DE1910997A1 - 8beta-Hydroxy-19-norsteroide,ihre im Ring A aromatisierten Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

'. DR. ELISABETH JUNG. DR. VOLKER VOSSIUS. DJPL.-ING. GERHARD COLDEWEY

• MDNCHEN23. 8 I EQE88TRA88E2β · TELEFON 34(0(7 . TELEQRAMM-ADRESSEt IN VENT/M DNCH EN

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Case 709 862 - S

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Priorität: 4= Mars 196S₈ ?_oSt₀JL_s Hr

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Die Erfindung betrifft neu© 8ß-~Hydro:£y~3.SMaoreteroide der allgemeiiien JPonnel I

0 OH π ^0H

in der 0 ^f die Gruppe -0^₈ -Ot » ^C*-

tetg uad ihrs im Eiag A aroaiatisierten Derivate der allgemeinen Formel II

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(H)

in der R eine Hydroxyl- oder Acyloxygruppe bedeutet.

Die Acyloxygruppe leitet sich von einer Carbonsäure ab^ die vor» zugsweise weniger als 13 C-Atome enthält» Beispiele für Carbonsäuren sind die aliphatischen gesättigten Carbonsäuren ₉ vie Essigsäure„ Propionsäure,) Buttersäure,, Önanthsäure und Laurinsäure, die olefinisch ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren, die monocyclischen aromatischen Carbonsäuren_B wie Benzoesäure und m-»SolU3l&äur@₉ die durch einen moiioeyslisetien aromatisehsn Rest substituierten niederen aliphatisolisa Carboneämr^Bg v/i© Phenylessigsäure and ß-"Phenylpropionsäur©₃ die GycloallcesaearbosiBäurea und die Cysloaiksnearbonsäuren_β

Die Erfindung betrifft auch ein ¥erfalirea zim R<3TBt®lXwng der 8S-Hydroxy»19~nor steroide und ihrer im Bisig A aromatisiert en Derivate _p das dadurch gekeujiseieiinet ist, dass man ein Steroid dei¹ allgemeinen Formel III

cm;-

in der C die vorstehend angegebene Bedeutung hat, in einem flüssigen Nährboden der Einwirkung der Enzyme von. Corynespora melonis oder Corynespora cassiicola aussetzt _s gegebenenfalls das erhaltene 8ß-Hydroxy~19-norsteroid der allgemeinen Formel I in einem flüssigen Nährboden mit den Enzymen von Corynebacterium

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ORIGINAL

simplex, Kocardia reatrictus (ATCC 14887) _B Pseudomonas testoBteroni (ATCC 11996)_f Cylindrocarpon radicicola (ATCC 11011)oder Mycobacteriura rhodoehrous (ATCC 4277) behandelt und gegebenenfalls das erhaltene Öetranderivat der allgemeinen Formel II mit einer Carbonsäure bzw« deren reaktionsfähigen Derivat in der 3-Stellung acyliert.

Die bevorzugten Verbindungen der Erfindung sind das 8ß-Hydroxy~ 19-nor- Δ -androsten-3117-dion, eß-Hydroxy-ig-nortestosteronj eiJ-HydroxyÖBtron und 8ß-Hydroxyöstradiol„

Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formel I als auch die Verbindungen der allgemeinen Formel II sind neue Verbindungen. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind Zwischenprodukte zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel H₀ Die Verbindungen der allgemeinen Formel II besitzen östrogene Wirkung und können sowohl in der Human- als auch Tiermedizin verwendet werdenο Die Verbindungen der allgemeinen Formel II wirken antigonadotrop und sie können zur Ereatztherapie bei der Menopause sowie zur Regelung der Fruchtbarkelt bei der Frau und in Tieren verwendet werden· Die Verbindungen haben auch eine antiöstrogene Aktivität und können daher zur Behandlung von Brust- und Uterustumoren verwendet werden« Zur Verabreichung können sie nach an eich bekannten Methoden tablettiert und in Tagesdosen von 0,10 bis 10,0 mg/kg Körpergewicht an Menschen und in Tagesdoeen von 0,05 bis 5 mg/kg Körpergewicht an Tiere, ζ «.Do Kühe, verabfolgt werden ο Die Verbindungen können auch in Form von Injektionspräparaten verabreicht werden« Zu diesem Zweck werden sie in einem pflanzlichen ÖX_r wie SesauÖl, oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst und parenteral verabreicht*

