Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen Es wurden gefunden, dass man Steroidverbindun- gen dadurch in wertvollere Steroidverbindungen über führen kann, dass man sie mit einer Kultur eines Mikroorganismus, welcher entweder zur Gattung Pseudomonas oder zur Gattung Serratia gehört, be handelt.
Im besonderen bezieht sich die vorliegende Er findung auf ein Verfahren zur 1,2-Dehydrierung von Steroiden der Pregnan- oder Allopregnanreihe, z. B. von 41-3-0n- oder 41-3,20-Dion-Verbindungen der Pregnanreihe, bei denen ausser den 11- und/oder 17-Stellungen die 21-Stellung sauerstoffhaltig sein kann oder nicht, oder von funktionellen Derivaten davon.
Als Ausgangsmaterial kann man 3-0n- oder 3,20-Dionverbindungen der Pregnanreihe, deren 21-Stellung sauerstoffhaltig sein kann oder nicht, oder funktionelle Derivate davon verwenden.
Zur Durchführung der erfindungsgemässen Um setzung kann man so vorgehen, dass man einen Stamm aus der Gattung Pseudomonas oder aus der Gattung Serratia in einem das obige Material enthaltenden, sterilen Medium aerob bebrütet oder das aus den Bakterien hergestellte Redoxenzym mit dem Material aerob in Berührung bringt, wobei zwischen den in 1- und 2-Stellung befindlichen Kohlenstoffatomen des Materials eines Doppelbindung gebildet wird.
Bei den funktionellen Derivaten kann es sich beispielsweise um ein Steroidderivat handeln, welches durch Überführung der Hydroxylgruppe in der 3-, 11-, 17-, 20- oder 21-Stellung des Materials in eine funktionelle Gruppe, wie z. B. Ester, Äther, Halo genid, Ketal, Hydrazon, Semicarbazon usw., herge stellt wird, oder aber um ein Steroidderivat, welches durch Ersatz des in der 9-, 16- oder 19-Stellung des Materials haftenden Wasserstoffatoms durch Halogen, wie z.
B. 9a-Fluor und -Chlor, oder durch eine Hydroxylgruppe erhalten wird.
Typische Steroidverbindungen, welche man bei der vorliegenden Erfindung als Ausgangsmaterial verwenden kann, sind beispielsweise die folgenden: Pregnan-3,20-dion, 4 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion, 4 4-Pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion, d 4-Pregnen-3,20-dion, 4 4-Pregnen-11ss,21-diol-3,20-dion, 4 4-Pregnen-21-ol-3,20-dion, 4 4-Pregnen-1 1ss,17a,21-triol-3,20-dion, Allopregnan-3,20-dion, d 4-Pregnen-21-ol-3,11,20-trion,
d 4-Pregnen-1 6a,17a,21-triol-3;20-dion, 9a-Fluor-d 4-pregnen-1 1ss,17a,21-triol-3,20-dion, d 4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion.
Ferner kann man jene Verbindungen verwenden, welche aus den obigen Verbindungen durch Vereste- rung, Verätherung oder durch Ersatz der Hydroxyl- gruppe durch ein Halogenatom oder durch über führen der Oxogruppe in ein Ketal, Hydrazon oder Semicarbazon erhalten werden.
Die erfindungsgemässe Umsetzung wird im allge meinen dadurch zustande gebracht, dass man das Material mit Bakterien der Gattung Pseudomonas oder der Gattung Serratia oder mit dem Redoxenzym, welches man aus den Bakterien unter aeroben Be dingungen erhält, in Berührung bringt. Geht man so vor, so werden die Endprodukte durch die folgende Massnahme erhalten: Bildung einer Doppelbindung zwischen dem Cl und C2 mittels Dehydrierung.
Die gemäss vorliegender Erfindung erhältlichen Produkte sind wertvolle Arzneimittel oder wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung derselben. So kann man die erfindungsgemäss erhältlichen Verbin dungen nach dem Abtrennen aus dem Reaktions gemisch mittels bekannter Methoden oder auch ohne Abtrennen für die verschiedenen Zwecke ver wenden.
