-
Verfahren zur Einführung einer 11ß-ständigen Oxygruppe in Steroide
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die
11f-Stellung des Steroidkerns. Als besonders wertvolle Umsetzung, die mit Hilfe
des vorliegenden Verfahrens durchgeführt werden kann, ist die Umwandlung von Reichsteins
Verbindung S (17-Oxy-11-desoxycorticosteron) in Kendalls Verbindung F (17-Oxycorticosteron)
zu nennen.
-
Die Herstellung von biologisch wirksamen Steroiden, wie von Cortison
und Kendalls Verbindung F, ist mit großen Schwierigkeiten verbunden. Eines der schwierigsten
Probleme ist die Einführung von Sauerstoffatomen in die 11-Stellung des Steroidkerns.
Reichsteins Verbindung S ist über verschiedene bekannte Synthesen aus verschiedenen,
natürlich vorkommenden, verhältnismäßig billigen Steroiden, z. B. aus pflanzlichen
Steroiden, zugänglich. Kendalls Verbindung F ist dagegen wesentlich schwieriger
zu erhalten. Sie stellt eine sehr wertvolle Verbindung dar, insbesondere zur Behandlung
von rheumatischer Arthritis und anderen. bestimmten menschlichen Erkrankungen. Jedes
Verfahren, nach dem Reichsteins Verbindung S in guter Ausbeute und ohne zu hohen
Kostenaufwand in Kendalls Verbindung F umgewandelt werden kann, ist von außerordentlicher
Bedeutung für die pharmazeutische Industrie und ganz allgemein für die menschliche
Bevölkerung.
-
Es wurden bereits Verfahren zur Umwandlung von Reichsteins Verbindung
S in Kendalls Verbindung F beschrieben, wobei Organismen angewandt werden, die von
den erfindungsgemäß verwendeten Organismen völlig verschieden sind. In der USA.-Patentschrift
2 602 769 ist die Verwendung von Cunninghamella blaskesleena (Ordnung Mucorales)
beschrieben, und in einer Veröffentlichung in Journal of the American Chemical Society,
Bd. 74, 1952, S. 2381, ist ein Verfahren angegeben, daß Streptomyces fradia.e verwendet.
In der USA.-Patentschrift 2 658 023 ist die Verwendung der Gattung Curvularia, die
zur Ordnung Moniliales gehört, beschrieben.
-
Es wurden bisher tausende von Organismen untersucht, und es wurde
gezeigt, daß sie für die Umwandlung von Reichsteins Verbindung S in Kendalls Verbindung
F nicht brauchbar sind. Es wurde nun überraschend gefunden, daß die Umsetzung mit
Organismen der Gattung Rhodoseptoria, die zur Ordnung Sphaeropsidales gehören, erfolgreich
durchgeführt werden kann. Mit Mikroorganismen dieser Gattung erzielte man sehr gute
Ergebnisse bei der Einführung einer 11 f-ständigen Oxygruppe in Reichsteins Verbindung
S und in andere Steroide, die eine Methylengruppe in der 11-Stellung enthalten.
Dabei werden gute Ausbeuten erhalten, und die Produkte können leicht gereinigt werden.
Außerdem läßt sich der Organismus äußerst einfach züchten und kann leicht in technischem
Maßstabe angewandt werden. Die Leichtigkeit, mit welcher der Organismus auf sehr
wohlfeilen Medien wächst, ist besonders vorteilhaft.
-
Einer der angewandten Organismen stammt aus dem Quartermaster Coups.
Es wurde von diesem als eine Art der Gattung Rhodoseptoria (QM 704) identifiziert.
Eine lebende Kultur dieses Organismus wurde bei der American. Type Culture Collection
in Washington, D. C., hinterlegt; wo ihr die Nummer ATCC 11833 gegeben wurde.
-
Die für das erfindungsgemäße Verfahren anwendbaren Ausgangssteroide
können in der 17-Stellung eine Seitenkette; z. B. die der Verbindung S oder deren
Ester und Äther enthalten, ferner eine C O O H-, Alkyl-, Alkylen- oder Ketogruppe.
