DE1695598B2 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von 9-(beta-d-arabinofuranosyl)adenin - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)-adenin.

Das Verfahren zur Herstellung von 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)-adenin ist dadurch gekennzeichnet, daß man den Streptomyces antibioticus NRRL 3238 aerob bei etwa 20 bis 45° C in einem Nährmedium einer Oberflächen- oder Submerskultur und dann die hierbei gebildete Adeninverbindung 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)-adenin aus der Kulturlösung gewinnt.

Nach beendeter Züchtung kann das 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin aus dem Medium durch die weiter unten beschriebenen Maßnahmen isoliert und gegebenenfalls weitergereinigt werden.

Die Verbindung 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)-adenin

ist aus der Literatur bereits bekannt (vgl. z. B.

J. American Chem. Soc. 82, 1960, S. 2648 bis 2649 und J. Org. Chemistry 27,1962, S. 3274 bis 3278, bes.

S. 3277, linke Spalte).

Ein Hinweis auf das erfindungsgemäße biologische Herstellungsverfahren läßt sich der Fachliteratur jedoch nicht entnehmen.

Der für Zwecke der Erfindung brauchbare Stamm ίο von Streptomyces antibioticus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in der Nähe von Bosco Trecase, Provinz Neapel, Campania, Italien gesammelt worden war. Kulturen dieses Organismus wurden deponiert bei dem »United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division«, Peoria, Illinois und werden als »NRRL3238« in permanenter Kulturkollektion gehalten.

Der Organismus ist ein an der Luft Sporen bildendes

Glied der Ordnung Actinomycetales und gehört zur Art Streptomyces, wie sie in der siebten Ausgabe von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1957) beschrieben sind.

Seine makroskopischen Kultureigenschaften auf zahlreichen Medien, nach welchen die Glieder dieser Art identifiziert werden können, gehen aus Tabelle I hervor.

Tabelle I

Makroskopische Kulturcharakteristika des 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)-adenin produzierenden Stammes Streptomyces antibioticus NRRL 3238

	Luftmycel	Farbe	Umkehrung des	löslicher	andere	28°C
Kulturmedium	grau-gelblich	Substratmycels	Farbstoff	Merkmale	gutes Wachstum
	braun	bräunlich-grau	mittelbraun	rötlich bei Zugabe	37°C
Hefeextrakt-	grau-gelblich			von NaOH*)	gutes Wachstum
Malzextrakt-Agar	braun	hell- bis mittel-	grau- bis stark	rötlich bei Zugabe	45°C
Haferflocken-Agar	hell- bis grau	olivbraun	gelblich-braun	von NaOH*)	gutes Wachstum
	gelblich-braun	hellolivgrau bis	hell- bis mittel	rötlich bei Zugabe	5O0C
Anorganische Salze-		mäßig gelblich	gelblich-braun	von NaOH*)	gutes Wachstum
Stärke-Agar	grau-gelblich	braun
	braun	grau-gelblich	grau- bis stark	rötlich bei Zugabe
Glycerin-Asparagin-	hell- bis grau		gelblich-braun	von NaOH*)
Agar	gelblich-braun	hell bräunlich	kein Pigment	—
Stärke-Agar B		grau bis licht
		grau-gelblich-
	—	braun
		—	—	Nitrat nicht zu
Organisches Nitrat	—			Nitrat reduziert
(Brühe)			dunkelbraun	starke
Gelatine	—			Verflüssigung
	—	—	dunkelbraun	starke Hydrolyse
Milch		—	dunkelbraun	—
Brühe aus Trypton-	—
Hefeextrakt		—	schwarz	—
Pepton-Hefeextrakt-	—
Eisen-Agar	—	—	dunkelbraun	—
Tyrosin-Agar
Hefeextrakt-
Malzextrakt-Agar

*) Farbe des löslichen Pigments.

Wenn der Organismus auf gewissen Agarmedien kultiviert wird, ist das Luftmycel gewöhnlich hell- bis grau-gelblich-braun. Die Züchtung in diesen Agarmedien führt zur Bildung eines gelblich-braunen bis mittelbraunen löslichen Pigments, das rötlich wird, wenn die Medien mit Natriumhydroxyd behandelt werden. In Medien mit einem Gehalt an komplexen Stickstoffquellen wird ein dunkelbraunes oder schwarzes lösliches Pigment gebildet.

