DE2120676C3

DE2120676C3 - Verfahren zur asymmetrischen Reduktion von 8,14-Secogonatetraen-14,17-dionen

Info

Publication number: DE2120676C3
Application number: DE2120676A
Authority: DE
Inventors: George Narberth Pa. Greenspan
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1970-04-28
Filing date: 1971-04-27
Publication date: 1981-10-01
Also published as: NL174958B; BE766291A; NL174958C; NL7105818A; DE2120676A1; FR2090828A5; DE2120676B2; GB1319127A; ZA712064B; JPS5612440B1; CA980278A; CH569745A5; US3697379A

Description

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Die Herstellung von Steroiden durch Gesamtsynthete aus relativ einfachen chemischen Verbindungen, wie sie beispielsweise von Smith und anderen in »Totally Synthetic Steroid Hormones, Part II«, J. Chem. Soc (1964), Seiten 4472 bis 4492, beschrieben sind, führen zur Bildung von Racematen. Nach der von Fieser und Fieser, »Steroids«, Seite 336 (1959) vorgeschlagenen Regelung sind die als d-Formen bezeichneten Verbindungen die Enantiomeren, die in der Konfiguration am Kohlenstoffatom 13 dem natürlichen Hormon Östron entsprechen. Die entsprechenden Enantiomorphen werden demgemäß als I-Formen, und die Racemate als dl-Formen bezeichnet

Weil die hormonalen Wirkungen im wesentlichen den d-Reihen zuzuschreiben sind, sind Verfahren, die zur Bildung solcher Verbindung führen, von Interesse.

in der R und R¹ für niedere Alkylgruppen stehen, unter der reduzierenden Wirkung von Mikroorganismen der Gattung Pichia zu den entsprechenden, optisch aktiven d-17/?-Hydroxy-secosteroiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Pichia farinosa NRRLY-118 oder Pichia farinosa CBS 185 verwendeL

Die Reaktion wird durch das nachfolgende Reaktionsschema erläutert:

RO

(D OH

RO

(Π)

worin jeder der Reste R und R¹ unabhängig voncinan^ der Aikylreste sind. Diese Verbindungen sind bekannt und beispielsweise in der GB^FS 10 41 273 beschrieben. Wie der nachstehende Versuchsbericht zeigt, liefern nur die Mikroorganismen Pichia farinosa NRRLY-118 und Pichia farinosa CBS 185 die gewünschten d-17/J-Hydroxy-seco-Steröide in sehr guten Ausbeuten.

Zur Verdeutlichung des erfindungsgemäß erzielbaren

technischen Fortschritts Und zur Belegung der Tatsache, daß die Aktivität unterschiedlicher Stämme der Gattung

Pichia farinosa für die selektive Reduktion von Methyl- und Äthyl-Secodionen zu den entsprechenden 17/?-Hydroxyderivaten nicht voraussagbar war, wurden Vergleichsversuche mit einer Reihe von unterschiedlichen Stämmen der Gattung Pichia farinosa bezüglich der vorstehend beschriebenen, selektiven Reduktion durchgeführt Die ausgewählten Mikroorganismen wurden zunächst in einem typischen Kulturmedium gezüchtet, das assimilierbaren Kohlenstoff, vorzugsweise ein Kohlehydrat, wie Dextrose, eine Stickstoffquelle, vorzugsweise organischen Stickstoff, wie proteinhaltige Substanzen, beispielsweise Maisquellwasser oder Pepton, oder beide Materialien dieser Art in Kombination, und Wasser enthält- Nach der Inkubierung während einer vorherbestimmten Zeitdauer wurde ein ausge- is wähltes Secosteroid-Substrat, nämlich 3-Methoxy-8,14-secoöstra-13,5(10,9-tetraen-14,17-dion bzw. |3/?-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-l,3,5(10),9-tetraen-l 4,17-dion, vorzugsweise in einem Lösungsmittel unter sterilen und anaeroben Bedingungen, zugesetzt. Dann wurde bei einer Temperatur im Bereich von 25° bis 37"C während eines, für die gewünschte biochemische Umwandlung des Secosteroids in das 17/?-Hydroxyderivat ausreichenden Zeitraums gerührt. Nach Beendigung der mikrobiologischen Reduktion wird die Fermentationsbrühc mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äthylacetat oder Methylisobutylketon, extrahiert, und die erhaltenen Extrakte bei einer Temperatur von unterhalb 50" C zur Entfernung des Lösungsmittel··, eingeengt. Aus dem Rückstand wurden dann die gewünschten Produkte iso^l;ert Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.

Pichia farinosa Stamm

NRRL Y-2060
NRRL Y-2070
CBS 1366
CBS 2101
CBS 2597

IFO 0465
IFO 0574
49-61

NRRL Y-118 (Erfindung)
CBS 185 (Erfindung)

Substrat

3-Mehtoxy-8,I4-secoöstia-l_T3,5(10),9-tetraen !Ί,Π-dion

Geringe Mengen des 17j8-Hydroxyderivats Geringe Mengen des 17ji-Hydroxyderivats 13/?-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5( 10),9,-tetraen-l 4,17-dion

Keines
Keines
Keines
Spurenmengen

Sehr geringe Mengen des
Produkts

14 or- und 17^-Dihydroxyderivat

14ff- und 17j?-Dihydroxyderivat

I)* Geringe Mengen des I4<r-Hydroxy-

derivat^c

2)** Geringe Mengen des 14ii-Hydroxy-

derivats und sehr geringe Mengen des

17yj-Hydroxyderivats

l)+2) Spurenmengen des 14a-Hydroxy-

derivals

l)+2) Geringe Mengen des 14ff-Hydroxy-

derivats, eine mittlere Menge des Πβ-

Hydroxyderivats und eine geringe Menge des

14ar,17/f-Dihydroxyderivats

17^S-Hydroxy,14-onderivat, Ausbeute = 65% (Beispiel 16)

17j8-HydΓoxy,14-onderivat, Ausbeute = 60,3% (Beispiel 15)

17j8-Hydroxy,14-onderivat
mit einer Ausbeute von
54,6 bis 81,2%
(Beispiele 6 bis 14)

*) Glukose 50 g/l, Maisquellwasser 20 g/L destilliertes Wasser 1

**) Glukose 20 g/L Aufschlußprodukl aus Casein durch cnzymatische Behandlung mit Pankreatin 20 g/l, Peplon 20 g/l, destilliertes Wasser 1 1.