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Spezielle Beispiele für Ausgangssteroide, die im Verfahren der Erfindung eingesetzt v/erden können, sind 19-Norandrostendiön, 19-Nor-17$ -methylteetosteron und 19«Nor~170{-äthinyltesto'«- sterono

Es wurde festgestellt, dass die Aromatisierung des Ringes A mit den vorgenannten Mikroorganismen gelingt„ obwohl die 10-Stellung unsubstituiert ist_e

Im allgemeinen sind die Bedingungen zur Züchtung der Mikroorganismen die gleichen₉ wie sie zur Züchtung verschiedener anderer Bakterien zur Herstellung organischer Säuren oder Glykole angewandt werden«. Die Mikroorganismen werden unter aeroben Bedingungen in oder auf einem geeigneten Nährboden gezüchtet. Ein geeigneter Nährboden enthält eine Stickstoffquelle sowie eine Quelle für Kohlenstoff und Energie_c Ale Kohlenstoffquellen kommen z.B. Kohlenhydrate, wie Rohrzucker, Melasse, Glukose, Maltose, Stärke oder Dextrin, oder Fettsäuren, Fett und bzw. oder das Steroid selbst in Frage«, Vorzugsweise enthält jedoch der Nährboden ausser dem Ausgangssteroid eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Energieο Als Stickstoffquellen kommen organische Verbindungen, wie Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt und bzw, oder die löslichen Rückstände bei der Alkoholdestillation_p oder synthetische Stoffe_e z₀B_o einfache organische oder anorganische Verbindungen,, wie Ammoniumsalze, Alkalinitrate, Aminosäuren oder Harnstoff in Frage.

Während der Züchtung der Mikroorganismen muss für die Zufuhr ausreichender Mengen steriler Luft gesorgt werden. Beispielsweise kann ma;i nach herköniiflichen Verfahren '.rlna trosse Oberfläche des liährboae.ns der Luft ^rrFct:,cn oder nach den: Su bin er s verfahr en mit

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ι ■

Belüftung arbeiten« Das Ausgangssteroid kann dem Währboden während der Inkubationszeit oder vor der Sterilisation oder Beimpf ung einverleibt werden₀

Die Beispiele erläutern die Erfindung ο

Beispiel 1

^ androsten-3„17~dion

A) Fermentation

Oberflächenwachsturn, von jeweils vier 10 Tage alten Schrägagarkultüren von Corynespora raelonis (CBS)₀ Centraal Bureau voor Schimmel Cultures _t Baarn₀ Niederlande-, werden in 5 ml einer O₉Ol #-igen wässrigen Natriumlaurylsulfatlösung suspendierte Die Schrägagarkultüren enthielten folgendes Nährmedium (A):

Hafermehl 20 g

l'onatenpastej, in 500 ml siedendem «o e Leitungswasser suspendiert ^&

Agar 15 g

Leitungswasser 500 ml

1 ml Anteile der erhaltenen Suspension in der wässrigen Natriumlaurylsulfatlösung werden zum Beimpfen von zv/oif 250 ml fassenden JBrlenmeyerkolben verwendet» die jeweils 50 ml des sterilisierten Mahrmediums (B) enthielten;

Glucose 30 g

Sojabohnenmehl 20 g

Sojabohnenöl 2,2 g

CaCO₃ 2,5g

destilliertes Wasser auf 1 Liter

Nach 72-stündiger Inkubation bei 25°C auf einer Drehsohüttelmaschine mit einem Hub von etwa 5 cm und 280 Umdrehungen/Min,, wer-

den 5 volo=#ige Übertragungen auf achtzig 250 ml fassende Erlenmeyerkolben durchgeführt, die jeweils 50 ml des sterilisierten Hährmediuim3 (G) enthielten:

Glucose . 10 g

Maisquellv/asser 6 g

NH₄H₂PO₄ 3 g

Hefeextrakt 2,5 g

CaCO₅ 2,5 g

destilliertes Wasser auf 1 Liter.