Die Sporenkstten sind gerade bis gewunden, ge- ίο Iegentlich weisen sie Schlingen oder lose Spiralen auf. Mit dem Altern werden die Ketten immer stärker gewunden und unregelmäßiger. Die Snoren sind weich und elliptisch oder kugelförmig;ihre Größe schwankt zwischen 0,7 bis 1,2 · 0,9 bis 1,7 μ.

In Versuchen zur Kohlenstoffausnutzung wurde mit den folgenden einzelnen Kohlenstoffquellen ein ziemlich gutes bis gutes Wachstum beobachtet: Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, i-Inosit, D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose. Ein schlechtes bis ziemlich gutei Wachstum wurde beobachtet mit Raffinose, ein schlechtes oder gar kein Wachstum mit Saccharose und Zellulose.

In seiner Mikromorphologie, der Farbe des Luftmycels und der Melaninproduktion entspricht der Organismus der Art Streptomyces antibioticus und ist daher als Glied dieser Art anzusehen. Bei vergleichenden Studien im Laboratorium ähnelt der Streptomyces antibioticus NRRL 3238 dem S. antibioticus IMRU 335. In gewisser Hinsicht unterscheidet er sich jedoch ausgesprochen von dem Stamm IMRU 3435, wie aus Tabelle II hervorgeht; er ist daher als ein neuer Stamm von S. antibioticus anzusehen.

Tabelle II

Vergleich des 9-(_/S-D-Arabinofuranosyl)-adenin produzierenden Stammes Streptomyces antibioticus NRRL 3238 mit S. antibioticus IMRU 3435

Charakteristik

S. antibioticus
NRRL 3238

S. antibioticus
IMRU 3435

Farbe des Luftmycels*) [ hell- bis grau-gelblich-braun

Mikromorphologie des Luftmycels

Lösliches Pigment
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar . Haferflocken-Agar

Agar mit anorganischen Salzen und Stärke Glycerin-Asparagin-Agar

Einwirkung von NaOH auf lösliches Pigment in obigen Medien

Tyrosin-Agar

Kohlenstoffverwertung

Saccharose

Xylose

i-lnositol

L-Rhamnose

Raffinose

Reduktion von Nitrat zu Nitrit

Gelatineverfiüssigung

Milchhydrolyse

Wachstum auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar bei

45 und bei 50⁰C

gelegentlich
Schlingen und Spiralen

mittelbraun
graustichig

bis stark gelblich-braun
leicht bis mittelgelblich-braun

graustichig bis
stark gelblich-braun

Pigment wird rötlich
dunkelbraun

schlecht

gut

ziemlich gut
ziemlich gut

schlecht bis ziemlich gut

negativ

stark

stark

positiv

mittelgrau bis hell bräunlich

grau

keine Schlingen oder
Spiralen zu beobachten

graugelb
graugelb

Pigment unverändert

ziemlich gut
gut
gut

positiv
schwach
schwach

negativ

*) Tabelle I, erste fünf Medien.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können zum Beimpfen Sporen oder Conidien der betreffenden Kultur von Streptomyces antibioticus NRRL 3238 verwendet werden, die vorzugsweise als wäßrige Suspension mit einem Gehalt von etwas Seife oder einem anderen Netzmittel vorliegen. Für Fermentationen im größeren Maßstab verwendet man fio zweckniäßigerweise frisch angesetzte, belüftete und gerührte Brühekulturen von lebenskräftigen Mikroorganismen.

Für das Verfahren eignen sich wäßrige Nährmedien, in denen assimilierbarer Kohlenstoff und Stickstoff vorhanden ist und deren pH-Wert vorzugsweise zwischen 6 und 8 liegt. Ausreichende Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff sind unter anderem reine Kohlenhydrate, die durch den Organismus verwerte werden können, ebenso wie handelsübliche Kohlen hydratgemische. Beispiele hierfür sind unter anderen verschiedene Zuckerarten, wie Glucose, Maltose Lactose und Mannose sowie Stärke, die gegebenenfall: modifiziert sein kann; auch Maissyrup, Malzextrakt Portweinmelasse, Glycerin und Maisschrot sind ge eignete Kohlenstoffquellen. Die Anteilsmenge ai Kohlenhydrat im Nährmedium liegt zweckmäßiger weise zwischen etwa 0,5 und 5% des Mediumgewichts es können jedoch auch Konzentrationen benutzt wer den, die etwas außerhalb dieses Bereiches liegen.

