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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C, welches in seinem Wesen darin besteht, dass man in einem wässerigen Kulturnährmedium unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen einen Penicillin N bildenden, zur Gattung Cephalosporium gehörenden Mikroorganismus NRRL 5445, ATCC 14615, NRRL 5712, NRRL 5716, NRRL 5718, NRRL 5719, NRRL 5720, NRRL 5721, NRRL 5722, NRRL 5723, NRRL 5724 oder NRRL 5725 züchtet, bis eine wesentliche Menge an Deacetoxyce- phalosporin C von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet wird, und man dann das Deacetoxycephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert.
Die Cephalosporinverbindung Deacetoxycephalosporin C wird durch die folgende Strukturformeldargestellt :
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Sie unterscheidet sich von Cephalosporin C dadurch, dass die Acetoxymethylgruppe in der 3-Stellung des Dihydrothiazinringes des Cephalosporins C durch eine Methylgruppe ersetzt ist. Dieser Strukturunterschied wird geeigneterweise durch die Vorsilbe Desacetoxy oder Deacetoxy bei der Bezeichnung der abgebildeten Cephalosporinverbindung ausgedrückt. Alternativ wird der formale Name, nämlich 3-Methyl-7- (5'-amino- - 5'-carboxyvaleramido)-3-cephem-4-carbonsäure, der dem Cepham-Nomenklatursystem entspricht, oft verwendet. Der Einfachheit halber wird die erfindungsgemäss hergestellte Verbindungals"Deacetoxyce- phalosporin" bezeichnet.
Deacetoxycephalosporin C ist ein wertvolles Zwischenprodukt, das für die Herstellung von Cephalosporin-Antibiotika verwendet werden kann. Beispielsweise kann es mit Nitrosylchlorid unter den in der USAPatentschrift Nr. 3, 188,311 beschriebenen Bedingungen umgesetzt werden, wobei die Aminoadipoyl-Seiten- kette entfernt wird und 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) gebildet wird. Die 7-ADCA kann mit der gewünschten Acylgruppe acyliert werden, wobei das Cephalosporin-Antibiotikum gebildet wird.
Beispielsweise kann 7-ADCA nach bekannten Verfahren mit einem aktiven Ester, mit gemischten Anhydriden oder andern geeigneten Derivaten vonPhenylglycin acyliert werden, wobei das bekannte Antibiotikum Cephalexin gebildet wird.
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3,tiven Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden entweder auf ein geringes Volumen konzentriert oder zur Trockne eingedampft. Das Konzentrat oder der trockene Feststoffrückstand wird in einer minimalen Menge an Isopropanol gelöst und die Lösung wird in Diäthyläther gegossen, um Deacetoxycepha- losporin C als Natriumsalz auszufällen.
Die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemässen Verfahren nützlich sind, wurden als Glieder der Klasse Fungi imperfeeti klassifiziert, da sie keine geschlechtlichen Sporen bilden. Sie werden weiter in die Klasse Moniliales, die Familie Moniliaceae und die Gattung Cephalosporium klassifiziert.
Die obige Klassifizierung der Fungi, die bei der Erfindung nützlich sind, basiert auf den beobachteten morphologischen und Kultureigenschaften.
Die Bezugnahme auf "Maerz und Paul Farbplatten"bezieht sich auf die Farbplatten in Maerz und Paul, Dietionary of Color, McGraw-HillBook Co., Ine. New York [1950].
Allgemeine Morphologie-Cephalosporium
Die sporentragenden Zellen sind Phialiden, die direkt aus den vegetativen Hyphen oder aus Keimgangfasern der Hyphen oder aus Coremia gebildet werden. Die Phialiden sind hyalin, konisch, d. h. spitz zulaufend, und bilden Phialosporen (= Phiolensporen) an der Spitze, die entweder in Form von Kügelchen oder als fragile Ketten gebildet werden. Die Sporen sind im allgemeinen nicht septiert, kugelig bis kurzzylindrisch.
Die Kolonien variieren von glatt und feucht ohne Luftmycel bis granular und flockig mit Luftmycel. Das Mycel enthält im allgemeinen funiculäre Hyphen. Die Farbe der Kolonie ist verschieden und liegt im Bereich von farblos, d. h. weiss, bis gelb bis rosa und dunkelgrau oder braun.
Morphologie und Kultureigenschaften - Cephalosporium-Stämme
In den folgenden taxanomischen Beschreibungen von Cephalosporium sp. bilden die Kulturen eine unvollständige Stufe bzw. eine "Stufe imperfecti", was für die Art Cephalosporium charakteristisch ist.
Cephalosporium sp. NRRL 5445
Sporogene Zellen werden auf unverzweigten Phialiden, die alternierend angeordnet sind, gebildet und entstehen direkt aus den synnematoischen Hyphen. Phialiden besitzen im wesentlichen einheitliche Durchmesser, wobei die Spitzen leicht konisch ausgebildet sind. Die Phialiden sind einzellig und besitzen einen durchschnittlichen Durchmesser an der Basis von 2,8 ji, ihre Länge liegt imBereich von 14 bis 25 J. ! und beträgt durchschnittlich 21 p. Die Phialosporen treten im allgemeinen in Ketten auf, enden jedoch üblicherweise in Sporenknäulen bei älteren Kulturen. Die Phiolensporen sind hyalin, erscheinen jedoch in der Masse leicht ockerfarben bis mittelgelb-rosa (Maerz und Paul Farbplatte 2-9A).
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kehrfarbe ist schwach-orange.
