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Verfahren zur 11-Hydroxylierung von Steroidverbindungen Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die 11-Stellung
des Steroidkems, und zwar entweder in der a- oder ß-Konflguration auf biochemischem
Wege. Besonders vorteilhaft erweist sich nach dem vorliegenden Verfahren die Umwandlung
der Verbindung S (Reichsteins Substanz S
oder 11-Desoxy-17-a-oxy-corticosteron)
und der Ester der Verbindung S in die Verbindung F (Kendalls Verbindung oder
17-a-Oxy-corticosteron) und in die Verbindung epi-F (17-a-Oxy-epi-corticosteron).
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Die Herstellung von biologisch wirksamen Steroidverbindungen, wie
Cortison, Ilß,17a-Dioxyprogesteron, Verbindung F und Verbindung epi-F, begegnet
zahl--reichen großen Schwierigkeiten. Eines der schwierigsten Probleme ist die Einführung
von Sauerstoffatomen in gewisse spezifische Stellungen im Steroidkern, insbesondere
in die 11-Stellung. Die Verbindung S läßt sich nach bekannten Syntheseverfahren
aus verschiedenen in der Natur vorkommenden, relativ billigen Steroidausgangsmaterialien,
wie z. B. pflanzlichen Steroidverbindungen, gewinnen. Andererseits läßt sich die
Verbindung F, die sehr wertvoll ist, nur unter wesentlich größeren Schwierigkeiten
herstellen. Sie ist besonders geeignet für die Behandlung von rheumatischer Arthritis
und gewissen anderen Krankheitszuständen des menschlichen Körpers. Daher ist ein
Verfahren, nach welchem die Verbindung S in guter Ausbeute und ohne übermäßig
hohe Kosten in die Verbindung F umgewandelt werden kann, für die Heilkunde von außerordentlich
hoher Bedeutung. Darüber hinaus ist die Verbindung epi-F als Zwischenprodukt bei
organischen Synthesen, insbesondere bei der Herstellung von Cortison brauchbar.
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Es wurde nun gefunden, daß überraschenderweise die erwähnte Umsetzung
mit Erfolg durch die Verwendung von Organismen der Gattung Stachylidium durchgeführt
werden kann, die der Ordnung Moniliales angehört. Noch überraschender ist die Tatsache,
daß gleichzeitig eine Ila-Hydroxylierung erzielt wird, also ein einfaches Verfahren
zur Herstellung der Verbindung epi-F zur Verfügung steht. So wurden mit Mikroorganismen
dieser Gattung sehr gute Ergebnisse hinsichtlich der Einführung sowohl einer Ila-
als auch einer Ilfl-ständigen Hydroxylgruppe in die Verbindung S oder in
andere Steroidmoleküle erzielt, die eine Methylengruppe in der 11-Stellung und eine
a-ständige Hydroxylgruppe in der 17-Stellung des Kerns enthalten, wie z. B. Ester
der Verbindung S und 17a-Oxyprogesteron. Die Umsetzungen wurden in guter
Ausbeute durchgeführt, die Produkte lassen sich leicht isolieren und auf einfache
Weise reinigen. Weiterhin läßt sich der Organismus auf sehr einfache .Weise kultivieren
und kann leicht in großem Maßstab in industriellen Verfahren hergestellt werden.
Die Leichtigkeit, mit der der Organismus auf sehr billigen Medien wächst, ist ein
besonderer Vorteil. Aus diesem Grunde wird die Herstellung in großem Maßstab von
Substanzen, wie der Verbindung F und der Verbindung epi-F, auf biochemischem Wege
möglich.
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Die Organismen, um die es sich handelt, sind die oxydierenden Stämme
der Gattung Stachylidium, besonders geeignet sind die Stämme der Art Stachylidium
theobromae. Einer der verwendeten Organismen wurde von dem Imperial Institute of
Mycology in Kew, England, bezogen (isoliert unter der Kodenummer 1464-233 M), während
ein anderer vom Cehtraal Bureau voor Schimmel Culture in Baarn, Niederlande, beschafft
wurde (isoliert unter der Kodenummer 1464-287 B).