Die Stickstoffquellen im Nährmedium können voi organischer, anorganischer oder gemischt organisch anorganischer Natur sein. Einige Beispiele für di

5 * 6

vielen stickstoffhaltigen Substanzen, die für das Nähr- tation üblich sind, verwendet werden. Stationäre medium in Betracht kommen, sind Aminosäuren, Kübelfermentatoren mit Einrichtungen zum Uuren-Peptone, hydrolysierte und nicht hydrolysierte Pro- arbeiten und Belüften sind zur Großproduktion beteine, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, sonders gut geeignet. Kleinere Mengen an Produkt Baumwollsamenmehl, Weizenkleber, Maismaische, 5 oder Kulturen des Organismus, die fur grobtechnische Fleischextrakt, anorganische Nitrate, Harnstoff und Fermentationen als Impfstoff dienen sollen, können Ammoniumsalze. Da die am leichtesten verfügbaren durch Submerskultur in kleinen Flaschen oder Kolben, Stickstoffquellen meist im Rohzustand vorliegen, die durch mechanische Einrichtungen geschüttelt oder lassen sich für die dem Nährmedium jeweils zuzu- gerührt werden, gewonnen werden,
fügende Menge, die vom Reinheitsgrad abhängt, keine io Bei der Submerskultur im technischen Maßstab genauen Angaben machen. Es kann jedoch gesagt kann das Durcharbeitendes Kulturgemisches zwecks werden, daß für praktische Zwecke die Menge an Belüftung auf verschiedene an sich bekannte Weise stickstoffhaltigen Stoffen nicht mehr als 6 Gewichts- erreicht werden, beispielsweise mit Hilfe von Turbinen, prozent des gesamten Fermentationsmediums zu be- Paddeln, Schrauben oder anderen mechanischen Ruhrtragen braucht und daß sie auch wesentlich geringer 15 einrichtungen oder mit Hilfe von Pumpeinnchtungen sein kann. oder auch, indem man Luft oder Sauerstoff durch d;i:

Wenn man besonders gute Ausbeuten an Medium hindurch leitet, z. B. über einseitig offene oder 9-(;S-D-Arabinofuranosyl)-adenin erhalten will, ist die perforierte Röhrchen oder über Röhren mit einen·. Anwesenheit einer gewissen Menge Mineralsalze sowie porösen Diffusionsabschnitt. Man kann den gleichen von wachstumsfördernden Faktoren unbekannter Zu- 20 Effekt auch erreichen durch Versprühen oder Versammensetzung in Spuren wünschenswert. Manche gut spritzen des Mediums in einer sauerstoffhaltigen Atmozugänglichen Naturprodukte, wie Maismaische, Hefe- Sphäre.

Zubereitungen, Sojabohnengrütze, Rückstände aus der Bei der Oberflächenkultur, die eine Alternative zu

Melassefermentation u. dgl, enthalten bereits an- der Submerskultur darstellt, wird eine flache Schicht organische Salze und wachstumsfördernde Faktoren, 25 von gewöhnlich weniger als 2 cm Dicke eines sterilen, weshalb zweckmäßigerweise das Fermentationsmedium wäßrigen Nährmediums mit dem 9-(p-r>-Arabinosolche Rohprodukte enthalten soll. Um sicherzustellen, furanosyl)-adenin produzierenden Stamm geimpft und daß in dem Medium entsprechende Mineralstoffe vor- unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis 45⁰C behänden sind, ist es gegebenenfalls vorteilhaft, an·· brütet.