Modifizierter V-8 Saft-Agar ergibt eine Kolonie, die einen Durchmesser von 37 mm besitzt, ausgehend von einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 17 mm. Die Lufthyphen sind etwas länger als die der Kolonien des Czapekmediums. Die Kolonie ist mässig gelblich-rosa. unddie Umkehrfarbe ist bräunlich- gelb -
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Konidien treten nur in mässiger Zahl auf.
Die Phialiden sind hyalin, zugespitzt und besitzen Längen im Bereich von 55,8 bis 92, lez die durch- schnittliche Länge beträgt 66,2 bt. Sie verlaufen konisch von 2,3 juin der Basis zu einer Breite von 0, 5/l in der Spitze.
Die unicellularen, hyalinen, länglichen bis elliptischen Konidien besitzen Längen im Bereich von 5,6 bis
7, 7 ,rund Breiten im Bereich von 2,5 bis 3,5 J. ! j ihre durchschnittliche Grösse beträgt 6, 8 bis 3, 1 J. !.
Cephalosporium sp. NRRL 5716
Die Kolonien auf den oben beschriebenenAgarmedien bilden kein makroskopisch sichtbares, freies Luft- mycel, sondern man beobachtet ein fast glattes, flaches, feuchtes, pastiges Mycel, das durch leicht radiale Falten gezeichnet ist.
Das Lösungsagar von Czapek ergibt eine Kolonie, die aus einer inokulierten Fläche mit einem Durchmesser von 20 mm einen Durchmesser von 32 mm erreichen kann. Die Phialiden entstehen aus festgepackten, niederliegenden Synnemata und verbreiten sich von der Myceloberfläche randomartig. Diese Kolonie ist schwachgelblich-weiss und besitzt eine glatte Gesamtperipherie. Die Umkehrfarbe ist weiss. Es bildet sich ein lösliches, schwachgelbliches grünes Pigment.
Die Kartoffe1- Dextrose-Agarkolonien ähneln den Czapekkolonien in der Grösse, der Farbe, der Phialidenbildung, der Konsistenz und dem Pigment. Sie unterscheiden sich dadurch, dass die Kartoffel-Dextrose-Kolonien durch einen engen, radial gefalteten, gefransten Rand begrenzt sind. Nach 14 Tagen wird das lösliche Pigment intensiver.
Malzextrakt-Agarkolonien sind ähnlich wie die auf dem Lösungsagar von Czapek, die lösliche Pigmentbildung tritt jedoch nicht auf. Bis zu 7 Tagen ist diese Kolonie auf beiden Oberflächen weiss und nach 14 Tagen wird sie schwachgrünlich-gelb auf beiden Oberflächen.
Modifizierter V-8-Saftagar ergibt eine Kolonie, die sich von den obigen Kolonien in verschiedenen Eigenschaften unterscheidet. Sie ist hellbraun und besitzt relativ tiefe, enge radiale Falten. Die Umkehrfarbe ist schwach-braun und das Mycel dringt gut in den Agar ein. Lose, farblose Lufthyphenbüschel punktieren die
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gelb. Der Kolonierand steht in scharfem Kontrast mit dem Hauptteil der Kolonie.
Die Phialiden sind hyaline, einzellige und spitze Strukturen. Sie sind von 18, 9 bis 29, 4 julangundan ihrer Basis 2,8 li breit, die durchschnittliche Grösse beträgt 24,6 x 2,8 m.
Die Konidien sind hyalin, einzellig und elliptisch. Sie sind von 3, 5 bis 4, 2 lang und 2, l ju breit, die durchschnittliche Grösse beträgt 4, 1 x2, 1 jn.
Cephalosporium sp. NRRL 5719
Dieser unvollendete Zustand des Pilzes wird als genus Cephalosporium corda klassifiziert. Es wird keine vollendete Stufe gebildet.
Die Kolonien sind auf Lösungsagar von Czapek rar, farblos und nicht sporenbildend bis zu 10 Tagen bei 26 C. Die Anwesenheit zahlreicher Sporen auf der Agaroberfläche zeigt an, dass auf diesem Agar keine Kei- mung auftritt. Die Kolonien auf Malzextrakt-Agar besitzen die Neigung, relativ flach zu wachsen und eine inokulierte Fläche mit einem Durchmesser von 17 mm ergibt Kolonien mit einem Durchmesser von 29 mm.
Die Peripherie ist scharf begrenzt und etwas ausgebogen. Gelegentliche Büschelaus flockigen bis funiculösen
Hyphen erstrecken sich über die untere wuchernde Hyphenoberfläche. Diese Kolonien sind sehr schwach rosa-weiss und dieUmkehrfarbe ist weiss. Einige Phialiden mit endständigen Ketten und Büschel aus Konidien entstehen aus den wuchernden Funiculi und individuellen Hyphenfilamenten. Kartoffel-Dextrose-Agar ergibt eine falche, gekerbte oder gesägte Kolonie, die austernweiss auf beiden Flächen ist und die aus einem inokulierten Bereich mit einem Durchmesser von 18 mm zu einer Kolonie mit einem Durchmesser von 26 mm wächst.
