 7,0.
(17) Sauerstoffbedarf: aerob (Wachstum nur an der Oberfläche der Stichkultur).
ίο (18) O-F-Test: unter aeroben Bedingungen Säurebildung aus D-GIucose. Etwa V« der ober-εη Schicht der Stichkultur wird gelb gefärbt
(19) Säurebildung (Hucker-Medium unter Zusatz eines Ammoniumsalzes): nach 24 Stunden Säurebildung aus Mannit
(20) Säure- und Gasbildung aus Zuckern
(Barsiekow-Medium):
(I) Aus L-Arabinose, D-Xyiose*. D-Glucose*.
Maltose, Saccharose*, D-Mannit*, Trehalose und Glycerin* wird Säure aber kein Gas
gebildet
(H) Aus D-Mannose, D-Fn-nose, D-Gaiactose, Lactose, D-Sorbit Inosit und Stärke werden weder Säure noch Gas gebildet
(21) Cellulose (Peptonwasser + mikrokristalline Cellulose): Hydrolyse.
(22) Methylenblau (Bouillon-Brühe, 24 Stunden): schwache Reduktion.
(23) Salzverträglichkeit: In einer 9 Prozent NaCi enthaltenden Bouillon-Brühu- wird nach 6 Tagen Wachstum beobachtet
D. Herkunft: Bodenproben
Auf Grund folgender Feststellungen kommt man beim Vergleich der vorgenannten taxonomischen Eigenschaften mit den Angaben im »Manual« zu dem Schluß, daß der erfindungsgemäße Stamm zur Gattung Bacillus gehört: Catalase-positive, aerobe und grampositive Stäbchen und Sporenbildung.
Folgende Feststellungen lassen auf eine Ähnlichkeit mit dem in Manual beschriebenen Species Bacillus megaterium schließen: kein Schwellen des Sporangiums, große Zellen mit einem Durchmesser von mehr als 0,9 μ, negative Voges-Proskauer-Reaktion und Säurebildung aus Mannit unter Verwertung von Ammoniumsalzen.
Zusätzlich zu den vorgenannten Feststellungen ergibt sich eine auffallende Übereinstimmung mit einer Variante von Baccilus megaterium, die im Manual aufgeführt ist. Der Stamm wird daher als zur Species Bacillus megaterium gehörig identifiziert und als Bacillus megaterium ASM-20 bezeichnet
III. Staphylococcus aureus ASM-30:
A. Beobachtungen:
(1) Gestalt der Zellen (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 300C): kugelförmig mit einem Durchmesser von 0,9 bis 1,2 μ, einzelnes oder paarweises Auftreten und gelegentlich kurze Ketten und unregelmäßige Klumpen.
(2) Beweglichkeit (Bouillon-Agar-Schrägkulturen bei 20,25 und 30° C): nicht beweglich.
(3) Sporen (Bouillon-Agar-Schrägkultur, 300C): keine; t,5 Bildung.
(*: Nach der Säurebildung wird das Medium
alkalisch gemacht)
(4) Gram-Färbung 300C): positiv.
(5) Säurefestigkeit 3O0C): negativ.
(Bouillon- Agar-Schrägkultur, (Bouillon- Agar-Schrägkultur,
B. Wachstum auf verschiedenen Medien.
(1) Bouillon-Agar-Kolonien (24 bis 48 Stunden bei 300C): kreisförmig, glattflächig, glattrandig, undurchsichtig, orangegelb und glänzend.
(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur (24 bis 48 Stunden bei 300C): Wachstum mäßig, fadenförmig, glänzend, butterartig, orangegelb; das Pigment dispergiert nitht in das Medium.
(3) Bouillon-Brühe (7 Tage bei 300C): mäßige Trübung; kein Oberflächenwachstum; viskoses Sediment ohne Geruch.
(4) Bouillon-Gelalinestich (12 Tage bei 20 und bei 25"C): vom dritten Tag an schichtförmige Verflüssigung unter Bildung von gelben Häütrhen und gelbem Sediment.
(5) Lackmusmilch (14 Tage bei 3O0C): leicht saure Reaktion, keine Koagulation.
(6) Kartoffel-Agar-Schrägkultur (14 Tage bei 30°C): mäßiges Wachstum (2 Tage lang), fadenförmig, weiß bis cremefarben und glänzend.
C. Physiologische Eigenschaften
(Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen bei 30"C):
(1) Nitrit: keine Bildung aus Nitrat.
(2) Denitrifikation: Wachstum aber keine Gasbildung in einer mit Paraffin verschlossenen Bouillon-Brühe, die 1 Prozent KNOienthält.