Gemäss vorliegender Erfindung verwendet man einen Bakterienstamm aus der Gattung Pseudomonas (nachstehend mit Ps. bezeichnet) oder der Gattung Serratia (nachfolgend mit S. bezeichnet). Typische Arten davon sind die folgenden:
Ps. boreopolis Gray und Thornton, Ps. fluorescens Migula, Ps. geniculata (Wright) Chester, Ps. putida (Trevisan) Migula, Ps. ovalis Chester,
Ps. convexa Chester, Ps. mephitica Claydon und Hammer, Ps. Oleovorans Lee und Chandler, Ps. arvilla Gray und Thornton, Ps. aeruginosa (Schroeter) Migula, Ps. coronafaciens (Elliot)
Stevens, Ps. mildenbergii Bergey et a1., Ps. fragi (Eichholz) Huss emend. Hussong et a1., Ps. tetrolens Hayens, Ps. reptilivora Caldwell und Ryerson,
Ps. riboflavina Foster, Ps. striafaciens (Elliot) Starr und Bulkholder, S. marcescens Bizio, S. plymuthica (Lehmann und Neumann) Bergey et a1., S. indica (Eisenberg) Bergey et a1., S.
kiliensis (Lehmann und Neumann) Bergey et a1., und S. Piscatorum (Lehmann und Neumann) Breed. Die obigen Namen sind aus Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 7. Auflage, Verlag The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., USA, 1957, entnommen.
Sollten einige der obigen Arten durch andere Nomenklaturen bezeichnet werden kön nen, so sollen sie trotzdem unter die für die vorlie gende Erfindung verwendbaren Bakterien fallen.
Die oben erwähnten Mikroorganismen sind bei den öffentlichen Kultursammlungen, wie z. B. Nor- thern Utilization Research Brauch, U. S. Department of Agriculture, Peoria, 11l., USA , American Type Collection, Washington, D.
C., USA , Centraal- bureau voor Schimmelcultures, Baarn , Institute of Applied Microbiology, Tokyo University, Tokyo, Japan , Institute for Fermentation, Osaka, Osaka, Japan und Nagao Institute, Tokyo, Japan , zu gänglich. Die Mikroorganismen kann man auch aus den natürlichen Quellen mittels der bekannten Me thoden isolieren.
Das zum Wachsen der Mikroorganismen verwen dete Nährmedium wird vorzugsweise Kohlenstoff und Stickstoffquellen enthalten, die sie assimilieren können. Auch eine kleine Menge an anorganischen Salzen, die für ihr Wachstum nötig sind, wird wünschenswerterweise vorhanden sein. Als Kohlen stoffquellen kann man die folgenden verwenden: Glu cose (oder Ceresole), Maltose, Sucrose, Dextrin, Stärke, Invertzucker und Glycerin. Als Stickstoff quelle kann man die folgenden Materialien verwen den: Peptone, Fleischextrakte, Casein und komplexe Stickstoffquellen, wie z.
B. Edamin (Lactalbumin- hydrolysat), Maiseinweichflüssigkeit und Sojabohnen produkte, welche man allgemein für Fermentierungen in grossem Massstabe verwendet, ferner stickstoff haltige, organische Verbindungen, wie z. B. Harn stoff, organische und anorganische Ammoniumsalze und verschiedene Arten von Nitraten. Zur Herstellung eines geeigneten Mediums kann man auch anorga nische Salze, wie z. B. Kaliumphosphat, Natrium chlorid, Ferrosulfat und Magnesiumsulfat zugeben.
Gewünschtenfalls kann man auch andere wachstums fördernde Materialien, wie z. B. Vitamine und Stimu- lantien, dem Medium zugeben.
Die für die vorliegende Erfindung verwendbaren Mikroorganismen wachsen auch in einfacheren Me dien als den bisher verwendeten in hinreichendem Masse, wobei die verbleibenden Zellen der Mikro organismen für den gleichen Zweck verwendet werden können. In diesem Falle sind die obgenannten Nähr mittel nicht notwendigerweise unentbehrlich. Da ausser dem Adaptivenzym das Konstitutivenzym der Mikroorganismen als Enzymsystem im vorliegenden Verfahren verwendet wird, ist das vorliegende Ver fahren vorteilhafter und weniger zeitraubend als die bekannten Verfahren.
Für die vorliegende Erfindung verwendbare Me dien sind die folgenden:
EMI0002.0136
<I>Beispiele <SEP> für <SEP> Zusammensetzungen <SEP> des <SEP> Incubationsmediums</I>
<tb> (2) <SEP> % <SEP> (3)
<tb> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> " <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2
<tb> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> KH2p04 <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,1</B>
<tb> MgS04 <SEP> * <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,05
<tb> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001 <SEP> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001 <SEP> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001
<tb> Glycerin <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> Glycerin <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> Ammonium Harnstoff <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> NH4N03 <SEP> .
<SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> lactat <SEP> . <SEP> . <SEP> 2
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0 <SEP> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,5 <SEP> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,5
<tb> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> bedeutet <SEP> Maiseinweichflüssigkeit .