Das Luftmycel enthält schwach flockenartige Hyphen, die lose mit funicu1ösen Hyphensträngen verwebt sind, aus denen zahlreiche Phialiden entstehen, von denen einige laterial verzweigt sind. Die Konidien bilden sich an der Spitze der Phialiden in feuchtenBüscheIn und selten InKetten. Mit dem Alter sammeln sich die Sporen in der Feuchtigkeit an den Hyphenfilamenten und Funiculi. ModifizierterV-8-Saft-Agar ergibt das beste Luftwachstum. Die weissen Lufthyphen werden beige mit zahlreichen Sporen. Die Oberfläche ist unregelmässig flockig und enthält sowohl Funiculi als auch Synnemataund zeigt einen geringfügig gekerbten Rand. Die Phialiden bilden sich lateral sowohl auf den Funiculi als auch auf den Synnemata. Die Sporulation tritt wie auf Kartoffel-Dextrose-Agar auf.
Die Phialiden sind einzellig, hyalin und von 17bis26, 4jnlangundanihrerBasis3 breit. Die durchschnittliche Grösse beträgt 11 x 3 je, wobei sie konisch zu 1, 5 li zulaufen.
Die Konidien sind hyalin, dickwandig, etwas rauh und kugelförmig bis elliptisch. Sie sind von 4, 2 bis 5,25 li lang und von 2, 1 bis 3,5 ,breit, ihre durchschnittliche Grösse beträgt 4,64 x2, 85 Jl.
Cephalosporium sp. NRRL 5720
Das Wachstum auf Lösungsagar von Czapek bei 260C während 10 Tagen ist mässig und Luftmycel wird nicht gebildet. Die Kolonie befindet sich hauptsächlich unter der Oberfläche bzw. im Wasser, verbreitert sich nur 3 bis 5 mm und hat einen unbestimmten Rand.
Nach 10 Tagen bei 260C ergibt Kartoffel-Dextrose-Agar eine Kolonie, die sich von einer inokulierten
Zone mit einem Durchmesser von 12mm auf eine Zone mit einem Durchmesser von 37 mm vergrössert. Die- se Kolonie ist mit Ringen und Streifen gezeichnet und enthält alternierende Banden mit und ohne Luftmycel.
Sie ist flockig bis funiculös und synnematisch. Die Kolonie ist gelblich-weiss und die Umkehrfarbe ist schwach- gelb. Die Phialiden entstehen aus den Funiculi, den Synnemata und den wuchernden Hyphen.
Malzextrakt-Agar-Kolonien erreichen einen Durchmesser von 31mm beim Wachsen auf einer inokulierten Fläche mit einem Durchmesser von 16 mm. Die Kolonie ist mit Ringen und Streifen gezeichnet und mit einem engen, ungebrochenen Rand aus Lufthyphen begrenzt. Die Zeichnung mit Ringen und Streifen, die Konidienstufen und die Farbe sind so, wie es bei den Kolonien auf Kartoffel-Dextrose-Agar beschrieben ist.
Modifizierter V-8-Saft-Agar ergibt Kolonien, die das meiste Luftmycel enthalten. Diese Kolonien wachsen aus einer inokulierten Fläche mit einem Durchmesser von 13 mm zu einer Kolonie mit einem Durchmesser von 37mm. Das Luftmycel ist dicht und zusammengewebt, stark funiculös, flockig und fast wollähnlich. Die Kolonie ist schwach gelblich-rosa. Die Umkehrfarbe zeigt alternierende Ringe, die schwach gelblich-lohfarben im Zentrum als ein dunklerer Ring sind usw.
Die Phialiden sind lang, spitz, tubular, mit hyalinen Strukturen, die in ihrer Basis knollig ausgebildet sind. Sie sind von 15,4 bis 24, 5 ,u lang, von 2, 1 bis 3, 5 jn an ihrer Basis breit undbesitzen durchschnittliche Grössen von 19,9 x2, 5 ; n.
Die Konidien sind im allgemeinen glatt, einige sind warzig, hyalin und kugelförmig bis subkugelformig.
Sie besitzen Durchmesser im Bereich von 2,8 bis 4, 9 Mund durchschnittliche Durchmesser von 3, 65 j. t.
Cephalosporium sp. NRRL 5721
AufAgar vonCzapek ist das Wachstum sparsam, nicht pigmentiert und nicht sporenbildend. Die Kolonien auf Malzextrakt-Agar erreichen aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 15 mm in 7 Tagen bei 260C einen Durchmesser von 28 mm. Das Luftmycel ist flockig bis samtartig. Mikroskopisch ist es funiculös und mit Synnemata versehen, die entweder aufgerichtet sind oder liegen. Die Kolonie ist mit Ringen oder Streifen gezeichnet, zeigt eine Grenze und einen inneren Rand mit verschiedenen Tönungen. Sie ist mä-
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ssig gelblich-rosa und wird von einem Rand umgeben, der schwach gelblich-rosa ist. Die Umkehrfarbe ist schwach gelblich-grün.
Kartoffel-Dextrose-Kolonien, die aus einer Zone aus Inokulum mit einem Durchmesser von 15 mm wachsen, werden von einem eingekerbten, farblosen, schleierartigen Rand umgeben, der 8 mm breit ist. Die
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weissen, kurzen Luftfilz. Nach 14 Tagen wird die Kolonie schwach gelb-braun, die Umkehrfarbe ist mässig orange-gelb, wobei die Peripherie einen schwächeren Ton besitzt.
Modifizierte V-8-Saft-Agarkolonien wachsen von einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 15 mm zu Zonen mit Durchmessern von 38 mm einschliesslich eines 3 bis 4 mm breiten, schleierartigen, farblosen, etwas gekerbten Randes. Der Hauptkörper der Kolonie enthält funiculäre Hyphenfilamente, die in einem bandartigen Muster zusammengewebt sind. Die Kolonie ist etwas flockig und zeigt geringe radiale Falten. Sie ist schwach braun mit einer gelblich-braunen Umkehrfarbe.