(3) Methylrot-Test: positiv.
(4) Voges-Proskauer-Reaktion:negativ.
(5) Indol: keine Bildung.
(6) Schwefelwasserstoff: keine Bildung.
(7) Ammoniak: Bildung.
(8) Stärke: keine Hydrolyse.
(9) Wachstum auf Citrat-Medien:
(I) Koser-Medium: kein Wachstum.
(II) Christensen-Medium:kein Wachstum.
(10) Wachstum in Gegenwart von anorganischen Stickstoffquellen:
(I) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium): kein Wachstum.
(II) Nitrat (Glucose-Dimmick-Medium): kein Wachstum.
(11) Bildung von Fai oe: orangegelb auf Bouillon-Agar-Schrägkultur, keine Diffusion.
(12) Urease:schvachpositiv.
(13) Catalase: positiv.
(14) Oxidase: negativ
(15) Temperatureinfluß:
(I) Wachstum bei 10 bis 40°C; kein Wachstum bei 4 und bei 45° C.
(II) Optimales Wachstum bei 35 bis 40°C
(16) pH-Einfluß:
(I) Wachstum bei ρH-Wert 5,0 bis 9,0.
(II) Optimales Wachstum bei pH-Wert 6,0 bis 7,0.
(17) Sauerstoffbedarf: fakultativ (Wachstum in allen Schichten einer mit Paraffin verschlossenen Stichkultur).
(18) O-F-Test: unter anaeroben Bedingungen Bildung von Säure aus D-Glucose.
(19) Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):
(I) Aus D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Saccharose, Lactose, Trehalose,
ϊ D-Mannit und Glycerin Säurebildung aber
keine Gasbildung. Die Säurebildung aus D-Mannit ist gering.
(II) Aus L-Arabinose, D-Xylose, Maltose, D-Sorbit, Inosit und Stärke werden weder Säure-
ii> noch Gasbildung beobachtet.
(20) Cellulose (Peptonwasser + mikrokristalline Cellulose): keine Hydrolyse.
(21) Methylenblau (Bouillon-Brühe, 24 Stunden): leichte Reduktion.
η (22) D-Gluconat: Verwertung.
(23) 2-Keto-D-gluconat:schwache Verwertung.
(24) Coagulase (Bacto-Coagulase-Plasma von Difco): positiv.
(25) Blut-Agar:/?-Hämolyse wird beobachtet.
:m (26) Salzverträglichkeit (NaCI enthaltende Bouillon-Brühe): gutes Wachstum bei 11 Prozent, Wachstum bei 13 Prozent und kein Wachstum bei 15 Prozent.
(27) Milchsäure: Bildung aus D-Glucose.
D. Herkunft: Abwasser
Auf Grund folgender Feststellungen kommt man beim Vergleich der vorgenannten taxonomischen Eigenschaften mit den Angaben im »Manual« zu dem Schluß, dar» der erfindungsgemäße Stamm zur Gattung
in Staphylococcus gehört: Kokken, die unregelmäßige Klumpen bilden; gram-positiv; keine Sporen; wahlweise aerob oder anaerob: Salzverträglichkeil: unter anaeroben Bedingungen Bildung von Säure aus D-Glucose.
Die physiologischen Eigenschaften des erfindungsge-
j-, maß verwendeten Stammes stimmen mit den Angaben im »Manual« für Staphylococcus aureus darin überein, daß aus D-Mannit Säure gebildet wird (wenn auch nur sehr schwach) und daß er koagulasepositiv ist.
Die geringfügigen Abweichungen im Wachstum auf
j, Bouillon-Brühe, Bouillon-Gelatinestich und Lackmus-Milch und in der Bildung von Acetoin werden nicht als sehr signifikant angesehen. Deshalb wird der Stamm als zur Species der Staphylococcus aureus zugehörig angesehen und als Staphylococcus aureus ASM-30
-r, bezeichnet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch Mutanten der vorgenannten Mikroorganismenstämme verwendet werden, die durch künstliche oder induktive Mutation erhalten worden sind. Beispielsweise kann die
-,o mutagene Behandlung durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder durch Behandlung mit mutagen .i Substanzen, wie Stickstofflost, durchgeführt werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die vorgenannten Stämme auf ein Nährmedium überimpft und darin inkubiert Das verwendete Nährmedium enthält das vorgenannte Substrat Die Zellen des gewählten Stammes, beispielsweise ruhende Zellen oder durch eine beliebige Behandlung dieser Zellen erhaltene Produkte, läßt man direkt auf das Substrat einwirken. Es können beliebige, bekannte Inkubationsverfahren angewendet werden, besonders bevorzugt sind aber Fermenter in Form von tiefen, belüfteten und gerührten Tanks. Besonders gute Ergebnisse werden durch Inkubation eines flüssigen
Nährmedhims erhalten.
