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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C.
In der deutschen Offenlegungsschrift 1492 053 ist ein Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C, Penicillin N oder Cephalosporin P mittels einer Emericellopsis-Cephalosporium-Kultur beschrieben. Bei diesem Verfahren erfolgt die Züchtung des Mikroorganismus in kontinuierlicher Kultur in einem Gleichgewichtszustand, wobei wachstumsbegrenzende Nährstoffe in jedem Falle auf den Wert eingestellt werden, durch den die Bildung der Antibiotika begünstigt wird.
Beim erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C werden in einem wässerigen Kulturnährmedium unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen Emericellopsis sp. NRRL 5446, Emericellopsis sp. NRRL 5447, Emericellopsis sp. NRRL 5713, Emericellopsis sp. NRRL 5714 oder Emericellopsis sp. NRRL 5717 gezüchtet, bis eine wesentliche Menge an Deacetoxycephalosporin C von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet wird, worauf das Deacetoxycephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert wird.
Die Cephalosporinverbindung Deacetoxycephalosporin C wird durch die folgende Strukturformel dargestellt :
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Sie unterscheidet sich von Cephalosporin C dadurch, dass die Acetoxymethylgruppe in der 3-Stellung des Dlhydrothiazinrings des Cephalosporins C durch eine Methylgruppe ersetzt ist. Dieser Strukturunterschied wird geeigneterweise durch die Vorsilbe Desacetoxy oder Deacetoxy bei der Bezeichnung der abgebildeten Cephalosporinverbindung ausgedrückt. Alternativ wird der formale Name, nämlich 3-Methyl-7- -amino- - 5'-carboxyvaleramido) -3-cephem-4-carbonsäure, der dem Cephem-Nomenklatursystem entspricht, oft verwendet. Der Einfachheit halber wird die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung als"Deacetoxy- cephalosporin" bezeichnet.
Deacetoxycephalosporin C ist ein wertvolles Zwischenprodukt, das für die Herstellung von Cephalosporin-Antibiotika verwendet werden kann. Beispielsweise kann es mit Nitrosylchlorid unter den in der USA -Patentschrift Nr. 3, 188, 311 beschriebenen Bedingungen umgesetzt werden, wobei die Aminoadipoyl- Seitenkette entfernt wird und 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) gebildet wird. Die 7-ADCA kann mit der gewünschten Acylgruppe acyliert werden, wobei das Cephalosporin-Antibiotikum gebildet wird. Beispielsweise kann 7-ADCA nach bekannten Verfahren mit einem aktiven Ester, mit gemischten Anhydriden oder andern geeigneten Derivaten von Phenylglycin acyliert werden, wobei das bekannte Antibiotikum Cephalexin gebildet wird.
Deacetoxycephalosporin C wurde zuvor durch Hydrogenolyse von Cephalosporin C gemäss dem in der USA-Patentschrift Nr. 3, 124, 576 beschriebenen Verfahren hergestellt. Wegen der Nützlichkeit dieser Verbindung als Zwischenprodukt bei der Herstellung von Cephalosporin-Antibiotika besteht ein Bedarf fir andere wirtschaftlichere Verfahren Bir die Herstellung dieser Verbindung.
Bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden die oben identifizierten Mikroorganismenstämme der Gattung Emericellopsis in einem wässerigen Kulturnährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen kultiviert, wobei Deacetoxycephalosporin C gebildet wird. Deacetoxycephalosporin C wird von den andern, gleichzeitig gebildeten Substanzen wie Cephalosporin C, Penicillin N und Desacetylcephalosporin C abgetrennt, indem man zuerst die gesamte Reaktionslösung mit einer Mineralsäure wie mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ungefähr PH 2 ansäuert.
Die angesäuerte Lösung wird dann bei Zimmertemperatur während ungefähr 1 h gerührt. Während dieser Zeit werden die säureempfindlichen Verbindungen zersetzt. Danach wird der pH-Wert durch die Zugabe einer geeigneten Base wie Natriumhydroxyd wieder auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestellt. Das Mycel und andere unlösliche Stoffe werden abfiltriert und das filtrierteKulturmedium wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, um weitere Verunreinigungen zu entfernen.
Das Deacetoxycephalosporin C wird aus dem wässerigen semi-gereinigten Kulturmedium durch Chromatographie auf folgende Weise gewonnen. (Wenn in dem Patent von Kulturmedium oder-lösung beim Züchten von Mikroorganismen gesprochen wird, wird darunter das Medium verstanden, das man bei der
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Züchtung erhält. Dieses kann auch einfach als "Brühe" bezeichnet werden. Das Wort "Medium" wird in die- sem Zusammenhang im Sinne des englischen Wortes"broth"verwendet.)
Das wässerige Medium wird zuerst über Aktivkohle chromatographiert. Die mit Aktivkohle beschickte Säule wird mit Wasser gewaschen, um Verunreinigungen weiter zu entfernen, und danach wird die Aktivität mit 50%igem wässerigen Aceton eluiert. Das Eluat wird konzentriert und über ein anionisches Austauschharz geleitet.
Das Deacetoxycephalosporin C wird davon, bevorzugt mit einer 0, 15 n Natriumacetatlösung, eluiert. Die Eluate werden dann zur Trockne eingedampft oder lyophilisiert, wobei man eine rohe Deacetoxycephalosporin C-Präparation erhält.