Alle Agars zeigen synnematische Hyphen, aber dieser Zustand wird am besten auf Kartoffel-Dextroseund modifizierten V-8-Saft-Agar beobachtet. Glatte, unicellulare, hyaline Phialiden entstehen aus den Synnemata und aus den wuchernden Funiculi und sind bei den Kartoffel-Dextrose-Agarkolonien beschrieben.
Diese Phialiden sind im Bereich von 9, 1 bis 38, 5 lang und von 2, 1 bis 2,8 ,breit an ihrer Basis. Sie besitzen durchschnittliche Grössen von 22, 26 x 2,5 li und verlaufen spitz auf 0,7 li zu. Die Konidien sind unicellular, glatt, hyalin und kugelförmig bis subkugelförmig. Sie sind von 2,8 bis 4,9 julang und von 2,8 bis 4,2 jn breit, im Durchschnitt besitzen sie Grössen von 3,6 x 3, 1 but.
Cephalosporium sp. NRRL 5722 AufLösungsagar vonCzapek erreichen sie Durchmesser von 32mm aus inokulierten Flächen von 14 mm.
Das Mycel ist flach, farblos auf beiden Oberflächen, radial durchfurcht und frei von Luftmycel. MalzextraktAgarkolonien wachsen zu Kolonien mit einem Durchmesser von 36 mm aus einer inokulierten Fläche mit einem Durchmesser von 20 mm. Die Lufthyphen sind funiculär und besitzen sowohl aufstehende als auch liegende Synnemata, sie sind radial durchfurcht und von einem flachen, glatten, 2 mm breiten Rand umgeben.
Die Phialiden entstehen sowohl aus den Funiculi als auch den Synnemata mit einer guten Konidienentwicklung. Malzextrakt-Kolonien sind rosa-gelbbraun und ihre Umkehrfarben sind mittel-gelblich-weiss. Die Kolonien, die auf Kartoffel-Dextrose-Agar wachsen, sind funiculär, scheinen samtartig zu sein und enthalten kurze, aufrechte Hyphenfilamente. Die Konidien sind rar. Die Kultur ergibt eine gräulich-weisse Kolonie mit einem mittelgrauen-braunen, 2 mm breiten Rand und die Umkehrfarbe ist mittelgelb. Sie erreicht einen Durchmesser von 30mm aus einer inokulierten Fläche von 16mm Durchmesser. Aufmodifiziertem V-8-Saft- Agar besitzen die Kolonien schwach gräulich-weisse Lufthyphen, die bei der Sporulation beige bis lederfarben werden.
Die Umkehrfarbe ist hellbraun mit einem gelblich-weissen, 3 mm Rand bzw. Saum. Die inokulierte Fläche mit einem Durchmesser von 15 mm wächst zu einer Kolonie mit einem Durchmesser von 34 mm in 10 Tagen bei 260C. Diese Kolonie enthält einen relativ tiefen, flockenartigen bis funiculären Luftfilz und ist stark synnematon.
Die Konidienstufe wurde in allen drei Medien beobachtet. Die Phialiden sind hyalin, einzellig, konisch verlaufend und spitz. Sie besitzen in ihrer Basis Breiten im Bereich von 1, 4 bis 3,5 ltund verlaufen spitz zu 1, 4 jn ; sie sind von 10,5 bis 25,9 li lang und die durchschnittliche Grösse beträgt 20,2 x3, 75 ju. Die Konidien sind einzellig, hyalin, elliptisch bis oval bis oboval und bilden entweder Ketten oder schleimige (mucoide)
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14, 0 x 2, 45 JL.
Cephalosporium sp. NRRL 5723
Diese Kultur wird durch ihre imperfekte Stufe gekennzeichnet und gehört zu der Art Cephalosporium corda. Keine perfekte Stufe ist evident. Das Wachstum ist auf allen Agars beschränkt und man beobachtet eine Reihe von unregelmässigen Lappen, die sich radial von der inokulierten Stelle erstrecken.
Auf Lösungsagar von Czapek wird eine Kolonie gebildet, die unregelmässig gekerbt bis lobulär (= kleinlappig) ist und die Lappen sind gefranst. Die unregelmässige Lappenbildung ergibt Unterschiede im Durchmesser, die von 25 bis 30 mm betragen und sich von einer 12 mm inokulierten Zone expandieren.
Die freien Luftkomponenten sind rar und werden mikroskopisch beobachtet. Sie bestehen aus zerstreuten Phialiden, Synnemata und Lufthyphenfasern. Diese Kolonie ist auf beiden Flächen farblos.
Kolonien auf Kartoffel-Dextrose-Agar sind tief und unregelmässig gelappt und bilden nur beschränkte weisse Lufthyphen und werden von einem glatten, 3 mm breiten Rand umgeben. Sie haben Durchmesser im Bereich von 30 bis 35 mm. Sowohl die aufgerichteten als auch die liegenden Synnemata ergeben Phialiden, die in Ketten oder feuchten Knäulen Sporen bilden. Das vegetative Mycel ist flach, hellgräulich-braun, die Umkehrfarbe ist schwach gelblich-braun.
Die Malzextrakt-Kolonien sind stark und unregelmässig kleinlappig und sie besitzen einen engen, radial gefalteten Rand. Sie sind mittel-bräunlich-rosa, die Umkehrfarbe ist schwach gelblich-rosa. Die Phialidenund Konidienbildung ist ähnlich wie bei den Kartoffel-Dextrose-Kolonien, jedoch stärker.