Die Wahl des NährniedrairiS zur Züchtung der Mikroorganismen ist nicht kritisch. Besonders geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoff-
quellen, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an anderen Nährstoffen enthalten.
Als Stickstoffqueilen können anorganische oder organische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele sind Ammoniumsalze, Nitratsalze, Maisquellwasser, Pepton, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Hefe und Harnstoff.
Als Kohlenstoffquellen können neben der als Ausgangsmaterial verwendeten 2,5-Diketo-D-glucon- in säure beispielsweise mehrwertige Alkohole oder Zukker verwendet werden, wie Glucose, Glycerin, Saccharose, Lactose, Dextrin, Maltose und Melassen.
Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Kalium, Zink, Kupfer, Eisen und ι > anderen Metallen.
Gegebenenfalls wird das Nährmedium mit Wachstumsfaktoren versetzt.
Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt vom verwendeten Mikroorganismenstamm ab. i<> Die Menge der als Ausgangsmaterial verwendeten 2,5-Diketo-D-gluconsäure sowie die Züchtungsbedingungen werden im Einzelfall festgelegt.
Im allgemeinen eignen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens 2,5-Diketo-D-glucon- _>> Säurekonzentrationen von etwa 1 bis 200 g/Liter, bevorzugt sind Konzentrationen von etwa 1 bis 50 g/Liter.
Wie bereits erwähnt, werden die Züchtungsbedingungen im Einzelfall so festgelegt, daß die bestmöglichsten Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei etwa 20 bis 35° C. Vorzugsweise wird das Medium dabei in einem pH-Bereich von etwa 4 bis 9 gehalten. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von 10 bis 100 Stunden ausreichend. Innerhalb dieser r> Zeit reichert sich die maximale Menge des gewünschten Produktes im Medium an.
Um den pH-Wert des Mediums in einem Bereich zu halten, der für die Aufrechterhaltung der gewünschten enzymatischen Aktivität, die durch den Mikroorganis- w mus erzeugt wird, am geeignetsten ist, wird das Medium zum gegebenen Zeitpunkt mit Säuren oder Basen versetzt. Eine andere Möglichkeit zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes besteht darin, das Medium zum Beginn der Inkubation mit einem entsprechenden Puffer zu versetzen.
Die erforderliche Menge der als Ausgangsmaterial verwendeten 2^5-Diketo-D-gluconsäure kann dem Nährmedium zu Beginn der Züchtung auf einmal oder während der Züchtung in mehreren Portionen zugegeben werden.
Abgesehen von der vorbeschriebenen Inkubation der erfindungsgemäB verwendeten Mikroorganismenstämme können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auch die Zellen des Mikroorganismus, d.h. ruhende Zellen, ein durch Behandlung der zerkleinerten Zellen mit Aceton erhaltenes Produkt oder Zellen von lyophilisierten Stämmen in direkten Kontakt mit dem das als Ausgangsmaterial verwendete 2^5-Diketo-D-gluconsäure enthaltenden Substrat gebracht werden.
im FaH des direkten Kontaktes der Zellen oder der durch eine Behandlung der Zellen erhaltenen Produkte mit dem Substrat können die Temperatur- und pH-Bedingungen und die übrigen Bedingungen ähnlich wie bei der Inkubation der Mikroorganismenstämme gewählt werden. Außerdem können zur Aufrechtcrhaltung eines konstanten pH-Wertes des Substrats Pufferlösungen verwendet werden.
Die Menge der Zellen oder der entsprechenden Produkte wird bei diesem direkten Verfahren so gewählt, daß sie ausreicht, um die Gesamtmenge der im Substrat erhaltenen 2,5-Diketo-D-gluconsäure in die gewünschte 2-Keto-L-gulonsäure überzuführen.
Die gebildete und im Medium angereicherte 2-Keto-L-gulonsäure kann nach bekannten Verfahren abgetrennt und gereinigt werden. Die 2-Keto-L-gulonsäure kann als freie Säure oder als Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Ammoniumsalz isoliert werden.
Wird die 2-Keto-L-gulonsäure als freie Säure erhalten, so kann sie nach bekannten Verfahren in die entsprechenden Salze überführt werden. Gleichermaßen können die Salze in die freie Säure oder in andere Salze überführt werden.