Das Rohmaterial wird durch weitere Chromatographie über eine Cellulosesäule oder über Silikagel gereinigt. Die aktiven Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden entweder auf ein geringes
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Die Mikroorganismen, die beim Verfahren gemäss der Erfindung nützlich sind und die Ascosporen bilden, wurden als Gattung Emericellopsis, dem vollendeten geschlechtlichen Zustand von Cephalosporium, klassifiziert. Die Organismen werden dementsprechend als Ascomyceten der Klasse Eurotiales Inder Familie Eurotiaceae klassifiziert.
Die obige Klassifizierung der Fungi, die bei der Erfindung nützlich sind, basiert auf den beobachteten morphologischen und Kultureigenschaften. In den folgenden Abschnitten erfolgt eine taxanomische Beschreibung der Mikroorganismenstämme.
Die Bezugnahme auf "Maerz und Paul Farbplatten"bezieht sich auf die Farbplatten in Maerz und Paul,
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McGraw-HillBookCo., Inc.,Cleistothecia sind kugelförmig, rund (globrous) und besitzen Durchmesser von 25 bis 120 g mit einer sub-hyalinen Peridie. Die Ascosporen sind einzellig, ellipsoid, dunkelwandig mit 3 bis 6 charakteristischen longitudinalen Flügeln. Die Ascocarpen enthalten von einigen (weniger als 5) bis vielen 8-sporigen Asci, die verschwindende Wände (= kleine Wände) enthalten.
Morphologie und Kultureigenschaften der Emericellopsisstämme :
Emericellopsis sp. NRRL 5713.
Dieser Fungus ist ein Glied der Familie Eurotiaceae und er besitzt sowohl eine Konidienstufe als auch eine ascogene Stufe. A 16005 ist als Emericellopsis von Beyma klassifiziert.
Auf Lösungsagar nach Czapek erhält man ein dichtes Luftwachstum, aber keine Art von Sporen. Die Kolonie erstreckt sich aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 18 mm bei 260C während 10 Tagen auf eine Fläche mit einem Durchmesser von 37 mm. Die Lufthyphen sind zuerst weiss und werden dann mässig gelblich-rosa. Die Umkehrfarbe ist lebhaft orange. Es werden Synnemata und funiculäre Hyphen gebildet.
Malzextrakt-Agar ergibt eine synnematische, flockige bis funiculäre Kolonie mit einem Durchmesser von 32 mm aus einer Inokulationszone mit einem Durchmesser von 18 mm. Die Kolonie ist schwach orangegelb und die Umkehrfarbe ist schwach gelblich-rosa. Innerhalb von 14 Tagen tritt keine Fruchtbildung auf.
Kartoffel-Dextrose-Agar ergibt eine Kolonie, die einen Durchmesser von 32 mm erzielt, ausgehend von einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 18 mm. Die Kolonie ist mit Ringen und Streifen gezeichnet, enthält wenig kurzes, weisses Luftmycel auf einer schwach orange-gelben, trüben Matte, deren Umkehrfarbe schwach gelblich-rosa ist. Etwas verstreutes Perithecium ist erkenntlich, die Konidien sind aber im Überfluss vorhanden.
Modifizierter V-8-Saft-Agar ergibt eine Kolonie, die aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 18 mm bis zu einer Zone mit einem Durchmesser von 31 mm wächst. Sie ist radial gefaltet, funiculär bis flockig, leicht gelblich-rosa mit einer Umkehrfarbe von mittel-orange. Die Phialiden entstehen aus Synnemata, Funiculi und wuchernden Hyphen. Durch die ascogene Stufe ist jedoch die Konidienstufe verkleinert.
Cleistothecia sind schwarz, kugelig und kugelförmig bis subkugelförmig mit dicken Wänden aus pseudoparenchymatischen Zellen. Sie besitzen Durchmesser von 57, 4 bis 131, 7 jU, der durchschnittliche Durch-
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Die Phialiden sind hyalin, glatt und gelegentlich verzweigt. Sie sind im Bereich von 35 bis 70 jet lang und durchschnittlich 49 p, lang. Sie sind an ihrer Basis 2, 5 tu breit und verlaufen an ihren Spitzen langsam auf 0, 5 li konisch. Die Konidien sammeln sich in feuchten Knäulen an den Spitzen der Phialiden.
Sie sind glatt,
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hyalin und elliptisch und von 2, 5 bis 3, 0 breit und von 3, 5 bis 8, 4 lang, die durchschnittliche Grösse beträgt 8, 0 x 2, 8 . Phialidenverzweigungen können bis zu 54 jn lang sein und ebenfalls Konidien bilden.
Emericellopsis sp. NRRL 5714
Dieser Fungus ist ein Glied der Familie Eurotiaceae und bildet sowohl eine Konidien- als auch eine asoogene Stufe und ist als Species von Emercellopsis von Beyma charakterisiert. Übermässige Cleistrothecia erscheinen auf einem modifizierten V-8-Saft-Agar, das eine Kolonie ergibt, dessen Zentrum praktisch schwarz ist. Die restliche Fläche der Kolonie ist dunkelrötlich-grau. Die Umkehrfarbe ist bräunlichorange.