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Modifizierter V-8-Saft-Agar ergibt eine Kolonie, die in ihrem Durchmesser bis zu 40 mm variiert, ausgehend von einer inokulierten Fläche mit einem Durchmesser von 15 mm. Ein ungleichmässiger, kleinlappiger, farbloser, unter der Oberfläche befindlicher, 3 mm breiter Rand umgibt die Kolonie. Diese Kolonie ist flockig bis funiculär, wobei die Synnemata und Lufthyphen als flache Oberfläche auftreten und am Rand ein dichteres und tieferes Wachstum beobachtet wird. Es ist schwach bräunlich-rosa und die Umkehrfarbe ist schwach bräunlich-gelb. Die Phialiden entstehen aus den Synnemata, Funiculi und wuchernden Hyphen.
Auf Kartoffel-Dextrose-und auf modifiziertem V-8-Saft-Agarwerdeninden Kolonien Phialiden beobachtet und aus diesen Kolonien beschrieben. Sie sind hyalin, unicellular, mit knolliger Basis und sie verlaufen langsam konisch zu einer Spitze mit einer Breite von 1 fl. Durchschnittlich sind sie von 12,5 bis 23,0 ju lang und an ihrer Basis von 2, 1 bis 2, 8 ,breit. Die durchschnittliche Grösse beträgt 19,0 x 2,3 jn.
Die Konidien sind unicellular, hyalin, glatt und elliptisch bis oval. Sie sind von 2,8 bis 5, 6jnlangund von
2, 1 bis 3,5 li breit. Die durchschnittliche Grösse beträgt 4,48 x2, 8 .
Cephalosporium sp. NRRL 5724
Luftfreie Hyphen sind auf allen, im folgenden beschriebenen Medien rar und treten entweder als flockenartige Büschel oder als gestreute einzelne Strähnen auf einem feucht erscheinenden Mycel auf.
Inokulum, das auf eine Fläche mit einem Durchmesser von 17 mm auf Lösungsagar nach Czapek aufgebracht wurde und bei 26 C während 10 Tagen inkubiert wurde, wächst zu einer Kolonie mit einem Durchmesser von 39 mm. Ausgezackte Stellen einer ungleichmässig gezackten Peripherie scheinen sich im Mittelpunkt der Kolonie durch radiale Reihen mit weniger Entwicklung zu verbinden. Verstreute Phialiden entstehen auf der flachen Myceloberfläche und unterstützen feuchte Konidienbüschel. Das Mycel ist schwach gelblichweiss. Die Umkehrfarbe ist weiss.
Malzextrakt-Agarkolonien wachsen von einer inokulierten Fläche mit einem Durchmesser von 18 mm zu Kolonien mit Durchmessern von 37 mm. Diese Art der Kolonie besitzt einen 4 mm breiten Rand, der schleierarüg ist und dessen äusserer Saum unklar ist. Der Hauptteil der Kolonie ist flach und glattundbesitzt ein kreisförmiges Muster aus unregelmässig angeordneten Büscheln, die die Kolonie von dem Rand trennen. Verstreute Phialiden, die feuchte Knäule aus Konidien tragen, treten randomartig über der schwach rosa-gelbbraunen Oberfläche auf. Die Umkehrfarbe der Kolonie ist schwach gelblich-weiss.
Kartoffel-Dextrose-Agar ergibt, wenn er mit einer Zone mit einem Durchmesser von 14 mm inokuliert wurde, eine Kolonie mit einem Durchmesser von 35 mm. Der Rand ist 4 mm breit, schleierartigund hauptsächlich submers. Diese Kolonie ist flach und glatt und enthält zerstreute, flockenartige bis funiculäre Büschel aus Hyphen. Die Phialiden bilden Konidien in kurzen Ketten oder feuchten Knäulen, sind jedoch relativ selten und auf der Oberfläche gut verstreut. Die Kolonie ist schwach orangegelb auf beiden Seiten, aber auf der umgekehrten Seite etwas schwacher gefärbt. Der gefärbte Teil ist unregelmässig gelappt.
Modifizierte V-8-Saft-Agarkolonien wachsen von einer inokulierten Fläche mit einem Durchmesser von 15 mm zu Kolonien mit einem Durchmesser von 34 mm. Ein schleierartiger, 3 bis 7 mm breiter Rand um-
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messer von 15 mm.
Kartoffel-Dextrose-Agar ergibt auf einer inokulierten Fläche mit einem Durchmesser von 15 mm eine
Kolonie mit einem Durchmesser von 28 mm. Die Kolonie ist dünn, schleierartig und funiculär. Die Peripherie ist schwach ausgebogen. Es sind schwach strahlenförmig verlaufende Falten vorhanden, die zu den ausgebo- genen Einkerbungen verlaufen. Die Kolonie ist auf beiden Flächen farblos.
Auseinanderlaufende Phialiden entstehen aus den Funiculi, Synnemata und wuchernden Hyphen. Diese
Phialiden verlaufen schwach konisch, sie sind hyalin, glatt und unverzweigt. Sie sind an ihrer Basis 3 jn breit und in ihren Spitzen 0,5 ja breit. Sie besitzen Längen im Bereich von 9,5 bis 35,0 M, die durchschnitt- liche Grösse beträgt 22 x3 jn.