Nach 24-stündiger Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben., wird ,jeder Kolben mit 0^25 ml einer sterilen Lösung (100 mg/ml) 19-2ior~ *& ~androsten-;5,17-dion in Npil-Dimethylformaniid versetzt« Es werden insgesamt 2,0 g Steroid eingesetzte Hach 6-stündiger Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben, v/ird die Gärmaische aufgearbeitet» Der Inhalt der Kolben wird vereinigte Man erhält ein Gesamtvolumen von 4500 ml»

B) Isolierung und Charakterisierung

Die vereinigte Gärmaische wird dreimal mit jeweils 900 ml Chloroform extrahierte Die vereinigten Chloroformextrakte v/erden mit V/asser gewaschen_s über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampfte Es hinterbleiben etwa 900 mg Rohprodukte Dieses Produkt wird an 24- Glasplatten der Grosse 40_fδ χ 20,3 cm chromatographiert, die mit einer dünnen Schicht von Kieselgel GF (Merck) in 1 mm Stärke beschichtet sind» Als bewegliche Phase wird Chloroform verwendet, das 5 YoI_o~$ Methanol enthält» Danach wird ein Gemieoh aus gleichen Yolumtei^ len Methanol und Chloroform eluiert» Nach dem Abdampfen des Lo=

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BAD OBiGlMAL

sungsmittels wird dor Rückstand zwischen Chloroform und einem Gemiech gleicher Volumteile Wasser und Methanol verteilte Die Chloroformphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene ein«= gedampft«, Es hinterbleibt kristallines 8fi~Hydroxy*"l9-nor~ Δ androsten-3_t17-diono Hach Ümkri3tallisation aus einer Mischung von Aceton und Hexan schmilzt üie reine Verbindung bei 208 bis 210⁰C; Λ S^¹3 3605_t 1731^5H., 1600 cm"¹;

Xu QJw

Beispiel 2

Gemäss Beispiel I₀ jedoch unter Verwendung einer äquivalenten Menge 19-Nortestosteron, erhält man das 8ß-Hydroxy-19-nortesto-Bterono

GemäßS Beispiel 2, jedoch unter Verwendung der nachstehend angegebenen Ausgangssteroide, werden die angegebenen 8ß-Hydroxysteroide erhaltene

Ausgangssteroid 8fl»Hydroxysteroid

19-Nor-170i-methyltestosteron 8ß-Hydroxy-19-nor-17 Of-

methyltestosteron

19-Nor-17o(-äthinyltestoBteron 8ß-Hydroxy-19-nor-17 Of -

äthinyltestoeteron

Beispiel ?

Herstellung, von 8ß-Hydroxyb*stron mit Hilfe einer wachsenden Kultur von Corynebacterium simplex
A) Fermentation

Corynebacterium simplex (ATCC 6946) wird in Schrägagarröhr— chen in folgendem Mährmedium (A) gezüchtet:

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- 8 - ■	Glucose	10	1910997	g
Hefeextrakt	2,	5 g
K2HPO4	1	β
Agar	20
destilliertes Wasser auf	1	Liter

Das Oberflächenwachstum von zwei Wochen alten Sohrägagarröhrchen von Corynebacterium simplex wird in 5 ml einer 0,01 §£-igen wässrigen Hatriumlaurylsulfatlösung suspendierte 1 ml Anteile dieser Suspension werden zum Beimpfen von zwei 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet» die jeweils 50 ml des sterilisierten Nährmediums (B) enthielten:

Rindfleischextrakt 1,5 g

Hefeextrakt 3 g

Pepton 6 g

Glucose 1 g

destilliertes Wasser auf 1 Liter·.