Kolonien in diesem Agar sind mit Ringen oder Streifen gezeichnet, was man am besten auf der entge-
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3 Wochen wird ein schwarzes, lösliches Pigment gebildet. Diese Kolonie wächst bei 260C in 10 Tagen aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 20 mm zu einer Kolonie mit einem Durchmesser von 37 mm. Auf diesem Agar tritt ebenfalls eine mässig dichte Konidienstufe auf.
Kartoffel-Dextrose-Agar ergibt eine Kolonie, die von einer inokulierten Zone mit 20 mm Durchmesser zu einer Kolonie mit einem Durchmesser von 38 mm in 10 Tagen bei 260C wächst. Zahlreiche unentwickelte Cleistothecia werden gebildet. Die Konidien sind relativ schwer. Das Mycel ist funiculär und entwickelt sowohl aufrechte als auch liegende Synnemata. Diese Kolonie ist schwach gelblich-rosa und wird von einem 3 mm Rand aus farblosen, luftfreien Hyphen umgeben. Die Umkehrfarbe des Mediums ist orange-gelb.
Malzextrakt-Agar-Kolonien können aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 20 mm zu Kolonien mit Durchmessern von 37mm wachsen. Man beobachtet eine gute Konidienbildung, aber die ascogene Stufe entwickelt sich nicht. Die Kolonie ist schwach orange-gelb auf beiden Flächen. Sie ist funiculär und entwickelt sowohl aufrechte als auch liegende Synnemata.
Auf Lösungsagar nach Czapek entwickeln sich die Luftkomponenten schlecht. Die Kolonie ist relativ flach und schimmert. Sie erreicht aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 20 mm Durchmesser von 44 mm. Diese Kolonie ist schwach gelblich-grün auf beiden Flächen mit einem 4 mm farblosen Rand aus Hyphen unter der Oberfläche. Die Hyphen sind unregelmässig geformt, verzerrt und mit Vacuolen versehen.
Cleistothecia auf modifizierten V-8-Saft-Agar sind dunkelbraun bis schwarz, kahl, kugelförmig bis subkugelförmig und besitzen Durchmesser von 28 bis 85 m. Der durchschnittliche Durchmesser beträgt
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messer von 18, 6 und enthalten jeweils 8 braune Ascosporen. Von 3 bis 5 Flügeln sind longitudinal an den Sporen angeordnet und 2 f. L breit. Die Ascosporen besitzen Grössen im Bereich von 8, 4 bis 11, 2 ; n in der Länge und von 4, 9 bis 7, 0 in der Breite, die durchschnittlichen Grössen sind 10, 0x5, 6 .
AufKartoffel-Dextrose-Agar wird eine typischeCephalosporium-Konidienstufe beobachtet. Die Phialiden entstehen aus Funiculi, Synnemata und wuchernden Hyphen. Sie sind unicellular, hyalin und verlaufen von der Basis zur Spitze etwas konisch. Ihre Basis ist 2 bu breit, die Spitzen sind 0, 5 breit. Sie sind von 20 bis 60 f. L lang und durchschnittlich 40 x 2 li gross. Konidien, die von den Phialiden episch gebildet werden und die feuchte Knäule bilden, sind hyalin, glatt, unicellular und elliptisch. Sie sind von 2, 1 bis 4, 2 jn breitund von 3, 5 bis 7, 0 un lang. Die durchschnittliche Grösse beträgt 3x5.
Emericellopsis sp. NRRL 5717
Dieser Fungus bildet sowohl eine ascogene als auch eine Konidienstufe. Er ist als Glied der Familie
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DiesertragendenStufen werden an modifizierten V-8-Saft-Agar beschrieben. Sie treten jedoch ebenfalls bei Kartof- fel-Dextrose-Agar auf. In Lösungsagar nach Czapek oder in Malzextrakt-Agar wird bei 260C in 14 Tagen keine Fruchtbildung erkenntlich.
In Lösungsagar nach Czapek erhält man eine Kolonie mit einem Durchmesser von 35 mm, deren Peripherie unbeschädigt und im wesentlichen kreisförmig ist. Diese Kolonie expandiert aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 18 mm. Auf diesem Medium treten die dichtesten Lufthyphen auf und die Kolonie erscheint samtartig. Die mikroskopische Untersuchung zeigt Synnemata und wuchernde funiculäre Hyphen. Sie ist mässig gelblich-rosa und die andere Seite ist gelblich-orange bis lebhaft orange.
Malzextrakt-Agar ergibt eine Kolonie, die im wesentlichen von Luftkomponenten frei ist, flach, glanzlos und schwach gelblich-orange gefärbt ist. Die andere Seite ist schwach gelblich-weiss. Die Wachstumsgeschwindigkeit ist ähnlich wie bei der Kolonie in dem Agar nach Czapek.
Kartoffel-Dextrose-Agar-Kolonien wachsen aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 16 mm zu Kolonien mit Durchmessern von 35 mm. Die Kolonieoberfläche ist flockig bis wollähnlich. Es sind sowohl aufgerichtete als auch liegende Synnemata vorhanden, die Phialiden ergeben. Diese Kolonie ist schwach gelblich-rosa und die umgekehrte Seite ist schwach orange-gelb.