Aus der vorstehenden Tabelle ist zu erkennen, daß lediglich die erfindungsgemäß ausgewählten, speziellen Mikroorganismen die gewünschten Verbindungen mit sehr pter Ausbeute liefern, während die übrigen Stämme der Gattung Pichia farinosa erheblich in ihrer Aktivität im Hinblick auf die gewünschte Reduktion schwanken.

Die erhaltenen Verbindungen sind besonders wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung optisch aktiver Steroide, wie sie in den vorausgehend erwähnten Veröffentlichungen von Gibian und anderen, und Rufer und anderen beschrieben worden sind. Steroide mit einem aromatischen Α-Ring, wie sie aus diesen Zwischenprodukten hergestellt werden, sind hormonell wirksame östrogene und beispielsweise zur Verringe* rung der Hyperlipämie bei Warmblütern geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Weise durchgeführt« daß man zuerst den ausgewählten Mikroorganismus in einem typischen Wuchsmedium kultiviert, das assimilierbaren Kohlenstoff, vorzugsweise ein Kohlehydrat, wie Dextrose, eine Stickstoffquelle, vorzugsweise organischen Stickstoff, wie proteinhaltige

Substanzen, beispielsweise Maisquellwasser und/oder Pepton, und Wasser, enthält.

Nachdem man den Mikroorganismus in dem gewünschten Ausmaß bebrütet hat, wird das ausgewählte Secosteroid-Substrat, vorzugsweise in einem Lösungsmittel unter sterilen und aeroben Bedingungen, zugegeben. Ein geeignetes Schaumverhütungsmittel ist zweckmäßig und kann ubenfalls zugesetzt werden. Es wird gerührt, wobei die Temperatur im Bereich von 25 bis 37° C so lange aufrechterhalten wird, bis die gewünschte Überführung oder biochemische Umwandlung des Seco-Steroids in die optisch aktive Verbindung erreicht ist.

Nach Beendigung de.r mikrobiologischen Reduktion wird die Fermentationsbrühe mit einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat oder Methylisobutylketon, extrahiert, und die so erhaltenen Extrakte zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt, wobei die Temperatur unter 50°C gehalten wird. Das gewünchte Produkt wird dann in der d-Form eines 2-Alkoxy-17/i-

hydroxy-8,14-secogona-1,3,5( 10),9(l 1)-tetraen- 14-ons
nach den üblichen Verfahren aus dem Rückstand isoliert.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben und erläutern die verschiedenen Möglichkeiten des Verfahrens in weiteren Einzelheiten.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von 3-Methoxy-8,14-secoöstra-U,5(10)3(1 l)-telraen-14,17- _M dion als Steroidsubstral zur Herstellung von d-3-Methoxy-8.14-secoöstra-1,3,5( 10),9( 11 )-tetraen-17j3-ol- 14-on

Eine Agarschrägkultur von Pichia farinosa NRRL Y-118 wurde mit 5 ml Medium der folgenden Zusammensetzunggewaschen: J5

Maisquellwasser	20 g
Pepton	20 g
Dextrose	50 g
Destilliertes Wasser	1 Liter

Vor dem Einbringen in den Autoklaven wurde der pH-Wert mit 5n-NaOH auf einen Wert von 7 eingestellt.

I ml der Zellsuspension wurde in einen 250-ml-KoI-ben. der 50 ml des oben beschriebenen Mediums enthielt, überführt. Der Kolben wurde bei 28°C auf « einem Drehschüttler mit 250 Umdrehungen/Minute (UpM) bei einem Drehdurchmesser von ca. 5 cm bebrütet.

Nach 24 Stunden wurden 5 ml der erhaltenen Zellsuspension in einen anderen Kolben mit dem gleichen Medium überführt. Nach 16 Stunden Bebrüten wurden 10 mg 3-Methoxy-8.14-secoöstra-1 J.5(10),9(11)-Ielraen-l4.l7-dion, gelöst in Äthanol, dem Kolben zugegeben. 5-ml-Proben wurden bei 3 und 6 Stunden entnommen, und jede Probe wurde mil ImI Methylisobutylketon versetzt.

Gleiche Teile der Lösungsmittelextrakte wurden auf Glasschieber, die mit Silicagel, das einen Fluoreszenzindikator, der im UV-Licht bei 254 nm aktiviert wird, enthielt, beschichtet waren, getupft, und die Platten bo wurden in einem Chloroform-Aceton-Gemisch (9:1) entwickelt. Die Prüfung der Platten unter UV-Lichi zeigte nach dem Trocknen einen Flecken des Produkts guter Größe mit dem Rt-Wert von d-3'Meihoxy'8,14'secoöstra-1,3,5( 10),9(,,)-tetraen· 170-ol-14-on. Die 6-Stun- _b5 dcn-Probe zeig«e eine erhöhte Ausbeute des Produkts, Wobei eine geringe Menge des Substrats unverändert blieb.

Nach 30 Sekunden Erhitzen auf 10O"C wurde die Platte mit einer Lösung von Phosphormolybdänsäure (PMA) in Äthanol (10 g pro 100 ml) besprüht Die Farbreaktion des Produkts glich der Slandardverbindung.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von 3-Meühoxy-8,l 4-secoöstra -1,3,5(10)3(11 )-letraen-14,17-dion als Steroidsubstrat, 1 g/I.