organische Salze, wie Natriumchlorid, Natriumbi- 30 Das erfindungsgemäß erzeugte 9-(/?-D-Arabinocarbonat, Kaliumphosphat, Natriumacetat, Calcium- furanosyl)-adenin kann auf verschiedene Weise aus carbonat oder Magnesiumsulfat zuzusetzen; auch der Kulturlösung gewonnen werden. Aus Submers-Spuren von Metallen wie Kupfer, Kobalt, Mangan, kulturen gewinnt man das Produkt am besten wie Zink und Eisen haben oft günstige Wirkungen. Die folgt: Das Mycel wird durch Filtrieren oder Zentrifubevorzugte Konzentration liegt für ein gegebenes 35 gieren abgetrennt, der Filterkuchen gut mit Wasser Mineralsalz zwischen 0,1 und 1% des Gewichtes des durchgewaschen und die mit den Waschwässern ver-Nährmediums. einigte abfiltrierte Brühe unter vermindertem Druck

Neben der Möglichkeit, den Organismus in Ober- auf etwa ^l/_lt des ursprünglichen Volumens eingeengt. fiächenkultur zu vermehren, besteht die Durchfüh- Die konzentrierte Lösung wird längere Zeit (einige rungsform des Verfahrens zur Herstellung von 40 Stunden bis mehrere Tage, je nach Volumen) auf etwa 9-(/}-D-Arabinofuranosyl)-adenin im größeren Maß- 5°C gehalten, worauf man den sich ausscheidenden stab in der Fermentation des 9-(/9-n-ArabinofuranosyI)- Feststoff unter Zusatz von Diatomenerde abfiltriert, adenin produzierenden Stammes in Submerskultur. Der Filterkuchen wird dann gut mit siedendem Man beimpft hierzu ein steriles wäßriges Nährmedium Wasser ausgezogen und die vereinigten Extrakte auf mit der betreffenden Kultur und hält es unter Rühren 45 etwa 5°C gekühlt bis sich kein Niederschlag mehr ab- und Belüftung und unter aseptischen Bedingungen bei scheidet. Das ausgeschiedene kristalline9-(/3-D-Arabinoeiner Temperatur von etwa 20 bis 45 ' C, vorzugsweise furanosyl)-adenin wird abgefiltert und mehrmals aus bei 33 bis 4O⁰C, bis sich in der Kulturflüssigkeit eine siedendem Wasser umkristallisiert.
wesentliche Menge 9-(/?-D-ArabinofuranosyI)-adenin Das Produkt aus der Submerskultur kann auch mit

angesammelt hat. Die zur Erzielung einer maximalen 50 Hilfe der folgenden Adsorptionstechnik isoliert wer-Ausbeute notwendige Zeit ist unterschiedlich, je nach den: Wenn die Fermentation durchgeführt ist, wird der betreffenden Kultur sowie der Größe und dem das Mycel wie oben durch Filtrieren (oder auch Zentri-Typus der verwendeten Einrichtung, der Rühr- und fugieren) abgetrennt und das Rohprodukt aus der fil-Belüftungsgeschwindigkeit und anderen Faktoren. Bei trierten Brühe adsorbiert, indem man diese mit Aktiv-Fermentationen im technischen Maßstab in Fermenta- 55 kohle oder anderen absorbierenden Mitteln behandelt, toren vom Tanktypus erreicht man eine maximale Man kann dabei entweder in einzelnen Chargen arbei-Produktion innerhalb etwa 3 bis 7 Tagen. Kürzere ten oder die Brühe kontinuierlich durch eine Adsorp-Fermentationsperioden sind zwar möglich, führen je- tionskolonne schicken. Gemäß der bevorzugten chardoch gewöhnlich zu schlechteren Ausbeuten. genweisen Methode fügt man 0,1 bis 0,6, vorzugsweise

