DE2652377B2 - Verfahren zur Herstellung von 7 a ß-Methylhexahydro-1 ,(5)-indan (di)on-Verbindungen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 7 a ß-Methylhexahydro-1 ,(5)-indan (di)on-Verbindungen

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DE2652377B2
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Description

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß sich eine später noch näher erläuterte Mikroorganismus-Mutante in hervorragender Weise zur Herstellung neuer Verbindungen, und zwar von
HO
HO
dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,l 7-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,l 7-dion, Androsta-1,4-' dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.
HO
und
(D
HO
HO
eignet.
Die Gegenstände der Erfindung sind in den Ansprüchen definiert.
Die erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus-Mutante, nämlich Mycobacterium fortuitum DSM 775 (= NRRL B-8129), die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen auszeichnet und in der Gärbrühe vornehmlich Verbindungen der beiden Formeln:
3a.\-H-43-[3'-Propanol]-7a/i-methylhexahydro-l,5-indandion-Hemiketal
HO
3a* -H-4\-[3'- Propanol] - 5« - hydroxy - 7a/i - methy 1-hexahydro-1 -indanon
HO
HO
anhäuft, erhielt man durch Mutationsmaßnahmen.
Beispiele für erfindungsgemäß selektiv abbaubare Steroide sind Sitosterine, Cholesterin, Stigmasterin und Campesterin, ferner Androst-4-en-3,l 7-dion, Androstal,4-dien-3,l7-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron. Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.
Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum NRRL B-8129 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine
oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/l. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet Bevorzugte Kohlenstoff lieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Brennereiri'ckstände, Tierpeptonflüssigkeiteit, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stick-Stofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.
Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsverfahrens reicht von etwa 25° bis etwa 37° C und beträgt vorzugsweise 300C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.
Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbriihe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.
Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermentationsbrühe läßt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.
Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Rückstand kann dann in einem 10% Chloroform enthaltenden handelsüblichen Hexanisomerengemisch gelöst und auf Silikagel chromatographiert werden, wobei als Entwicklerlösungsmittel das handelsübliche Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen an Äthylacetat verwendet werden. Hierbei läßt sich die Verbindung der Formel I eluieren. Die Verbindung der Formel II läßt sich beispielsweise durch 5% Methanol enthaltendes Äthylacetat eluieren. Kristalline Produkte erhält man bei Verwendung eines Lösungsmittels, beispielsweise von Äthylacetat. Die Lösung kann dann auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Entfernung des angefallenen Steroids filtriert werden. Die gewünschten umgewandelten Steroide lassen sich auch aus der überstehenden Flüssigkeit nach Verdampfen des darin enthaltenen Lösungsmittels gewinnen.
Die Verbindungen der Formeln I und II eignen sich als Zwischenprodukte bei der chemischen Synthese wertvoller Steroide. So können sie beispielsweise in die bei dem aus der US-PS 38 80 884 bekannten Verfahren zur Totalsynthese wertvoller 19-Norsteroide verwendeten Ausgangssubstanzen umgewandelt werden. Diese Umwandlung in die a. a. O. genannten Ausgangssubstanzen läßt sich in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Oxidation mit Chromsäure in Essigsäure und anschließender Nachbehandlung mit Essigsäureanhydrid und Natriumacetat bewerkstelligen (vgl. »Biochem.« 2, 1238 bis 1243 und »J. Am. Chem. Soc.« 85,2135 bis 2137).
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben »Gewichtsprozente«. Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nichts anderes angegeben, »Volumina«.
Beispiel 1
Herstellung der Mutante M. fortuitum
NRRL B-8129 aus M. fortuitum ATCC 6842
a) Nitroguanidin-Mutagenese
Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 280C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:
Nährbrühe 8 g/l
Hefeextrakt 1 g/l
Natriumpropionat 0,5 g/l
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf 1 1
Der pH-Wert des Mediums wird mit 1 n-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121°C auf 7,0 eingestellt.
Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 χ 108/ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1-m Natriumeitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d. h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37° C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1-m Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:
NR1NO3 1,0 g/l
K2HPO4 0,25 g/l
MgSO4 · 7 H2O 0,25 g/l
NaCl 0.005 g/l
FeSO4 · 7 H2O 0,001 g/l
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf 11
resuspendiert Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 2f)minütigen Sterilisieren bei 121CC mit 1 n-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet
b) Auswahl und Isolierung der Mutante
M. fortuitum NRRL B-8129
Die in der geschilderten Weise mutierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fräser und ] e r r e 1,1963 »J. Biol. Chem.«, 205,291 bis 295):
lieferanten enthaltenen Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28° C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflasehen ausgewertet
c) Sch'Qttelflaschenauswertung
Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotninsformationsimittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:
20
Glyzerin 10,0 g/l
Na2HPO4 8,4 g/l
KH2PO4 4,5 g/l
NH4Cl 2,0 g/l