Die Konidien werden in feuchten Knäulen oder Ketten an den Spitzen der Phialiden gebildet. Diese Konidien sind hyalin, glatt, einzellig und subkugelförmig bis elliptisch. Sie sind von 2, 1 bis 3,5 jet breit und von 2, 1 bis 4,2 p, lang. Die durchschnittliche Grösse beträgt 3,43 x 2,63 p.
Wie zuvor erwähnt, sind die Fungi, die bei dem erfindungsgemässen Verfahren nützlich sind, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sie Penicillin N bilden. Zusätzlich besitzen die oben beschriebenen Fungi die morphologischen Eigenschaften der Bildung von Phiolensporen aus Phialiden, die entweder einzeln aus Hyphen oder aus verzweigten oder unverzweigten Konidiophoren gebildet werden.
Die oben beschriebenen Stämme von Cephalosporium wurden ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit bei der dauernden Kulturkollektion von der Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Serive, United States Department of Agriculture, Pedria, Hlinois 61604, hinterlegt, wo den Kul- turen die bei der zuvor angegebenen taxanomischen Beschreibung nach dem Namen der entsprechenden Kultur aufgeführten Zahlen als Eingangszahlen zugeordnet wurden.
Die restliche Kultur, die die letztere Bezeichnung ATCC besitzt, nämlich Cephalosporium chrysogenum ATCC 14615 wurde ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit bei der permanenten Kulturkollektion von American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt.
Wie zuvor erwähnt, wird ein Organismus, der bei der Erfindung verwendet wird, nach einem submersen aeroben Fermentationsverfahren kultiviert. Das Kulturmedium, das verwendet werdenkann, kannirgendeines einer Anzahl von unterschiedlichen Medien sein. Beispielsweise kann man verschiedene Kohlenstoffquellen verwenden wie Saccharose, Glucose, Stärke und ähnliche Kohlenstoffquellen. Ähnlich kann man die Stickstoffquellen aus einer Vielzahl von Verbindungen auswählen wie Sojabohnenmehl, Sojabohnengriess oder-staub, Baumwollsamenöl, Erdnussmehl, Aminosäuren, Aminosäuremischungen, Peptonen u. ähnl.
Aus Wirtschaft- lichkeitsgründen bei der Herstellung, wegen der maximalen Ausbeute und der leichten Isolierung sind bestimmte Medien bevorzugt, beispielsweise sind Melassen eine bevorzugte Quelle von Kohlenhydraten, und bevorzugt Quellen von Stickstoff sind Sojabohnenmehl und Aminosäuren.
Anorganische Nährsalze, die in das Kulturmedium einverleibt werden können, umfassen die gewöhnli-
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stimmte unentbehrliche Spurenelemente für das Wachstum, ihre Entwicklung und ihren Metabolismus. Solche Spurenelemente können zu dem Fermentationsmedium zugegeben werden, jedoch sind sie im allgemeinen in ausreichender Menge als Verunreinigungen in den andern Bestandteilen vorhanden, die zu dem Kulturmedium zugefügt werden.
Die erfindungsgemäss verwendeten Cephalosporiumorganismenkonnen in Vorrichtungen kleiner Grosse wie in 1 l-Schüttelkolben kultiviert werden, wobei man geringe Mengen an Deacetoxycephalosporin C erhält. Für eine Herstellung der Cephalosporinverbindungen in grösserem Massstab werden die Organismen in Fermen- tationstanks in grösserem Massstab unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen kultiviert.
Bei derHerstellung vonDeacetoxycephalosporin C in grösserem Massstab werden die Sporen der Organismen auf einer Agar-Schrägfläche gehalten. Die Sporen aus der Schrägfläche werden verwendet, um ein vegetatives Medium mit geringem Volumen zu inokulieren. Das vegetative Medium wird inkubiert, wobei man eine
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DiesesInokulum für das Fermentationsmedium in grösserem Massstab verwendet. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, weiteres vegetatives Medium als Inokulum für das Fermentationsmedium zu verwenden. Solche vegetativen Medien der zweiten Stufe oder Organmedien werden im allgemeinen verwendet, wenn das Volumen des Fermentationsmediums signifikant oder wesentlich grösser ist als das Volumen des ersten vegetativen Mediums.
Auf diese Weise werden die Sporen der Organismen zuerst in einem geringen Volumen an vege- tativemMedium kultiviert, wobei man das Inokulum für ein vegetatives Medium mit grösserem Volumen erhält. Das vegetative Medium mit grösserem Volumen bildet dann eine ausreichende Konzentration an Organismus, um einen schnellen Beginn der Fermentation in einem Fermentationstank in grossem Massstab zu initiieren. Das vegetative Medium kann die gleiche Zusammensetzung wie das Fermentationsmedium besitzen, oder es kann zusätzliche Bestandteile enthalten, um das Wachstum und die Bildung der Organismen
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in kleinem Massstab zu unterstützen.
Es wurde beobachtet, dass die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen Deacetoxycephalosporin C innerhalb eines pH-Bereiches von ungefähr PH 6, 2 bis ungefähr PH 8, 0 züchten und bilden. Während der sub- mersen, aeroben Fermentation in Tanks in grossem Massstab nimmt der pH-Wert des Mediums von einemAnfangs-PH-Wert von ungefähr 6,5 auf einen End-pH-Wert von ungefähr 7,5 zu.
Die erfindungsgemäss verwendeten Organismen können bei Temperaturen zwischen ungefähr 20 und 350C gezüchtet werden. Das Deacetoxycephalosporin C scheint bei einer Temperatur von ungefähr 2 6 C in optimalen Ausbeuten gebildet zu werden.