EMI0003.0001
(4) <SEP> % <SEP> (5) <SEP> % <SEP> (6)
<tb> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> * <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> Harnstoff <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> Glycerin <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,01 <SEP> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,03 <SEP> Pepton <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> MgS04-7H20 <SEP> 0,05 <SEP> MgS04-7H20 <SEP> 0,02 <SEP> Fleischextrakte <SEP> 0,5
<tb> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,00l <SEP> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001 <SEP> NaCI <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Ammonium succinat <SEP> . <SEP> 2 <SEP> Glucose <SEP> . <SEP> .
<SEP> 2
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0 <SEP> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,8 <SEP> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0
<tb> (7) <SEP> % <SEP> (8) <SEP> % <SEP> (9)
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> Hefeextrakte <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> Brunnenwasser <SEP> oder
<tb> Cerelos <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> destilliertes <SEP> Wasser
<tb> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> MgS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,05
<tb> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001
<tb> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> bedeutet <SEP> Maiseinweichflüssigkeity.
Die Mikroorganismen können gemäss vorliegender Erfindung durch eine stationäre Kultur ausgebrütet werden, doch wird man angesichts der aeroben Natur das Kulturmedium vorzugsweise schütteln oder unter Lüftung submers züchten.
Die als Ausgangsmaterialien verwendeten Steroide kann man dadurch mit dem Redoxenzymsystem in Kontakt bringen, dass man sie während der Inkuba tion der Mikroorganismen in das Medium einführt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass man die Mikroorganismen während einer gewissen Zeit züchtet und die gewachsenen Zellen auszentrifugiert, worauf man sie in einem anderen Medium mit den als Ausgangsmaterialien verwendeten Steroidverbin- dungen in Berührung bringt. Im letzteren Falle muss das Medium nicht notwendigerweise die oben ge nannten Nährstoffe enthalten.
Da die Mikroorganismen, welche zur Gattung Pseudomonas oder zur Gattung Serratia gehören, in Medien von verhältnismässig einfacher Zusammen setzung wachsen können, so kann die Umwandlung der Ausgangsmaterialien nach dem vorliegenden Verfahren in einem einfachen Medium, wie es sich für die Nachbehandlung eignet, bewirkt werden.
Der pH-Wert des Mediums, die ReaktionsteMpe- ratur (Züchtungstemperatur), die Reaktionsdauer (Züchtungsperiode) und andere Bedingungen wird man selbstverständlich der besonderen Art der Aus gangsverbindungen, den zu erzeugenden Steroidver- bindungen, den in Frage stehenden Mikroorganismen, der Art des Zusammenbringens des Substrats und des Enzyms und der Konzentration des Mediums an passen. Im allgemeinen wird man einen pH-Wert von etwa 6-9, eine Reaktionstemperatur von 20 bis 37 C und eine Reaktionsdauer von 3 bis 50 Stunden be vorzugen.
Diese Bedingungen sollen aber den Rah men der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einengen. Bei der Züchtung einer Kultur von bei spielsweise Ps. boreopolis während etwa 2 bis 3 Stun den in Gegenwart einer beträchtlichen Menge eines niedrigen Alkohols, wie z. B. Methanol oder Äthanol, in einer Menge von etwa 5 Vol:o/o@, bezogen auf das Kulturmedium, bildet sich beinahe ausschliesslich eine Doppelbindung zwischen den Ci und C2 Stellungen des Substrats.
Im allgemeinen wird man einer Konzentration des Substrats von 0,1 bis 0,5 Q/a den Vorzug geben. Je nach Art des verwendeten Mikroorganismus und des Endproduktes sowie der anderen Kulturbedingun gen kann man aber auch mit anderen Konzentratio nen noch bessere Resultate erzielen. Die Zugabe des Substrates erfolgt zu Beginn der Inkubationszeit oder in einem geeigneten späteren Stadium. Werden die zentrifugierten Zellen mit dem Substrat in Be rührung gebracht, so kann man die Zellen dem das Substrat enthaltenden Medium zusetzen.
Das Substrat wird dem Medium entweder einmalig oder portionen- weise in Form eines feinen Pulvers, als Lösung oder Suspension beispielsweise in Methanol, Äthanol, Propylenglycol, Dioxan, Dimethylformamid oder Wasser, oder als Lösung oder Suspension in einem ein oberflächenaktives Mittel oder ein Dispergie- rungsmittel enthaltenden Lösungsmittel zugesetzt.
Um die Reaktion glatt verlaufen zu lassen, ist es wünschenswert, dass das Ausgangsmaterial im Me dium als Lösung oder in Form eines möglichst feinen Pulvers vorliegt.