Eine Agarschrägkultur von Pichia farinosa NRRL Y-118 wurde mit 5 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung gewaschen:

Aufschlußprodukt aus Casein

durch enzymatische Behandlung

mit Pankreatin 20 g

Pepton 20 g

Dextrose 20 g

Destilliertes Wasser 1 Liter

1 ml der Zellsuspension wurde in e'nen 250-mi-Koiben überführt, der 50 ml des oben angegebenen Mediums enthielt- Der Kolben wurde auf einem Drehschüttler bei 25°, 250 UpM, 2,5 cm Drehdurchmesser, b*brütet.

Nach 23stündigem Anbrüten wurden 5 ml des Kolbeninhalts in einen zweiten Kolben mit dem gleichen Medium überführt. Nach 19 Stunden wurden 50 mg 3- Methoxy-8,14-secoöslra- IJ-5( 10)3( 11)- telraen-14.17-dion, gelöst in 0,5 ml Äthanol, dem Kolben unter Bildung einer hohen Konzentration von 1 g/I zugegeben. Proben wurden nach 6 und 24 Stunden K.ontaktzeit entnommen; diese wurden, wie in Beispiel 1 angegeben, bearbeitet Die Dünnschicht-Chromatographie zeigte ein Produkt mit dem Rr-Wert des 17jS-Ol-Analogen und einem geringen Rückstand an Substrat bei der 6-Stunden-Probe. Die Analyse der 24-Stunden-Probe zeigte eine Erhöhung der Ausbeute an 17/?-oI-Verbindung, wobei noch Spuren des Substrats zurückblieben.

Beispiel 3

Fermentation im präparativcn Umfang von
3-Melhoxy-8.14-secoöstra-1 Jfi 10),9( 1 ? )-

tctraen-14.17-dion
in einem 14 Liter-Gärbehälter

Drei Agarschrägkulturen von Pichia farinosa NRRI. Y-118 wurden jede mit 5 ml destilliertem Wasser gewaschen und die Zellsuspcnsion in 3-Einliier-Kolben übergeführt, wobei jeder 200 ml des in Beispiel 2 angegebenen Mediums enthielt.

Πιο Kolben wurden 24 Stunden bei 26"C auf einem Drehschütller mit 250 UpM bebrütet, wonach ihr Inhalt in einem 14-Litrr-Gärbehälter überfuhr! wurde, der 6 I Beimpungsmedium enthielt. Das Rühren erfolgte mit 250 UpM, die Belüftung mit 6 Liter und die Temperatur wurde bei 25°C gehalten. Ein verdünntes Silicon (1 : 2) wurde als Schau/iiverhinderungsmiltel zugesetzt.

Nach 18 Stunden Bebrüten wurden 18 g 3-Methoxy-8,14-secoöstra-l,3,5(10),9(l l)-lelraen-14,l7-dion (3 g/l), gelöst in 90 ml Äthanol, dem FernieMlafionsgcmiscn zugegeben. Das Rühren wurde auf 300 UpM erhöht und die Belüftung auf 3 Liter gesenkt Es wurden 30 ml Äthanol dem Fertnentationsbehälter 24 Stunden nach der Steroidzugabc zugeführt. Bei 77 Stunden wurde das Rühren auf 150 UpM verringert, und eine halbe Stunde

später wurden 120 ml Äthanol zugegeben.

Das Fermentationsgemisch, 5,71, wurde nach 121 Stunden entnommen, wobei etwas Substrat zurückblieb. Eine Probe, die man dem 14-Liter-Fermentationsgemisch entnommen hatte, dem man 3-Methoxy-8,l4-secoöstra-l,3.5(10),9(ll)-letraen-14,17-dion mit 1 g/l zugegeben hatte, zeigte einen ähnlichen Grad an nicht verändertem Substrat. Die Lösungsmittelextraktion wurde mit 4 I Methylisobutylketon durchgeführt, und die gemischten Extrakte wurden mit NaHCOs-Lösung gewaschen und mit NazSOj getrocknet.

Die Extrakte wurden zu einem lösungsmittelfreien Rückstand eingeengt, der in Diisopropyiather gelöst und bei -10°C über Nacht gelagert wurde. Das ausgefällte Produkt wurde filtriert und getrocknet (0,1 mm Hg/1 h/P₂O₅) unter Bildung von 10,0 g; Schmelzbereich 118 bis 12O⁰C; [«]i'=-30° (c=2; Dioxan), 58,8% Ausbeute.

ifiatuiiui nuiub <iua

pyläther umkristallisiert unter Bildung von
Schmelzbereich 112 bis 114⁰C; [α] =-36°
Dioxan). Die Ausbeute betrug 39,9%.

7,175 g, (t=2;

Beispiel 4

Fermentation im präparativem Umfang von

Pichia farinosa NRRL Y-118 mit
3-Methoxy-8.14-secoöstra-U.5(10).9(H)·

letraen-14.17-dion,
das im Verhältnis von 1 l/g zugegeben wurde

Das Verfahren wurde ähnlich dem Verfahren gemäß Beispiel 2 mit zwei Ausnahmen durchgeführt. Die Rührgeschwindigkeit für die Beimpfungs-Kolben wurde auf 215UpM gesenkt und die Zusammensetzung des Mediums wie folgt geändert:

Aufschlußproduki aus Casein

durch enzymatische Behandlung

mit Pankreatin IO g

Pepton 10 g

Dextrose 20 g

Destilliertes Wasser 1 Liter

Dem Fermentationsprozeß wurden nach 18 Stunden 6 g 3-Methoxy-8.14-secoöstra-l,3.5(10).9(l l)-tetraen-14.17-dion in 60 ml Äthanol, und 6 Stunden später 144 mg MgSOi ■ 7 H2O zugegeben. Nach weiteren 18 Stunden wurde die Zugabe von MgSOi · 7 H2O wiederholt