MgSO4 · 7 H2O 0,3 g/l
FeCl3 · 6 H2O 0,05 g/l
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf 11
25
30
Glycerin 10,0 g/l
Na2HPO4 8,4 g/l
KH2PO4 4,5 g/l
NH4Cl 2,0 g/I
MgSO4 · 7 HjO 0,3 g/l
FeCl3 ■ 6 H2O' 0,05 g/l
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf 1 I
Nach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklav auf eine Temperatur von 121°C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutationsverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28° C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das durch Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G. E. Peterson, H. L. Lewis und J. R. Davis »Preparation of uniform dispersiens of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media«, J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/I Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121° C im Autoklav erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.
Die auf den Kontrollpiatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstoff-Hierauf werden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt Nach 20minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklav auf 1210C werden sie auf 28° C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:
Die vereinigten Isolate aus Stufe b) werden bei einer Temperatur von 28° C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:
Nährbrühe 8 g/i
Hefeextrakt 1 g/i
Glyzerin 5 g/i
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf 1 1
wird eine von einem geneigten Agar entnommene öse voll Zellen verwendet
Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20minütigen Erhitzen der Flaschen auf 121° C in einem Autoklav mit 1 :n-NaOH auf 7,0 eingestellt Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28° C inkubiert
Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30° auf einem Drehrüttler inkubiert wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d. h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/FIüssig-Chromatographie analysiert Ein Nachweis der Anwesenheit von Verbindungen der Formeln I und IH bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch die neue Mutante aus dem Muttermycobacterium fortuitum ATCC 6842.
Auf die Herstellung der Mutante wird hier kein Wert gelegt.
Beispiel 2
Umwandlung von Sitosterin zu Verbindungen
der Formeln I und Il
Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel Ic). Dieses Medium wird durch 30minütigcs Erhitzen auf 121"C sterilisiert, dann auf 30"C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur der Mutanlc Mycobactcrium M. fortuitum DSM 775, die entsprechend Beispiel Ic) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 300C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Melhylcnchlorid extrahiert. Der Extrakt wird durch Diatomeencrdc filtriert, worauf das Filtrai im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der hierbei angefallene Destillationsrückstand wird in einem 10% Chloroform enthaltenden, handelsüblichen Hcxanisomcrcngemisch aufgenommen und auf Silikagel Chromatographien, wobei als Enlwicklerlösungsmittcl das handelsübliche Hcxanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen Äthylacetat verwendet werden. Hierbei kann man die Verbindung der Formel 1 eluiercn. Die Verbindung der Formel 11 läßt sich aus der Säule mit 5% Methanol enthaltendem Äthylacetal eluieren. Die Reihenfolge des Eluierens der Verbindungen ist I -» II. Die RrWerte der erhaltenen Verbindungen auf einem Diinnschichtchromatogramm unter Verwendung eines 3 :2-Cyclohexan/Äthylacetai-Gemischs betragen:
I = 0,37
Il = 0,05
Auf diinnschichtchromatographischem Wege ermittelte geeignete Fraktionen werden gesammelt und zur Trockene eingedampft, wobei die Verbindungen der Formel I und Ii in guten Ausbeulen erhalten werden.
Beim Umkristallisieren aus Äthylacetal fällt die Verbindung I in Form eines 1 : 1-Epimcrengemisehs ■5 eines Fp. von 100" bis 112"C an. Die Verbindung II besitzt einen Fp. von 148° bis 150"C.
Auf einem Diinnschichtchromatogramm zeigt sich,
daß 3ai\-H-4i\-[3'-l>ropanoI]-5a-hydroxy-7<\/J-mcthyl· hexahydro-1-indanon-Hemiacetal und 3a«-H-4i\-[3'-
I» Propionsa ure]-5(X-hydroxy-7a/i-mcthy !hexahydro-1-indanon-rt-laclon in Spuren anwesend sind.
Beispiel 3
r> Auch bei Ersatz des Silostcrins in Beispiel 2 durch Cholesterin erhält man die Verbindungen der Formeln I und II.
Beispiel 5
Auch bei Ersatz des Silostcrins in Beispiel 2 durch Stigmasterin erhält man die Verbindungen der Formeln 1 und II.
Beispiel 4
2) Auch bei Ersatz des Sitostcrins in Beispiel 2 durch Campesterin erhält man die Verbindungen der Formeln I und II.
Beispiel 6
i(i Bei Zusatz einer Kombination aus den Steroiden der Beispiele 2 bis 5 zu Sitosterin oder bei Verwendung einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 5 anstelle des Sitosterins in Beispiel 2 erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I
r> und II.

Claims (1)

  1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von
    O
    HO
    und
    Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 »Berichte« 70, 470 und »Berichte« 70, 2079. A.a.O. wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17/?-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet Im Jahre 1952 (vgl. US-PS 26 02 769) berichten Peterson und M u r r a y über die 11 λ-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 36 84 657) berichten K r a y c h y und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst l,4-dien-3,17-dion und 20«-Hydroxymethylpregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 37 59 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.
    Die Ringöffnungsform der Verbindung der Formel I, nämlich 7a-Methylperhydroindandion-( 1,5)-[/?-propanol-(4)], ist von Schubert und Mitarbeitern in »Steroids« 4,581 —586 (1964) als Zwischenprodukt beim Abbau von Progesteron durch Mycobacterium smegmatis erwähnt.
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