Modifizierter V-8-Saft-Agar ergibt eine Kolonie, die aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 20 mm zu einer Kolonie mit einem Durchmesser von 39 mm wächst. Synnematisches, flockiges
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Die oben beschriebenen Stämme von Emericellopsis wurden ohne Beschränkung hinsichtlich der Ver- fügbarkeit bei der dauernden Kulturkollektion von der Northern Regional Research Laboratory, Agricultural
Research Serive, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt, wo den Kul- turen die bei der zuvor angegebenen taxanomischen Beschreibung nach dem Namen der entsprechenden
Kultur aufgeführten Zahlen als Eingangszahlen zugeordnet wurden.
Wie zuvor erwähnt, wird ein Mikroorganismus, der bei der Erfindung verwendet wird, nach einem sub- mersen aeroben Fermentationsverfahren kultiviert. Das Kulturmedium, das verwendet werden kann, kann irgendeines einer Anzahl von unterschiedlichen Medien sein. Beispielsweise kann man verschiedene Kohlen- stoffquellen verwenden wie Saccharose, Glucose, Stärke und ähnliche Kohlenstoffquellen.
Ähnlich kann man die Stickstoffquellen aus einer Vielzahl von Verbindungen auswählen wie Sojabohnen- mehl, Sojabohnengriess oder -staub, Baumwollsamenöl, Erdnussmehl, Aminosäuren, Aminosäuremischungen,
Peptonen u. ähnl. Aus Wirtschaftlichkeitsgründen bei der Herstellung, wegen der maximalen Ausbeute und der leichten Isolierung sind bestimmte Medien bevorzugt, beispielsweise sind Melassen eine bevorzugte Quelle von Kohlenhydraten, und bevorzugt Quellen von Stickstoff sind Sojabohnenmehl und Aminosäuren.
Anorganische Nährsalze, die in das Kulturmedium einverleibt werden können, umfassen die gewöhnlichen Salze, die fähig sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Bromid-, Nitrat-, Carbonat-, Eisen- (n)-, Eisen- (in)-, Magnesium-, Mangan-Ionen und ähnliche Ionen zu ergeben. Die erfindungsgemässen Fungi erfordern ähnlich wie andere Mikroorganismen, die Antibiotika ergeben, bestimmte unentbehrliche Spurenelemente für das Wachstum, ihre Entwicklung und ihren Metabolismus. Solche Spurenelemente können zu dem Fermentationsmedium zugegeben werden, jedoch sind sie im allgemeinen in ausreichender Menge als Verunreinigungen in den andern Bestandteilen vorhanden, die zu dem Kulturmedium zugefügt werden.
Die erfindungsgemäss verwendeten Emericellopsis-Mikroorganismen können in Vorrichtungenkleiner Grösse, wie in 11-Schüttelkolben, kultiviert werden, wobei man geringe Mengen an Deacetoxycephalosporin C erhält. Für eine Herstellung der Cephalosporinverbindungen in grösserem Massstabe werden die Mikroorganismen in Fermentationstanks in grösserem Massstab unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen kultiviert.
Bei der Herstellung von Deacetoxycephalosporin C in grösserem Massstab werden die Sporen der Organismen auf einer Agar-Schrägfläche gehalten. Die Sporen aus der Schräglläche werden verwendet, um ein vegetatives Medium mit geringem Volumen zu inokulieren. Das vegetative Medium wird inkubiert, wobei man eine starkefrische, tiefwachsendeKultur des Mikroorganismus erhält. Dieses vegetative Wachstum wird dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in grösserem Massstab verwendet.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, weiteres vegetatives Medium als Inokulum für das Fermentationsmedium zu verwenden. Solche vegetativen Medien der zweiten Stufe oder Organmedien werden im allgemeinen verwendet, wenn das Volumen des Fermentationsmediums signifikant oder wesentlich grösser ist als das Volumen des ersten vegetativen Mediums. Auf diese Weise werden die Sporen der Organismen zuerst in einem geringen Volumen an vegetativem Medium kultiviert, wobei man das Inokulum für ein vegetatives Medium mit grösserem Volumen erhält.
Das vegetative Medium mit grösserem Volumen bildet dann eine ausreichende Konzentration an Organismus, um einen schnellen Beginn der Fermentation in einem Fermentationstank in grossem Massstab zu initiie- ren. Das vegetative Medium kann die gleiche Zusammensetzung wie das Fermentationsmedium besitzen, oder es kann zusätzliche Bestandteile enthalten, um das Wachstum und die Bildung der Organismen in kleinem Massstab zu unterstützen.
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6,2Anfangs-PlI-Wert von ungefähr 6, 5 auf einen End-pH-Wert von ungefähr 7, 5 zu.
Die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen können bei Temperaturen zwischen ungefähr 20 und 35 C gezüchtet werden. Das Deacetoxycephalosporin C scheint bei einer Temperatur von ungefähr 260C in optimalen Ausbeuten gebildet zu werden.
Die maximaleBildung von Deacetoxycephalosporin C tritt auf, wenn der Organismus in Tanks in grossem Massstab während einer Zeit zwischen ungefähr 4 und 7 Tagen gezüchtet wird. Wenn man jedoch in Vorrichtungen in kleinerem Massstab züchtet, wie in 1l-Schüttelkolben, verläuft das Wachstum der Organismen schneller und Deacetoxycephalosporin C wird in einer kürzeren Zeit, beispielsweise während 2 oder 3 Tagen, gebildet.