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Auch andere Mikroorganisinen der Gattung Stachylidium können zur Durchführung
des erfindungsgemäßei# Verfahrens gewählt werden. Viele dieser Organismen sind in
öffentlichen Kultursammlungen erhältlich, andere können als in der Natur vorkommend,
z. B. aus dem Erdboden nach Standardverfahren, isoliert werden. Insbesondere kann
auch ein Orgar#ismus der Art Stachylidium bicolor verwendet werden, um an der
11 fl-Stelluni von Verbindungen vom Kortikalsteroidtyp eine Oxydation durchzuführen.
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Die Ausgangssteroide können in der 17-Stellung des Kerns verschiedenartige
Seitenketten enthalten, z. B. die der Verbindung S oder die der Ester und
Äther dieser Verbindung. In der 3-Stellung kann eine Ketogruppe oder Hydroxylgruppe
anwesend sein, oder die Verbindung kann an dieser Stelle veräthert oder verestert
sein. Die als Substrate für die Umsetzung verwendeten Steroide verbindungen können
ferner an verschiedenen Stellen des Kerns, z. B. in den 3,4-.oder 5,6-Stellungen
Doppelbindungen zwischen 2 Kohlenstoffatomen besitzen.
Die Ausbeute
an oxydiertem Produkt hängt in gewissem \laße von der Natur der als Ausgangsmaterial
verwenleten Steroidverbindung, dem verwendeten speziellen 3tanlin von Stachylidium
und den angewendeten Reakbionsbedingungen (z. B. Temperatur, Zeit, p11-Wert, Nährmedium,
Zeitpunkt, an dem die Verbindung dem Hilcroorganismus zugesetzt wird, usw.) ab.
Ferner kann ,in gegebener oxydierender Mikroorganismus seiner Wirkung nach auf die
verschiedenen Steroidverbindungen verschieden sein, d. h., die Ausbeute wird
sich jeweils indern. Die Gegenwart einer Hydroxylgruppe in der 21-Stellung von Verbindungen
des Kortikalsteroidtyps begünstigt die Hydroxylierung in der 11-Stellung. Die besten
Ausbeuten wurden übrigens bei Steroiden erzielt, die 21 Kohlenstoffatome besitzen.
Für die Isolierung und Identifizierung der nach diesen Verfahren erhaltenen Produkte
können verschiedene bekannte Verfahren angewendet werden.
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Die Züchtung des Mikroorganismus erfolgt vorzugsweise in einem wäßrigen
Nähnnedium bei einer Temperatur von etwa 24 bis 30' C bei submersen Bedingungen
unter Rühren und Belüftung. Zu den Nährinedien, die für diese Zwecke brauchbar sind,
gehören Kohlehydrate, wie z. B. Zucker und Stärke, Maismehl, als Quelle organischen
Stickstoffs, Sojabohnenmehl, Erdnußmebl, Weizengluten, Baumwollsamenmehl, Laktalbumin,
enzymatisches Kaseinhydrolysat und durch Trypsinhydrolyse erhaltene Peptone. Als
Quelle einer Wachstumssubstanz kommen in Frage lösliche Destillationsrückstände,
Hefeextrakt, bei der Molassegärung entstehende Rückstände, Mineralsalze, wie z.
B. Natriumchlorid, Natriumnitrat, Kahumphosphat, Magnesiumsulfat, und Spurenmineralien,
wie z. B. Kupfer, Zink und Eisen, können ebenfalls mit vorteilhaften Ergebnissen
verwendet werden. Falls während der Gärung eine übermäßige Schaumbildung auftritt,
können dem Gärungsmedium Antischaummittel, wie z. B. Pflanzenöle, zugesetzt werden.
Es wurde die interessante Tatsache beobachtet, daß der p11-Wert bei der Gärung dazu
neigt, ziemlich konstant zu bleiben und im Bereich zwischen 6 und
7 liegt, Falls jedoch Veränderungen auftreten, kann ein Puffermittel, wie
z. B. Calziumcarbonat, dem Nährinedium zugesetzt werden.
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Die Impfung für die 11-Hydroxylierung von Kortikalsteroiden durch
das Stachylidium-Wachstum kann dadurch bewirkt werden, daß man Schrägnährböden verwendet,
die auf Medien, wie z. B. Kartoffeldextroseagar oder Rindslaktose, angelegt wurden.
Das Wachstum kann zum Impfen von geschüttelten Kolben oder Impftanks für submerses
Wachstum verwendet werden, oder aber die Impftanks können aus den geschüttelten
Kolben geimpft werden. Das Wachstum des Mikroorganismus erreicht sein Maximum gewöhnlich
in etwa 2 oder 3 Tagen. Abweichungen in den verwendeten Anlagen, der Reaktionsgeschwindigkeit,
der Rührgeschwindigkeit usw. können jedoch die Geschwindigkeit beeinträchtigen,
mit der die maximale Aktivität erreicht wird. Im allgemeinen schreitet die Gärung
fort, bis ein wesentliches Wachstum erreicht ist. Hierfür ist ein Zeitraum von etwa
24 Stunden bis zu 4 Tagen für die meisten Zwecke ausreichend. Die Belüftung des
Mediums in den für submerses Wachstum vorgesehenen Tanks wird mit einer Geschwindigkeit
von etwa 1/2 bis 2 Volumen freie Luft pro Volumen Gärflüssigkeit pro Minute aufrechterhalten.
Das Rühren kann durch Rührwerke eines geeigneten Typs erfolgen. Aseptische Bedingungen
müssen während der Übertragung des Inoculums und während der gesamten Wachstumsperiode
des Mikroorganismus aufrechterhalten werden.
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Die Steroidverbindung wird als fester Stoff oder gelöst in einem geeigneten
Lösungsmittel, wie z. B. Aceton-oder Äthanol, dem kultivierten Mikroorganismus unter
sterflen Bedingungen zugesetzt und das Gemisch gerührt und belüftet. Das Steroid
kann zugesetzt werden, nachdem das Medium unter sterilen Bedingungen mit einer Kultur
des Mikroorganismus geimpft ist oder nachdem das Wachstum des Organismus eingetreten
ist. In einigen Fällen kann es sich als zweckmäßig erweisen, wenn man die Steroidverbindung
zusetzt, nachdem das Wachstum des Mikroorganismus in dem Nährmedium unter aeroben
Bedingungen erfolgt ist. Dies ist besonders dann der Fall, falls eine Neigung zur
Bildung unerwünschter Nebenprodukte aus dem Steroidsubstrat während der anfänglichen
Stadien des Wachstums des Mikroorganismus besteht. Das Acetat oder ein anderer Ester
eines Steroids kann an Stelle des Alkohols selbst verwendet werden; dies führt jedoch
manchmal zu einer etwas verringerten Ausbeute an hydroxyliertem Produkt.
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Ein anderes sehr nützliches Verfahren besteht darin, daß man den Mikroorganismus
auf einem geeigneten Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Abwesenheit eines Steroids
züchtet. Das Myzelwachstum kann dann aus der Gärungslösung abfiltriert und mit destilliertem
Wasser gewaschen werden. Das Myzel wird darauf in einer wäßrigen Lösung des Steroidsubstrats
suspendiert. Das Rühren und die Belüftung werden etwa 12 bis 48 Stunden fortgesetzt,
danach werden die Reaktionsprodukte isoliert. Dieses Verfahren hat den Vorteil einer
leichten Gewinnung der Steroidverbindung, da die verschiedenen ursprünglich zur
Förderung des Mikroorganismuswachstums verwendeten Nährmaterialien abwesend sind,
und das gleiche ist hinsichtlich der verschiedenen Materialien der Fall, die von
den wachsenden Organismen während der Anfangsperiode ausgeschieden werden.
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Für die Durchführung des vorliegenden Oxydationsverfahrens können
auch andere Verfahren zur Anwendung kommen, die Chemikern auf dem Gebiet der Enzyme
geläufig sind. Die Oxydationsgeschwindigkeit und demzufolge die Menge der gebildeten
Produkte sowie die Natur der Nebenprodukte können in Abhängigkeit davon verschieden
sein, ob die ganze Gärungslösung oder nur das isolierte gewaschene Myzel verwendet
wird.
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Man kann aber auch Enzympräparate aus dem Wachstum eines geeigneten
oxydierenden Organismus der Gattung Stachylidium für die Durchführung des Verfahrens
verwenden. Diese können nach zahlreichen Verfahren aus den Zellen der ausgewählten
Organismen hergestellt werden. Es können mehrere verschiedene Verfahren verwendet
werden, um diese oxydierenden Enzyme aus den Zellen freizusetzen. Hierzu gehört
Mahlen, insbesondere mit Schleifmitteln, wie Glaspulver oder Sand, das dazu dient,
die Zellwände zu zerstören und die wesentlichen Materialien freizusetzen. Bei einem
zweiten Verfahren wird Autolyse angewendet. Die Zellen werden aus dein Medium entfernt,
in dem diese gezüchtet wurden. Sie werden dann gewaschen und in Wasser suspendiert.