Die maximale Bildung vonDeacetoxycephalosporin C tritt auf, wenn der Organismus in Tanks in grossem Massstab während einer Zeit zwischen ungefähr 4 und 7 Tagen gezüchtet wird. Wenn man jedoch in Vorrichtungen In kleinerem Massstab züchtet, wie in 1l-Schüttelkolben, verläuft das Wachstum der Organismen schneller und Deacetoxycephalosporin C wird in einer kürzeren Zeit, beispielsweise während 2 oder 3 Tagen, gebildet.
Da der End-pH-Wert in Fermentationsmedium in grossem Massstab einenwert von PH 8, 0 oder höher zu erreichen scheint, kann die Ausbeute an Deacetoxycephalosporin C nachteilig beeinflusst werden. Es ist daher wünschenswert, den PH-Wert des Fermentationsmediums in grossem Massstab von Zeit zu Zeit während der Fermentation zu prüfen. Es scheint so zu sein, dass der pH-Wert solche Werte vor dem Zeitpunkt erreicht, zu dem eine maximale Bildung an Antibiotikum auftritt. Der pH-Wert kann geeigneterweise durch Zugabe einer geeigneten Säure oder eines geeigneten Puffermittels zu dem Fermentationsmedium niedriger eingestellt werden.
Die Bildung von Deacetoxycephalosporin C während der Fermentation kann verfolgt werden, indem man Testproben der Fermentationsbrühe chromatographisch untersucht. Alternativ kann die Anwesenheit von Deacetoxycephalosporin C durch Bioautographien geprüft werden. Der Organismus Pseudomonas solanacearcum kann verwendet werden, um bei der Bioautographie den Organismus festzustellen.
Wie bei den meisten submersen, aeroben Fermentationen wird sterile Luft durch das Kulturmedium
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gesäuert und dann wird das Medium 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Der pH-Wert des Mediums wird dann mit Natriumhydroxyd auf 6,0 eingestellt und das basisch gemachte Medium wird anschliessend filtriert, wobei man eine Filterhilfe verwendet, um Mycel und andere unlösliche Stoffe zu entfernen. Das wässerige Medium wird dann mit n-Butanol extrahiert, um weitere Verunreinigungen zu entfernen, und dann wird das extrahierte Medium über aktiviertem Kohlenstoff chromatographiert. Die Kohlenstoffsäule wird mit Wasser gewaschen und das Fermentationsprodukt wird daraus mit 50% gem Aceton-Wasser eluiert. Das Eluat wird zu einer wässerigen Phase konzentriert.
Die wässerige Phase wird über einem anionischen quaternären Ammoniumaustauschharz im Acetatzyklus, bevorzugt dem quaternärenAmmoniumpolystyrolharz, das im Handel erhältlich ist und als Amberlite mA-68 (Rohm and Haas, Philadelphia, Pa. ) bezeichnet wird, chromatogra- phiert. DasAustauschharz wird zuerst mit Wasser gewaschen und dann werden das Deacetoxycephalosporin C und andere mitgebildete Verbindungen mit 0, 15n wässerigem Natriumacetat eluiert. Die aktiven Eluate werden an aktiviertem Kohlenstoff absorbiert und die Säule wird mit Wasser gewaschen, um wasserlösliche Salze wie überschüssiges Natriumacetat, das von den Harzeluaten mit übergetragen wurde, zu entfernen. Das Deacetoxycephalosporin C wird aus dem Kohlenstoff mit 50%igem Aceton : Wasser eluiert.
Das Eluat wird dann zur Trockne eingedampft, wobei man rohes Deacetoxycephalosporin C als Natriumsalz erhält. Das rohe Material wird bevorzugt durch Chromatographie über eine Cellulosesäure (Avicel PH 101) gereinigt. Die Cellulosesäule wird mit Acetonitril : Wasser (80 : 20) eluiert und viele Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C, bestimmt durch Bioautogramme, enthalten, werden zusammengegeben und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der getrocknete festeRücks1andanDeacetoxycepha- losporin C wird in einer minimalen Menge an Isopropylalkohol gelöst. Die Alkohollösung wird dann in Di- äthyläther gegossen, um das Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C auszufällen.
Bei einemandern Verfahren zur Isolierung von Deacetoxycephalosporin C wird das Eluat aus dem anioni- schen Austauschharz in dem Acetatzyklus durch Eindampfen konzentriert und eine 20% ige wässerige Lösung aus Natriumacetat wird zu dem Konzentrat zugefügt. Das Konzentrat wird unter Kühlen gerührt, um das Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C auszufällen.
Die Salzform von Deacetoxycephalosporin C kann in die freie Säure durch Verfahren überführt werden, die man üblicherweise verwendet, um Salze in Säuren zu überführen. Beispielsweise kann das Salz über ein kationisches Austauschharz geleitet werden, wobei man die Säure in freier Form erhält.
Das Chromatographiesystem, das verwendet wird, um Deacetoxycephalosporin C in rohen Fermenta-
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tionsmedien oder inHarzeluatfraktionen zu identifizieren, wird unter Verwendung von Whatman Nr. 1-Chro- matographiepapier in absteigender Weise durchgeführt. Das Lösungsmittelsystem, das man zur Entwicklung verwendet, ist Acetonitril : Wasser, 80 : 20 Vol. : Vol., wobei die Kammer mit den Dämpfen der Lösungsmittelmischung, die aus n-Propanol : Pyridin : Essigsäure : Acetonitril : Wasser in Verhältnissen von 45 : 30 : 9 : 40 : 36, ausgedrückt durch das Volumen pro Volumen, besteht, gesättigt wird.