Da der End-PlI-Wert in Fermentationsmedium in grossem Massstab einen Wert von PH 8, 0 oder höher zu erreichen scheint, kann die Ausbeute an Deacetoxycephalosporin C nachteilig beeinflusst werden. Es ist daher wünschenswert, den pH-Wert des Fermentationsmediums in grossem Massstab von Zeit zu Zeit während der Fermentation zu prüfen. Es scheint so zu sein, dass der pH-Wert solche Werte vor dem Zeitpunkt erreicht,
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zu dem eine maximale Bildung an Antibiotikum auftritt. Der pH-Wert kann geeigneterweise durch Zugabe einer geeigneten Säure oder eines geeigneten Puffermittels zu dem Fermentationsmedium niedriger einge- stellt werden.
Die Bildung von Deacetoxycephalosporin C während der Fermentation kann verfolgt werden, indem man
Testproben der Fermentationsbrühe chromatographisch untersucht. Alternativ kann die Anwesenheit von
Deacetoxycephalosporin C durch Bioautographien geprüft werden. Der Organismus Pseudomonas solanacear- cum kann verwendet werden, um bei der Bioautographie den Organismus festzustellen.
Wie bei den meisten submersen, aeroben Fermentationen wird sterile Luft durch das Kulturmedium ge- leitet, um ein wirksameres Wachstum der Organismen zu erreichen und um die Bildung an Fermentations- produkten zu erhöhen. Das Luftvolumen, das durch das Kulturmedium gezwungen wird, beträgt im allge- meinen mindestens ungefähr 0, 2 Vol. Luft/min/Vol. Kulturmedium. Jedoch kann eine erhöhte Geschwindig- keit bei dem Durchleiten von Luft oft eine günstige Wirkung auf die Bildung von Deacetoxycephalosporin C besitzen.
Die Fungi, die bei dem Verfahren nützlich sind, bilden zusätzlich zu Deacetoxycephalosporin C und dem charakteristischen Penicillin N ebenfalls Desacetylcephalosporin C, Cephalosporin C und gelegentlich das
Lacton, das mit Desacetylcephalosporin C gebildet wird, wie auch andere unidentifizierbare Metabollten.
Einige der zuvor erwähnten Verbindungen sind säurelabil. Es ist daher bei der Gewinnung von Deacetoxy- cephalosporin C aus dem Fermentationsmedium wünschenswert, das gesamte Fermentationsmedium Sir kurze Zeit bei einem sauren pH-Wert zu behandeln, um einen Teil der mitgebildeten Verunreinigungen zu zerstören. BeiFermentationen inkleinemMassstab kann das PenicillinN durch die Zugabe einer Penicillinase zu dem Medium zerstört werden.
Das Deacetoxycephalosporin C-Fermentationsprodukt wird aus der filtrierten Fermentationsbrühe, die so behandelt wurde, gewonnen und von den andern Bestandteilen des Fermentationsmedium durch Chromato- graphie über einem Ionenaustauschharz abgetrennt. Es wird weiter durch Chromatographie über Cellulose oder Silikagel gereinigt und anschliessend ausgefällt und umkristallisiert.
Zu Beginn wird das filtrierte Fermentationsmedium einem vorläufigen Reinigungsverfahren unterworfen, wobei eine erste Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie n-Butanol, Amylacetat erfolgt, um Verunreinigungen zu entfernen. Das extrahierte Medium kann dann weiter vorbereitet werden, durch Chromatographie über aktiviertem Kohlenstoff gereinigt werden. Das extrahierte Medium wird über einer Säule chromatographiert, die mit aktiviertem Kohlenstoff, beispielsweise Pittsburgh 12 x 40 Kohlenstoff, gepackt ist und die Säule wird dann mit Wasser gewaschen, um wasserlösliche, gefärbte Verunreinigungen und wasserlösliche anorganische Stoffe zu entfernen.
Die Fermentationsprodukte werden dann mit 50%igem Aceton-Wasser von dem Kohlenstoff eluiert. Das Eluat wird zu einer wässerigen Phase konzentriert, die dann über einem basischen, anionischen Austauschharz chromatographiert wird. Unter den basischen anionischen Austauschharzen, die verwendet werden können, sind solche der Polystyrol quaternären Ammoniumart, beispielsweise solche, die im Handel unter den Bezeichnungen Dowexl, Dowex2 (DowChemicalCo., Midland, Mich. ) und solche, die unter den Bezeichnungen IRA-400, IRA-45, IRA-68 (Amberlite, Rohm and Haas, Philadelphia, Pa. ) erhältlich sind. Die Harze können in dem Hydroxylzyklus, dem Acetatzyklus, dem Formiatzyklus oder andern geeigneten Zyklen vorliegen bzw. verwendet werden.
Das konzentrierte Eluat aus der Kohlenstoffsäure wird auf das anionische Austauschharz gegeben und dann wird das Harz mit Wasser gewaschen. Das Deacetoxycephalosporin C wird aus dem Austauschharz in Salzform mit einer geeigneten schwachen Base eluiert, beispielsweise ist das Elutionslösungsmittel wünschenswerterweise, wenn die Säule im Acetatzyklus verwendet wird, eine wässerige Lösung aus Natriumacetat in einer Konzentration von ungefähr ln oder geringer. Die Konzentration der Natriumacetatlösung ist nicht kritisch.