Das Wasser wird mit einer dünnen Toluolschicht überzogen, um eine Verunreinigung
zu verhindern und das Gemisch bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa
50' C abgestellt. Die Zellen zerfallen innerhalb von 1 bis
5 Tagen, und der Zellenrückstand kann beispielsweise durch ein Seitz-Filter
oder durch ein Bakterienfilter aus gesintertem Glas abfiltriert werden.
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Ein drittes Verfahren zur Herstellung von zellfreien Aufbauprodukten
von Stachylidium besteht in dem wiederholten raschen Gefrieren und Tauen des Zellenmaterials.
Ein weiteres Verfahren besteht in der Anwendung von Ultraschallenergie zur Zerstörung
der Zellen. Ein anderes Verfahren zur Erreichung des gleichen Zwecks ist die Verwendung
eines wassermischbaren Lösungsmittels,
insbesondere die Verwendung
von Aceton. Wenn die Zellen in ein derartiges Lösungsmittel gebracht werden, werden
sie zerstört, und man erhält einen Extrakt der gewünschten Enzyme..
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Die Stachylidium-Enzyme können zur Oxydation der 17a-Oxysteroidverbindungen
in Medien verwendet werden, die denen ähnlich sind, die für die wachsenden Zellen
verwendet werden, d. h. einem Medium, das einen Wasserstoffakzeptor, wie
z. B. Fumarat, einen Puffer und in einigen Fällen ein zweiwertiges Metall, insbesondere
Magnesium, sowie eine kleinere Menge Adenosintriphosphat enthält. Die zellfreien
oxydierenden Enzyme von Stachylidium können in den vorstehend angegebenen Medien
bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40' C verwendet werden. Im allgemeinen wird
die Oxydation der Steroidverbindung innerhalb weniger Stunden bis zu mehreren Tagen
herbeigeführt. Die optimale Zeit und Temperatur sowie die anderen Bedingungen können
auf einfache Weise durch wenige Versuche festgestellt werden. Eingehende Beschreibungen
geeigneter Medien für die Verwendung isolierter und erneut suspendierter Zellen
sowie für die Verwendung zellfreier Stoffwechselprodukte sind in den Lehrbüchern,
»Manometric Technique in Tissue Metabolism« von W. W. Ombreit und Mitarbeitern,
Burgess Publishing Company, Minneapolis (1949), und »Respiratory Enzymes« von H.
Lardy, Burgess Publishing Company, Minneapolis. (1949), enthalten.
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Im allgemeinen wird für das erfindungsgemäße Verfahren eine Konzentration
von 1 bis 2 Gewichtsprozent Substrat (z. B. ein Material vom Typ der
Verbindung S),
bezogen auf das Gesamtgewicht, bevorzugt, manchmal können sich
jedoch andere Konzentrationen als günstiger erweisen. In Anbetracht der begrenzten
Löslichkeit des Ausgangsmaterials in Wasser kann ein Überschuß des Materials
langsam in das oxydierte Produkt umgewandelt werden. Die Teilchengröße des Steroids
bei der Zugabe zum oxydierenden System, d. h. zu einem kultivierten Mikroorganismus
oder einem Enzymsystem, scheint unter sonst gleichen Bedingungen die Ausbeute oder
die Natur der gebildeten Produkte nicht wesentlich zu beeinflussen. Falls dem wäßrigen
Gärsystem eine Lösung der Steroidverbindung in einem mit Wasser misclibaren Lösungsmittel
zugesetzt wird, fällt das Steroid bei Anwesenheit eines großen Wasserüberschusses
im allgemeinen in feinzerteilter Form aus. Die Umsetzungsgeschwindigkeit wird hier
gegenüber einem Verfahren, bei dem trockene, relativ große Kristalle des Steroids
zugesetzt werden, nicht wesentlich verbessert.