Bei der Submerskultur tritt der Mikroorganismus in 60 0,35 bis 0,40% (Gewicht/Volumen) des bevorzugten Form von diskreten Teilchen auf, die gleichmäßig im Holzkohlen-Adsorptionsmittels zu der filtrierten Brühe Nährmedium verteilt sind, im Gegensatz zu der prak- hinzu und rührt das Gemisch 1 bis 3 Stunden lang tisch kontinuierlichen Haut, die sich bei Züchtung an durch. Sollen Verunreinigungen aus der filtrierten der Oberfläche auf dem Medium bildet. Auf Grund Brühe entfernt werden ehe man sie der Holzkohlendieser Verteilung des Organismus innerhalb des ganzen 65 behandlung unterwirft, so kann man sie entweder mit Mediums können große Volumina des beimpften einem nicht damit mischbaren organischen Lösungs-Nährmediums zur Vermehrung des Organismus in mittel (z. B. Äthylendichlorid oder Essigester) Tanks und anderen Behältern, wie sie bei der Fennen- extrahierten oder mit einem synthetischen Kat-

ionenaustauscherharz in Natriumform vorbehan- 7,5 eingestellt und die Gefäße werden sterilisiert durch

dein. 90 Minuten langes Erhitzen auf 121°C. Nach dem

Das Rohprodukt wird in diesem Fall isoliert durch Kühlen wird das Medium in den Fermentiergefäßen

Eluieren des Holzkohlenadsorbers mit wäßrigem geimpft mit 80 ml der oben beschriebenen Fermenta-

Aceton oder einem verdünnten Alkohol und Evapo- 5 tionsmischung und 96 Stunden bei 25 bis 27°C be-

rieren des Eluats unter- reduziertem Druck. Der feste brütet, wobei mit 200 Umdr./Min. gerührt und Luft

Rückstand wird dann entweder durch mehrfaches mit einer Geschwindigkeit von 16 1 je Minute hin-

Umkristallisieren aus Wasser oder einem niedrigen durchgeleitet wird. In jedes Fermentiergefäß werden

Alkohol oder wie folgt gereinigt: der Rückstand wird während der Brütungszeit noch 170 g der oben be-

mit einem mit Wasser nicht mischbaren flüssigen io schriebenen Antischaummischung in Portionen hinzu-

Alkanol, wie n-Butylalkohol extrahiert, und der Ex- gegeben.

trakt auf eine Tonerdesäule (pH-Wert 5 bis 6) ge- Die Fermentationsgemische aus den vier Gefäßen

gössen. Die Tonerdesäule wird mit 95%igem wäßri- werden kombiniert und mit Hilfe von Diatomeenerde

gern Äthanol eluiert, das Eluat eingedampft und der filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck

feste Rückstand aus Wasser oder Alkohol umkristalli- 15 auf ein Volumen von 10 1 konzentriert und das Kon-

sicrt, so daß man das gewünschte 9-Q9-D-Arabino- zentrat mit 200 g aktivierter Kohle behandelt, bei

furanosyl)-adenin erhält. Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und dann filtriert.

Das Produkt aus dem erfindungsgemäßen Verfahren, Der Holzkohlenkuchen wird mit 7,5 1 Wasser gedas 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)-adenin, ist verwendungs- waschen und dreimal mit je 101 eines 50%igen Wasserfähig als virenfeindliches Mittel, das sowohl in vitro ao Acetongemisches extrahiert. Die drei Wasser-Acetonals auch in vivo aktiv ist gegen Herpes- sowie gegen extrakte werden kombiniert, unter vermindertem Vaccinia-Viren. Druck auf etwa 11 konzentriert und 48 Stunden bei

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher 5°C gekühlt. Das ausfallende 9-(/J-D-Arabinofurano-

erläutert. syl)-adenin wird isoliert und durch mehrfaches Um-

35 kristallisieren aus siedendem Methanol und siedendem

Beispiel 1 Wasser gereinigt; Schmelzpunkt 262 bis 263°C.

Erhöht man bei dem oben beschriebenen Verfahren

Es werden sterile Agarschalen bereitet, wozu das die Inkubationstemperatur in den beiden Fermenta-

Streptomyces-Sporenmedium nach H ickey und tionsstufen von 25 bis 27 auf 36 bis 38°C, so erhält

T1 e s η e r (R. J. Hickey und H. D. T r e s η e r, 30 man das gleiche Produkt, 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)-

J. Bact., VoI. 64, S. 891/892 [1952]) verwendet wurde. adenin, in höherer Ausbeute.
Vier solche Schalen werden mit lyophilisierten Sporen
von Streptomyces antibioticus NRRL 3238 geimpft,

bei 28°C 7Tage oder bis das Wachstum der Luft- Beispiel 2
sporen genügend fortgeschritten ist bebrütet und dann 35

bei 5°C aufbewahrt. Die Sporen aus den vier Schalen Es wird ein Nährmedium der folgenden Zusammenwerden in 40 ml einer 0,l%igen sterilen Lösung von stellung vorbereitet:
Natriumheptadecylsulfat suspendiert.