Um jedoch die Anwesenheit von überschüssigem anorganischen Salz (Natriumacetat) im Eluat aus der Austauschsäule zu vermeiden, liegt die wünschenswerte Konzentration an Natriumacetat zwischen ungefähr 0, ln und 0, 5n. Eine besonders bevorzugte Konzentration für die Eluierung, die überschüssiges Salz in dem Eluat vermeidet, beträgt 0, 15n. Wird das Austauschharz in dem Formiatzyklus oder bei andern geeigneten Zyklen verwendet, so kann das entsprechende Salz in wässeriger Lösung als Elutionslösungsmittel verwendet werden. Beispielsweise kann man Ammoniumformiat verwenden, wenn das Harz in dem Formiatzyklus vorliegt.
Viele Fraktionen werden gesammelt und die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, bestimmt durch Bioautogramm, werden vereinigt. Die vereinigten Eluate werden dann über aktiviertem Kohlenstoff chromatographiert, über überschüssige anorganische Salze, beispielsweise Natriumacetat, das als Salzlösung zum Eluieren verwendet wurde, zu entfernen. Die Kohlenstoffsäule wird mit Wasser gewaschen, um diese anorganischen wasserlöslichen Salze zu entfernen und das DeaoetoxycephalosporinC wird dann aus der Säule mit einer 50%igen Aceton-Wasser-Mischung entfernt.
Das Eluat wird zur Trockne eingedampft
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oder, alternativ, wird das Aceton abdestilliert und die konzentrierte wässerige Lösung wird dann lyophilisiert, wobei man bei beiden Verfahren Deacetoxycephalosporin C als festes Rohprodukt erhält.
Die rohe Präparation von Deacetoxycephalosporin C wird durch Chromatographie über Cellulose oder Silikagel oder über andere geeignete, nicht ionische Adsorbentien weiter gereinigt. Das Deacetoxycephalosporin C wird aus der Säule mit Aceton : Wasser, 80 : 20, eluiert und viele Fraktionen werden gesammelt.
Die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C, bestimmt durch Papierchromatographie oder Bioautogramm, unter Verwendung eines Versuchsorganismus von Pseudomonas solanacearcum enthalten, werden vereinigt und auf ein geringes Volumen konzentriert oder bis zur Trockne eingedampft.
Der stark konzentrierte wässerigeRückstand oder der trockenerilckstand wird dann in einer minimalen Menge an Isopropylalkohol gelöst und die alkoholische Lösung wird in ein grosses Volumen an Diäthyläther gegossen. Das gereinigte Deacetoxycephalosporin C wird in Form des Salzes, das dem wässerigen Elutionmittel, das man bei der Elution des anionischen Austauschharzes verwendet hatte, entspricht, erhalten.
Wenn beispielsweise Natriumacetat als Elutionsmittel verwendet wurde, wird das Deacetoxycephalosporin C als Mononatriumsalz erhalten. Die Salzform des Deacetoxycephalosporins C wird filtriert und getrocknet.
Bei dem erfindungsgemässenVerfahren verwendet man bevorzugt bei der Isolierung die folgenden Bedingungen. Die gesamte Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von 2 durch Zugabe von Schwefelsäure angesäuert und dann wird das Medium 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Der pH-Wert des Mediums wird dann mit Natriumhydroxyd auf 6, 0 eingestellt und das basisch gemachte Medium wird anschliessend filtriert, wobei man eine Filterhilfe verwendet, um Mycel und andere unlösliche Stoffe zu entfernen.
Das wässerige Medium wird dann mit n-Butanol extrahiert, um weitere Verunreinigungen zu entfernen,
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wird mit Wasser gewaschen und das Fermentationsprodukt wird darauf mit 50%igem Aceton-Wasser eluiert. Das Eluat wird zu einer wässerigen Phase konzentriert. Die wässerige Phase wird über einem anionischen quaternären Ammoniumaustauschharz im Acetatzyldus, bevorzugt dem quaternären Ammoniumpolystyrol- harz, das im Handel erhältlich ist und als Amberlite IRA-68 (Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.) bezeichnet wird, chromatographiert.
Das Austauschharz wird zuerst mit Wasser gewaschen und dann werden das Deacetoxycephalosporin C und andere mitgebildete Verbindungen mit 0, 15n wässerigem Natriumacetat eluiert. Die aktiven Eluate werden an aktiviertem Kohlenstoff absorbiert und die Säule wird mit Wasser gewaschen, um wasserlösliche Salze wie überschüssiges Natriumacetat, das von den Harzeluaten mit übertragen wurde, zu entfernen. Das Deacetoxycephalosporin C wird aus dem Kohlenstoff mit 50%igem Aceton : Wasser eluiert. Das Eluat wird dann zur Trockne eingedampft, wobei man rohes Deacetoxycephalosporin C als Natriumsalz erhält.
Das rohe Material wird bevorzugt durch Chromatographie über eine Cellulosesäure (Avicel PH 101) gereinigt. Die Cellulosesäule wird mit Acetonitril : Wasser (80 : 20) eluiert und viele Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C, bestimmt durch Bioautogramme, enthalten, werden zusammengegeben und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der getrocknete feste Rückstand an
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dann in Diäthyläther gegossen, um das Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C auszufällen.