Zur Abtrennung des gewünschten Produktes aus dem Medium können beliebige Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können die folgenden Schritte wiederholt angewendet bzw. miteinander kombiniert werden:
a) Entfernung der Mikroorganismenzellen aus der Gärmaische durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Behandlung mit Aktivkohle;
b) Fällung eines Rohproduktes in Form von Kristallen durch Einengen des Gärmaischefiltrats;
c) Gewinnung der ausgefällten Kristalle durch Filtrieren oder Zentrifugieren des eingeengten Filtrats;
d) Umkristallisierender rohen Kristalle;
e) Lösungsmittelextraktion;
f) chromatographische Auftrennung.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene 2-Keto-L-gulonsäure kann durch geeignete Kennzahlen identifiziert werden.
Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens näher beschrieben:
Aus einer wäßrigen Lösung von 2,5-Diketo-D-gluconsäure werden durch Filtration eventuell vorhandene Mikroorganismen entfernt. Diese Lösung wird mit einer Flüssigkeit, die die übrigen erforderlichen Bestandteile enthält, versetzt. Wegen der geringen Wärmestab:iität der Salze der 2,5-Diketo-D-gluconsäure werden dabei die verwendeten Flüssigkeiten gekühlt eingesetzt.
Zur großtechnischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind wirksamere und sichere Verfahrensmaßnahmen zu empfehlen, beispielsweise kontinuierliche Hitzesterilisation oder Filtration durch Mikrofilter.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
600 ml eines sterilisierten Mediums, das 1,5 Prozent Calciuni-24-diketo-D-gluconat, 03 Prozent Glycerin, 0,1 Prozent Polypepton, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 0,1 Prozent Monokaliumphosphat und 0,02 Prozent Magnesiumsulfat - 7 H2O enthält und einen pH-Wert von etwa 6,3 bis 7 aufweist, werden in einen 1,5 Liter fassenden Fermenter gegeben. Dieses Medium wird mit 20 ml einer Suspension von Brevibacterium ketosoreductum nov.sp. ASM-1005 in sterilisiertem Wasser inokuliert Der Mikroorganismus wurde vorher 2 Tage bei 30° C auf einem Bouillon-Agar gezüchtet
Die Züchtung wird bei 30° C unter Belüftung (1 Votomteil Lnft/I Vohimteil Flüssigkeit/min) und unter Rühren (300 U/min) durchgeführt Zu gegebenen Zeitpunkten werden ans der Gärmaische Prober, entnommen. Die Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure wird durch Papierverteilungschromatographie in Form eines
roten Fleckens nachgewiesen. Dabei wird ein Gemisch aus Phenol zu Wasser zu Ameisensäure (75 : 25 :4) als Laufmittel verwendet.
Nach quantitativer Bestimmung durch Gas-Flüssig-Chromatographie (Siliconkautschuk-Säule, silylierte Probe) erhält man folgende Ergebnisse:
Inkubationszeit (Stunden) 36 48 72
/ml) 200 620 1890.
Beispiel 2
15 Liter eines sterilisierten Mediums, das 1 Prozent Kalium-D-gluconat,0,2 Prozent Polypepton, 0,2 Prozent Hefeextrakt, 0,1 Prozent Monokaliumphosphat und 0,02 Prozent Magnesiumsulfat · 7 H2O enthält und einen pH-Wert von 6,7 bis 7 aufweist, wird in einen 30 Liter fassenden Fermentergegeben. Dieses Medium wird mit einer wäßrigen Suspension von Brevibacterium ketosoreductum gemäß Beispiel 1 beimpft und bei 300C unter Einhaltung einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 Volumteil Luft/1 Volumteil Flüssigkeit/min inkubiert. Während der logarithmischen Wachstumsphase werden Teile der Mikroorganismenzellen aus der Gärmaische abgetrennt, zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 400 ml einer 0,1m sterilisierten Phosphatpufferlösung von pH-Wert 6,86 suspendiert. Diese Zellsuspension wird zu 200 ml einer wäßrigen Lösung, die 3 Prozent 2,5-Diketo-D-gluconsäure enthält, und aus der gegebenenfalls vorhandene Mikroorganismen durch Filtration abgetrennt sind, gegeben. Anschließend wird 48 Stunden bei 300C gerührt.
Während dieses Kontaktes werden zu gegebenen Zeitabständen Proben aus dem Gemisch entnommen. Diese Proben werden qualitativ durch Papierverteilungschromatographie und quantitativ durch Gas-FIüssig-Chromatographie untersucht. Dabei wird festgestellt, daß sich mit Beginn des Kontaktes 2-Keto-L-gulonsäure bildet Nach einer Kontaktdauer von 48 Stunden wird die Flüssigkeit von den Zellen abzentrifugiert und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingeengt Die eingeengte Flüssigkeit wird anschließend mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz und mit Aktivkohle behandelt und sodann nach Filtration wieder eingeengt Die Lösung wird über eine mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz (Formiatform) beschickte Säule gegeben, wobei die gebildete 2-Keto-L-gulonsäure adsorbiert wird. Die Säule wird mit einem Ameisensäuregradienten eluiert Die mit 0,2 bis 1 η-Ameisensäure eluierten Fraktionen werden gesammelt Nach Entfernung der Ameisensäure durch Extraktion mit Diäthyläther und nach Eindampfen erhält man ein sirupöses Produkt. Man setzt eine kleine Menge V.'asser zu und läßt sie über Nacht stehen, worauf man Kristalle von 2-Keto-L-gulonsäure erhält. Ausbeute ca. 360 mg (ca. 8,5% der Theorie).
Schmelzpunkt, optische Drehung und IR-Spektrum des umkristallisierten Produktes stimmen mit einer authentischen Probe von 2-Keton-L-gulonsäure, die aus L-Sorbose hergestellt wurde, überein.
|() Beispiel 3
Jeweils 80 ml eines sterilisierten Mediums, das 0,7 Prozent Calcium-2,5-diketo-D-gluconat, 0,1 Prozent Polypepton, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 0,05 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Monokaliumphosphat und 0,02
r. Prozent Magnesiumsulfat · 7 H2O enthält und einen pH-Wert von 6,3 bis 7 aufweist, werden in Schüttelkolben von 500 ml Fassungsvermögen gegeben. In diese Kolben sind jeweils eine öse von Bacillus megaterium ASM-20 gegeben. Der Bacillus ist aus Bodenproben
.'ο isoliert und vorher auf einem Bouillon-Agar inkubiert worden. Die Fermentation wird 96 Stunden bei 300C in einem Rotationsschüttler mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 200 U/min durchgeführt. Gemäß Beispiel 1 werden aus der Gärmaische Proben
r> entnommen und quantitativ analysiert:
Inkubationszeit (Std.) 24 48 72 96
2-Keto-L-gulonsäure (y/ml) 40 55 68 44
Jeweils 15 ml des in Beispiel 2 verwendeten sterilisierten Nährmediums werden in 70 ml fassende Reagenzgläser gegeben. Anschließend wird jeweils eine öse der im folgenden aufgeführten Mikroorganismen
S3 überimpft. Die Mikroorganismen wurden aus Bodenoder Abwasserproben isoliert bzw. vom Institute of Fermentation, Osaka, erhalten. Vor dem Überimpfen wurden die Stämme auf einem Bouillon-Agar inkubiert.
Die Fermentation wird 72 Stunden bei 300C in einem Reagenzglasschüttler (350 Schüttelbewegungen/min) durchgeführt. Man gelangt zu folgenden Ergebnissen:
Stamm
2-Keto-L-gulonsäure
(y/ml)
Staphylococcus aureus ASM-30 53
Micrococcus denitrificans IFO 12442 86
Micrococcus rubens IFO 3768 43
Micrococcus roseus IFO 3764 28
Pseudomonas chlororaphis IFO 3904 49

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-guIonsäure und deren Salzen, dadurch gekenn- zeichnet, daß man einen 2-Keto-L-gulonsäure bildenden Mikroorganismenstamm der Gattungen Brevibacterium, Bacillus, Staphylococcus, Micrococcus oder Pseudomonas oder ruhende Zellen des Mikroorganismus, ein durch Behandlung der zerklei- ι ο nerten Zellen mit Aceton erhaltenes Produkt oder Zellen von lyophilisierten Stämmen in Kontakt mit 2,5-Diketo-D-gIuconsäure oder deren Salzen bringt und die gebildete 2-K.eto-L-gulonsäure oder deren Salze aus dem Gemisch isoliert
Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den 2-Keto-L-guIonsäure bildenden Stamm auf ein Medium, das 23-Diketo-D-gluconsäure oder deren Salze enthält, überimpft und darin inkubiert und die bei der Inkubation angereicherte 2-Keto-L-gulonsäure oder deren Salze isoliert
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ds3 man dieses mit den Mikroorganismenstämmen Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. ASM-1005 (FERM-P 1905, ATCC 21914), Bacillus megaterium ASM-20 (FERM-P 1903, ATCC 21916), Staphylococcus aureus ASM-30 (FERM-P 1904, ATCC 21915), Micrococcus denitrificans IFO 12442, Micrococcus rubens IFO 3768, Micrococcus roseus jo IFO 3764 oder Pseudomonas chlororaphis 3904 durchführt
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