In der 3-Stellung kann eine freie, veresterte oder verätherte Hydroxylgruppe stehen.
Die als Substrate für die Reaktion verwendeten Steroide können auch Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen
in verschiedenen Stellungen des Kerns enthalten!, z. B. in der 3 (4) - oder 5 (6)-Stel-Jung.
Die Ausbeute an oxydiertem Produkt ist bis zu einem gewissen Grade von der Beschaffenheit
des als Ausgangsmaterial verwendeten Steroids, dem besonderen Stamm der verwendeten
Rhodoseptoria und den angewandten Reaktionsbedingungen (d. h. Temperatur, Zeit,
pH,' Nährmedium, Zeitpunkt der Zugabe der Verbindung zum Mikroorganismus usw.) abhängig.
Weiterhin kann ein gegebener oxydierend wirkender Mikroorganismus der bevorzugten
Gattung auf verschiedene Steroide verschieden starke Wirkung ausüben, d. h., die
Ausbeuten werden etwas schwanken. Zu den Verbindungen, die in die entsprechenden
11-Öxyverbitidungen umgewandelt wurden, gehören Reichsteims Verbindung S und Desoxycorticosteron.
Zur
Bewertung der nach diesen Verfahren hergestellten Produkte können verschiedene Methoden
herangezogen werden. Zum Beispiel kann, falls ein Steroid mit einer geeigneten Seitenkette
verwendet wurde, die Menge .des erzeugten Produkts durch Bestimmung der Wirkung
auf Mäuse, bei denen die Nebennierenrinde entfernt wurde, oder auf die Anzahl eosinophiler
Zellen von Versuchstieren ermittelt werden. Weiterhin können. die bei der Hydroxylierung
erhaltenen reinen Produkte, wie weiter unten beschrieben, isoliert werden.
-
Die Wirksamkeit eines für das erfindungsgemäße Verfahren ausgewählten
Mikroorganismus kann ermittelt werden, indem man den Organismus in rin-ein geeigneten
Nährmedium, das Kohlehydrate, Salze, organische Stickstoffquellen usw. enthält,
züchtet und dem gezüchteten Mikroorganismus das Steroid in festem Zustand oder in
einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Aceton oder Äthanol, gelöst unter sterilen
Bedingungen zusetzt und die Mischung rührt und beilüftet, um das Wachstum des Mikroorganismus
und Oxydation des Steroids zu bewirken. Das Steroid kann zugesetzt werden, nachdem
das Medium unter sterilen Bedingungen mit einer Kultur des Mikroorganismus geimpft
wurde, oder nachdem das Wachstum des Organismus eingesetzt hat. In manchen Fäll
len kann es ratsam sein, das Steroid zuzufügen, nachdem das Wachstum des Mikroorganismus
unter aeroben Bedingungen im Nährmedium eingesetzt hat, besonders dann, wenn während
des anfänglichen Wachstums des Mikroorganismus die Neigung vorhanden ist, aus dem
Steroidsubstrat unerwünschte Nebenprodukte zu erzeugen. An Stelle des feinen Alkohols
kann das Acetat oder ein anderer Ester eines Steroids verwendet werden, obgleich
dies manchmal zu einer merklichen Erniedrigung der Ausbeute an hydroxyliertem Produkt
führt. Man kann aber auch Enzympräparate aus der Züchtung eines geeigneten oxydierend
wirkenden Organismus der Gattung Rhodoseptoria zur Durchführung des Verfahrens verwenden.
Ein weiteres sehr brauchbares Verfahren ist folgendes: Der Mikroorganismus wird.
in Abwesenheit des Steroids auf einem geeigneten Nährmedium unter aeroben Bedingungen
gezüchtet. Die Mycelzüchtung kann dann von der Nährlösung abfiltriert und, falls
gewünscht, mit destilliertem Wasser gewaschen werden. Das Mycel wird dann in destilliertem
Wasser, in dem sich das Stero:id befindet, suspendiert. Das Rührender Mischung und
die Belüftung wird etwa 12 bis 48 Stunden fortgesetzt. Anschließend werdendieReaktionsproduktegewonnen.
Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß das S-teroid leicht gewonnen werden kann,
da weder die zur Erzielung des Wachstums des Mikroorganismus verwendeten Nährstoffe
noch die anfänglich. von dem wachsenden Organnsmus ausgeschiedenen Stoffe vor- ;
handen sind. Ferner können andere, dem Enzymchemiker vertraute Verfahren zur Durchführung
des vorliegenden Oxydationsprozesses angewandt werden. Die Menge am erhaltenen Produkten
und die Oxydationsgeschwindigkeit sowie die Beschaffenheit der gebildeten Nebenprodukte
können schwanken, je nachdem die gesamte Nährlösung oder das isolierte gewaschene
Mycel verwendet wird.
-
Im allgemeinen wird bei der Durchführung des Verfahrens eine Konzentration
von nicht mehr als 1 bis. 2 Gewichtsprozent des Gesamtgewichts an Substrat, z. B.
von Reichsteins Verbindung S, verwendet, obgleich sich zuweilen andere Konzentrationen
als günstiger erweisen können. Da die Löslichkeit des Ausgangsmaterials in Wasser
ziemlich begrenzt ist, kann ein Überschuß an Material langsam in das oxydierte Produkt
umgewandelt werden. Jedoch scheint der Verteilungszustand des dem oxydierenden System,
d. h. dem wachsenden Mikroorganismus oder dem Enzym zugesetzten Steroids die Ausbeute
oder die Beschaffenheit der Produkte unter sonst identischen Bedingungen nicht stark
zu beeinflussen. Falls das Steroid dem wäßrigen Gärsystem als Lösung in einem mit
Wasser mischbaren Lösungsmittel zugesetzt wird, wird das Steroid in Gegenwart eines
großen Wasserüberschusses gewöhnlich in feinverteilter Form ausgefällt. Dies scheint,
verglichen mit der Zugabe von trockenen, verhältnismäßig großen Kristallen des Steroids,
die Reaktionsgeschwindigkeit nicht wesentlich zu-erhöhen.
-
Nach Beendigung des Oxydationsprozesses kann das Produkt durch Extraktion
mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel in bekannter Weise
aus dem Gemisch gewonnen werden. Geeignete Lösungsmittel sind chlorierte niedere
Kohlenwasserstoffe, Ketone und Alkohole. Zu diesen gehören Chloroform, Methylenchlorid,
Trichloräthan, Äthylenchlorid usw. Die Anwendung von heißem Äthylendichlorid von
etwa 40 bis 80° ist für die Extraktion der Steroide besonders günstig. Der Extrakt
aus Produkt und nicht umgesetztem, Ausgangsmaterial kann bis auf ein kleines Volumen
oder bis zur Trockene eingeengt werden, um ein. festes Produkt zu erhalten. Die
Reinigung des Produktes kann auf verschiedene Weise erfolgen, Am günstigsten ist
die chromatographische Abtrennung des Produkts vom Ausgangsmaterial und anderen
Produkten, z. B. von während der Umsetzung gebildeten Verbindungen, die mehr Sauerstoff
enthalten. Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen »Silicagel«) oder andere
geeignete Adsorptionsmittel sind für diesen Zweck besonders geeignet. Es wurde gefunden,
daß ein Säule aus Silicagel und einem niederen Alkohol, insbesondere Äthanol, für
die Abtrennung des Ausgangssteroids besonders brauchbar ist. Die Steroidgemische
können auf die Adsorptionsmittelsäulen, z. B. »Silicagel«-Säulen, in konzentrierter
Chloroform- oder Methylenchloridlösung aufgebracht werden. Die Säule kann dann mit
weiteren Mengen des Lösungsmittels gewaschen werden, um Verunreinigungen, wie Fette
und Pigmente, zu entfernen. Das adsorbierte Gemisch wird dann durch allmähliche
Zugabe einer Mischung aus dem Lösungsmittel und einem kleinen Prozentsatz, z. B.
