DE3541581A1 - Verfahren zur herstellung von muconsaeure - Google Patents

Verfahren zur herstellung von muconsaeure

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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Muconsäure.
Es ist bekannt, daß man Muconsäure aus Benzoesäure unter Verwendung von Mutantenstämmen, die dem Genus Corynebacterium angehören, herstellen kann (Hakko Kogaku, Vol. 55 (1977), Seiten 95 bis 97). Weiterhin ist auch ein Verfahren bekannt, bei dem Arthrobacter sp. (DSM 20427) verwendet wird (Arch. Microbiol. Vol. 110, Seiten 253 bis 256).
Es wurden umfangreiche Untersuchungen nach Verfahren zur Herstellung von Muconsäure mit verbesserter Produktivität unter Verwendung von Benzoesäure als Kohlenstoffquelle durchgeführt, wobei Mikroorganismen aufgefunden wurden, die in der Lage sind, Benzoesäure in hoher Ausbeute in Muconsäure umzuwandeln. Die Erfindung beruht auf dieser Erkenntnis.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Muconsäure, welches darin besteht, einen Mikroorganismus ausgewählt aus:
(i) Arthrobacter sp. T-8626 oder Mutantenstämmen davon, die Muconsäure zu bilden in der Lage sind; (ii) zu Corynebacterium acetoacidophilum oder Corynebacterium lilium gehörenden Mikroorganismen, die Muconsäure zu bilden in der Lage sind; und
(iii) zu dem Genus Brevibacterium oder dem Genus Microbacterium gehörenden Mikroorganismen, die Muconsäure zu bilden in der Lage sind;
unter Verwendung von Benzoesäure als Kohlenstoffquelle zu züchten und die Muconsäure aus der Kultur zu gewin-
35 nen.
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Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen werden aus den folgenden Klassen (i), (ii) und (iii) ausgewählt.
(i) Mikroorganismen des Genus Arthrobacter, die in der Lage sind, Muconsäure zu bilden, wie Arthrobacter sp. T-8626 (FIRM (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, Bikoken) Hinterlegungsnummer 7952) und Mutantenstämme davon, beispielsweise Arthrobacter sp. T-8626-11 (FIRM Hinterlegungsnummer 7953).
Arthrobacter sp. T-8626 ist ein Bakterium, welches von der Anmelderin aus dem Boden isoliert worden ist und dessen bakteriologische Eigenschaften die folgenden sind:
a) Mikroskopische Eigenschaften
Die Eigenschaften der in einem Agar-Nährmedium im Verlauf von einer Woche bei 300C gebildeten Kolonie sind die folgenden:
1. Form der Kolonie: rund
2. Größe: 2 bis 4 mm
25 3. Form der Oberfläche: konvex
4. Aussehen der Oberfläche: glatt
5. Glanz: matter Glanz
6. Farbe: anfänglich weißgrau, später gelblich
7. Transparenz: undurchsichtig 30 8. Peripherie: vollständig.
Morphologische Eigenschaften während der Züchtung bei 3 00C während 3 bis 2 4 Stunden:
1. Zellmorphologie: Die Zellen wachsen während etwa der ersten 3 Stunden ungleichmäßig und werden läng-
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lieh, stabförmig und keulenförmig. Später bilden sich Septa im mittleren Bereich und die Zellen biegen sich an den Septa und die Teilung wiederholt sich. Die Biegung setzt sich bis zur 6. bis 8. Stun-5 de fort. Nach der 12. Stunde sind fast sämtliche Zellen stabchenförmig, bilden Diplokokken und Streptokokken und werden einheitlich.
2. Polymorphismus: Die Mikroorganismen sind polymorph. 10 Die Zellen ändern sich von einem relativ kurzfaserigen Zustand zu einem kurzen stabchenförmigen und kokkusförmigen Zustand.
3. Teilungsmodus: Biege-Typ 15
4. Motilität: Keine
5. Sporenbildung: Keine
20 6. Kornreaktion: Schwach positiv während etwa 8 Stunden nach Beginn des Züchtungsvorgangs und negativ nach 12 Stunden.