Es wird ein Nährmedium der folgenden Zusammen- Glukosemonohydrat 2,0%

Setzung vorbereitet" 40 Sojabohnenmehl, extrahiert mit Lösungsmittel, 44% Protein 1,0%

Glukosemonohydrat 2,0% Tierisches Pepton 0,5%

Sojabohnenmehl, extrahiert mit Lö- Ammoniumcnlorid 0,2%

sungsmittel, 44% Protein 1,0% Natriumchlorid 0,5%

Tierisches Pepton 0,5 % 45 Calciumcarbonat 0,25 %

Ammoniumchlorid 0,2% Wasser auf 100%

Natriumchlorid 0,5 %

Calciumcarbonat 0,25 % Der pH-Wert des Mediums wird mit 10n-Natron-

Wasser auf 100% lauge auf 7,5 eingestellt.

50 381 dieses Mediums werden in einen 144-1-Fermen-

Der pH-Wert des Mediums wird mit lOn-Natrium- tator aus rostfreiem Stahl eingebracht. Das Medium

hydroxydlösung auf 7,5 eingestellt. wird sterilisiert, indem man es 60 Minuten bei 121° C

121 dieses Mediums werden in einen 30-1-Fermen- hält, dann wird es abgekühlt und mit 40 ml einer

tator aus nichtrostendem Stahl eingebracht. Das Me- Sporensuspension, hergestellt nach Beispiel 1, Absatzl,

dium wird sterilisiert, indem man es 90 Minuten auf 55 beimpft. 150 ml eines Antischaumgemisches, bestehend

121°C hält, und nach Abkühlen geimpft mit 40 ml aus Fett und Mineralölen mit Mono- und Diglyceriden

der oben beschriebenen Sporen-Suspension; die Inku- wird zugefügt, und das Gemisch 59 Stunden bei 26 bis

bationszeit bei 25 bis 27° C beträgt 32 Stunden, wobei 27° C bebrütet, wobei Luft mit einer Geschwindigkeit

gerührt (200 Umdr./Min.) und Luft mit einer Ge- von etwa 1771 je Minute durchgeleitet wird,

schwindigkeit von 121 je Minute durchgeleitet wird. 60 11401 eines Nährmediums der obigen Zusammen-

Während dieser Zeit werden 38 g eines Gemisches aus Setzung werden in ein mit einer korrosionsbeständigen

Schweinefett und Mineralölen mit Mono- und Di- Nickellegierung umkleidetes Fermentiergefäß von

glyceriden in Portionen zugefügt, um ein allzu starkes 19001 Inhalt eingebracht Der pH-Wert des Mediums

Schäumen zu vermeiden. wird mit lOn-Natronlauge auf 7,5 eingestellt, woraul

In vier 30-1-Fermentiergefäße aus rostfreiem Stahl 65 das Medium durch 30 Minuten langes Erhitzen aui

werden je 161 eines Nährmediums der obigen Zusam- 121° C sterilisiert wird. Das abgekühlte Medium wird

mensetzung eingefüllt. Der pH-Wert des Mediums in dann mit 381 des obigen Fermentationsgemisches be-

den Fennentiergefäßen wird mit lOn-Natronlauge auf impft, etwa 11 der obigen Antischaummischung züge-

9 10

fügt und das Gemisch 24 Stunden bei 24 bis 25,5°C beträgt. Während der Inkubationszeit fügt man ii bebrütet, wobei mit 84 Umdr./Min. gerührt und mit Portionen 44 g eines Gemisches aus Schweinefett un< 1275 1 Luft je Minute belüftet wird. Während dieser Mineralölen mit einem Gehalt an Mono- und Di Periode werden nochmals 513 ml des Antischaum- glyceriden zu, um ein allzu starkes Schäumen zu ver mittels zugegeben. 5 hindern.