1 bis 59/o, an niederem Alkohol (Methanol, Äthanol u:sw.) getrennt. Die verschiedenen
Stoffe können getrennt und die getrennten Verbindungen mit einer Mischung von Lösungsmitteln
allmählich zunehmender Polarität aus der Säule eluiert werden; z. B. ist eine Mischung
aus Methylenchlorid und einer geringeren allmählich zunehmenden Menge Äthanol sehr
geeignet.
-
Fraktionen des aus den, chromatographischen Säulen eluierten Materials
können auf die Beschaffenheit des Produktes geprüft werden, indem man kleine Mengen
der Lösungen papierchromatographisch untersucht. Methoden, die zur Durchführung
dieser Trennungsart und Analyse besonders geeignet sind, sind eingehend in der USA.-Patentschrift
2 602 769 und in einer Veröffentlichung von S h u 11 und Mitarbeiter in »Archives
of Biochemistrym«, Bd.37, 1952, S.186, beschrieben. Diese Methoden sind auch für
die Bewertung neuer Stämme von Mikroorganismen. sehr nützlich, um ihre Verwendbarkeit
für das erfindungsgemäße Verfahren zu ermitteln. Dabei züchtet man den zu untersuchenden
Mikroorganismus in kleinem
Maßstabe mit einem Steroid, z. B. mit
Reichsteins Verbindung S oder einem geeigneten Derivat dieser Verbindung, konzentriert
den gesamten Extrakt des Gärgemisches und untersucht das Konzentrat auf papierch,romatographischem
Wege. Verwendet man zum Vergleich Proben von Reichst-eins Verbindung S, Kendalls
Verbindung F und anderer verwandter Verbindungen, so kann man ermitteln, ob der
gewählte Mikroorganismus für das vorliegende Verfahren wirtschaftlich zweckmäßig
ist.
-
Absteigende Papierchromatogramme (aufs Papier, das mit einer 35%igen
Lösung von Propylenglykol behanrdelt wurde), die mit einem Gemisch aus 78 Volumr
teilen Toluol und 22 Volumteilen Dioxan entwickelt wurden, können für die schnelle
Bewertung verschiedener bevorzugter Stämme von Mikroorganismen verwendet werden.
Solch eine Trennung kann in nur 3 Stunden durchgeführt werden, und das Papierchromatogramm
kann nach dem Trocknen mit ultraviolettem Licht in einem Fluoreszenzabtaster, wie
dem von Haines und Drake (Federation Proceedings, 1950, Bd. 9, S. 180), untersucht
werden, um die Lage der verschiedenen Verbindungen, wie die von Reichs-teins Verbindung
S und Kendalls Verbindung F, mittels ihrer Fluoreszenz zu bestimmen. Die Zonen,
in denen sich die verschiedenen Substanzen befinden, können auf dem Papierblatt
oder Streifen markiert und ausgeschnitten werden. Die .entsprechenden Verbindungen
können dann mit einem Lösungsmittel, wie Äthanol, eluiert und durch Verdampfen als
praktisch reine feste Stoffe erhalten werden. Auf diese Weise kann ein solches Gemisch
quantitativ analysiert werden. Die Menge der isolierten Produkte kann z. B. durch
Messen der Ultraviolettabsorption von Lösungen dieser Stoffe bestimmt werden. Besonders
nützlich sind die Absorptionscharakteristika dieser Verbindungen, wenn diese in
konzentrierter Schwefelsäure gelöst werden.
-
Nach der Trennung der Reaktionsprodukte durch Säulenchromatographie,
können die gewünschten Fraktionen vereint und auf ein kleines Volumen eingeengt
werden. Das Produkt kann dann aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äthylacetat,
auskristallisiert werden. Corticosteron, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurde, wurde mit einer Standardprobe verglichen und erwies sich mit
diesem identisch.