Die so erzeugten und im Medium angereicherten Endprodukte können beispielsweise wie folgt isoliert werden: a) Die Produkte werden auf einem geeigneten Adsorptionsmittel, wie z. B. aktiver Kohle, adsorbiert und hierauf mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Methanol und Äthanol, eluiert.
b) Die Produkte werden mit einem mit Wasser nicht mischbaren, geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, Methylenchlorid und Äthylenchlorid, extrahiert oder nach dem Gegenstromprinzip extra hiert. c) Die Produkte werden auf einem geeigneten Trägermittel, wie z. B.
Aluminiumoxyd, Silicium- dioxydgel, Cellulose und Holzfasermasse, chromato- graphiert, d) Die Produkte werden dadurch getrennt, dass man die verschiedenen Löslichkeitsgrade zwischen zwei Lösungsmitteln sich zu Nutze macht.
e) Die Produkte werden zuerst in einem Lö sungsmittel extrahiert und hierauf als Derivate ihrer funktionellen Gruppen durch Anwendung von Girard's-Reagenzien, das heisst Trimethylcarbonyl- hydrazinomethyl-ammoniumchlorid und Hydrazino- carbonylmethyl-pyridiniumchlorid, isoliert, oder sie werden mit einem niedrigen Fettsäureanhydrid und einem Entsäuerungsmittel acyliert und die so abge trennten Derivate in die ursprünglichen Verbindungen übergeführt.
Manche der so erhaltenen Produkte stellen Adrenocorticalhormone, männliche Sexualhormone und weibliche Sexualhormone dar, welche man oral oder parenteral verabreichen kann. Wiederum andere dieser Verbindungen können als Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimitteln, denen die genannte Wirksamkeit zukommt, oder für die Her stellung von Zwischenprodukten verwendet werden.
Die Temperaturen sind in sämtlichen Beispielen unkorrigiert angegeben. Sämtliche Analysenwerte beziehen sich auf Gewichtsprozente. In den Bei spielen bedeuten die Ausdrücke UV-Spektrum und IR Spektrum das ultraviolette Spektrum, welches man in äthanolischer Lösung einer Probe beobachtet, und das Infrarotspektrum, welches man in einer flüssigen Paraffinsuspension für jede Probe beob achtet.
Die Abkürzung ATCC für die Kultursamm lung bedeutet American Type Culture Collection, Peoria, I11., USA .
<I>Beispiel 1</I> 50 cm3 des oben erwähnten Mediums 1 werden in einem 350-cm3-Schüttelbecher während 15 Minu ten bei einem Dampfdruck von 1,05 kg/cm2 sterili siert. Dann wird das Medium mit Ps. olevorans mit Hilfe von zwei Platinösen angeimpft und während 10 Stunden unter Schütteln (100-150mal pro Minute bei einer Amplitude von 5,08 cm) bei etwa 28 C ausgebrütet.
Hierauf versetzt man mit 10 mg 44-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion und 2,5 cm3 Propylenglykol, worauf man das Gemisch während weiteren 10 Stunden unter den gleichen Bedingungen ausbrüten lässt. Dann wird der flüssige Anteil 3mal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert, während der feste Anteil 3mal mit je 5 cm3 Aceton extrahiert wird. Beide Extrakte werden vereinigt und das Lö sungsmittel unter vermindertem Druck in Anwesen heit von Stickstoff bei Zimmertemperatur destilliert.
Das verbleibende kristalline Pulver stellt eine Mi schung von 41,4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-3-on 41,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion dar. Diese bei den Verbindungen werden durch die nachfolgenden Teste identifiziert. 1. Das Pulver wird in einer kleiner Menge von Chloroform gelöst und die Lösung nach der Methode von Zaffaroni der Papierverteilungschromatographie unterworfen, das heisst, sie wird mit Propylenglycol- Toluol entwickelt, worauf die entsprechenden Stellen an den entsprechenden Zonen in Erscheinung treten.
2. 1,0 g des Pulvers wird in 12,5 cm3 Pyridin gelöst und die Lösung mit 7,5 cm3 Essigsäureanhydrid versetzt. Nach dem Stehenlassen während 24 Stun den bei Zimmertemperatur erwärmt man die Lösung während 1 Stunde auf 50 C und destilliert das Lö sungsmittel unter vermindertem Druck ab. Der Rück stand wird in Chloroform gelöst und die Lösung mit verdünnter Salzsäure, hierauf mit einer wässrigen Lösung von Natriumcarbonat und schliesslich mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird auf 280 g Magnesiumsilikat mittels einer Mischung von Äther und Aceton entwickelt, wobei sich die beiden Verbindungen voneinander trennen. Während der Chromatographie nimmt der Acetongehalt allmählich zu. Die beiden Verbindun gen werden aus Aceton umkristallisiert, wobei man 0,2 g farblose Nadeln vom Smp. 215-218 C und 0,1 g farblose Prismen vom Smp. 178-179 C erhält.
Die erstere Verbindung besteht aus
EMI0004.0071
IR-Spektrum
<tb> y",a,: <SEP> 3,00 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 5,75<I>,u,</I> <SEP> 5,82<I>,u,</I> <SEP> 6,03<I>,u</I>
<tb> 6,20<I>,u,</I> <SEP> 6,25<I>,u,</I> <SEP> 11,20<I>,u.</I>
EMI0004.0072
Analyse:
<tb> ber. <SEP> für <SEP> C"11"0,: <SEP> C <SEP> = <SEP> 71,48, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,82
<tb> gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 71,26, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,78 Eine Lösung von 0,4 g dieser Substanz in 40 cm3 Methanol wird mit einer Lösung von 0,42 g Kalium- bicarbonat in 5 cm3 Wasser versetzt. Das Gemisch wird während 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt und hierauf unter vermindertem Druck eingeengt.
Der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, worauf man das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird aus Aceton umkristallisiert, wobei man 0,245 g farblose Platten vom Smp. 225-228 C (unter Zer setzung) erhält.
Dieses Produkt dürfte das d 1,4- Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion sein, dessen Eigen schaften die folgenden sind: IR-Spektrum Ymat: 3,00,u, 5,80 ,u, 6,00,u, 6,18,u, 6,22,u.
EMI0004.0092
Analyse:
<tb> ber. <SEP> für <SEP> <B>C21112804:</B> <SEP> C <SEP> = <SEP> 73,22, <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,19
<tb> gef:: <SEP> C <SEP> = <SEP> 73,01, <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,13.
Die letztere Verbindung ist das 20ss,21-Diacetoxy- d 1,4-pregnadien-17-ol-3-on, welches die folgenden Eigenschaften aufweist: [a] : -I- l00 (c = 1,0 fl/o, CHC1D 3). UV-Spektrum d",@@: 243 my (E = 15 900).
EMI0005.0001
IR-Spektrum
<tb> <B>AICI;Vx'</B> <SEP> <I>2,87 <SEP> ,a.,</I> <SEP> 5,78<I>,u,</I> <SEP> 6,04<I>,u,</I>
<tb> <I>6,16,u,</I> <SEP> 6,25 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 11,30<I>,u.</I>
EMI0005.0002
Analyse:
<tb> ber. <SEP> für <SEP> <B>C <SEP> 25H3406.</B> <SEP> C <SEP> = <SEP> 69,74, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,96
<tb> gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 69,49, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,88. Eine Lösung von 0,65 g dieser acetylierten Ver bindung in 50 cm3 Methanol wird mit einer Lösung von 1,2g Kaliumbicarbonat in 5 cm3 Wasser versetzt und das Gemisch während 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt.
Das Reaktionsgemisch wird hierauf unter ver- mindertem Druck eingeengt und der Rückstand in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Äther extrahiert, der Extrakt mit Wasser gewaschen und über wasser freiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt. Der Rückstand wird aus einer Aceton- Äther-Mischung umkristallisiert, wobei man 0,22 g farblose Prismen vom Smp. 194-195 C erhält.
Das Produkt ist das d 1>4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-3-on mit folgenden Eigenschaften: [a120: -I- 33 (c = 1,0 % CHC13). UV-Spektrum A,"": 244 mg (s = 14 200). IR-Spektrum A",ax: 3,00,u, 6,00,u, 6,21,u, 6,26,u, 11,32,u.
EMI0005.0026
Analyse:
<tb> ber. <SEP> für <SEP> <B>C21HS004' <SEP> C=72,80, <SEP> H=8,73,</B>
<tb> gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> <B>72,31,</B> <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,40.
Die beiden obigen Verbindungen besitzen die gleichen Eigenschaften wie jene der entsprechenden, nach den bekannten Methoden erhaltenen Produkte.
Der Stamm Ps. oleovorans, welcher im vorliegen den Beispiel verwendet wird, ist deponiert bei ATCC unter der Identitätszahl ATCC 13 474.
<I>Beispiel 2</I> 30 Liter des weiter oben unter Nr. 3 bezeichneten synthetischen Mediums wird während 20 Minuten bei einem Dampfdruck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert. Dieses Medium wird hierauf mit Ps. boreopolis an geimpft und während 24 Stunden unter solcher Ent lüftung und Schütteln bei 28 C ausbrüten gelassen, dass ein Liter einer Natriumsulfitlösung 6,3-7,0 Milli- mol Sauerstoff pro Stunde absorbiert (Kooper, Fels- rome, Millar:
Ind. Eng. Chem. <I>36,</I> 504 [1944]). Dieses Medium wird dann mit einer Mischung von 18 g 4 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion und 20 cm3 Propylenglykol versetzt und die erzielte Suspension während 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen, wie sie oben angegeben sind, gezüchtet. Die Gär- brühe wird filtriert und die Zellen und das Filtrat mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert.