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Nach Beendigung des mikrobiologischen Oxydationsverfahrens kann das
Produkt aus dem Gärmedium durch Extraktion mit einem geeigneten, mit Wasser nicht
mischbaren Lösungsmittel gewonnen werden. Geeignet sind chlorierte niedere Kohlenwasserstoffe,
Ketone und Alkohole, wie Methylelichlorid, Trichloräthan, Äthylendichlorid und insbesondere,
Chloroform. Der das Produkt und nicht umgesetztes Ausgangsmaterial enthaltende Extrakt
kann dann im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt oder zur Trockne eingedampft
werden. Die Reinigung kann nach mehreren Verfahren erfolgen, vorteilhaft unter Verwendung
von z. B. Kieselerdegel.
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Die bei der Oxydation erhaltenen Steroidgemische können dabei in Form
konzentrierter Chloroform- oder Methylenchloridlösungen auf Adsorptionssäulen aus
vorzugsweise mit einem niederen Alkohol behandeltem Kieselerdegel aufgebracht werden.
Entwickelt wird mit einem chlorierten niederen Kohlenwasserstoff, der etwas, z.
B. 1 bis 5 Volumprozent eines niederen Alkohols (Methanol, Äthanol
usw.) enthält. Dann wäscht man mit einer Mischung von Lösungsmitteln mit allmählich
steigender Polarität aus, z. B- mit Methylenchlorid, das steigende Mengen Äthanol
enthält.
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Die ausgewaschenen Fraktionen können dann papierchromatographisch
untersucht werden (vgl. die USA.-Patentschrift 2 602 769 und die Veröffentlichung
von Shull und Mitarbeitern in Archives of Biochernistry, Bd. 37, 1952, S. 186)-
Auf diese Weisc können auch neue Mikroorganismenstämme auf ihre Brauchbarkeit für
das erfindungsgemäße Verfahren untersucht werden. Man führt die Gärung erst in kleinem
Maßstab aus und unterwirft dann den gesamten Extrakt des Gärgemisches einer papierchromatographischen
Analyse, aus der sich ergibt, ob der ausgewählte Mikroorganismus für das Verfahren
geeignet ist. Chromatographisches Papier, das mit einer 350[,igen Lösung von Propylenglykol
behandelt wurde und nach dem Auftragen des Gäre-xtraktes mit einer Mischung von
79 Volumteilen Toluol und 22 Volumteilen Dioxan entwickelt wird, eignet sich
besonders gut für-die rasche Beurteilung von Mikroorganismenstämmen. Eine Trennung
dieser Art kann in 3 Stunden beendet sein.
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Nach der Trennung der Reaktionsprodukte- durch Säulenchromatographie
können die gewünschten Eluatfraktionen vereinigt und auf ein kleines Volumen eingeengt
werden. Das Produkt kann dann kristallisiert und die erhaltenen Kristalle durch
Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Äthylacetat, weiter
gerenugt werden.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen
Verfahrens: Beispiel
1
Eine Kultur eines Organismus, der von der Kulturensammlung
des Imperial Institute of Mycology in Kew, England, bezogen und dort als Stachylidium
theobromae bezeichnet worden war (isoliert unter Kodenummer 1464-233 M), wurde auf
einem Kartoffel-Dextrose-Agar Nährmedium bei
28' C gezüchtet. Eine lebende
Kultur dieses Organismus wurde bei der American Type Culture Collection in Washington
D. C. deponiert, in der sie mit der laufenden Nummer ATCC 12 474 versehen
wurde. Eine Schrägnährbodenkultur dieses Stammes wurde in mehrere
300 cem
fassende Erlenmeyer-Kolben gebracht, die
100 ccm eines sterilen Mediums der
folgenden Zusammensetzung enthielten:
| Glucose ................... 1,0 Gewichtsprozent |
| Lactose ................... 2,0 11 |
| Maisquellwasser ............ 6,0 |
| Calciumcarbonat ........... 0,55 |
| Natriumsulfat ............. 0,1 |
| Maismehl ................. 1,2 |
| Sojabohnenöl .............. 0,25 |
| Destilliertes Wasser, mit Ka- |
| liumhydroxyd auf einen |
| pn-Wert von 6,5 eingestellt. |
Nachdem die vorstehende Mischung
5 Tage bei
28' C
geschüttelt worden
war, wurden
10 mg Reichsteins Substanz
S trocken in
j eden
der Kolben gegeben. Während dieser Vorgänge wurde das Gärungsgemisch unter sterilen
Bedingungen gehalten. Das Gemisch wurde dann etwa 48 Stunden bei einer Temperatur
von
28' C geschüttelt. Die Inhalte der Kolben wurden dann gründlich mit mehreren
Mengen Chloroform extrahiert, wobei jedesmal die Hälfte der wäßrigen Phase verwendet
wurde. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und das Lösungsmittel, nachdem das Trockenmittel abfiltriert worden war,
unter Vakuum verdampft, bis ein Lösungsvolumen von etwa
1 bis 2 ccm erhalten
wurde. Eine Probe dieser Lösung
wurde dann der Papierchromatographie
unterworfen, wobei ein Propylenglykol und Toluol enthaltendes Lösungsmittelgemisch
verwendet wurde. Durcli Überprüfung des Papierehromatogranuns unter ultraviolettem
Licht unter Verwendung einer authentischen Probe der Verbindung F als Kontrolle,
wurde festgestellt, daß das Produkt die Verbindung F enthielt; Anzeichen für die
Gegenwart der Verbindung epi-F sowie höher oxydierter Produkte ergaben sich gleichfalls.
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Das Chloroforinkonzentrat wurde dann auf eine ehromatographische Kolonne
gegeben, die aus Kieselerdegel bestand, welches mit einem kleinen Volumen Äthanol
vermischt war (1 ccm Äthanol pro Gramm Kieselerdegel). Die Kolonne wurde
mit einer Mischung aus 98 Volumen Äthylenchlorid und 2 Volumen Äthanol entwickelt.
Das aus der Kolonne abfließende Produkt wurde in kleinen Fraktionen gleichen Volumens
aufgefangen und die letzteren periodisch mittels Papierchromatographie unter-.5ucht,
um die das gewünschte Produkt enthaltendengetrennten Fraktionen zu identifizieren.
Alle gewünschten Fraktionen (chromatographisch identisch) wurden vereinigt und die
erhaltene Lösung im Vakuum unter Gewinnung des festen Produktes eingedampft. Durch
Vergleich mit einer bekannten Probe des gleichen Materials wurde es als Verbindung
F identifiziert. B eispiel 2 Eine Kultur S. theobromae (isoliert unter der
Kodenummer 1464-233 M) wurde in mehreren Kolben gezüchtet, die 100 ccm eines
aus Soj abohnenmehl (3,3 0/,)
und monomeres Kaliumphosphat (1,140/,) bestehenden
Mediums enthielten. Nach 48stündigem Schütteln bei 28' C wurde dieses Inoculum
unter sterilen Bedingungen und unter Rühren in ein Gefäß gegeben, das 21 eines Mediums
mit der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 enthielt. Das geimpfte
Medium wurde mit einer- Geschwindigkeit von etwa 1/, bis 1 Volumen Luft pro
Volumen Lösung pro Minute 23 Stunden belüftet. Während dieser Zeit wurde
das Gemisch mit einer Geschwindigkeit von etwa 1700 Umdrehungen pro Minute
gerührt, während das diese Mischung enthaltende Gefäß in ein Bad gesetzt wurde,
das eine konstante Temperatur von 28' C hatte. Mengen von jeweils
500 ccm dieser Gärungslösung wurden mit destilliertem Wasser auf ein Volumen
von 2 1 verdünnt, und 500 mg der Verbindung S
wurden trocken
unter sterilen Bedingungen dem Gärungsgemisch zugesetzt. Die Umsetzung wurde dann
weitere 16 Stunden unter genau den gleichen wie vorstehend beschriebenen
Bedingungen fortgesetzt.
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Das gesamte Reaktionsgemisch wurde aus dem Gärungsgefäß entfernt und
zweimal mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden dann
vereinigt und zur Trockne eingedampft. Die auf diese Weise erhaltenen trockenen
Stoffe wurden in einem kleinen Volumen Äthylenchlorid gelöst und diese Lösung auf
eine Kolonne aus Kieselerdegel gegeben. Die Kieselerdegelkolonne war zuvor durch
Behandlung jedes Gramms Kieselerdegel mit Iccm Äthan.ol hergestellt worden. Diese
Mischung wurde dann in Athylenchlorid suspendiert und auf eine chromatographische
Kolonne gegossen. Anschließend wurde eine Waschung mit Äthylenchlorid durchgeführt.