Dem Gärgemisch. 6 Liter, wurden nach 48 Stunden 2 Liter entnommen und mit 500 ml Cyclohexan extrahiert. Wegen der geringen Trennung des Lösungsmittels und der Brühe wurde das Gemisch mit den verbleibenden 41 gemischt, und dieses neue Gemisch mit 1 I Methylisobutylketon extrahiert Nach Abtrennen der Zellen mittels Zentrifugieren wurden sie mit 1 I des zweiten Lösungsmittels extrahiert Die Flüssigkeit wurde ebenso gleichfalls mit 2 1 Methyiisobuiylketon extrahiert Die gemischten Extrakte wurden zweimal mit NaHCOrLosung gewaschen und mit NaiSOi getrocknet

Die gemischten Extrakte wurden zu einem lösungsmittelfreien Rückstand eingeengt, der in Diisopropyiather gelöst und auf —10° C abgekühlt wurde. Man n*-U;<*l* t AC\

palTkoramh

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von IS^-Äthyl-S-melhoxy-S.H-secogona-U.SUOj.gilO-te* iraen-14,17-dion als Steroidsubstrat.

Ein 250-ml-Kolben mit 50 ml des in Beispiel 2 beschriebenen Mediums wurde mit einer Zellsuspension von Pichia farinosa NRRL Y-118, wie vorausgehend angegeben, geimpft. Die Inkubation wurde auf einem Drehschüttler bei 215 UpM und 26°C 24 Stunden lang durchgeführt. Es wurde dann eine 5-ml-Übertragung zu einem zweiten Kolben mit dem gleichen Medium vorgenommen. Nach 18,5 Stunden wurden 50 ml

U/i-Äthyl-S-methoxy-S.M-secogona-lJ.SOOJ.gOO-letraen-14,l7-dion, gelöst in 0.5 ml Äthanol, dem Kolben zugegeben, wodurch man die hohe Konzentation von 1 g/l erhielt.

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einer nach 23 Stunden entnommenen Probe und nach einem Verfahrensablauf wie in Beispiel 1 zeigte das 170-OI-Derival. d-BjS-Äthyl^-methoxy-S.M-secogona-1,3,5( 10),9( 1 l)-tetraen-!7j?-ol-14-on mit einer schwachen Spur des verbleibenden Substrates an.

Beispiel 6

Fermentation in präparativem Umfang von

l3j9-Äthyl-3-methoxy-8.14-secogona-1.3.5(10).(l I)-

tetraen-14.17-dion meinem 14-Liter Gärbehälter

(1 g/l in zwei Zugaben von G.5 g)

von !09 bis UO=C [α]"=-36° (c=2: Dioxan): die Ausbeute betrug 57_5°/o.

Es wurden drei 1-Liter-Beimpfungs-Kolben mit Zellen von Pichia farinosa NRRL Y-118, wie in Beispiel 3 ausgeführt, beimpft. Das Bebrüten der Kolben (215 UpM) und die Übertragung ihres Inhalts in einen 14-Liter-GärbehäIter mit 61 des gleichen Mediums wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt. Die Wuchsbedin-

AO gungen in dem Fermentationsbehälter waren gleich, ausgenommen die Temperatur, die auf 26° C gehalten wurde.

Nach 18 Stunden wurden 3 g 13j?-Athyl-3-methoxy-8,I4-secogona-l,3,5(10)5(ll)-tetraen-14.17-dion. gelöst in 60 ml Äthanol (oder 0.5 g/l) zugegeben. Die Belüftung wurde mit 61 Luft aufrechterhalten, während das Rühren auf 300 UpM erhöht wurde. 7 Stunden später wurde die Zugabe von 13^-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-13.5(10).9(l l)-tetraen-!4.17-dion wiederholt. Nach

)0 24 Stunden wurde die Fermentation. 6,151, zur Extraktion mit Methylisobutylketon entnommen. Nach der ersten Extraktion mit 1 1 Lösungsmittel wurden die Zellen abnitriert und mit 131 gleichem Lösungsmittel extrahiert Das Filtrat wurde dann mit 3 1 Methylisobu-

S5 tylketon extrahiert

Die vereinigten Extrakte wurden zweimal mit NaHCOj gewaschen und über Na2SO* getrocknet wonach sie zu einem lösungsmittelfreien Rückstand eingeengt in Diisopropyiather gelöst und bei 10⁰C über

bo Nacht gelagert wurden. Durch Filtrieren und Trocknen erhielt man das Produkt (3.275 g); Schmelzbereich 87 bis 89°C;[«]" = + 10° (c=2; Dioxan); die Ausbeute betrug 54,6%.

Durch Einengen der Mutterlaugen im Vakuum und

&<5 durch Behandeln des Rückstands mit Cyclohexan erhielt mjn wgi»ere 0,450 ™; Schnielzbereich 87' bis 89° C· [α] ■·'=-!-11° (c= 2: Dioxan) und damit eine Gesamtausbeute von 62%.

Beispiel 7

Verwendung von Pichia fafinosa NRRLY-118

in präparativem Umfang mit n^-Äthyl-i-methoxy-S.H-secogona- '

l,3,5(I0),9(ll)-tetraen-14,17-dion(l g/l)

Γ'ie in Beispiel 6 beschriebene Fermentation wurde wiederholt, ausgenommen, daß 13j9-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-l,3,5(10),9(ll)-tetraen-14,17-dion in einer einzigen Zugabe mit Ig/l (6g) nach 17 Stunden im (Gärbehälter zugegeben wurden. Die Gesamtbrühe. 6 1, *rurde nach 6 Stunden mit Methylisobutylketon (strahiert, wie im vorausgehenden Beispiel 6 angegeben. Die Zellen wurden nach Filtrieren mit Il lösungsmittel und das Filtrat mit 31 Lösungsmittel Kxtrahiert.

Die vereinigten Extrakte wurden gewaschen und wie Ift Beispiel 5ge'.rockn?· »prf ?>ir Trnrlcene eingedampft. (Durch Behandeln mit heißem Cyclohexan und Einengen Mif die Hälfte des Volumens erhielt man das Produkt in Iriner Menge von 3,95 g; Schmelzbereich 80 bis 86°C; Mc]'.'= +7° (c= 2: Dioxan): die Ausbeute betrug 65,7%. ©ie Dünnschichtchromatographie zeigte, daß das (Produkt nur Spuren an Ausgangsmaterial ohne eine (tndere Verunreinigung enthielt.

Beispiel 8

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40

Fermentation in1 präparativem Umfang von

13j3-Äthyl-3-methoxy-

8,14-secogona-1,3,5( 10),9( 11)-tetraen-14,17-dion. 2 g/l, mit Pichia farinosa NRRL Y-118

Eine weitere Fermentation wurde in einem 14-Liter-(Fermentationsgefäß in dem in Beispiel 2 hergestellten ^Medium vorgenommen. Das Fermentationsverfahren (war dem von Beispiel 6 ähnlich, ausgenommen, daß die ^uchsstufe in dem Fermentationsgefäß 1 Stunde kurzer Iwar, nämlich 17 Stunden betrug. 12 g 13j3-Äthyl-3-meth-

oxy-8,14-secogona-1.3_r5(10),S'(ll)-tetraen-14,17-dion, gelöst in 90 ml Äthanol, wurden zu diesem Zeitpunkt jiugegeben. Dem Behälter wurden nach der Steroidzuführung zweimal bU ml Ätnanol. einmal nacn ö Munden lind erneut 5 Stunden später, zugegeben. Die Temperatur in dem Fermentationsgefäß lag während des Ablaufs tfes Verfahrens im Bereich von 24 bis 28° C.

Das Fermentationsprodukt, 61₁ wurde nach 25 Ätunden entnommen und die Extraktion mit Methylisofcutylketon, wie in Beispiel 7 angegeben, durchgeführt. (Das Behandeln des eingeengten Extraktes mit heißem (Cyclohexan lieferte das Produkt in einer Menge von fr,235 g; Schmelzbereich 86 bis 88⁰C; [*]% = +9° (c=2; t>ioxan); die Ausbeute betrug 60,2%.

Beispiel 9

13^-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-13,5(10)3(11 )-tetraen-14,17-dion wurde einem 14-Liter-Fermentationsgefäß mit 2 g/l (in 2-g-Zuschiägen) zugegeben.

Die Fermentation mit Pichia farinosa NRRL Y-118 wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt, ausgenommen, daß die Wuchsdauer in dem Fermentationsgefäß auf 16 Stunden verringert wurde. 6 g

13^-ÄthyI-3-methoxy-8,14-secogona-13^(10)3(ll)-tetraen-14,17-dion wurden in 60 ml Äthanol zugegeben. 5'/2 Stunden später wurden weitere 6 g 13/?-Äthyl-3-

methoxy-8,14-secogor.a-i3^{10}5{!!)-tetraen-!4₁17-dion in ähnlicher Weise unter Bildung einer Gesamtkon-Eentration von 2 g/I zugegeben. 30 ml Äthanol wurden dem Ferrnentationsablauf nach weiteren 5'/i Stunden Bebrüten zugegeben. Die Temperatur wurde auf 26 bis 26,5°C gehalten.

Die Fermentationsbrühe, 5,8 1, wurde nach 12 Stunden Kontaktzcit entnommen und, wie in Beispiel 7 beschrieben, extrahiert, ausgenommen, daß die Zellen viermal mit 1,51 Methylisobutylketon extrahiert wurden. Die vereinigten Extrakte wurden zu einem lösungsmittelfreien Rückstand eingedamoft. Durch Behandeln mit warmen Cyclohexan (50°C) und nachfolgendem Filtrieren erhielt man das Produkt in einer Menge von 9,61 g; Schmelzbereich 70 bis 80" C; die Ausbeute betrug 83%. Zur Entfernung des Pigments wurde das isolierte Material aus Cyclohexan umkristallisiert unter Bildung von 7,20 g Produkt; Schmelzbereich 87 bis 88°C (Ausbeule 62%, [*]?= +10° (c=2; Dioxan). Die Dünnschichtchroniatographie dieses Materials und des anfangs isolierten Produkts zeigte nur Snnren des Auseanesmnterials als HauDtverunreinisune

20 an.

60 Beispiel 10

Pichia farinosa NRRL Y-118 mit l30-Äthyl-3-meth-

oxy-8,14-secogona-l,3,5(10),9(ll)-tetraen-14,17-dion;
Zugabe von 3 g/l (drei Zugaben zu jeweils 1 g).

Das Fermentationsverfahren mit Pichia farinosa NRRL Y-118 war dem yon Beispiel 9 ähnlich, wobei die erste Zugabe von BjJ-Äthyl-S-methoxy-e.H-secogonai.3,5(IO),9(ll)-tetraen-l4,17-dion, 6 g in 60 ml Äthanol (1 g/l), nach 16 Stunden dem Fermentationsgefäß zugegeben wurde. 5'/2 Stunden später erfolgte eine weitere Zugabe von O/S-Äthyl-S-methoxy-S.H-secogona-l,3,5(10),9(ll)-tetraen-14.17-dion mit lg/1; nach einem ähnlichen Zeitraum erfolgte die dritte Zugabe der Verbindung unter Bildung einer Gesamtkonzentration von 3 g/l.

Nach 19 Stunden Fermentationszeit wurde das Gemisch, 5,84 I₁ mit 1 1 Methylisobutylketon extrahiert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugieren abgetrennt und viermal mit 1,35 1 Lösungsmittel extrahiert, wobei die überstehende Schicht 5mal mit 5 1 Lösungsmittel extrahiert wurde. Nach Waschen und Trocknen wurden die vereinigten Extrakte zu einem iösungsmiucifreien Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wurde kräftig mit Cyclohexan 300 ml) bei Raumtemperatur gerührt, und das ausgefällte Produkt filtriert und getrocknet. Man erhielt 11,275 g (Ausbeute 64,3%); Schmelzbereich 75 bis 80°C; [α]?= +8° (c=2; Dioxan); Gas-FIüssig-Chromatographie, 1,8 m Methylsilicongummi, 3%, CH₂Cl₂ (250° D 300° J 300°), was einer 96,2%igen Reinheit entspricht.

Beispiel 11

Pichia farinosa NRRL Y-118 mit 13£-Äthyl-3-methoxy-8,14-secogona-l ,3,5(10),9(l 1 )-tetraen-14,17-dion, zugegeben mit 3 g/l (drei Zugaben zu 1 g).

Diese Fermentation von 13/?-ÄthyI-3-methoxy-8,14-secogona-l,3,5(10),9(l l)-tetraen-14,17-dion erfolgte mit 3 g/l mit Pichia farinosa NRRL Y-ί 18 in dem in Beispiel 4 beschriebenen Medium. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 10 bis und einschließlich der ersten Zugabe von 1 g/l ISß-Äthyl-S-methoxy-e.^secogona-13^(10)3(1 l)-tetraen-14,17-dion durchgeführt Der zweite und dritte Anteil des Steroids (jeweils ί g/l) wurde nach 7 bzw. 18³A Stunden zugegeben. 4 Stunden nach der zweiten Zugabe wurden dem Fermentaiionsgemisch 60 ml Äthanol zugesetzt

Die Fermentatiönsbrühe, 5,04 I, wurde nach 30'/«tundiger Bebrütung entnommen. Das Extraktionsverfahren mit Methylisobutylkelon wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben, durchgeführt, ausgenommen, daß die Zellen dreimal mit 1 I Lösungsmittel und die überstehende Schicht viermnJ mit 41 Lösungsmittel extrahiert wurden. Die vereinigten Extrakte wurden gewaschen und getrocknet u.td zur Trockene zu einem lösungsmittelfreien Rückstand eingeengt, der bei Raumtemperatur, wie in Beispiel 10 beschrieben, gerührt und filtriert wurde; man erhielt 12,250 g getrocknetes Produkt; Schmelzbereich 80 bis 85"C:[(%]'„'- +8" Cc= 2; Dioxan): Ausbeute 81.2%: Gas-Flüssig-Chromatographie = 91,5%ige Reinheit.

Beispiel 12

Pichia farinosa NRRL Yl 18 mit 13/}-Äthyl-3-meth-

oxy-8.14-secogona-1.3.5( 10),9(ll)-tetraen-14,17-dion. Zugabe mit 1 g/l. Zellen in Wasser suspendiert.

Drei Agarschrägkulturen von Pichia farinosa NRRL V-118 wurden jede mit 5 ml destilliertem Wasser gewaschen, und die erhaltenen Zellsuspensionen in drei Einliter-Kolben übergeführt, wobei jeder 200 ml des in Beispiel 2 beschriebenen Mediums enthielt. Die Kolben wurden 24 Stunden auf einem Drehschüttler bei 26° bebrütet, nachdem ihr Inhalt in ein 14-Liter-Fermentalionsgefäß mit 6 I des gleichen Mediums übergeführt war. Das Rühren wurde mit 250 UpM, die Belüftung mit • 1 Luft pro Minute durchgeführt und die Temperatur bei 25° C gehalten.

Nach 17,5 Stunden Bebrüten wurde das Fermentationsgemisch zentrifugiert, die überstehende Schicht dekantiert und die Zellen in destilliertem Wasser unter Bildung eines Volumens von 61 suspendiert. 6 g 13|3-Äthyl-3-methoxy-8,l 4-secogona-1,3,5( 10),9( 11 )-tetraen-14,17-dion, gelöst in 60 ml Äthanol, wurden iugegeben. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 300 UpM erhöht. Nach 10 Stunden Kontaktzeit wurde die Rührgeschwindigkeit auf 200 UpM gesenkt, wobei die Belüftung auf Null und dann auf den früheren Stand eingestellt wurde.

Bei 21 Stunden (die Belüftung war erneut auf Null cingesieüi worden) wurde die Fermentaiionsbruhe entnommen. Das Gesamtvolumen von 5,85 1 wurde mit 11 Methylisobutylketon extrahiert. Nach Abtrennen der Zellen und Flüssigkeit wurde jeweils dreimal mit 3 I Wethylisobutylketon extrahiert.

Die vereinigten Extrakte wurden zweimal mit NaHCO₃-Lösung gewaschen, mit Na₂SO₄ getrocknet und die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der lösungsmittelfreie Rückstand wurde mit Gylohexan (300 ml) 4 Stunden gerührt, die ausgefallenen Feststoffe abfiltriert und getrocknet; Ausbeute 4,05 g (69,2%); Schmelzbereich 84 bis 86°C;[«]« = 12° (c=2-Dioxan); Gas-FIüssig-Chromatographie = 98,7%ige Reinheit.

Beispiel 13

Pichia farinosa NRRL Y-118 mit 13^-Äthylen-3-methoxy-8,14-secogona-l,3,5(10),9(n)-teiraen-14,17-dion, Zugabegeschwindigkeit 3 g/l (1 g pro Zugabe), Zellen in Wasser suspendiert.

Das Fermentationsverfahren wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 12 durchgeführt, ausgenommen, daß die Temperatur 26° C betrug.

na-13^(10)3(ll)-tetraen-14,17-dion mit lg/1 in 60ml Äthanol zu der Zelisuspension wurde die Belüftung auf 3 I Luft/Minute verringert und die Rührgeschwindigkeit auf 300 UpM erhüiit. Eine halbe Stunde später wurde das Anfangsbelüftungsverhältnis, 6 l/Minute, wieder hergestellt. Zwei weitere Zugaben von 13/S-Äthyl-3-

=; methoxy-S.H-secogona-U.SOOpOlJtetraen-M,!/-dion, jeweils 6 g, wurden nach 5 und 10 Stunden nach der ersten Zugabe vorgenommen.

Die Fermentationsbrühe, 5,51, wurde nach 46,5 Stunden entnommen. Das Extraklionsverfahren war

in dem von Beispiel 12 ähnlich.

Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum zu einem lösungsmittelfreien Rückstand eingeengt. Das Rühren des getrockneten Rückstands mit Cyclohexan (360 ml) wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Das ausgefällte Produkt wurde abfiltriert und getrocknet; man erhielt eine Ausbeute von 11,065 g (67,1%); Schmelzbereich 86 bis 88°C; [α]?= f 12.5" (c<=\; Dioxan); Gas-FIüssig-Chromatographie = 95,8%ige Reinheit.

Beispiel 14

Pichia farinosa NRRL Y-118 mit njJ-ÄthylO-niethoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(l 1 )-tetraen-14,17-dion;
Zugabe 1 g/l in synthetischem Medium.
Drei Agarschrägkulturen von Pichia farinosa NRRL Y-118 wurden jede mit 5 ml destilliertem Wasser gewaschen und die Suspensionen zur Impfung von drei I-Liter-Kolben verwendet, wobei jeder der Kolben 200 ml eines Mediums gemäß Pacifici, Lloydia, 25, 37 JO (1962) enthielt:

	g/l
Mannit	30,0
Bernsteinsäure	30.0
KH₂PO₄	1,0
MgSO₄ · 7 H₂O	0,3
FeSO₄ · 7 H₂O	0,014
MnSO₄ - H₃O	0,00522
ZnSO₄ · 7 H₂O	0,0037
H₃BOj	0,0025
KJ	0,00076
AICl₃ ■ 6 H₂O	0.0000.'4
	nnnnrn
NH₄OH bis zu einem
pH-Wert von	5,5
Destilliertes Wasser	ad 1000 ml

Die Kolben wurden auf einem Drehschüttler 24 Stunden bei 28°C bebrütet und ihr Inhalt in ein 14-Liter-Fermentationsgefäß überführt, das 61 des

so obigen Mediums enthielt. Die Belüftung wurde mit 61 Luft/Minute und das Rühren mit 250 UpM durchgeführt.

Nach 16 Stunden Bebrüten wurden 6 g 13j3-ÄthyI-3-methoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(l 1 )-tetraen-14,17-

dion, gelöst in 60 ml Äthanol, zugegeben. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 300 UpM erhöht. Nach 6 Stunden Kontaktzeit wurde die Geschwindigkeit auf 200 UpM gesenkt

Die Fermentation, 5,8 I, war nach 24 Stunden beendet und das Aufarbeiten wurde wie in Beispiel 12 beschrieben, durchgeführt, ausgenommen, daß die Zellen mit 41 Methylisobutylketon extrahiert wurden. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Iösungsmittelfreie Rückstand bei Raumtemperatur mit Cyclohexan (300 m) gerührt. Der -svs^efaüsne Feststoff weirds sbfi'*"⁰¹**^itn/^ ffofrA^vnat Man erhielt 4,45 g des Produkts (76,7% Ausbeute); Schmelzbereich 81 bis 83°C; [α]? = + 10° (c=2;

Gas-Flüssig-Chromatographie =

Beispiel 15

Dia/tan);
Reinheil.

Pichia farinosa CBS 185 mit

stra-l,3,5(10),9(ll)-tetraen-14,17-dion, Zugabe mit 1 g/l in einem Medium aus Maisquellwasscr.

Die in Beispiel 14 hergestellten Zellsuspensionen wurden in drei I-Liter-Behälter überführt, die 200 ml in nachfolgendes Medium enthielten:

Maisquellwasser
Deiorose
Destilliertes Wasser

20
50

Liter

Beispiel 16

Reduktion von 3-Methoxy-8.l4-secoöslra- !.3.5(10),9( 11 )tetraen-14.17-dion in einem 10-L.iier-Fermentationsgefäß.

Eine Agarschrägkultur von Pichia fa.inGsa NRRL Y-118 wurde mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen und I ml der erhaltenen Zellsuspension iw einen 0.5 I großen Erlenmeyer-Kolben übergeführt, der ein Med·- um der folgenden Zusammensetzung enthielt:

20

25

30

Der pH-Wert wurde vor der Überführung in den Autoklaven auf 6,9 eingestellt.

Nach 24 S.'unden Bebrüten auf einem Drehschüttler lei 28°C wurde der Inhalt der 3 Kolben in ein I4-Liter-Fermentationsgefäß mit 61 des gleichen Mediums überführt. Die Temperatur wurde bei 37T gehalten und die Belüftung und das Rühren erfolgte wie in Beispiel 14.

Nach 17 Stunden wurden 6 g S-Methoxy-S.M-seco- «stra-l,3,5(10),9(ll)-tetraen-14,l7-dion, gelöst in 60ml Äthanol, zugegeben: die Rührgeschwindigkeit wurde »uf 300 UpM erhöht.

Die Fermentationsbrühe, 5,ii I, wurde nach 13 Stunden entnommen und das Gemisch mi« 1 I Methylisobutylketon extrahiert. Der flüssige Teil wurde danach mit 3 I Methylisobutylketon und die Zellen mit 2 I extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zweimal mit NaHCOj-Lösung gewaschen und über Na2SÜ4 getrocknet.

Der Methylisobutylketonextrakl wurde durch Glaswolle filtriert und im Vakuum bei 6O⁰C auf ein kleines Volumen eingeengt. Das rückständige Methylisobutylketon wurde dann weiter dadurch entfernt, daß man es im Vakuum mit drei 75-ml-Anteilen Cyclohexan destillierte. Das Endvolumen wurde mit Cyclohexan auf 200 ml eingestellt, das Gemisch auf 75°C erhitzt und t^-»lor»rro ac HoiR. tuoi* fur I-ntfprntlncy Hpc un!f\clif*hpn

Materials filtriert. Das Filtrat wurde erneut auf 75°C erhitzt, dann 2 Stunden auf 5°C abgekühlt, wobei es bei dieser Temperatur eine weitere Stunde gehalten wurde. Das kristalline Material wurde abfiltriert, mit 2 χ 10 ml eiskaltem Cyclohexan gewaschen und bei 35 bis 40° C getrocknet. Das Produkt wurde in einer Menge von 3,5 g (Ausbeute 603%) isoliert; Schmelzbereich 102 bis 107⁰C: [<x] =-33,2° (c=\: Dioxan): Gas-Flüssig-Chromatographie=93.8%.

45 Maisquellwasscr
Dextrose
Keimöl
Leitungswasser

20 g (Gew./Vol.) 20 g (Gew./Vol.)

1 ml

I Liter

Vor Überführen in den Autoklaven wurde der pH-Wert mit 50%iger NaOH (Gew./Vol.) auf 6,7 eingestellt.

Das beimpfte Medium wurde bei 25°C auf einem ürehschiiltier, bei 250 UpM. 5 cm Drehdurchmesser, l$ Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt war die Gesamtzellenzahl, die mittels einer Petroff-Hausser-Bakterienznhlkammer bestimmt wurde, annähernd 3,0 χ 10³ Zellen/ml.

100 ml der vorstehend angegebenen Züchtung wurden aseptisch in einen 4-Liter-Behälter mit Aspiratorvorrichtung überführt, der 1 I des oben beschriebenen Mediums enthielt. Der beimpfte Gefäßinhalt wurde erneut bei 25°C auf einem Drehschüttler, 250 UpM. 5 cm Drehdurchmesscr, 24 Stunden inkubierl.

Der gesamte Inhalt des Aspiratorgefäßes (I I) wurde in ein 14-Liter-Fermentationsgefäß übergeführt,das 101 des oben beschriebenen Mediums enthielt. Das Rühren wurde mit 300 UpM fortgesetzt und die Belüftung mit 3 l/Minute während des ganzen Umwandlungszyklus beibehalten.

Nach 16 Stunden bei 25°C wurden 10 g 3-Methoxy-8,10-secoöstra-l,3.5(10),9(ll)-tetraen-14.17-dion, gelöst in 280 ml Äthanol, zu der Brühe zugegeben. Zwei gleiche Zugaben wurden bei 20 und 24 Stunden vorgenommen. Nach 35 Stunden Inkubation wurde eine >95%ige Umwandlung von d-3-Methoxy-8,14-secor>ctra-1 λ "tflOJQM 1).tplrapn-t 7i?-nl-1<l-rvn prhnltpn nip Umwandlung wurde mittels Gas-FIüssig-Chrn -»latographie einer Probe bestimmt, die zuvor mit Methylisobutylketon extrahiert worden war. Die Zellen wurden aus der umgewandelten Brühe mittels Absorption an Dialomeenerde abgetrennt. Das Produkt wurde bei einer Temperatur von 70 bis 75"C mit Heptan extrahiert. Es wurde eine Gesamtmenge von 19,5 g des Produkts als reines kristallines Material erhalten, was einer Gesamtausbeule von 65% entspricht.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur asymmetrischen Reduktion von e.^Secogonatetraen-H^-dionen der allgemeinen Formel

RO

in der R und R¹ für niedere Alkylgruppen stehen, unter der reduzierenden Wirkung von Mikroorganismen der Gaitung Pichia zu den entsprechenden optisch aktiven d-17/3-Hydroxy-secosteroiden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pichia farinosa NRRLY-118 oder Pichia farinos» CBS 185 verwendeL

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der dort angegebenen allgemeinen Formel verwendet in der die Reste R und R¹ Äthylgruppen bedeuten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der dort angegebenen allgemeinen Formel verwendet, in der der Rest R eine Methylgruppe und der Rest R¹ eine Äthylgruppe bedeuten.

Dabei ist klar, daß dieses Problem dadurch gelöst werden könnte, daß man bereits von einem der Zwischenprodukte die d-Form herstellt, aus dem man dann auf einfache Weise die d-Form des Endsteroids erhalten kann.

Ausgehend von diesen Überlegungen beschreiben Gibian und andere die Bildung von optisch aktiven Seco-Steroiden durch mikrobiologische Verfahren unter Verwendung einer Hefe der Gattung Saccharomyces in Tetrahedron Letters Nr. 21, Seiten 2321 bis 2330 (1966). Die gleiche biologische Gattung wird ebenso, und zwar für denselben Zweck, von Rufer und anderen in Liebigs Ann. Chem. 702, Seiten 141 bis 148 (1967) erwähnt Ferner ist aus der NL-PS 68 10 400 die Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Pichia für die asymmetrische Reduktion von 8,14-Secogonapo-Iyen-14,17-dionen, nämlich von 8,14 Secogona-1,3,5(1O)^(I l),15-pentaen-14,17-dionen unter Bildung der entsprechenden 17/?-Hydroxyderivate bekannt- Als Mikroorganismen werden die Stämme Pichia wickerhamiS NRRL 1278. Pichia eicbeüsii NRRL !283 und Pichia pijperi NRRL 1290 eingesetzt

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß gewisse Mikroorganismenstämme besonders gut wirksame Reduktionsmittel für die speziellen, erfindungsgemäß eingesetzten Secosteroid-Derivate sind, ein Sachverhalt, der aus dem Stand der Technik nicht zu erwarten war.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur asymmetrischen Reduktion von 8,14-Secogonatetraen-14,17-dionen der allgemeinen Formel