Nach 24-8tündiger Inkubation bei 25°C auf einer Drehßchüttelmaechine mit einem Hub von etwa 5 cm und 280 Umdrehungen/Hinute werden 5 VoI₀-Jt Übertragungen auf zwei 250 ml fassende Erlenmeyerkolben durchgeführt, die jeweils 50 ml des frisch sterilisierten Nährmediums B enthielten. Nach 24-etUndiger weiterer Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben, wird jeder Kolben mit 0,25 ml einer sterilen Lösung von 100 mg/ml 8ß-Hydroxy-19-nor-<d -androsten-3pl7~dion in N₁N-Dimethylformamid versetzte Es werden insgesamt 50 mg Steroid eingesetzte Nach 48-stündiger weiterer Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben, wird der Inhalt der Kolben vereinigt, die Gärmaische wird dreimal mit jeweils 50 ml Methylisobutylketon extrahiert„ und der Hethylisobufylketonextrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampfte Man

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erhält kristallines 8ß=ilydroxyöstron_p das aweimal aus einer Mischung von Aceton und Hexan umkristallisiert wird. Ausbeute 40 mg vom F₀ 260⁰C (Zersetzung); Λ ^ ⁵⁵⁶⁵» ³³⁷°» ¹⁷²°* 1580(Schulter), 1504

Beispiel 4

Herstellung von 8ß~Hydroxyöstron mit Hilfe gewaschener Zellen von Corynebacterium simplex -

Gemäss Beispiel 3» jedoch unter Verwendung von Testosteron, werden die Zellen der Kultur von Corynebacteriura. simplex am Ende der 72=>stündigen Inkubation durch Abschleudern geerntet» Die sedimentierten Zellen werden dreimal mit einem Phosphatpuffer gewaschen, der jeweils O₉005 Mol KH₂PO. und Na^HgPgO^ im Liter enthält und auf p_H 7jO eingestellt ist» Danach werden die gewaschenen Zellen in dem gleichen Phoephatpuffer in einem Volumen suspendiert ₉ das 1/4 des Volumens der ursprünglichen Kultur entspricht«. Dann werden das Substrat 8ß«=>Hydroxy~19~norandrostendion und der Wasserst off acceptor „ z.B 2~Methylnaphthochinon„ in Form ihrer !lösungen in Äthanol bis au einer Endkonzentration von 100/*/n>l bzw= 0,4 mMol isugegebeno Die Ithanolmenge beträgt insgesamt höchstens 5 i» der Gesamtmenge der Flüssigkeit₀ Das Reaktionsgemiseh wird 4 bis 6 Stunden bei 30⁰C stehengelassen und danach zweimal mit jeweils 1/4 seines Volumens durch Methylisobutylketon extrahierte. Der Methylisobutylketonextrakt wird gemäss Beispiel 3 aufgearbeitet«. Man erhält reines 8ß~Hydroxyö8tron vom SO 260^QC (Zersetzung)«

909847/1108 bad ö^wölHAL

Beispiel 5

Herstellung von ββ-Hydroxyöstron mit Hilfe von durch Aceton getrockneten Zellen von Corynebacterium simplex Gemäse Beispiel 4 werden die sediiaentierten Zellen mit einem gleichen Volumen Phosphatpuffer p_H 7»O verdünnt_o Me Zellensuspension wird tropfenweise und unter konstantem Rühren in das 10-fache Volumen Aceton eingerührt, das auf eine Temperatur unterhalb 5 C abgekühlt ist* Die !Fällung wird sofort auf einen Büchner trichter abgesaugt, mit wenig Aceton gewaschen und au™ schlieesend an der Luft getrocknet.» Eine Suspension von 10 mg der mit Aceton getrockneten Zellen pro ml des Phosphatpuffers vom Pu 7}0 wird in einem hoehtourigen Mischer hergestellt_o Das Substrat und der Wasserstoff accept or werden in der gleichen V/eise wie im Beispiel 4 zugegeben, und die Aufarbeitung in gleicher weise durchgeführt* Han erhält kristallines 8ß-Hydroxyöstrom vom P₀ 260⁰C (Zersetzung),