Bei einem andern Verfahren zur Isolierung von Deacetoxycephalosporin C wird das Eluat aus dem anionischen Austauschharz in dem Acetatzyklus durch Eindampfen konzentriert und eine 20%ige wässerige Lösung aus Natriumacetat wird zu dem Konzentrat zugefügt. Das Konzentrat wird unter Kühlen gerührt, um das
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Die Salzform von Deacetoxycephalosporin C kann in die freie Säure durch Verfahren überfdhrt werden, die man üblicherweise verwendet, um Salze in Säuren zu überfahren. Beispielsweise kann das Salz über ein kationisches Austauschharz geleitet werden, wobei man die Säure in freier Form erhält.
Das Chromatographiesystem, das verwendet wird, um Deacetogycephalosporin C in rohen Fermentationsmedien oder in Harzeluatfraktionen zu identifizieren, wird unter Verwendung von Whatman Nr. 1-Chromatographierpapier in absteigenderweise durchgeführt. Das Lösungsmittelsystem, das man zur Entwicklung verwendet, ist Acetonitril : Wasser, 80 : 20 Vol. : Vol., wobei die Kammer mit den Dämpfen der Lösung- mittelmischung, die aus n-Propanol : Pyridin : Essigsäure : Acetonitril : Wasser in Verhältnissen von 45 : 30 : 9 : 40 : 36, ausgedrückt durch das Volumen pro Volumen, besteht, gesättigt wird.
Die entwickelten Chromatogramme werden dann als Bioautogramme verwendet, wobei man Pseudomonas solanacearcum als Mikroorganismus für die Ermittlung verwendet.
Um die Chromatographie zu vereinfachen, ist es wünschenswert, die Versuchsprobe mit einer Penicillinase zu behandeln, bevor das Chromatogramm durchgeführt wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
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Beispiel 1 : Getrennte Sporen von Emericellopsis sp. Stamm NRRL 5446 und Emericellopsissp.
Stamm NRRL 5447 wurden getrennt auf eine Schrägplatte aus Nähragar mit der folgenden Zusammensetzung eingeführt :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol)
<tb> Lactose <SEP> 1
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Sojapepton <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> lösliche <SEP> Stoffe, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Trocknen <SEP> von <SEP> Getreide <SEP> und
<tb> Malzextrakten <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Eisen- <SEP> (II)-sulfatheptahydrat <SEP> 0,001
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0,2
<tb> Spuren <SEP> Minerallösung3 <SEP> 0,625
<tb> Agar <SEP> 2 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
Enzymatischer Auszug von Sojabohnenmehl 2 "Produlac", National Distillers Products Co.
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<tb>
<tb> Gewicht <SEP> Salz
<tb> 0, <SEP> 102 <SEP> g <SEP> CuSO.
<SEP> 5H20
<tb> 0, <SEP> 018 <SEP> g <SEP> FeSO4. <SEP> 7H20 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 126g <SEP> MnCI <SEP> . <SEP> 4H <SEP> O
<tb> 0, <SEP> 024 <SEP> g <SEP> ZnSO4.7H2O
<tb>
Die Schrägplatten wurden während 7 Tagen bei einer Temperatur von 260C inkubiert. Die reifen Schrägmlturen wurden mit sterilem destillierten Wasser bedeckt und mit einem sterilen Stab leicht gekratzt, vobei man die Sporensuspensionen erhielt.
Die Sporensuspensionen, die so erhalten wurden, wurden jeweils verwendet, um zwei getrennte sterile Vachstumsmedien der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren :
EMI8.4
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol) <SEP>
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Malzextrakt <SEP> 2
<tb> Maiswasser <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 025
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 0,1
<tb> Dikaliumhydrogenphosphat <SEP> 0,05
<tb> Calciumchloriddihydrat <SEP> 0,01
<tb> Spar <SEP> Minerallösung <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 625
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
EMI8.5
<Desc/Clms Page number 9>
Der pll-Wert des vegetativen Mediums wurde vor der Behandlung in dem Autoklaven auf pg 6,5 eingestellt.
Die inokulierten vegetativen Medien wurden bei einer Temperatur von 260C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit 250 Umdr/min mit einer Weite von 5,08 cm während 48 h inkubiert.
Die inkubieren vegetativen Medien wurden dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in einem Verhältnis von 1% vegetativem Medium pro Volumen Fermentationsmedium verwendet. Die sterilen Produktionsmedien, die verwendet wurden, hatten die folgende Zusammensetzung :
EMI9.1
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew.-/Vol)
<tb> Saccharose <SEP> 4
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Natriumglutamat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Eisen- <SEP> (II) <SEP> -ammoniumsulfat- <SEP>
<tb> hexahydrat <SEP> 0, <SEP> 3
<tb> Kaliumnitrat <SEP> 2,0
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> Volumen
<tb>
Die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln oder Entschäumungsmitteln findet gelegentlich statt, wenn man eine Fermentation in grossem Massstab durchführt.
Der PH-Wert der Fermentationsmedien wurde vor der Sterilisation auf PH 6,5 eingestellt. Die inokulierten Fermentationsmedien wurden dann unter Rühren bei einer Temperatur von 260C während 5 Tagen inkubiert ; während der Fermentation wurde sterile Luft durch dieFermentationsmedien mit einer Geschwindigkeit entsprechend ungefähr 1/2 Volumen Luft/Volumen Kulturmedium/min durchgeleitet. Der End-pH-Wert der Fermentationsmedien betrug PI 7, 5.