Nachdem das Steroidgemisch in die Kolonne eingeführt worden war, wurde es wiederum
mit mehreren Mengen Äthylenchlorid gewaschen, um Fette und Pigmente zu entfernen.
Die Kolonne wurde dann durch Verwendung einer Mischung von 98 Volumen Äthylenchlorid
und 2 Volumen Äthanol entwickelt. Das Eluat wurde in eine Reihe von kleinen Fraktionen
getrennt. Teile dieser Fraktionen wurden mit Hilfe des vorstehend beschriebenen
papierchroniatographischen Systems analysiert und die die gleiche Verbindung enthaltenden
Fraktionen vereinigt.
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Es wurde gefunden, daß das erste die Kolonne verlassende Material
aus der Verbindung
S bestand; sie kann wiederverwendet werden. Das zweite,
die Kolonne verlassende Material bestand aus einem nicht identifizierten Steroid.
Das dritte, die Kolonne verlassende Material wurde gewonnen. Es war, wie sich zeigte,
chromatographisch mit der Verbindung F identisch. Durch Entfernung des Lösungsmittels
aus den vereinigten, die Verbindung F enthaltenden Fraktionen wurde ein trockenes
Produkt erhalten, welches nach dreimaligem Umkristallisieren aus Äthylacetat bei
201'C schmolz; [a]2D5=
+ 163'
(c =
1; CHCI,); Ein". =
15911. Sein Infrarotabsorptionsspektrum und sein Schwefelsäurechromogen waren
mit den Werten einer reinen Probe der Verbindung F identisch. Die quantitative Chromatographie
zeigte, daß-52
0/, der Verbindung
S in die Verbindung F umgewandelt
worden waren. Darüber hinaus wurden 24
0/, einer stärker polaren Verbindung
erhalten. Die weitere Chromatographie dieser zweiten Verbindung in verschiedenen
Systemen und im Vergleich zu verschiedenen Kontrollproben zeigte, daß es sich um
die Verbindung epi-F handelte. Beispiel
3
Eine Kultur eines bei dem Nagao
Institute, Tokio, Japan, erhältlichen Organismus (isoliert unter der Kodeminimer
1464-272A) wurde in Kolben unter aeroben Bedingungen auf dem im Beispiel
1 beschriebenen Medium gezüchtet. Es wurde festgestellt, daß dieser Organismus
zur Art Stachylidium bicolor gehört. Eine lebende Kultur dieses Organismus wurde
bei der American Type Culture Collection in Washington D.C. deponiert, wo sie der
permanenten Sammlung von Mikroorganismen unter der laufenden Nummer ATCC.
12672 einverleibt wurde. Nach 24stündigem Wachstum wurden
100 ccm
dieses Gemischs verwendet, um 21 des im Beispie12 beschriebenen Mediums zu impfen.
Nachdem das aus 21 bestehende Gemisch unter aeroben Bedingungen 24 Stunden lang
gewachsen -war, wurden dem Gärungsgemisch
0,5g der Verbindung
S unter
sterilen Bedingungen zugesetzt und das Gemisch während eines Zeitraums von 48 Stunden
bei etwa 28'C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann aus dem Gefäß, in dem die
Gärung durchgeführt worden war, entfernt und dreimal jeweils mit
1/, Volumen
Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und im Vakuum auf ein kleineres
Volumen konzentriert. Die Mischung wurde dann in eine Kolonne aus Kieselerdegel
gegeben, die früher beschrieben wurde. Die Kieselerdegelkolonne -wurde mit Methylenchlorid
gewaschen und dann mit einer Lösung von Äthanol in Methylenchlorid entwickelt. Das
llß-oxydierte Produkt, die VerbindungF sowie eine kleinere Menge der als Ausgangsmaterial
verwendeten Verbindung
S. wurden aus der Kolonne gewonnen. Das isolierte
Produkt -wurde gereinigt, und sein Schmelzpunkt und andere physikalischen Eigenschaften
wurden mit denen einer authentischen Probe reinen synthetischen Materials verglichen.
Es zeigte sich, daß beide Materialien identisch waren. Weiter wurde die auf diese
Weise erhaltene Verbindung F auf ihre Wirkung durch den bei Mäusen durchgeführten
Glykogenvorratstest bei Tieren -untersucht, die adrenalektomisiert worden waren.