Die vereinigten Extrakte werden mit 1/1o Volumen einer 2 o/oigen wässrigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat (3 bis 10 g pro Liter) getrocknet und eingedampft, wobei man eine Mischung von d 1,4-Pregnadien-17a,20ss,21- triol-3-on und 4 4-Pregnen-l lss,17a,21-triol-3,20-dion erhält. Eine jede dieser beiden Verbindungen wird wie folgt identifiziert.
Eine Lösung des Produktes in 47 cm3 Pyridin wird mit 29 cm3 Essigsäureanhydrid versetzt und das Gemisch zuerst während 22 Stunden bei Zimmer- temperatur und hierauf während einer Stunde bei 50 C stehengelassen.
Nach dem Entfernen des Lö sungsmittels wird der Rückstand in Chloroform ge löst und die Lösung zuerst mit -verdünnter Salzsäure, hierauf mit Natriumbicarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und eingedampft. Durch Umkristalli- sieren des Rückstandes aus Äther oder Aceton erhält man farblose Prismen vom Smp. 178-179 C. Das Produkt hat die nachstehenden Eigenschaften.
Es handelt sich um das [a120 : -h- 100 (c = 1,0%, CHCl3). UV-Spektrum A",ax: 243,5 mg (a = 15 900).
EMI0005.0083
IR-Spektrum
<tb> A,"ax: <SEP> 2,85 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 5,75 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 6,01 <SEP> <I>,u,</I>
<tb> <I>6,15,u, <SEP> 6,22 <SEP> ,u,</I> <SEP> 11,29 <SEP> <I>,u.</I>
EMI0005.0084
Analyse:
<tb> ber. <SEP> für <SEP> C25H340s: <SEP> C <SEP> = <SEP> 69,74, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,96,
<tb> gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 69,52, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,92.
Eine Lösung von 0,65 g dieser Acetylverbindung in 50 cm3 Methanol wird mit einer Lösung von 1,2 g Kaliumbicarbonat in 5 em3 Wasser versetzt und das Gemisch während einer Stunde unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird unter ver mindertem Druck eingeengt,
der Rückstand in Wasser gelöst und die Lösung mit Äther extrahiert. Die ätherische Lösung wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wird abdestilliert. Durch Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton und Äther erhält man 0,22 g farblose Prismen vom Smp. 194-195 C.
Das Pro dukt, welches das d 1.4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol- 3-on darstellt, besitzt die folgenden Eigenschaften: [a]20: + 33 (c = 1,019/o CHC13).
UV-Spektrum A",ax: 244,5<I>mg</I> (E <I>=</I> 14 200). IR-Spektrum A,"ax: 3,00,u, 6,00,u, 6,20,u, 6,25,u, 11,30,u.
EMI0005.0114
Analyse:
<tb> ber. <SEP> für <SEP> <B>C21H3004'</B> <SEP> C <SEP> = <SEP> 72,80, <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,73
<tb> gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 72,53, <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,43. Das Produkt lässt sich auch durch Vergleich mit einer authentischen Probe, welche nach einer andern Methode erhalten wird, identifizieren.
Die Mutterlauge aus dem obigen Produkt wird auf 100 g Magnesiumsilikat -mit einer Mischung von Benzol und Chloroform (Mischungsverhältnis 1:1) entwickelt und die kristalline Substanz, welche mittels des Chromatogramms abgetrennt wurde, aus einer Mischung von Methanol und Aceton umkristallisiert, wobei man farblose Körner vom Smp. 214-216 C erhält.
Das so erhaltene 21-Acetoxy-d 4-pregnen- 11ss,17a-diol-3,20-dion besitzt die folgenden Eigen schaften: IR Spektrum A",a1: 2,95,u, 3,05,u, 5,75,u, 5,85,u, 6,15,u.
EMI0006.0016
Analyse:
<tb> ber. <SEP> für <SEP> C.3H3206: <SEP> C <SEP> = <SEP> 68,29, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,97
<tb> gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 67,91, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,86. Das Produkt lässt sich auch durch Vergleich mit einer authentischen Probe, welche mit einer andern Methode erhalten worden ist, identifizieren.
Der Stamm Ps. boreopolis, welcher in diesem Beispiel verwendet worden ist, ist bei ATCC unter der Nummer ATCC 13 476 registriert.