7. Säurebeständigkeit: 25
b) Physiologische Eigenschaften
1. Wachstum unter anaeroben Bedingungen: -
2. Wachstum unter aeroben Bedingungen: + 3. Katalase: +
4. Oxidase: -
5. OF-Test: -
6. Nitratreduktion: +
7. Hydrolyse von Gelatine: + 5 8. Hydrolyse von Casein: -
9. Hydrolyse von Stärke: +
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10. Urease: +
11. Wachstum in 5 % NaCl: +
12. Wachstum in 10 % NaCl: -
13. Wachstumstemperaturbereich: 5 40C
1O0C +
200C ++
26°C ++
300C +++
10 370C +++
420C +
14. Säurebildung aus Kohlenhydraten: In Tabelle I angegeben.
15. Assimilierung von organischen Säuren: In Tabelle II angegeben.
c) Biochemische Eigenschaften
1. DNA-Basenzusammensetzung: GC-Gehalt 66,5 % 20 2. Haupt-Aminosäure der Zellwandung: Lysin
3. Glycolattest: Acyl-Typ
4. Art des Peptidoglucans: Die Muraminsäurereste des Peptidoglycans sind von dem Typ Lys-Ala.
25 d) Taxonomische Eigenschaften
Der vorliegende Stamm T-8626 ist ein gramnegatives Bakterium, welches während einer Periode des Zellzyklus keulenförmig (coryneförmig) ist, eine Teilung des Biege-Typs aufweist und schwach verzweigt polymorph ist. Der GC-Gehalt der DNA beträgt bis zu 70 %. Diese Tatsachen lassen darauf schließen, daß dieser Stamm der Familie der Corynebacteriaceae, Mycobacteriaceae oder Nocardiaceae angehört. Von diesen Familien zeichnen sich Mycobacteriaceae und Nocardiaceae dadurch aus, daß die Haupt-Aminosäure der Zellwandung DL-Diaminopimelinsäure ist und daß die Muramin-
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säurereste des Peptidoglycans dem Glycolyl-Typ angehören. Andererseits weisen die Corynebacteriaceae verschiedene Zusammensetzungen der Zellwand-Aminosäuren auf, wobei die Haupt-Aminosäuren der Zellwand LL-Diaminopimelinsäure, Lysin, Ornithin oder Diaminobuttersäure sind. Die Aminosäure-Analyse der Zellwand und der Muraminsäurerest des Peptidoglycans zeigen, daß bei dem vorliegenden Stamm T-8626 die Haupt-Aminosäure der Zellwandung Lysin ist und der Muraminsäurerest des Peptidoglycans dem Acyl-Typ angehört. Aufgrund dieser Tatsachen ist ersichtlich, daß der Stamm T-8626 der Gruppe der Corynebakterien angehört.
identifizierung des Genusbereichs
Der Genus und die Bakterienart von keulenförmigen Bakterien werden auf der Grundlage von instabilen Merkmalen und kleinsten Unterschieden festgestellt. Daher sind die Klassifizierung und die Identifizierung dieser Bakterien schwierig und häufig kontrovers. Yamada, Komagata et al.
haben taxonomische Untersuchungen an keulenförmigen Bakterien durchgeführt und ein neues taxonomisches System für diese Bakteriengruppe vorgeschlagen (1969 bis 1972). Sie haben die Aminosäurezusammensetzung der Zellwand, den GC-Gehalt der DNA, das Assimilierungsmuster von Kohlenhydraten und organischen Säuren und die Art der Zellteilung als Klassifizierungsfaktoren von keulenförmigen (Coryneformen) Bakterien im Genusbereich herangezogen und diese Bakterien in sieben Genera klassfiziert, nämlich Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Curtobacterium, Cellulomonas, Pimelobacter und eine unbekannte Gruppe.
Es ist davon auszugehen, daß der Stamm T-8626 dem Genus Arthrobacter angehört aufgrund der Tatsache, daß der Stamm keine Säuren aus verschiedenen Kohlenhydraten bildet und Lysin als Haupt-Aminosäure der Zellwand aufweist und einen biegenden Teilungsmodus zeigt.
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Identifizierung im Artenbereich
Für den Genus Arthrobacter wurden bislang 21 Arten (Spezies) nachgewiesen. Diese Arten werden über ihre physiologischen und biochemischen Eigenschaften unterschieden. Insbesondere wird die Aminosäure-Zusammensetzung der Interpeptid-Brücken der Zellwand (Peptidoglycan-Typ) als sehr wichtiges Identifizierungscharakteristikum angesehen (siehe Schleifer & Kandier: Bacteriological Review 36 (1972), 407 bis 477; und den DSM Catalog, herausgegeben von Claus & Schaab-Engels, 2. Auflage 1977).
Es wird angenommen, daß der Stamm T-8626 aufgrund der Tatsache, daß sein Peptidoglycan-Typ ein Lys-Ala-Typ ist, eine Art, die sehr eng verwandt ist mit Arthrobacter crystallopoietes. Nach der ursprünglichen Beschreibung von J.C. Ensign & S. C. Rittenberg (1963), die als erste Arthrobacter crystallopoietes beschrieben haben, ist diese Art dadurch gekennzeichnet, daß sie, wenn sie in einem 2-Hydroxypyridin als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium gezüchtet werden, die Kristalle eines grünen Pigments in dem Kulturmedium bilden.
Somit wurde ein Standardstamm von Arthrobacter crystallopoietes JCM 2522 beschafft und mit dem vorliegenden Stamm verglichen. Wenn der Standardstamm von Arthrobacter crystallopoietes (JCM 2522) in einem 2-Hydroxypyridin als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium gezüchtet wird, produziert er in dem Medium Kristalle eines grünen Pigments. Im Gegensatz dazu läßt sich bei der Züchtung des vorliegenden Stammes in dem gleichen Medium keine Bildung des grünen Pigments nachweisen. Darüber hinaus sind zwischen den beiden Stämmen einige Unterschiede bezüglich anderer physiologischer und biochemischer Eigenschäften festzustellen.
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Demzufolge ist davon auszugehen, daß der vorliegende Stamm T-8626 eine neue Spezies des Genus Arthrobacter darstellt. Jedoch wird die genaue Nomenklatur der Spezies berichtet, nachdem viele Stämme verwandter Spezies gefunden worden sind. Der Stamm T-8626 wird derzeit lediglich als Arthrobacter sp. bezeichnet.
Tabelle I
Assimilierung von verschiedenen Kohlenhydraten (Bildung von Säuren)
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Rhamnose - - - - - - - - - - —
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Fructose - - - - - - - - - - - -
Mannose - - - - - - - - - - - -
Galactose - - - - - - - - - - - -
Solbose - - - - - - - - - - - -
Sucrose - - - - - - - - - - - -
Lactose - - - — - - — - - - - -
Maltose - - - - - - - - - -
Trehalose - - - - - - - - - -
Cellobiose - - - - - - - - - -
Raffinose - - - - - - - - - -
Dextr in - - - - - - - - - -
Stärke - — - — — - - - — -
Inulin - _ - _ _ - - — — -
Glycerin — _ - - — - - - -
Erythrit - _ — - _ - — - - —
Aden it - - _ - - - - - - —
Mannit - - _ - - - - - - -
Dulcit - - _ - - - - - - -
Sorbit - - - - - - - - - -
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Tabelle II
Assimilierung von organischen Säuren
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Essigsäure + + + + + + + + + +
Brenztraubensäure + + .J- + + + +
Milchsäure + ■» + + + + + +
Äpfelsäure -j. + + + + + + + +
Bernsteinsäure + ■i + - + + +
Fumarsäure + ■i + + + + +
d. -Ketoglutarsäure - + + + + +
Citronensäure ■I - + + + + + + +
Ameisensäure + H + + +
Propionsäure + H + + + +
Buttersäure + - - + + + +
Oxalsäure + - - + + + +
Malonsäure - + + + - + + +
Glutarsäure - + + + - - - + +
Adipinsäure + - + -t- + - + + +
Pimelinsäure + + + + + + + + -
Glykolsäure Γ 4* + + + + + J.
Glyoxylsäure + Γ + + + + +
Gluconsäure + U + + +
Hippursäure . h + +
Harnsäure
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m χ
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OO
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Tabelle III
Vergleich von physiologischen und biochemischen Eigenschaften von Athrobacter sp. (T-8626) und A. crystallopoietes (JCM 2522)
5
Spezies T-8626 JCM 2522
Eigenschaften
Gramms—Flecken schwach positiv schwach positiv
Teilungsmodus biegend biegend
Motilität keine keine OF-Test
Nitratreduktion + +
Hydrolyse von Gelatine + +
15 Hydrolyse von Casein -
Hydrolyse von Stärke +
Urease + +
Wachstum in 5 % NaCl + +
Wachstum in 10 % NaCl - + Wachstumstemperaturbereich
4°C
1O0C
20°C ++ +
26°C ++ ++
3O0C ++ ++
37°C ++ +
42°C ■ +
Assimilierung von Kohlenhydraten (Bildung von Säuren)
Assimilierung von organi- + +
30 sehen Säuren
Zusammensetzung der DNA-Basen 66,8 % 63,6 %
Zusammensetzung der Zellwand Lysin Lysin
Peptidoglycan-Typ Lys-Ala-Typ Lys-Ala-Typ
Glycolat-Test Acyl-Typ Acyl-Typ
Bildung eines Pigments in - +
einem 2-Hydroxypyridin-Medium
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Der Mutantenstamm Arthrobacter sp. T-8626-11 wird nach der Verfahrensweise des Referenzbeispiels 1 erhalten.
(ii) Mikroorganismen, die zu Corynebacterium acetoacidophilum oder Corynebacterium lilium gehören und Muconsäure zu bilden in der Lage sind, wie Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium lilium ATCC 21793 etc.
(iii) Mikroorganismen des Genus Brevibacterium oder des Genus Microbacterium, die Muconsäure zu bilden in der Lage sind, wie Brevibacterium flavum ATCC 13826, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium divaricatum ATCC 21642, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13655, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 21645, ATCC 15354, etc.
Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen sind bei FIRM (Fermentation Research Institute, Agengy of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan) und ATCC (American Type Culture Collection) hinterlegt und von dort erhältlich.
Die erfindungsgemäß geeigneten Kulturmedien sind nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, daß sie Benzoesäure als Kohlenstoffquelle enthalten.
Neben der Benzoesäure können verschiedene Kohlenhydrate, organische Säure etc. zugesetzt werden. Als Stickstoffquelle kann man organische Ammoniumsalze, anorganische Ammoniumsalze, Harnstoff etc. verwenden.
Gegebenenfalls können weitere anorganische Substanzen, wie verschiedenartige Phosphorsäuresalze, Sulfatsalze, verwendet werden und auch verschiedene organische Nähr-
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substanzen zugegeben werden.
Die Züchtung erfolgt im allgemeinen während 12 Stunden bis 10 Tagen unter aeroben Bedingungen. 5
Der pH-Wert des Kulturmediums liegt im Bereich von 4 bis 10, während die Temperatur bei 20 bis 4O0C gehalten wird.
Für die Herstellung der Muconsäure kann man entweder Zellen in der Wachstumsphase oder Zellen in der Ruhephase verwenden.
Man kann irgendeine herkömmliche, allgemein angewandte Methode zur Gewinnung und Reinigung von organischen Substanzen zur Gewinnung und Reinigung der Muconsäure einsetzen.
Die erhaltene Muconsäure kann durch Hydrieren in Adipinsäure umgewandelt werden und ist als Ausgangsmaterial für die Herstellung von 1,4-Dicarbonsäurederivaten und auch als Rohmaterial für funktionelle Harze geeignet.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich die Muconsäure in hoher Ausbeute aus Benzoesäure bilden.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. In den Beispielen wurden die Substanzen gaschromatographisch, massenspektrometrisch etc. im Vergleich zu Standardproben identifiziert.
Beispiel 1
Man löst in 1 Liter Wasser 10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 5 g Natriumbenzoat und stellt den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 7,0 ein. Man gießt jeweils 50 ml des hergestellten Mediums in 500 ml-Flaschen und ste-
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rilisiert sämtliche Proben während 10 Minuten bei 1200C.
In der Zwischenzeit züchtet man Arthrobacter sp. T-8626 in einem Benzoesäure enthaltenden Schrägmedium während 30 Tagen bei 300C und impft dann eine der oben angesprochenen Flaschen mit einer Platxndrahtosenmenge des gezüchteten Mikroorganismus an und züchtet diesen während
2 Tagen bei 300C unter Bewegung des Mediums mit Hilfe einer bei 112 min betriebenen Schütteleinrichtung. Ausgehend von dieser Impfkultur impft man eine der oben angesprochenen Flaschen, die 50 ml des Kulturmediums enthält, welches einen modifizierten Natrxumbenzoatgehalt von
3 % aufweist, mit dem Mikroorganismus auf einen Mikroorganismengehalt von 8 % an. Man züchtet das Material während 2 bis 3 Tagen bei 300C, wobei man es in der Schütteleinrichtung, die mit der oben angegebenen Geschwindigkeit betrieben wird, bewegt. Es zeigt sich, daß man 50 mg eis, cis-Muconsäure erhält (1 g/Liter).
20 Referenzbeispiel 1
Man sammelt Arthrobacter sp. T-8626 in der logarithmischen Wachstumsphase aus dem Nährbrühenkulturmedium, welches einer Flüssigkeits-Bewegtkultur unterworfen worden ist, und wäscht das Material mit einer Citronensäure-Pufferlösung (pH-Wert - 7,0).
Man bestrahlt die gesammelten Mikroorganismen in üblicher Weise mit UV-Strahlung. Die bestrahlten Mikroorganismen werden über Nacht in einem Nährbrühenmedium einer Zwischenkultur unterworfen. Die in dieser Weise gezüchteten Mikroorganismen werden von der Stammplatte eines Agarnährmediums nach der Replika-Technik auf Medien übertragen, die Benzoesäure als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. In dieser Weise werden die nichtwachsenden Mutantenstämme nachgewiesen und auf dem letzteren Medium ge-
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sammelt.
Bezüglich der gesammelten Mutantenstämme wird die Fähigkeit der Umwandlung von Benzoesäure in Muconsäure untersucht, wobei zwei Muconsäure bildende Mutantenstämme gefunden wurden.
Beispiel 2
Man beschickt einen 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 45 ml eines Nährbrühenmediums und sterilisiert dann während 20 Minuten bei 12O0C. Dieses Kulturmedium impft man mit einem Muconsäure bildenden Stamm an, nämlich Arthrobacter sp. T-8626-11, d. h. einem der in dem Referenzbeispiel 1 erhaltenen Mutantenstämme, der auf einem Agarnährmedium vermehrt worden ist. Man führt die Flüssigkeits-Bewegtkultur während 24 Stunden bei 300C durch. Anschließend gibt man 5 ml einer getrennt sterilisierten NatriumbenzoatlÖsung (50 g/Liter) zu und setzt den Züchtungsvorgang unter den gleichen Bedingungen fort.
Dann analysiert man den Muconsäuregehalt des erhaltenen Kulturmediums, wobei sich zeigt, daß das Kulturmedium 4,5 g Muconsäure pro Liter enthält (molare Ausbeute gegenüber Benzoesäure = 91 %).