-
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beis,pielI Eine Kultur eines Organismus, aus der Kulturensammlung des Quartermaster
in Philadelphia, die von diesem als Rhodoseptoria sp. 0M 704 bezeichnet wurde, wurde
auf einem Agarnährmedium gezüchtet. Der Organismus wurde von dem schrägen Agarnährmedium
unter sterilen Bedingungen in ein steriles Medium folgender Zusammensetzung gespült:
| Malzextrakt ...................... 0,5 % |
| Cerelose .......................... 3,5 0/0 |
| Natriumnitrat .................... 0,2 % |
| Kaliumchlorid .................... 0,050/0 |
| Bittersalz ........................ 0,05% |
| Eisenvitriol ...................... 0,05°/o |
| sekundäres Kaliumphosphat ....... 0,1 0/0 |
| destilliertes Wasser, mit Kalium- |
| hydroxyd auf PH = 7 eingestellt |
Jeweils 100 cms dieses Mediums wurden in mehrere 300-cms-Kolben gegeben. Jedem Kolben
wurden 50 mg Reichsteins Verbindung S, gelöst in einem kleinen Volumen Aceton, zugesetzt.
Währenddessen wurde das Gärgemisch unter sterilen Bedingungen gehalten. Das Gemisch
wurde dann 7 Tage bis etwa 28° geschüttelt. Die Kolbeninhalte wurden vereinigt und
mehrere Male mit jeweils dem halben Volumen der wäßrigen Phase Dichloräthylen extrahiert.
Die vereinigten Dichloräthylenextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und nach Entfernung des Trocknuugsmittels das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt.
Die Lösung wurde auf 1 bis 2 cms eingeengt und eine Probe dieser Lösung papierchromatographisch
untersucht, wobei man ein Lösungsmittelsystem aus Propylenglykol und Toluol verwendete.
Durch papierchromatographischen Vergleich mit einer Probe der authentischen Verbindung
F von Kendall wurde gezeigt, daß das Produkt Kendalls Verbindung F enthielt. Es
ergaben sich auch Anzeichen dafür, daß stärker sauerstoffhaltige Produkte erhalten
wurden.
-
Das Dichloräthylenkonzentrat wurde auf eine chromatographische Säule
aus »Silicagel« und einem kleinen Volumen Äthanol aufgebracht (1 cms Lösungsmittel
je g »Silicagel«). Die Säule wurde mit Hilfe eines Gemisches aus 97 Volumteilen
Methylenchlorid und 3 Volumteilen 95%i,gem Äthanol entwickelt. Die aus der Säule
fließende Flüssigkeit wurde in kleinen Fraktionen gleichen Volumens gesammelt und:
diese von Zeit zu Zeit papierchromatographisch untersucht, um die Fraktionen, die
das gewünschte Produkt enthalten, abzutrennen. Alle diese Fraktionen wurden vereinigt
und im Vakuum zur Trockene eingedampft, um das feste Produkt zu erhalten. Durch
Vergleich mit einer bekannten Probe desselben Materialis wurde nachgewiesen, daß
das Produkt Kendalls Verbindung F ist. Beispiel II Eine Kultur von Rhodoseptoria
sp. QM 704 wurde in. Kolben gezüchtet, die ein wäßriges Medium aus 30 g Sojamehl
und 1,43 g primärem Kaliumphosphat pro Liter enthielten. 100 cms dieses Impfmaterials
wurden unter sterilen Bedingungen zu 21 eines Mediums derselben Zusammensetzung
gegeben. Das geimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 27 bis 28° mit einer Geschwindigkeit
von ungefähr 1/2 bis 1 Volumen Luft pro Volumen Lösung pro Minute belüftet. Während
dieser Zeit wurde das Gemisch mit einer Geschwindigkeit von etwa 1700 Umdrehungen
pro Minute gerührt. 1/2 g Reichsteins Verbindung S in Form des Alkohols wurde in
20 cms 951%igem Äthanol gelöst. Die Lösung wurde unter sterilen Bedingungen dem
Gärgemisch zugesetzt. Die Umsetzung wurde dann weitere 24 Stunden unter denselben
Bedingungen, wie oben beschrieben, fortgesetzt.