Jeweils 151 der wie oben beschriebenen, erhaltenen vollständigen Medien wurden mit Schwefelsäure auf einen PlI-Wert von 2 angesäuert. Die angesäuerten vollständigen Medien wurden 1 h bei Zimmertemperatur gerührt und danach wurde der pH-Wert mit Natriumhydroxydlösung auf pH 6,0 eingestellt. Die Medien wurden filtriert und die wässerigen Filtrate wurden mit n-Butanol zur Entfernung von unlöslichen Stoffen in Suspension extrahiert. Die wässerigen Phasen wurden dann durch Säulen eingeleitet, die mit aktiviertem Kohlenstoff beschickt waren und die Säulen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Eluat aus der Wasserwäsche wurde verworfen. Die Säulen wurden dann mit 50% gem wässerigen Aceton eluiert.
Die Eluate wurden im Vakuum bis zur wässerigen Phase eingedampft, die dann über Säulen chromatgraphie wurde, die mit Amberlite IRA 68 einem quaternären Ammoniumpolystyrolharz im Acetatzyklus gepackt waren. Die Säulen wurden zuerst mit Wasser gewaschen und dann wurde das Wasser verworfen. Die aktiven Fermentationsprodukte wurden aus den Säulen mit 0, 15n wässeriger Natriumacetatlösung eluiert. Es wurden viele Fraktionen gesammelt und die Fraktionen aus jedem einzelnen Versuch, die Deacetoxycephalosporin C enthielten, wurden vereinigt.
Die Anwesenheit von Deacetoxycephalosporin C in den Eluatfraktionen wurde jeweils durch Bioautogramme bestimmt. In jedem Versuch wurde das folgende System verwendet : Die erste Chromatographie wurde in absteigender Weise unter Verwendung von nichtbehandeltem Whatman Nr. 1 Chromatographiepapier durchgeführt. Als Elutionslösungsmittel verwendete man Acetonitril : Wasser (80% : 20%).
DerBoden derChromatographiekammer war mit einer Lösungsmittelmischung, die 300 ml einer Lösung
EMI9.2
nitril verdünnt war, beschichtet. Die Lokalisierung von Deacetoxycephalosporin C auf dem Chromatogramm erfolgte, indem man ein Bioautogramm mit dem entwickelten Chromatogramm durchfährt und als Feststellungsorganismus Pseudomonas solanacearcum verwendete.
Die Fraktionen, die nach dem oben beschriebenen Chromatographieverfahren erhalten wurden und Deacetoxycephalosporin C-enthielten, wurden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann auf einer Säule absorbiert, die mit aktiviertem Kohlenstoff gefüllt war, und dann wurde die Säule zuerst mit destilliertem Wasser gewaschen, um lösliche anorganische Stoffe, beispielsweise Natriumacetat, zu entfernen. Danach wurde die Säule mit 50%igem wässerigen Aceton eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man eine rohe feste Präparation von Deacetoxycephalosporin C-natriumsalz erhielt.
Das rohe Material wurde weiter durch Chromatographie über einer Säule gereinigt, die mit Cellulose (Avicel pH 101) gepackt war. Das Antibiotikum wurde aus der Cellulosesäule mit einer Lösungsmittel-
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mischung, die Acetonitril : Wasser (80 : 20) enthielt, eluiert. Es wurden viele Fraktionen gesammelt und dann wurden die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthielten, vereinigt, wobei man zur Feststellung das oben beschriebene Chromatographiesystem verwendete.
Die vereinigten Fraktionen wurden dann zur Trockne eingedampft und der trockene Rückstand, der Deacetoxycephalosporin C enthielt, wurde in einer minimalen Menge Isopropanol gelöst. Die Alkohollösung wurde in eine Äthermenge gegossen, die ungefähr das 20-fache Volumen der Isopropanollösung hatte. Unter Rühren bildete sich das Natriumsalz von Deacetoxycephalosporin C als Niederschlag. Der Niederschlag wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet, wobei man 126 mg des Antibiotikums als Natriumsalz erhielt.
Beispiel 2 : Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Sporen von Emericellopsis sp.
NRRL 5714 in einer vegetativen Mediumstufe kultiviert, wobei man im wesentlichen das gleiche vegetative Medium verwendete. Das kultivierte Medium wurde dann verwendet, um ein Produktionsmedium der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren :
EMI10.1
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew. <SEP> /Vol)
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Dextrose <SEP> 4, <SEP> 0
<tb> Sojabohnengriess <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0,5
<tb> Antischaummittel <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> Volumen
<tb>
Der pH-Wert des Produktionsmediums wurde vor der Inokulation und vor der Behandlung im Autoklaven auf 6, 5 eingestellt.
Die Fermentation wird während 5 Tagen bei ungefähr 260C durohgeführt und das Deacetoxycephalosporin C wird wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und isoliert.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von DeacetoxycephalosporinC, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässerigen Kulturnährmedium unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen Emericellopsis sp. NRRL 5446, Emericellopsis sp. NRRL 5447, Emericellopsis sp. NRRL 5713, Emericellopsis sp. NRRL 5714 oder Emericellopsis sp. NRRL 5717 züchtet, bis eine wesentliche Menge an Deacetoxycephalosporin C von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet wird und man dann das Deacetoxycephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert.