DE2120676A1 - Verfahren zur asymmetrischen Reduktion von Seco Steroiden - Google Patents
Verfahren zur asymmetrischen Reduktion von Seco SteroidenInfo
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Description
!TRASSE 2O 2120676
um
Ihr Z«d»n
AnwaltsaJcte 20 852
Be/A
Be/A
American Home Products Corporation New York, H.Y. (ü3A)
y er fahren zur asymmetrischen ^Reduktion von
Seco-SteroiäenM
Die Herstellung von Steroiden durch Geaamtayntheae aus
relativ einfachen chemischen Verbindungen» wie aie beispielsweise von Smith und anderen in "Totally Synthetic
Steroid Hormones, Part IIM, J. Chem. Soe, (1964)t Seiten
4472 bis 4492, beschrieben sind, führen zur Bildung von
Gase AHP-4888 -2-
109883/18U
lacematen. Nach der von Fieser und Fieser, "Steroide";,
Seite 336 (1959) vorgeschlagenen Regelung sind die als d-
die
formen bezeichneten Verbindungen r T^änantiomeren, die in der Konfiguration bei C-13 dem natürlichen Hormon Oestroii entsprechen. Die entsprechenden Enantiomorphen v/erden demgemäß als l-Formen und die Racemate als dl—"Wurmen bezeichnet'»
formen bezeichneten Verbindungen r T^änantiomeren, die in der Konfiguration bei C-13 dem natürlichen Hormon Oestroii entsprechen. Die entsprechenden Enantiomorphen v/erden demgemäß als l-Formen und die Racemate als dl—"Wurmen bezeichnet'»
Weil die hormonalen Wirkungen im wesentlichen den d-Reihen
zuzuschreiben sind, sind Verfahren, die zur Bildung solcher " Verbindungen führen, von Interesse· Babel ist klar, daß dieses
Problem dadurch gelöst werden könnte, daJ3 man von einem
der Zwischenprodukte die d-3?orm herstellt, v/oö.urch man die
d-lPorm eines fertigen Hormonsteroids erhalten kann»
Gemäß den vorausgehenden Darlegungen beschreiben S-IIb lan. und
andere die Bildung von optisch aktiven Seco-Steroiden durch
mikrobiologische Verfahren unter Verwendung einer Hefe der Gattung Saccharomyees in Tetrahedron Letters LIr* 21, Seiten
2321 - 2330 (1966). Die gleiche biologische Gattung wird
ebenso, und zwar für denselben Zweck, von Rufer und anderen
in Liebigs Ann. Chem. 702, Seiten 141 - HS (1967) erwähnt,,
Die Erfindung betrifft optisch wirksame Seco-b.; ;roide and
im besonderen die Verwendung spezifischer Mikroorganismen?
um diese Steroide zu erhalten.
Das Verfahren umfaßt allgemein die fermentati ri H^iJlcti^ii
von ausgewählten Seco-Steroiden unter Verwendung der spezifischen
Llikrocrganismen Pichia farinosa NRRL Y-118 oder
Pichia farinosa CBS 185.
Die Reaktion wird durcn den nachfolgenden Reaktionsablauf
erläutert
CD
(II)
worin jeder der Beste R und R1 unabhängig voneinander Alkylreste
sind. Diese Verbindungen sind bekannt und beispielsweise in der Britischen Patentschrift 1 041 273 vom 1.9.1966
beschrieben.
Nach der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß die Mikroorganismen Picnia farinosa NRRL Y-118 oder Pichia farinosa
CSS 185 oder die von ihnen hergestellten Enzyme die oben beseiiriebenen Seco-Steroide zu optisch aktiven Verbindungen
reduzieren können und dies besonders zu den wertvollen d-1 Tß-Hydroxy-Seco-Steroiden.
Die aus der Reamktionsstufe erhaltenen Verbindungen sind
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besonders wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung der
optisch aktiven Steroide der in den vorausgehend erwähnten Veröffentlichungen von G-ibian und anderen und Rufer und anderen
beschriebenen Art. Steroide mit einem aromatischen A-Ring, wie sie aus diesen Zwischenprodukten hergestellt werden,
sind hormonell wirksame Oestrogene und beispielsweise zur Verringerung der Hyperlipämie bei Warmblütern geeignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß man zuerst den ausgewählten Mikroorganismus in
typischen Wuchsmedien kultiviert, die assimilierbaren Kohlenstoff, vorzugsweise ein Kohlehydrat wie Dextrose, eine
Stickstoffquelle, vorzugsweise organischen Stickstoff wie
proteinhaltige Substanzen, beispielsweise Getreide-(einweich) liquor und/oder Pepton, und Wasser enthalten,
Nachdem man die Mikroorganismen in dem gewünschten Ausmaß bebrütet hat, wird das ausgewählte Seco-Steroid-Substrat
vorzugsweise in einem Lösungsmittel unter sterilen und aeroben Bedingungen zugegeben. Ein geeignetes Schaumverhütungsmittel
ist zweckmäßig und kann ebenso verwendet werden. Es wird gerührt, wobei die Temperatur im Bereich von 25 bis
370G solange beibehalten wird, um die gewünschte Überführung
oder biochemische Umwandlung des Seco-Steroids zu der optisch aktiven Verbindung zu bewirken.
—5—
109883/18U
Nach Beendigung der laikrobiologischen Reduktion wird die
Fermentationsbrühe mit einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise
Äthylacetat oder Methylisobutylketon, extrahiert, und die so erhaltenen Extrakte werden zur Entfernung
des Lösungsmittels konzentriert, wobei die Temperatur unter 5O0C gehalten wird. Das gewünschte Produkt wird dann in der
d-IOrm eines 3-Alkoxy-17ß-hydroxy-8,14-secogona-1,3t5(iO),-9(11)-tetraen-14-on
nach den üblichen Verfahren aus dem Rückstand isoliert.
Die nachfolgenden Beispiele besehreiben und erläutern die
verschiedenen Möglichkeiten des Verfahrens in weiteren Einzelheiten.
Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von 3-Methoxy-8,14-secooestra-1,3,5(1O),9(11)-tetraen-14,17-dion
als Steroidsubstrat zur Herstellung von d-3-Methoxy-8,14-secooestra-1,3,5(10),9,11-tetraen-17-ß-ol-14-on.
Eine Agarsehrägkultur von Pichia farinosa NBRL Y-118 wurde
mit 5 ml Medium der folgenden Zusammensetzung gewaschen:
Getreide-(einweich)-Liquor 20 g
Pepton 20 g
Dextrose 50 g
destilliertes H2O 1 Liter.
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Vor der Einbringung in den Autoklaven wurde der pH-Wert auf
7,0 mit 5 N NaOH eingestellt.
Ein ml Zellsuspension wurde in einen 250 ml Kolben übertragen, der 50 ml des oben beschriebenen Mediums enthielt« Der
Kolben wurde bei 28 G auf einem Drehsehüttler mit 250 Upm
bei einem ca. 5 cm (2 Inches) Drehdurchmesser bebrütet»
^ !fach 24 Stunden Wuchs wurden 5 ml der erhaltenen Zellsuspension
in einen anderen Kolben mit dem gleichen Medium überführt. Nach 16 Stunden Bebrüten wurden 10 mg 3-ðoxy-8,-14-secooestra-1,3,5(10),9(11)-tetraen-H,17-dion,
gelöst in Äthanol, dem Kolben zugegeben· 5 ml-Proben wurden bei 3 und
6 Stunden entnommen, und jede Probe wurde mit 1 ml Methylisobutylketon
äquilibiert.
Gleiche Teile der Lösungsmittelextrakte wurden auf Glasschieber, die mit Silikagel, ¥ 254 (Brinkmann), beschichtet
waren, getupft, und die Platten wurden in einem Ghloroform-Aceton-Gemisch
(9s1) entwickelt. Die Prüfung der Platten
unter UV-Licht zeigte nach Trocknen einen !"lecken des Produkts
guter Größe mit dem R~-Wert von d-3-Meth.oxy-8,i4~seco
oestra-1,3,5(10),9(11)-tetraen-17-ß-ol-14-on. Die 6-3tunden
Probe zeigte eine Erhöhung des Produkts, wobei eine geringe Menge des Substrats unverändert blieb.
Nach 30 Sekunden Erhitzen auf 100° C wurde die Platte mit
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einer Lösung von Phosphojiaolybdänsäure (PMA) in Äthanol
(10 g pro 100 ml) gesprüht. Die Farbreaktion des Produkts
glich der Standardverbindung.
Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von 3-Methoxy-8,14-secooestra-1,3»5(1O)r9(11)-tetraen-H,l7-dion
als Steroidsubstrat, 1 g/l.
Eine Agarschrägkultür von Pichia farinosa NERL Y-118 wurde
mit 5 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung gewaschen ι
"H-Z Case" (Pepton) 20 g
Bacto-Pepton 20 ζ
Dextrose 20 g destilliertes Wasser 1 Liter
1 ml der Zellsuspensioii wurde in einen 250 ml-Kolben überführt,
der 50 ml des oben angegebenen Mediums enthielt. Der
Kolben wurde auf einem Brehschüttler bei 25°C, 250 üpm,
2,5 cm (1 inch) Brehdiirchmesser, bebrütet.
Hach 23-stündigem Anbrüten wurden 5 ml des Kolbeninhalts in
einen zweiten Kolben mit dem gleichen Medium überführt. Nach
19 Stunden Wuchs wurden. 50 mg 3-Methoxy-8, H-secooestra-1,3»-
5(10),9(11)-tetraen-14f17-dion, gelöst in 0,5 ml ÄtQH, dem
Kolben unter Bildung einer hohen Konzentration von 1 g/l
1QS8S3/18U "8~
zugegeben. Proben wurden nach. 6 und 24 Stunden Kontaktzeit
entnommen; diese wurden, wie in Beispiel 1 angegeben, bearbeitet. Die Dünnschicht-Ghromatographie zeigte ein Produkt
mit dem R^-Wert des 17ß-ol-Analogen und einem geringen Rückstand
an Substrat bei der 6-Stunden-Probe. Die Analyse der 24-Stunden-Probe zeigte eine Erhöhung des 17ß-ol, wobei
noch Spuren.des Substrats zurückblieben.
Fermentation im präparativen Umfang von 3-Methoxy-8,H-secooestra-1,3,5(10)
,9(11)-tetraen-H, 17-dion in einem 14 Liter
Gärbehälter.
Drei Agarsehrägkulturen von Pichia farinosa KRRL Y-118 wurden
jede mit 5 ml destilliertem V/asser gewaschen und die Zellsuspension in 3 Einliter-Kolben überführt, wobei jeder
200 ml des in Beispiel 2 angegebenen Mediums enthielt.
Die Kolben wurden 24 Stunden bei 26 C auf einem Drehschüttler
mit 250 Upm bebrütet, wonach ihr Inhalt in einen 14 1 Gärbehälter überführt wurde, der 6 1 Inoeulum-Medium enthielt.
Das Rühren erfolgte mit 250 Upm, die Belüftung mit 6 Liter und die Temperatur wurde bei 25°0 gehalten. "Dow
Corning Silicone B", verdünnt 1:2, wurde als Schaumverhinderungsmittel verwendet.
Nach 18 Stunden Bebrüten wurden 18 g 3-Methoxy-8,14-seco-
-9-
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oestra-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion (3 g/l), gelöst
in 90 ml Äthanol, dem lermentationsgemisch zugegeben. Das
Rühren wurde auf 300 Upm erhöht und die Belüftung auf 3
liter gesenkt« Es wurden 30 ml Äthanol dem Fermentationsbehälter 24 Stunden na oh der Steroidzugabe zugeführt» Bei
77 Stunden wurde das Eühren auf 150 Upm verringert, und eine halbe Stunde später wurden 120 ml Äthanol zugegebene
Das Fermentationsgemisch, 5,7 1, wurde bei 121 Stunden entnommen,
wob.ei etwas Substrat zurückblieb. (Eine Probe, die man 14 Liter-Fermentationsgemisch entnommen hatte, dem man
3-Methoxy-8,H-seoooestra~1,3,5(10),9(11)~tetra en-H, 17-dion
mit 1 g/l zugegeben hatte, zeigte einen ähnlichen G-rad an nicht verändertem Substrat.) Die Lösungsmittelextraktion
wurde mit 4 1 Methylisobutylketon durchgeführt, und die gemischten
Extrakte wurden mit NaHCQ.,-Lösung gewaschen und
mit NapSO. getrocknet.
Die Extrakte wurden auf einen lösungsmittelfreien Rückstand konzentriert, der in Diisopropyläther gelöst und bei -100G
über Nacht gelagert wurde. Das ausgefällte Produkt wurde filtriert und getrocknet, (0,1 mm/1 Std./PgO,-) unter Bildung
von 10,0 g Schmelzbereich 118 bis 12O0Cj D*J^ =
-30° (Grad optischer Drehung) (c => 2,Dioxan), 58,8 # Ausbeute.
Das oben angegebene Material wurde aus Diisopropyläther um-
109883/18U
kristallisiert unter Bildung von 7»175 g, Schmelzbereich
112 - 1H0C; ZT*7^5 = -36° (Grad optischer Drehung)
(c = 2,Dioxan).
Fermentation in präparativem Umfang von Pichia farinosa HREL Y-118 mit 3-Methoxy-8,H-secooestra-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14»17-dion,
das im Verhältnis von 1 l/g zugegeben wurde.
Das Verfahren wurde ähnlich dem Verfahren 2 mit zwei Ausnahmen durchgeführt. Die Rührgeschwindigkeit für die Inoculuja-Kolben
wurde auf 215 Upm gesenkt und die Zusammensetzung des Mediums wie folgt geänderts
"N-Z Case» (Pepton) 10 g
Bacto-Pepton 10 g
Dextrose 20 g destilliertes Wasser 1 Liter
6 g 3-Methoxy-8,H-secooestra-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion
in 60 ml Äthanol wurden dem Fermentationsbehälter nach 18 Stunden Wuchs zugegeben. 6 Stunden später wurden 144 mg
MgSO..7HpO dem Fermentationsprozeß zugegeben, wach weiteren
18 Stunden wurde die Zugabe von MgSO..7HpO wiederholt.
Die Gärung, 6 1, wurde bei 48 Stunden entnommen und 2 Liter
-11-
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der Gesamtbrühe wurden, mit 500 ml Gycloliexan extrahiert.
Wegen der geringen Trennung des Lösungsmittels und der Brühe wurde das Gemisch mit den verbleibenden 4 1 gemischt, und
dieses neue Gemisch wurde mit 1 1 Methylisobutylketon extrahiert. Nach Abtrennen der Zellen mittels Zentrifugieren wurden
sie mit 1 1 des zweiten Lösungsmittels extrahiert. Die
Flüssigkeit wurde ebenso mit 2 1 Methylisobutylketon extrahiert. Die gemischten Extrakte wurden zwei mal mit NaHCO-,-Lösung
gewaschen und mit NapSO, getrocknet.
Die gemischten Extrakte wurden zu einem lösungsmittelfreien
Rückstand konzentriert, der in Diisopropyläther gelöst und bei -100O abgeschreckt wurde unter Bildung des Produkts,
3,40 g; Schmelzbereich 109 - 1100C; C"J^ = ~36° (c = 2,
Dioxan); 57»5 $ige Ausbeute.
Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von 13ß-Äthyl-3-methoxy-S,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion
als Steroidsubstrat.
Ein 250 ml Kolben mit 50 ml des in Beispiel 2 beschriebenen Mediums wurde mit einer Zellsuspension von Pichia farinosa
NRRL Y-118, wie vorausgehend angegeben, geimpft. Die Inkubation
wurde auf einem Drehschüttler bei 215 Upm und 26 t 24 Stunden durchgeführt. Es wurde dann eine 5 ml Übertragung
zu einem zweiten Kolben mit dem gleichen Medium vorgenommen.
-12-
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2Ί20676
Nach 18,5 Stunden Wuchs wurden 50 ml 13ß-Athyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,
5(10) ,9(11 )-tetraen-14,17-dion, gelöst in
0,5 ml Äthanol, dem Kolben zugegeben, wodurch man die hohe Konzentration von 1 g/l erhielt.
Die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie einer nach Stunden entnommenen Probe und nach einem Verfahrensablauf
wie in Beispiel 1 zeigte das 17ß-ol-Derivat, d-13ß-Äthyl-3-methoxy-8,14-seeogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-17ß-ol-14-on
mit einer schwachen Spur des verbleibenden Substrates.
Fermentation in präparativem Umfang von 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion
in einem 14 Liter-Gärbehälter (1 g/l in zwei Zugaben von V2 G-ramrn).
Drei 1 Liter-Inoculum-Kolben wurden hergestellt und mit
Zellen von Pichia farinosa IiERL Y-118, wie in Beispiel 3
ausgeführt, geimpft. Das Bebrüten der Kolben (215 Upm) und die Übertragung ihres Inhalts in einen 14 Liter-Gärbehälter
mit 6 1 des gleichen Mediums wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt. Die Wuchsbedingungen in dem Fermentationsbehälter
waren gleich, ausgenommen die Temperatur, die auf 26 G gehalten wurde.
Nach 18 Stunden Wuchs im Fermentationsbehälter wurden 3 g
13ß-Äthyl-3-methoxy-8,i4-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-
-13-
109883/1814 . ,
14,17-d.ion, gelöst in 60 ml Äthanol (oder 0,5 g/l) zugegeben.
Die Belüftung wurde mit 6 1 Luft beibehalten, während das Rühren auf 300 Upm erhöht wurde. 7 Stunden später wurde
die Zugabe von 13ß-Äthyl~3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),
9(11 )-tetraen-14, 17-dion wiederholt. Nach 24 Stunden wurde
die fermentation, 6,15 1, zur Extraktion mit Methylisobutylketon entnommen. Nach der ersten Extraktion mit 1 1 Lösungsmittel
wurden die Zellen abfiltriert und mit 1,5 1 gleichem Lösungsmittel extrahiert. Das Filtrat wurde dann
mit 3 Litern Methylisobutylketon extrahiert.
Die zusammengegebenen Extrakte wurden zwei mal mit NaHCO,
gewaschen und über Na?SO. getrocknet, wonach sie zu einem
lösungsmittelfreien Rückstand gebracht, in Diisopropyläther gelöst und bei 10°0 über Nacht gelagert wurden. Durch filtrieren
und Trocknen erhielt man das Produkt (3»275 g)| Schmelzbereich 87 - 890Cj D1J^ = +10° (G=2>
Dioxan)J 54»6 $ige Ausbeute.
Durch Verringerung der Mutterlaugen unter Vakuum und durch l'riturieren des Rückstands mit Cyclohexan erhielt man weitere
0,450 g| Schmelzbereich 87 - 89°Cj C*J?$ = +11° (o=2,
Dioxan) und damit eine Gesamtausbeute von 62 $.
Verwendung von Pichia farinosa NRRIi Y-118 in präparativem
Umfang mit 13ß-Äthyl-3-methoxy-8rH-secogona-1,5,5(10),9(11)·
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tetraen-14,17-dion (1 g/l).
Die in Beispiel 6 beschriebene Fermentation wurde wiederholt,
ausgenommen, daß 13ß-Äthyl-3-methoxy-8f14-secogona-1
»3,5(10),9(T1 )-tetraen-H, 17-dion in einer einzigen Zugabe
mit 1 g/l (6 g) nach 17 Stunden Wuchs im Gärbehälter zugegeben wurden. Die Gesamtbrühe, 6 1, wurde nach 6 Stunden mit
Methylisobutylketon extrahiert, wie im vorausgehenden Beispiel angegeben. Die Zellen wurden nach Filtrieren mit 1 1
" Lösungsmittel, und das Filtrat mit 3 1 Lösungsmittel extrahiert.
Die zusammengegebenen Extrakte wurden gewaschen und wie in Beispiel 5 getrocknet und zur Trockne konzentriert. Durch
Triturieren mit heißem Cyclohexan nach Konzentrieren auf die Hälfte des Volumens erhielt man das Produkt} 3,95 gj
Schmelzbereich 80 - 860Oj £kJ^ = +7° (c=2, Dioxan) j
65,7 $ige Ausbeute. Die DünnschichtChromatographie zeigte,
daß das Produkt nur Spuren an Ausgangsmaterial ohne eine andere Verunreinigung enthielt.
Fermentation in präparativem Umfang von 13ß-Ä'thyl-3-methoxy-8,H-aecogona-1,3|5(1O),9(11)-tetraen-14,17-dion,
2 g/l, mit Pichia farinosa URHL Y-118.
Eine weitere Fermentation wurde in einem 14 Liter-Fermenta-
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tionsgefäß in dem in Beispiel 2 hergestellten Medium vorgenommen. Das Fermentationsverfahren war dem von Beispiel 6
ähnlich, ausgenommen, daß die Wuchsstufe in dem Fermentationsgefäß nur 1 Stunde kürzer war, nämlich 17 Stunden.
12 g 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,H-secogona--1,3,5(10),9(ii)-tetraen-14j17-dion,
gelöst in 90 ml Äthanol, wurden zu diesem Zeitpunkt zugegeben. 60 ml Äthanol wurden zwei mal dem
Behälter nach der Steroidzuführung, einmal nach 8 Stunden
und erneut 5 Stunden später, zugegeben. Die Temperatur in dem Fermentations gefäß lag während dem Ablauf des Prozesses
im Bereich von 24 bis 280G.
Das Fermentationsprodukt, 6 1, wurde nach 25 Stunden entnommen
und die Extraktion mit Methylisobutylketon, wie in Beispiel 7 angegeben, durchgeführt« Das Triturieren des verdampften
Extraktes mit heißem Gyclohexan lieferte das Produkt, 7,235 g; Schmelzbereich 86 - 880G; £*J^ = +9°
(c=2, Dioxan)j 60,2 °/o±ge Ausbeute.
13ß-Äthyl-3-methoxy-8,H-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion
wurde einem H Liter-Fermentationsgefäß mit 2 g/l (in 2 Gramm-Zuschlägen) zugegeben.
Die Fermentation mit Pichia farinosa NEEL Y-118 wurde, wie
in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt, ausgenommen, daß
die Wuchsdauer in dem Feimentationsgefäß auf 16 Stunden
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verringert wurde. 6 g 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,H-secogona-1,3
5(10) ,9(11 )-tetraen-H, 17-cLion wurden in 60 ml Äthanol zugegeben.
5V2 Stunden später wurden weitere 6 g 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,
H-secogona-1,3, 5(10) ,9(11 )-tetraen-H, 17-dion in
ähnlicher Weise unter Bildung einer Gesamtkonzentration von 2 g/l zugegeben. 30 ml Äthanol wurden dem Fermentationsablauf
nach weiteren 5V2 Stunden Bebrüten zugegeben. Die Temperatur
wurde auf 26 - 26,5°0 gehalten.
Die Fermentationsbrühe, 5,8 1, wurde nach 12 Stunden Kontaktzeit entnommen und, wie in Beispiel 7 beschrieben, extrahiert,
ausgenommen, daß die Zellen vier mal mit 1,5 1 Methylisobutylketon
extrahiert wurden. Die zusammengegebenen Extrakte wurden zu einem lösungsmittelfreien Rückstand konzentriert.
Durch Triturieren mit warmem (500O) Cyclohexan
und nachfolgendem Filtrieren erhielt man das Produkt, 9,61g; Schmelzbereich 70 - 800O; 83 folge Ausbeute. Zur Entfernung
des Pigments wurde das isolierte Material aus Gyclohexan ψ umkristallisiert unter Bildung von 7,20 g; Schmelzbereich
87 - 880C (62 $ige Ausbeute); C*J^ = +10° (c=2, Dioxan).
Die DünnschichtChromatographie dieses Materials und des anfangs
isolierten Produkts zeigte nur Spuren des Ausgangsmaterials als Hauptverunreinigung.
Pichia farinosa KEEL· Y-118 mit 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,H-secogona-1,3,5(10)
,9(11 )-tetraen-H, 17-dion, Zugabe mit
-17-109883/18U
- 17 3 g/l (drei Zugaben zu jeweils 1 Gramm).
Das Fermentationsverfahren mit Pichia farinosa NERIi Y-118
war dem von Beispiel 9 ähnlich, wobei die erste Zugabe von 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(1O),9(11)-tetraen-14,17-dion,
6 g in 60 ml Äthanol (1 g/l), nach 16 Stunden Wuchs dem Fermentationsgefäß zugegeben wurde. 5Y2 Stunden
später erfolgte ein zweiter Zuschlag von 13ß-A'thyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion
mit 1 g/l; nach einem ähnlichen Zeitraum erfolgte die dritte Zugabe der Verbindung unter Bildung einer Gesamtkonzentration
von 3 g/l·
Hach 19 Stunden Fermentationszeit wurde das Gemisch, 5,84 1,
mit 1 Liter Methylisobutylketon extrahiert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugieren abgetrennt und vier mal mit 1,35
Liter Lösungsmittel extrahiert, wobei die überstehende Schicht 5 mal mit 5 Liter Lösungsmittel extrahiert wurde.
Nach Waschen und Trocknen wurden die kombinierten Extrakte zu einem lösungsmittelfreien Eückstand konzentriert. Dieser
Rückstand wurde kräftig mit Gyclohexan (300 ml) bei Zimmertemperatur gerührt, und das ausgefällte Produkt, filtriert
und getrocknet, lieferte 11,275 g bei 64,3 #iger Ausbeute j
Schmelzbereich 75 - 800C; D*J^ = +8° (c=2>
Dioxan) i &><*
(Gasflüssigkeitschromatographie) 1,8 m (6 ft.) SE 30, 3 #,
GH2G12(25O°D 3000J 300°), was einer 96,2 #igen Reinheit
entspricht.
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Pichia farinosa HBEL Y-118 mit 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-l,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion,
zugegeben mit 3 g/l (drei Zuschläge zu 1g)·
Diese Fermentation von 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion
erfolgte mit 3 g/l mit Pichia farinosa HEHL Y-118 in dem in Beispiel 4 beschriebenen
Medium. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 10 bis und ) einschließlich der ersten Zugabe von 1 g/l 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(1O),9(11)-tetraen-14,17-dion
durchgeführt. Der zweite und dritte Zuschlag des Steroids,
jeweils 1 g/l, wurde nach ? bzw. 18 3/4 Stunden durchgeführt. 4 Stunden nach der zweiten Zugabe wurden dem Fermentationsgemisch
60 ml Äthanol zugegeben.
Die Fermentationsbrühe, 5fO4 1, wurde nach 30,25 Stunden
Steroidbebrütung entnommen* Das Extraktionsverfahren mit Methylisobutylketon wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben,
™ durchgeführt, ausgenommen, daß die Zellen drei mal mit 1 1
lösungsmittel und die überstehende Schicht vier mal mit 4 Lösungsmittel extrahiert wurden. Das Waschen und Trocknen
der kombinierten Extrakte erfolgte über ihre Konzentration zur Trockne zu einem lösungsmittelfreien Eückstand, der bei
Zimmertemperatur, wie in Beispiel 10 beschrieben, gerührt und unter Bildung des getrockneten Produkts filtriert wurde
(12,250 g)j Schmelzbereich 80 - 85°C; /*7p4 = +8° (c=2,
-19-109883/1814
Dioxan); 81,2 #ige Ausbeute j G-asflüssigkeitschromatographie
= 91,5 9&ige Reinheit.
Pichia farinosa NRRL Y-118 mit 13ß-A'thyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-i4,17-dion,
Zugabe mit 1 g/l, Zellen in Wasser suspendiert.
Drei Agarschrägkulturen von Pichia farinosa HRRL Y-118 wurden
jede mit 5 ml destilliertem V/asser gewaschen, und die erhaltenen Zellsuspensionen wurden in drei Einliter-Kolben
überführt, wobei jeder 200 ml des in Beispiel 2 beschriebenen Mediums enthielt. Die Kolben wurden 24 Stunden auf
einem Drehschüttler bei 26 bebrütet, nachdem ihr Inhalt in ein 14 Liter-Fermentationsgefäß mit 6 1 des gleichen Mediums
überführt war. Das Rühren wurde mit 250 Upm, die Belüftung
mit 6 1 Luft pro Minute durchgeführt und die Temperatur bei 25°C gehalten.
Nach 17,5 Stunden Bebrüten wurde das üPermentationsgemisch
zentrifugiert, die überstehende Schicht dekantiert und die Zellen in destilliertes V/asser suspendiert unter Bildung
eines Volumens von 6 1. 6 g 13ß-Ä'thyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(1O),9(11)-tetraen-14,17-dion,
gelöst in 60 ml Äthanol, wurden zugegeben. Die Rührgeschwindigkeit wurde
auf 300 Upm erhöht. Nach 10 Stunden Kontaktzeit wurde die Rührgeschwindigkeit auf 200 TJpm gesenkt, wobei die Belüf-
-20-109883/1*14
2120G76
tung auf Null und dann auf den früheren Stand eingestellt
wurde.
Bei 21 Stunden (die Belüftung war erneut auf Hull gestellt) v/urde die Fermentationsbrühe entnommen. Das G-esamtvolumen
von 5,85 1 wurde mit 1 liter Methylisobutylketon (MIBK)
extrahiert. Nach Abtrennen der Zellen und Flüssigkeit wurde jede drei mal mit 3 1 Methylisobutylketon extrahiert.
Die kombinierten Extrakte wurden zwei mal mit NaHCO^-Lösung
gewaschen und mit ITa2SO. getrocknet und die Lösungsmittel
unter reduziertem Druck entfernt. Der lösungsmittelfreie Rückstand wurde mit Cyclohexan (300 ml) 4 Stunden gerührt
und die ausgefällten Feststoffe abfiltriert und unter Bildung des Produkts getrocknet; Ausbeute 4,05 g (69,2 fo)-,
Schmelzbereich 84 - 860G; /j^J^ = +12°(c=2, Dioxan); Gasflüssigkeitschromatographie
=98,7 $ige Reinheit.
Pichia farinosa NRRL Y-118 mit 13ß-Äthyl-3-methoxy-S,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion,
zugegeben mit 3 g/l, (1 g pro Zugabe), Zellen in Wasser suspendiert.
Das Fermentationsverfahren wurde in ähnlicher Weise wie
in Beispiel 12 durchgeführt, ausgenommen daß die Temperatur 260C betrug.
-21-
109883/1814
Wach Zugabe von 15ß-&tnyl-3-methoxy-8,H-secogona-1,3,5-(1O),9(ii)-tetraen-14,17-dion
mit 1 g/l in 60 ml Äthanol zu der Zellsuspension, wurde die Belüftung auf 3 1 Luft/Min,
verringert und die Rührgeschwindigkeit auf 300 Upm erhöht.
Eine halbe Stunde später wurde das Anfangsbeluftung3verhältnia,
6 l/Min., wieder hergestellt. Zwei weitere Zugaben von 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11 )-tetraen-14,17-dion,
jeweils 6 g, wurden nach 5 uncL 10 Stunden
nach der ersten Zugabe vorgenommen.
Die Fermentationsbrühe, 5,5 1, wurde nach 46,5 Stunden
entnommen. Das Extraktionsverfahren war dem von Beispiel ähnlich.
Die zusammengegebenen Extrakte wurden unter Vakuum auf einen Lösungsmittel freien Rückstand verringert. Das Rühren
des getrockneten Rückstands mit Cyolohexan (360 ml), wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Das ausgefällte
Produkt wurde filtriert und getrocknet, wodurch" man
11,065 g (67,1$ige) Ausbeute erhielt; Schmelzbereich 86 bis 880C; [<*, ] ^0 = + 12,5° (c=1, Dioxan); Gas-Plussigkeits-Chromatographie
= 95,8%ige Reinheit.
Pichia farinosa NRRL Y-118 mit 13ß-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion,
zugegeben mit 1 g/l in synthetischem Medium.
-22-109883/18,14
Drei Agarschrägkulturen von Piohia x'arinosa i-IMEL Y-II0
wurden jede mit 5 ml destilliertem wasser gewaschen und
die Suspensionen zur Impfung von drei 1 1-Kolben verwendet,
wobei jeder der Kolben 200 ml als "Pacifici" definiertes Medium (Il/odia, 25, 37 (1962) enthielt:
g/l
Mannitol 30,0
Bernsteinsäure 30,0
KH2PO4 * 1,0
MgSO4.7H2O 0,3
.7H2O 0,014
48H2O 0,00522
ZnSO4.7H2O 0,0037
H3BO3 0,0025
KJ 0,00076
AlCl .6H2O 0,000054
CuSO4.5H2O 0,00003
NH4OH auf pH 5,5
destilliertes Wasser auf 1000 ml
Die Kolben wurden auf einem Drehschüttler 24 Stunden bei 280C bebrütet und ihr Inhalt in ein 14 l-iermentationsgefäß
überführt, das 6 1 Pacifici-Medium enthielt. Die Belüftung
wurde mit 6 1 Luft/Min, und das Rühren mit 250 üpm durchgeführt.
Nach 16 Stunden Bebrüten wurden 6 g 13Ä~Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion,
gelöst in 60 ml Äthanol, zugegeben. Bie Rührgeschwindigkeit wurde au-L 300 üpm erhöht. Nach 6 Stunden Kontakt zeit wurde die-Geschwindigkeit
auj. 200 Upm gesenkt.
109883/18U "25~
Die Fermentation, 5,8 1, war nach 24 Stunden beendet
und das Aufarbeiten wurde wie in Beispiel 12 beschrieben, durchgeführt, ausgenommen da£ die Zellen mit 4- 1
Methyl13obutylketon extrahiert wurden. Das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Lösungsmittel freie Rückstand wurde bei Raumtemperatur mit
Cyclohexan (300 ml) gerührt. Der ausgefällte ieststoff
wurde filtriert und unter Bildung des Produkts getrocknet. Ausbeute 4,45 g (76,7$); Schmelzbereich 81 bis 830C;
[<C]D + 10° (c=2, Dioxan); Gas-Flüssigkeits-Chromatographie
= 98,2^ige .Reinheit.
Pichia farinosa CB3 185 mit 3-Methoxy-8,14-secooestra-1,5,5(10),9(ii)-tetraen-14,17-dion,
zugegeben mit 1 g/l in einem Medium aus Getreide~(einweich-)liq.or.
Die in Beispiel 14 hergestellten Zellsuspensionen wurden in drei 1 1-Behälter überführt, die 200 ml nachfolgendes
Medium enthielten:
g/l
Getreide-(einweich)-liquor 20
Dextrose 50
destilliertes Wasser 1 1
der pH-Wert wurde auf 6,9 vor der überführung in den Autoklaven eingestellt.
-24-109883/18U
2120876
Nach 24 Stunden Bebrüten auf einem Drehschüttler bei 280C
wurde der Inhalt der 3 Kolben in ein 14 1-Fermentationsgeiäß
mit 6 1 des gleichen Mediums überführt. Die Temperatur
wurde bei 370C gehalten und die Belüftung und das Rühren erfolgte wie in Beispiel 14.
Nach 17 Stunden Wuchs im Fermentiergefaß, wurden 6 g
3-Methoxy-8,H-secooestra-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion,
gelöst in 60 ml Äthanol, zugegeben; die Rührge-' schwindigkeit wurde auf 300 Upm erhöht.
Die Fermentationsbrühe, 5,8 1, wurde nach 13 Stunden
entnommen und das Gemisch mit 1 1 Methylisobutylketon extrahiert. Der flüssige Teil wurde danach mit 3 1
Methylisobutylketon und die Zellen mit 2 1 extrahiert.
Die kombinierten Extrakte wurden zweimal mit NaHCO,-Lösung gewaschen und über NapSO, getrocknet.
Der Methylisobutylketonextrakt wurde durch Glaswolle
" filtriert und unter Vakuum bei 6O0C auf ein geringes
Volumen konzentriert. Das rückständige Methylisobutylketon wurde dann weiter dadurch entfernt, daß man es
unter Vakuum mit drei 75 ml Anteilen Cyclohexan destillierte.
Das Endvolumen wurde auf 200 ml mit Cyclohexan eingestellt und das Gemisch auf 75°C erhitzt, und solange
es heiß war, zur Entfernung des unlöslichen Materials filtriert. Das Filtrat wurde erneut auf 750C erhitzt, dann
-25-109883/18U .
während 2 Stunden auf 5°C gekühlt, wobei es bei dieser
Temperatur eine weitere Stunde gehalten wurde.
Das kristalline Material würfe filtriert, mit 2x10 ml
eiskaltem Cyclohexan gewaschen und bei 35 bis 4O0C getrocknet.
Das Produkt wurde bei einer Menge von 3,5 S (60,3$) Ausbeute isoliert; Schmelzbereich 102 bis 1070C;
[A ] υ - 33,2° (c=l, Dioxan); Gas-Flüssigkeit-Chromatographie
=93,8$.
Reduktion von 3-Methoxy-8,14-secooestra-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-dion
in einem 10 1-Fermentationsgexäß.
Eine Agars chrägkultur von Pichia x'arinosa NRRL Y-118
wurde mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen und 1 ml der erhaltenen Zellsuspension wurde in einen 0,5 1 großen
Erlenmeyer-Kolben überführt, der ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Getreide-(einweich)-liquor 20 g(Gew./Vol.)
Dextrose 20 g(Gew./Vol.)
Keimol 1 ecm
Leitungswasser 1 1
vor Überführen in den Autoklaven wurde der
pH-Wert aui 6,7 mit 50$iger (Gew./Vol.)
NaOH eingestellt.
Das inokulierte Medium wurde bei 250C auf einem Drehschüttler,
bei 250 üpm, 5 cm Drehdurchmesser, 24 Stunden
-26-109883/1814
2120G76
bebrüht. Zu diesem Zeitpunkt betrug die Gesamtzeilenzahl, wobei diese durch eine Petroff—Hausser Bakterien—
zählkammer besti]
len/ml bestimmt.
len/ml bestimmt.
zählkammer bestimmt wurden, au!' ungefähr 3,0 χ 10 ZeI-
100 ml der vorausgehend angegebenen Züchtung wurden aseptisch in einen 4 1-Behö.lter mit Saugvorrichtung überführt, der 1 1 des voraus beschriebenen Mediums enthielt.
Der beimpfte Gefä'ßinhalt vrarde erneut bei 250C auf einem
W Drehschüttler, 250 Upm, 5 cm Drehdurchmesser, 24 Stunden gebrüht.
Der gesamte Inhalt des Sauggefäßes (1 l), wurde in ein
14 l-Fermentationsgefäß überführt, das 10 1 des vorausgehend
beschriebenen Mediums enthielt. Das Rühren wurdemit 300 Upm fortgesetzt und die Belüftung auf 3 l/Min.
während dem ganzen umwandlungszyklus beibehalten.
Nach 16 Stunden Wuchs bei 25°C wurden 10 g 3-Methoxy-8,10-
* secooestra-1,3*5(10),9(ii)-tetraen-14,17-dion, gelöst in
280 ml Äthanol, der Brühe zugegeben. Zwei gleiche Zugaben wurden bei 20 und 24 Stunden vorgenommen. Eine^959^ige
umwandlung von d-3-Methoxy-8,14-secooestra-1,3»5(10),9(11 )-tetraen-17-ß-ol-14-on,
wurde nach 35 Stunden Bebrüten erhalten. Die Prozentige Umwandlung wurde mittels Gas-ilüssigkeits-Chromatographie
einer Probe bestimmt, die vorausgehend mit Methylisobutylketon extrahiert wurde.
-27-1 0 9 8 8 3 / 1 8 U
Die Zellen wurden von der umgewandelten Brühe mittels
Absorption auf Celit abgetrennt. Das Produkt wurde bei einer Temperatur von 70 bis 75°C mit Heptan extrahiert.
Es wurde eine Gesamtmenge von 19»5 g de3 Produkts als
reines kristallines Material erhalten, was einer Gesamtausbeute von 65$ entspricht.
109883/1814
Claims (1)
- Patentansprüche :/ι/ Verfahren zur asymmetrischen Reduktion eines 8,14-Secogona-tetraen-14>17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man die· Verbindung der reduzierenden Wirkung von Pichia x'arinosa unterwirft und ein optisch aktives d-17ß-Hydroxy-8, H-secooestratetraen-H-on isoliert O2 ο Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e kennze ichnet, daß man als Mikroorganismus Pichia tarinosa NRRL Y-118 verwendet.3· Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e kennze ichnet, daß man als Mikroorganismus Pichia J-arino3a CBS 185 verwendet.4 ο Verfahren gemäis Anspruch 1, dadurch ;< e ■ Ic e η η ζ e ichnet, daß die zur asymii;.e brisehen Reduktion vorgesehene Verbindung die Formel5 β Verfahren gemäß Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet , daß man eine Verbindung verwendet, worin die Reste R und R1 jeder Äthyl ist.6e Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung verwendet, worin der Rest R Methyl und der Rest R1 Äthyl ist-109883/1814ORIGINAL INSPECTED
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|---|---|---|---|---|
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1450510A (fr) * | 1965-04-28 | 1966-06-24 | Roussel Uclaf | Procédé de préparation d'hydroxycycloalcanones et produits résultant de ce procédé |
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-
1970
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1450510A (fr) * | 1965-04-28 | 1966-06-24 | Roussel Uclaf | Procédé de préparation d'hydroxycycloalcanones et produits résultant de ce procédé |
| US3481974A (en) * | 1967-05-19 | 1969-12-02 | Searle & Co | 3-alkoxy - 14-oxo-17beta-ol-8,14-secoestra-1,3,5(10),9(11) - tetraenes and ester derivatives |
| NL6810400A (de) * | 1967-07-24 | 1969-01-28 | ||
| DE1922035A1 (de) * | 1968-04-30 | 1969-11-06 | American Home Prod | Verfahren zur Herstellung optisch aktiver seco-Steroide |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013102619A2 (de) | 2012-01-04 | 2013-07-11 | C-Lecta Gmbh | Verfahren zur reduktion eines secodion-derivats mit einer alkoholdehydrogenase |
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