-
Das gesamte Reaktionsgemisch wurde aus dem Gärgefäß entfernt und zweimal
bei 70° mit dem gleichen Volumen Dichloräthylen ertrahiert. Die Extrakte wurden
vereinigt und zur Trockene eingedampft. Die trockene Substanz wurde in einem kleinen
Volumen Methylenchlorid gelöst und die Lösung auf eine »Silicagel«-Säule aufgebracht.
Die »Silicagel«-Säule war zuvor durch Behandlung jedes Grammes »Silicagel« mit 1
ems 95%igem Äthanol, Suspendierung dieses Gemisches in Methylenchlorid und Einbringen
in eine chromatographische Säule hergestellt worden. Nachdem das Steroidgemisch
auf die Säule gebracht worden war, wurde es mehrere Male mit Methylenchlorid gewaschen,
um Fette und Pigmente zu entfernen. Die Säule wurde dann durch Zugabe eines Gemisches
aus 97 Volumteilen Methylenchlorid und
3 Volumteilen Äthanol entwickelt.
Das Eluat wurde in kleine Fraktionen aufgeteilt. Proben dieser Fraktionen wurden,
wie oben beschrieben, papierchromatographisch_analysiert und die Fraktionen, die
dieselbe Verbindung enthielten, vereinigt. Der erste, die Säule verlassende Stoff
war zurückgewonnene Verbindung S. Diese kann erneut verwendet werden. Der zweite,
die Säule verlassende Stoff war ein nicht identifiziertes Steroi.d. Der dritte,
die Säule verlassende Stoff wurde gewonnen und erwies sich als Kendalls Verbindung
F. Durch Entfernung des Lösungsmittels aus den vereinten, Kendalls Verbindung F
enthaltenden Fraktionen wurde ein trockenes Produkt erhalten, das leicht weiter
gereinigt werden kann. Beispiel III Eine Kultur Rhodos.eptoria sp. QM 704 wurde
im Beispiel II und auf demselben Medium unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Das
Mycel aus 21 eines solchen Gemisches,, das: nach 22stündigem Wachstum erhalten wurde,
wurde abfiltriert, mit einem kleinen Volumen destilliertem Wasser gewaschen und
dann in 21 destilliertem Wasser suspendiert. Dem Gemisch wurde 1/2 g Reichsteins
Verbindung S zugefügt, das Gemisch gerührt und 16 Stunden mit einer Geschwindigkeit
von -1/2 Volumen Luft pro Volumen Gemisch pro Minute belüftet. Dasi Gemisch wurde
dann dreimal mit 1/2 Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinten Chloroformextrakte
wurden auf ein kleines Volumen eingeengt und das Gemisch von Steroiden durch Säulenchromatographie
über »Silicagel« gereinigt. Es wurde gute Ausbeute an reiner Verbindung F von Kendall
erhalten. Außerdem wurde noch etwas Reichsteins Verbindung S, die als Ausgangsmaterial
benutzt worden war, in reiner Form zurückgewonnen. Beispiel IV Eine Kultur Rhodoseptoria
sp. QM 704 wurde, wie im Beispiel II beschrieben, gezüchtet, mit der Abweichung,
daß an Stelle von Reichsteins Verbindung S Desoxycorticosteron verwendet wurde.
Nach beendigter Gärung wurde- das Rohprodukt mit Chloroform extrahiert und das Lösungsmittel
unter Vakuumentfernt. Der Rückstand wurde auf seine Wirkung auf die Leber-Glykogen-Speicherung
bei Mäusen, bei denen die NTebennierenrindeentfernt worden war, untersucht, und
das positive Ergebnis zeigte, daß eine 11 ß-ständige Hydroxylgruppe in das Steroidmolekül
eingeführt worden war. Die Reinigung durch Säulenchromatographie, wie oben beschrieben,
.ergab eine Verbindung, die sich auf Grund ihrer physikalischen Konstanten als,
Corticosteron erwies. Beispiel V Das Verfahren des Beispiels II wurde wiederholt,
mit der Abweichung, daß als Ausgangssteroid 17 a-Oxyprogesteron verwendet wurde.
Das gewonnene Produkt erwies sich auf Grund seiner physikalischen Konstanten als;
11 ß, 17 a-Dioxyprogesteron.