Beispiel 6

Herstellung von 8fi~Hydroxyo*gtroii mit Hilfe eines zellfreien

Enzympräparates aus Gorynebacterium simplex

Gemäss Beispiel 4 werden diese sediment!erten Zellen zusammen mit einer gleichen Menge feinpulverisiertem Aluminiumoxyd in einen Mörser gegeben und 20 Hinuten mit ultraschall behandelte Danach wird das Gemisch 10 Minuten bei 20CC G

1 mg aß-Hydroxy-19-norandrostendion, 5<Xy 2~Methyliiaphthoe&f»oji

, und 2,0 ml des zellfreien Überstandes werden in ein Eeagensglss

ι ·

gegeben und rait C,03 molarem Hatrlumphosphatpuffer auf 5>0 ml aufgefüllte Das Gemisch wird eine Stunde bei 3O°0

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danach zweimal mit jeweils 1 ml Methylisobutylketon extrahierte Die vereinigten Extrakte werden papierehromatographierto Als stationäre Phase wird Athylenglykol sowie ale bewegliche Phase ein Genisch gleicher Volumteile Benzol «net Chloroform verwendet. Ein fleck mit dem gleichen R_f-Wert von O,19_S der die gleichen charakteristischen Karbrealctionen gibt, wie Sß-Hydroxyöstron, das im Beispiel 3 erhalten wurde, wird beobachtet,

Gemäss den Verfahren von Beispiel 2 bis 6₉ jedoch unter Verwendung von 8ß-Hydroxy-19-nor-170^-methylt©sto8teron, 8ß-Hydroxy-19-nor—17<X -äthinyltestosteron und 8ß-Hydroxy-19-norteBtoeteron, erhält stan die entsprechenden 8ß-HydroxySstran-Berivate,

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Claims (1)

1. Patentansprüche 8ß«Hydroxy-19-nor8teroide der allgemeinen Formel I

   0 OH τ» Ci* mi» OH

   17 Ii t *& κ ,A⁵"? ,

   In der 0 die Gruppe -C- _s ~C- , -C* * oder ~C~ bedeutet, und ihre im Ring A aromatisieren Derivate der allgemeinen Formel II

   (II)

   in der R eine Hydroxyl- oder Acyloxygruppe bedeutet, 2· 8ß-Hydroxy-19-nor~4 -androsten-3 $17-dion. Jo eß-Hydroxy-19-norte8toaterono
   4. 8ß-Hydroxyöstron.
   5 c 8ß*H3'droxyöetradiolc

   6ο Verfahren sur Herstellung von 8ß-Hydroxy-19~nor8teroiden gemäße Anspruch I₁. dadurch gekennzeichnet? dass man ein Steroid der allgemeinen Formel 111

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   (in)

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   in der C die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, in einem flüssigen Nährboden der Einwirkung der Enzyme von Corynespora melonis oder Corynespora eassiicole aussetzt, gegebenenfalls das erhaltene 8ß-Hydroxy-19-norateroid in einem flüssigen Nährboden mit den Enzymen von Corynebacterium simplex, Nocardia restrictus (ATCC 14887), Pseudomonas testosteron! (ATCC 11996), Cylindrocarpon radlcioola (ATCC 11011) oder Mycobaoterium rhodochrous (ATCC 4277) behandelt und gegebenenfalls das erhaltene östranderivat der allgemeinen Formel II mit einer Carbonsäure bzw₀ deren reaktionsfähigen Derivat in der 3~Stellung acylierto

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   OflQlNAL INSPECTED