<I>Beispiel 3</I> Das obige Medium 3 wird mit S. marsescens in Gegenwart von 44-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion kultiviert. Behandelt man die erzielte Brühe wie in Beispiel 2, so erhält man 150 mg d 1.4-Pregnadien- 17a,21-diol-3,20-dion.
Der Stamm S. marsescens, welcher in diesem Bei spiel verwendet wird, ist bei ATCC unter der Num mer ATCC 13 477 registriert.
<I>Beispiel 4</I> Das oben erwähnte Medium 9 wird mit den Zellenkörpern aus Ps. boreopolis und d4-Pregnen- 17,21-diol-3,20-dion versetzt und das Gemisch genau gleich wie in Beispiel 3 behandelt, wobei man eine Mischung von 41,4-Pregnadien-17a"21-diol-3,20-dion, 44-Pregnen-llss,17a,21-triol-3,20-dion und 41,4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-3-on erhält.
Diese Produkte werden durch Papierehromato- graphie identifiziert.
Der Stamm Ps. boreopolis, welcher in diesem Beispiel verwendet wird, ist der gleiche Stamm wie jener gemäss Beispiel 2. <I>Beispiel 5</I> Das Medium 3 wird mit S. plymuthica in Gegen wart von 44-Pregnen-llss,l7a,21-triol-3,20-dion ge züchtet. Wird dieses Kulturdemium in gleicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, so erhält man ,11,4_ Pregnadien-1 lss,17a,21-triol-3,20-dion.
Der Stanun S. plymuthica ist bei ATCC unter der Nummer ATCC 13 478 registriert.
<I>Beispiel 6</I> Das oben erwähnte Medium 4 wird mit Ps. oleo- vorans in Gegenwart von 44-Pregnen-17a,21-diol- 3,20-dion gezüchtet. Erfolgt die Behandlung in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man d1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion. Die Richtig keit der Bezeichnung dieses Produktes lässt sich durch einen Vergleich mit einer authentischen, nach einem andern Verfahren erhaltenen Probe feststellen. Der Stamm Ps. oleovorans, welcher in diesem Bei spiel verwendet wird, ist der gleiche Stamm wie jener von Beispiel 1.
<I>Beispiel 7</I> Ps. boreopolis, welches in einem Agarbouillon gezüchtet worden ist, wird mit einer Platinöse zur Impfung von 50 cm3 des Mediums 6 in einem 200-em3-Schüttelbehälter verwendet. Die Züchtung erfolgt unter Verwendung einer rotierenden Schüttel vorrichtung, wobei die Behandlung während 18 Stun den bei 28"C geschieht. Die so gezüchtete Samen kultur wird zur Impfung in 3 Liter des genannten Mediums 6 in einer Fermentierungsvorrichtung ver wendet, worauf man die Züchtung während 6 Stun den bei 28 C unter Lüftung (1,5 Liter pro Minute) und unter Rühren bei 250 Umdrehungen pro Mi nute durchführt.
Das Kulturmedium wird dann mit einer Lösung von 1,2 g d4-Pregnen-17a,21-diol-3,20- dion in 150 em3 Äthanol versetzt, worauf man die Züchtung während weiterer 3 Stunden unter den obigen Bedingungen weiterführt.
Nachdem man den pH-Wert mittels Schwefel säure auf 4,0 eingestellt hat, werden 50 cm3 der obigen Kultur 3mal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert, worauf man die vereinigten Extrakte mit 20 cm3 einer 1 0/eigen wässrigen Natriumcarbonat- lösung und hierauf mit 20 cm3 destilliertem Wasser wäscht. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird das Lösungsmittel unter vermin dertem Druck auf einem Wasserbade bei einer Tem peratur von 55 C eingeengt.
Mittels Papierchromato- graphie werden 850 mg 41,4-Pregnadien-17a,21-diol- 3,20-dion in der gesamten Kultur festgestellt. Dabei stellt man auch fest, dass keine anderen Produkte zugegen sind.
Der in diesem Beispiel verwendete Stamm von Ps. boreopolis ist der gleiche wie jener in Beispiel 2. <I>Beispiel 8</I> Ein Kulturmedium, in welchem Ps. boreopolis in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 gezüchtet wor den ist, versetzt man mit einer Lösung von 1,2 g 44-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 30 cm3 Äthanol. Dann wird unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 7 die Züchtung während weiterer 21-Stun- den durchgeführt.
In der Kulturflüssigkeit werden schliesslich 635 mg 41,4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol- 3-on festgestellt, während andere Produkte nicht vor handen sind.
Der in diesem Beispiel verwendete Stamm von Ps. boreopolis ist der gleiche wie in Beispiel 2. <I>Beispiel 9</I> Ein in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 ge züchtetes Kulturmedium von Ps. oleovorans wird mit einer Lösung von d4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 60 eins Äthanol versetzt. Der Züchtungsvorgang wird während weiterer 4 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 7 fortgeführt.
Genau gleich wie in Beispiel 7 kann man auf diese Weise die Anwesenheit von 660 mg d 1,4_ Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion und 204<B>mg</B> 41,4_ Pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion oder von <B>108</B> mg 41.4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-3-on fest stellen.
Der in diesem Beispiel verwendete Stamm von Ps. oleovorans ist der gleiche wie in Beispiel 1. <I>Beispiel 10</I> Eine Suspension einer Kulturflüssigkeit von Ps. oleovorans auf einem Agarbouillon in 10 eins sterilisiertem, destilliertem Wasser wird mit einer Platinöse entnommen und die Konzentration auf ein Zehntel verdünnt. Die verdünnte Suspension wird in Petrischalen mit Ultraviolettstrahlen während 1 bis 5 Minuten mit Hilfe einer 30 Watt-Lampe bei einer Distanz von 54 cm bestrahlt.
Diese Kultur wird dann auf einem Agarbouillon angeimpft, worauf man die auf dem Agar gewachsenen Kolonien erneut auf einem anderen Agarbouillon impft. Dann wird ein Teil dieses Kulturmediums in 500 cms des oben er wähnten Mediums 6 in einem 3-Liter-Kulturkolben angeimpft und während 18 Stunden unter Schütteln bei 28 C gezüchtet. Die so erhaltene Samenkultur wird in einem rostfreien 30-Liter-Stahlbehälter geimpft und die Inkubation während 5 Stunden bei 28 C durchgeführt.
Das Kulturmedium wird dann mit einer Lösung von 12 g 44-Pregnen-17a,21-diol- 3,20-dion in 750 cm3 Äthanol versetzt, worauf man eine weitere Inkubationszeit von 12 Stunden unter den gleichen Bedingungen anschliesst.
Mittels einer Papierchromatographie eines Extraktes, welcher durch Extrahieren der Brühe mittels Äthylacetat erhalten wird, stellt man 2,5 g 41,4-Pregnadien- 17a,21- diol - 3,20 - dion, 0,6 g d1,4-Pregnadien- 17a,20ss,21-triol-3-on und 3,8 g 41,4-Pregnadien- llss,17a-21-triol-3,20-dion in der Kulturbrühe fest.
Die gesamte Kulturbrühe wird dann in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, indem man sie bei einem pH-Wert von 4,0 mit Äthylacetat extra hiert. Hierauf wird die Äthylacetatlösung unter ver mindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 8,1 g kristallines Pulver erhält.
Nach dem Acety- lieren des rohen Pulvers mittels Pyridin und Essig säureanhydrid unterwirft man das erhaltene acety- lierte Material der Kolonnenchromatographie auf einem Magnesiumsilikat, wobei man die Kolonne mit einer Mischung von Äther und Aceton entwickelt und den Acetongehalt erhöht, um das Material in 3 Fraktionen abzutrennen.
Aus der ersten Fraktion erhält man 2,0 g 21-Acetoxy-41,4-pregnadien-17a-ol- 3,20-dion in Form von farblosen Nadeln, welche nach dem Umkristallisieren aus Aceton bei 215-2l8 C schmelzen. Aus der zweiten Fraktion erhält man 300 mg 20ss,21-Diacetoxy-d1,4-pregnadien-17a-ol- 3-on in Form von farblosen Prismen, welche nach dem Umkristallisieren aus Aceton bei 178-179 C schmelzen.
Aus der letzten Fraktion schliesslich ge winnt man 3,3 g farblose Körner vom Smp. 230 C, sofern das Produkt aus einer Mischung von Dioxan und Äthylacetat umkristallisiert worden ist. Dieses zuletzt genannte Produkt, welches 21-Acetoxy-d1,4_ pregnadien-llss,17a-diol-3,20-dion darstellt, besitzt die folgenden Eigenschaften:
[a] D : + 116 (c = 1,0 % Dioxan). UV-Spektrum @niaX- 243 mu (E = 15 300). IR-Spektrum
EMI0007.0075
d",0,y: <SEP> 2,993,075,745,82
<tb> 6,076,3011,29<I>,u.</I>
EMI0007.0076
Analyse: <SEP> C <SEP> = <SEP> 68,63 <SEP> %, <SEP> H <SEP> = <SEP> <B>7,511/9</B>
<tb> <B>C=68,370/9,</B> <SEP> H=7,38%.
Ein jedes der obigen 3 Produkte ist mittels entsprechender authentischer Probe identifiziert worden.
Der in diesem Beispiel verwendete Stamm von Ps. olevorans ist der gleiche wie in Beispiel 1.