Sie erwies sich als hochgradig wirksam, wodurch die Natur des Produktes weiter bestätigt
wurde. Beispiel 4 Eine Kultur des Organismus Stachylidium theobromae wurde auf einem
zuvor hergestellten Nährboden auf die
im Beispiel 2 beschriebene
Weise gezüchtet und der Nährboden einem Gefäß zugesetzt, das ein Medium mit der
folgenden Zusammensetzung enthielt:
| Sojabohnenmehl ............ 2,0 Gewichtsprozent |
| Maismehl .................. 1,0 |
| Ferrosulfatheptahydrat ...... 0,00025 |
| Magnesiumsulfatheptahydrat . 0,00125 |
| Destilliertes Wasser, mit Ka- |
| liumhydroxyd auf den pa- |
| Wert 6,8 eingestellt. |
Nachdem auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise ein Wachstum erzielt worden war,
wurden
500 ccm dieser Gärungslösung mit destilliertem Wasser auf 2
1 verdünnt und
500 mg der Verbindung
S unter sterilen Bedingungen
und unter Rühren zugesetzt. Die Umsetzung wurde weitere
16 Stunden fortgesetzt.
Das Gemisch wurde dann jeweils mit einem halben Volumen Chloroform dreimal extrahiert
und die vereinigten Chloroformextrakte im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert.
Das Gemisch der Steroide wurde dann durch Kolonnenchromatographie auf Kieselerdegel
auf übliche Weise gereinigt; Analysen der Fraktionen ergaben eine 680/,ige Ausbeute
an Verbindung F sowie eine
15 O/Oige Ausbeute an der Verbindung epi-F, bezogen
auf die verwendete Menge der Verbindung F. Beispiel
5
Eine Kultur des Organismus
S. theobromae wurde auf einem zuvor hergestellten Nährboden gezüchtet und
eine
5 0/,ige Suspension dieses Materials zu 94,62
1 des Mediums nach
Beispiel 2 zugesetzt. Nach dem Züchten und Verdünnen gemäß dem im Beispiel 4 beschriebenen
Verfahren wurden
25 g der Verbindung
S zu 94,62
1 der Gärungslösung
zugegeben. Die auf die übliche Weise ,durchgeführte Analyse der Reaktionsteilnehmer
ergab eine
32 0/,ige Ausbeute an Verbindung F und eine
60/, ige Ausbeute
an Verbindung epi-F.
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Beispiel 6
Eine Kultur eines Organismus, der aus der Kultursammlung
des Centraal Bureau voor Schimmel Culture in Baarn, Niederlande, stammte, und dort
als S. theobromae bezeichnet worden war (isoliert unter der Kodenummer 1464--287
B) wurde nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren verwendet. Es wurde gefunden,
daß 390/, der zugesetzten Verbindung S in die -Verbindung F und
31 % in die Verbindung epi-F umgewandelt wurden.
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Beispiel 7
Eine Kultur des Organismus S. theobromae,
wurde auf die im vorstehenden Beispie12 beschriebene Weise mit der Abweichung gezüchtet,
daß 17a-Oxyprogesteron an Stelle der Verbindung S verwendet wurde. Nach der
Beendigung des Gärvorganges wurde das Rohprodukt mittels Chloroform extrahiert,
und das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt. Das zurückbleibende Produkt
wurde auf die vorstehend beschriebene Weise durch Kolonnenchromatographie gereinigt,
und man erhielt ein Produkt, welches an Hand der Papierchromatographie und anderer
physikalischer Konstanten als Ilß,17a-Dioxyprogesteron identi&iert wurde. Beispiel
8
Das Verfahren des Beispiels2 wurde mit der Ab-
weichung wiederholt,
daß das Acetat der Verbindung S
als Ausgangssteroid verwendet wurde. Das gewonnene
Produkt wurde an Hand seiner physikalischen Konstanten als Verbindung F identifiziert.
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Auf die gleiche Weise wurde die Verbindung F ebenfalls erhalten, als
man das Propionat, das Butyrat, das Benzoat und den Thiophen-2-carbonsäureester
der Verbindung S als Ausgangsmaterialien in getrennten Umsetzungen verwendete.