Beispiel 3
Man löst 10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 5 g Natriumbenzoat in 1 Liter Wasser und stellt den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 7,0 ein. Man gießt jeweils 50 ml des in dieser Weise erhaltenen Mediums in 500 ml-Flaschen und sterilisiert diese während 10 Minuten bei 1200C.
Zwischenzeitlich züchtet man Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21421 in einem Benzoesäure enthaltenden Schräg-
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medium während 3 Tagen bei 300C und impft eine der oben angesprochenen Flaschen mit einer Platindrahtöse des gezüchteten Mikroorganismus an und züchtet diesen während
2 Tagen bei 300C unter Bewegung mit Hilfe einer bei
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min betriebenen Schütteleinrichtung. Ausgehend von dieser Impfkultur impft man eine der oben angesprochenen Flaschen, die 50 ml des Kulturmediums mit einem modifizierten Benzoesäuregehalt von 3 % in der Weise mit dem Mikroorganismus an, daß sich ein Mikroorganismengehalt von 8 % ergibt. Man setzt den Züchtungsvorgang während
3 Tagen bei 3O0C unter Bewegung mit der Schütteleinrichtung, die mit der oben angegebenen Geschwindigkeit betrieben wird, fort. Man erhält schließlich 125 mg eis, cis-Muconsäure (2,5 g/Liter).
Beispiel 4
Man löst 10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 5 g Natriumbenzoat in 1 Liter Wasser und stellt den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 7,0 ein. Man gießt jeweils 50 ml des hergestellten Mediums in 500 ml-Flaschen und sterilisiert sämtliche Proben während 10 Minuten bei 1200C.
In der Zwischenzeit züchtet man Corynebacterium lilium ATCC 21793 in einem Benzoesäure enthaltenden Schrägmedium während 3 Tagen bei 300C und impft eine der oben angesprochenen Flaschen mit einer Platindrahtösenmenge des gezüchteten Mikroorganismus an und züchtet diesen dann während 2 Tagen bei 300C unter Bewegung mit Hilfe einer bei 112 min betriebenen Schütteleinrichtung. Ausgehend von dieser Impfkultur impft man eine der oben angesprochenen Flaschen, die 50 ml des Kulturmediums, dessen Benzoesäuregehalt auf 3 % eingestellt worden ist, mit dem Mikroorganismus an. Man setzt den Züchtungsvorgang während 3 Tagen bei 300C unter Bewegung mit Hilfe der bei der gleichen Geschwindigkeit betriebenen Schütteleinrich-
TER MEER · MÜLLER ■ STEINME'STER; * . " '■ ■■ FK4P2
tung fort. Es zeigt sich, daß man 70 mg eis, cis-Muconsäure erhält (1,4 g/Liter).
Beispiel 5 5
Man löst 10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 5 g Natriumbenzoat in 1 Liter Wasser und stellt den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 7,0 ein. Man gießt jeweils 50 ml des hergestellten Mediums in 500 ml-Flaschen und sterilisiert sämtliche Proben während 10 Minuten bei 12O0C.
In der Zwischenzeit züchtet man Brevibacterium flavum ATCC 14067 in einem Benzoesäure enthaltenden Schrägmedium während 3 Tagen bei 300C und impft dann eine der oben angesprochenen Flaschen mit einer Platindrahtösenmenge des gezüchteten Mikroorganismus an und züchtet diesen während 2 Tagen bei 300C unter Bewegung mit Hilfe einer bei 112 min betriebenen Schütteleinrichtung. Ausgehend von dieser Impfkultur impft man eine der Flaschen, die 50 ml des Kulturmediums enthält, dessen Natriumbenzoatgehalt auf 3 % modifiziert worden ist, in der Weise mit dem Mikroorganismus an, daß sich ein Mikroorganismengehalt von 8 % ergibt. Man setzt den Züchtungsvorgang während 3 Tagen bei 300C unter Bewegen mit Hilfe der Schütteleinrichtung, die mit der oben angegebenen Geschwindigkeit betrieben wird, fort. Es zeigt sich, daß man 130 mg eis, cis-Muconsäure erhält (2,6 g/Liter).
30 Beispiel 6
Man löst 10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 5 g Natriumbenzoat in 1 Liter Wasser und stellt den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 7,0 ein. Man gießt dann jeweils 50 ml des hergestellten Mediums in eine 500 ml-Flasche und sterilisiert sämtliche Proben während 10 Minuten bei
TER MEER · MÜLLER · STEINMEiSTER. ' * _■ FK4P2
12O0C.
In der Zwischenzeit züchtet man Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 während 3 Tagen bei 300C in einem Benzoesäure enthaltenden Schrägmedium und impft eine der Flaschen mit einer Platindrahtösenmenge des gezüchteten Mikroorganismus an und züchtet diesen während 2 Tagen bei 300C unter Bewegung mit Hilfe einer bei 112 min betriebenen Schütteleinrichtung. Ausgehend von dieser Impfkultur impft man eine der Flaschen, die 50 ml des Kulturmediums, dessen Natriumbenzoatgehalt auf 3 % modifiziert worden ist, in der Weise mit dem Mikroorganismus an, daß sich ein Mikroorganismengehalt von 8 % ergibt. Man setzt das Züchten des Mikroorganismus während 4 Tagen bei 300C unter Bewegung mit Hilfe der bei der oben angegebenen Geschwindigkeit betriebenen Schütteleinrichtung fort. Es zeigt sich, daß man 120 mg eis, cis-Muconsäure erhält (2,5 g/Liter).

Claims (6)

TER MEER-MÜLLER-STEINMEISTER PATENTANWÄLTE- EUROPEAN PATENT ATTORNEYS Dipl.-Chem. Dr. N. ter Meer Dipl. Ing. H. Steinmeister Dipl. Ing. F. E. Müller Artur-Ladebeck-Strasse 51 Mauerkircherstrasse 45 D-8000 MÜNCHEN 80 D-4800 BIELEFELD 1 PK4P2 25. November 1985 Agency of Industrial Science & Technology Ministry of International Trade and Industry of Japan 3-1 Kasumigaseki 1—chome Chiyoda-ku, Tokyo, Japan Verfahren zur Herstellung von Muconsäure Priorität: 26. November 1984, Japan, Nr. 248205/84 (P) 26. November 1984, Japan, Nr. 248207/84 (P) 30. Juli 1985, Japan, Nr. 166902/85 (P) Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Muconsäure, d a durch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus ausgewählt aus:
(i) Arthrobacter sp. T-8626 oder Mutantenstämmen davon, die Muconsäure zu bilden in der Lage sind; (ii) zu Corynebacterium acetoacidophilum oder Corynebacterium lilium gehörenden Mikroorganismen, die Muconsäure zu bilden in der Lage sind; und
TERMEER-MaLLER-STEINME)STER; FK4P
(iii) zu dem Genus Brevibacterium oder dem Genus Microbacterium gehörenden Mikroorganismen, die Muconsäure zu bilden in der Lage sind;
unter Verwendung von Benzoesäure als Kohlenstoffquelle züchtet und die Muconsäure aus der Kultur gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man Arthrobacter sp. T-8626 FIRM No. 7952 oder Arthrobacter sp. T-8626-11 FIRM No.
10 7 953 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus ausgewählt aus der Corynebacterium acetoacidophilum ATCC No. 21421 und 13870 und Corynebacterium lilium ATCC No. 21793 umfassenden Gruppe verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus ausgewählt aus der Brevibacterium flavum ATCC No. 13826, Brevibacterium saccharolyticum ATCC No. 14066, Brevibacterium divarcatum ATCC No. 21642 und Brevibacterium lactofermentum ATCC No. 13655 umfassenden Gruppe verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus aus der Microbacterium ammoniaphilum ATCC No. 21645 und ATCC No. 15 354 umfassenden Gruppe verwendet.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 4O0C bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 10 in einem Benzoesäure oder ein Benzoat enthaltenden Kulturmedium
35 züchtet.
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