In zwei mit einer korrosionsbeständigen Nickel- Weiter wird ein Nährmedium der folgenden Zu

legierung umkleidete Fermentiergefäße von etwa sammensetzung bereitet: 7500 1 Inhalt werden je 45401 des obigen Nährmediums

eingebracht. Die Medien werden mit lOn-Natronlauge Glucosemonohydrat 2,0%

auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und durch io Sojabohnenmehl, extrahiert mit Lö-

30 Minuten langes Erhitzen auf 121°C sterilisiert. sungsmittel, 44% Protein 2,0%

Nach Abkühlen werden die beiden Gefäße mit je Natriumchlorid 0,5%

568 1 des obigen Fermentationsgemisches beimpft, je Calciumcarbonat 0,25%

101 Antischaummittel zugegeben und die Gefäße Wasser auf 100%

95 Stunden auf 24,5 bis 26,5°C bebrütet, wobei mit 15

125 Umdr./Min. gerührt und mit einer Geschwindig- Der pH-Wert des Mediums wird mit lOn-Natron-

keit von 3400 1 Luft je Minute belüftet wird. Während lauge auf 7,5 eingestellt.

dieser Periode werden bei Bedarf weitere 40 bis 46 I 38 1 dieses zweiten Mediums werden in ein Fermcn

Antischaummittel zugefügt. tationsgefäß aus rostfreiem Stahl von 114 1 Inhalt ein-

Die Fermentationsgemische aus den beiden Fer- 20 gebracht. Das Medium wird zwecks Sterilisatior mentiergefäßen werden kombiniert, mit 10n-Natron- 60 Minuten auf 121°C gehalten, worauf man es ablauge auf ein pH von 7,2 eingestellt, mit 136 kg Di- kühlen läßt und es mit etwa 400 ml des oben beschrie atomeenerde aufgeschlämmt und filtriert. Das Filtrat benen Fermentationsgemisches impft. 150 ml eines wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von Antischaumgemisches aus Schweinefett und Mineral-1900 1 eingeengt und das Konzentrat mit 40 kg akti- z5 ölen mit einem Gehalt an Mono- und Diglyceriden vierter Holzkohle behandelt, 1 Stunde bei Raum- wird zugefügt und das Gemisch 24 Stunden bei 29 hitemperatur gerührt und filtriert. Der Kohlenkuchen 30⁰C bebrütet, wobei die Belüftung mit einer (>·.:- wird mit 15001 Wasser gewaschen und dann mit drei schwindigkeit von rund 178 1 Luft je Minute erfolg. Portionen von je 19001 50%iger Wasser-Aceton- 1136 1 eines Nährmediums mit gleicher Zusammen

mischung extrahiert. Die drei Extrakte werden korn- 30 setzung wie das oben beschriebene Impfmediiim \-.>.i biniert, unter vermindertem Druck auf 1701 konzen- 381 werden in ein mit einer korrosionsbeständigen triert und 48 Stunden bei 5°C gekühlt. Das feste Nickellegierung umkleidete* Fermentationsgefäß \<·η 9-(/9-»-Arabinofuranosyl)-adenin, das ausgefällt, wird 1900 1 Inhalt eingebracht. Da* Medium wird i>'! isoliert und nacheinander aus Methanol und Wasser 10n-Natronlauge auf ein pH von 7,5 eingestellt i.rJ umkristallisiert; Schmelzpunkt 262 bis 263°C. 35 dann zwecks Sterilisation 30 Minuten auf 121 Γ uc-

Bei der oben beschriebenen Arbeitsweise kann man halten. Nach dem Kühlen wird das Medium mit '.->- i verbesserte Ausbeuten an 9-(/?-n-Arabinofuranosyl)- des oben beschriebenen Fermentationsgemische¹; ^radenin erhalten, wenn die Inkubationstemperatur in impft, worauf man etwa 1 1 des ebenfalls oben "·.-der ersten Fermentationsstufe von 26 bis 27 auf schriebenen Antischaumgemisches zugefügt und (>■■; 29 bis 30⁰C, in der zweiten von 24 bis 25,5 auf 29 bis 40 Gemisch 24 Stunden bei 30 bis 31 C bebrütet, währen: 3O⁰C und in der Endfermentationsstufe von 24.5 bis man es mit 84 Umdr./Min. rührt und die Belüfi·:■ 26,5 auf 36 bis 38^CC erhöht wird. mit 12751 Luft je Minute durchführt. Während di ■

Periode werden weitere 4 I Antischaummischunv ■ Einzelportionen zugefügt.

B e 1 s ρ 1 e 1 3 « 4540 I eines Nährmediums der gleichen Ziisamir. ■ -

setzung wie die oben beschriebenen Medien von ->

Es wird ein Nährmedium der folgenden Zusammen- und 11361 werden in je eines von zwei mit ci'.i

setzung vorbereitet: korrosionsbeständigen Nickellegierung umkleideten

„, , , _.„. Fermentationsgefäßen von 75701 Inhalt eingebracht.

Glucosemonohydrat .. 2,0% 50 Das Medium in den beiden Gefäßen wird mit 10:,-

Sojabohnenmehl extrahiert mit Lo- Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 5 eingestel't

sungsmittel, 44% Protein 1,0% _{und zwec}ks Sterilisation 30 Minuten bei 121° C ge-

Tiensches Pepton 0,5 % _ha]_ten. Nach dem Kühlen werden die beiden Gefäße

Ammoniurnchlond 0,2% mit je 568 1 des oben beschriebenen Fermentations-

Natriumchlorid 0,5 /_{0 55 gem}i_Sches geimpft, jeweils 10 1 Antischaummittel zu-

Calciumcarbonat 0,25% _gefügt und 144 Stunden bei 36,5 bis 38°C bebrütet,

Wasser auf 100 /„ _wobei man mit 125 Umdr./Min. rührt und die Belüf

tung mit 34001 Luft je Minute erfolgt. Während dieser

Der pH-Wert des Mediums wird mit 10n-Natron- Periode werden, falls nötig, 140 bis 1961 Antischaumlauge auf 7,5 eingestellt. 60 mittel zugegeben.

121 dieses Mediums werden in ein 30-I-Fermenta- Die Fermentationsgemische aus den beiden Fer-

tionsgefäß aus rostfreiem Stahl eingebracht.· Das Me- mentiergefäßen werden zusammengegossen, durch eine dium wird zwecks Sterilisation 90 Minuten auf 121⁰C Platten- und Rahmenpresse mit Hilfe von Diatomeengehalten, worauf man abkühlen läßt und mit 40 ml erde filtriert und der Filterkuchen mit etwa 3801 einer Sporensuspension, bereitet nach Beispiel 1, 65 Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Wabchwasser impft Das beimpfte Medium wird dann 36 Stunden werden zusammengegossen, die kombinierte Flüssigbei 29 bis 30° C bebrütet, wobei es mit 200 Umdr./Min. keit unter vermindertem Druck auf etwa Vn ^des gerührt wird und die Belüftung 121 Luft je Minute Originalvolumens eingedampft und die konzentrierte

11 12

Lösung 72 Stunden bei 5⁰C gekühlt. Der sich aus der sam 72 Stunden auf 5° C gekühlt. Das aus der Lös

gekühlten Lösung ausscheidende Niederschlag wird ausfallende kristalline 9-(/3-D-Arabinofuranosyl)-adi

unter Zufügung von Diatomeenerde abfiltriert, der wird abfiltriert und aus 75 1 und daraufhin nochi

Filterkuchen mit 100 1 und dann nochmals mit 150 I aus 100 I siedendem Wasser umkristallisiert.um e:

siedendem Wasser extrahiert und die Extrakte gemein- 5 reinigen; Schmelzpunkt 262 bis 263°C.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 9-Q3-D-Arabinofuranosyl) - adenin, dadurch gekennzeichnet, daß man den Streptomyces antibioticus NRRL 3238 aerob bei etwa 20 bis 45°C in einem Nährmedium einer Oberflächen- oder Submerskultur unterwirft und dann die hierbei gebildete Adeninverbindung 9-(/S-D-Arabinofuranosyl)-adenin aus der Kulturlösung gewinnt.