Die entwickelten Chromatogramme werden dann als Bioautogramme verwendet, wobei man Pseudomonas solanacearcum als Mikroorganismus für die Ermittlung verwendet.
Um die Chromatographie zu vereinfachen, ist es wünschenswert, die Versuchsprobe mit einer Penicilli- nase zu behandeln, bevor das Chromatogramm durchgeführt wird.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel :GetrennteSporenvonCephalosporiumsp.StammNRRL5445undCephalosporiumchrysogenum ATCC 14 615 wurden getrennt auf eine Schrägplatte aus Nähragar mit der folgenden Zusammensetzung eingeführt :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol.)
<tb> Lactose <SEP> 1
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Sojapepton <SEP> 1 <SEP> 0,25
<tb> lösliche <SEP> Stoffe, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Trocknen <SEP> von <SEP> Getreide <SEP> und <SEP> Malzextrakten <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0,05
<tb> Eisen <SEP> (a)-sulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 001
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0,2
<tb> Spuren <SEP> Minerallösung <SEP> 3 <SEP> 0,625
<tb> Agar <SEP> 2
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
1 Enzymatischer Auszug von Sojabohnenmehl "Produlac", National Distillers Products Co.
EMI10.2
100 ml entionisiertem Wasser :
EMI10.3
<tb>
<tb> Gewicht <SEP> Salz
<tb> 0, <SEP> 102g <SEP> CuSO <SEP> 4. <SEP> 5HO <SEP>
<tb> 0, <SEP> 018g <SEP> FeSO. <SEP> THO <SEP>
<tb> 0, <SEP> 126 <SEP> g <SEP> MnC1. <SEP> 4H20 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 024g <SEP> ZnSO. <SEP> 7HO <SEP>
<tb>
Die Schrägplatten wurden während 7 Tagen bei einer Temperatur von 260 inkubiert. Die reifen Schrägkulturen wurden mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und mit einem sterilen Stab leicht gekratzt, wobei man die Sporensuspensionen erhielt.
Die Sporensuspensionen, die so erhalten wurden, wurden jeweils verwendet, um zwei getrennte sterile Wachstumsmedien der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol.)
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Malzextrakt <SEP> 2
<tb> Maiswasser <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> MagnesiumsuIfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dikaliumhydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Calciumchloriddihydrat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Spur <SEP> Minerallösung <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
EMI11.2
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wurde vor der Behandlung in dem Autoklaven auf pH 6, 5 eingestellt.
Die inokulierten vegetativen Medien wurden bei einer Temperatur von 26 C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit 250 Umdr/min mit einer Weite von 5, 08 cm während 48 h inkubiert.
Die inkubieren vegetativen Medien wurden dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in einem Verhältnis von 1% vegetativem Medium pro Volumen Fermentationsmedium verwendet. Die sterilen Produktionsmedien, die verwendet wurden, hatten die folgende Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol.)
<tb> Saccharose <SEP> 4
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Natriumglutamat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Eisen <SEP> (H)-ammoniumsulfathexahydrat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Kaliumnitrat <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> Volumen
<tb>
Die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln oder Entschäumungsmitteln findet gelegentlich statt, wenn man eine Fermentation in grossem Massstab durchführt.
Der pH-Wert der Fermentationsmedien wurde vor der Sterilisation auf PH 6, 5 eingestellt. Die inokulierten Fermentationsmedien wurden dann unter Rühren bei einer Temperatur von 26 C während 5 Tagen inkubiert ; während der Fermentation wurde sterile Luft durch die Fermentationsmedien mit einer Geschwindigkeit entsprechend ungefähr 1t2 Vol. Luft/Vol. Kultur- medium/min durchgeleitet. Der End-pH-Wert der Fermentationsmedien betrug pH 7, 5.
Jeweils 151 der wie oben beschriebenen, erhaltenen vollständigen Medien wurden mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 angesäuert. Die angesäuerten vollständigen Medien wurden 1 h bei Zimmertemperatur gerührt und danach wurde der pH-Wert mit Natriumhydroxydlösung auf PH 6, 0 eingestellt. Die Medien wurden filtriert und die wässerigen Filtrate wurden mit n-Butanol zur Entfernung von unlöslichen Stoffen in Suspen- sion extrahiert. Die wässerigen Phasen wurden dann durch Säulen geleitet, die mit aktiviertem Kohlenstoff beschickt waren und die Säulen wurden mit destilliertemWasser gewaschen. Das Eluat aus der Wasserwäsche wurde verworfen. Die Säulen wurden dann mit 50% igem wässerigem Acetonelulert.
DIeEluate wurden im
Vakuum bis zur wässerigen Phase eingedampft, die dann über Säulen chromatographiert wurde, die mit
Amberlite IRA-68 einem quaternären Ammoniumpolystyrolharz im Acetatzyklus gepackt waren. Die Säulen wurden zuerst mitWasser gewaschen und dann wurde das Wasser verworfen. Die aktiven Fermentationspro- dukte wurden aus den Säulen mit 0, 15n wässeriger Natriumacetatlösung eluiert. Es wurden viele Fraktionen gesammelt und die Fraktionen aus jedem einzelnen Versuch, die Deacetoxycephalosporin C enthielten, wur- den vereinigt.
Die Anwesenheit von Deacetoxycephalosporin C in den Eluatfraktionen wurde jeweils durch Bioauto- gramme bestimmt. In jedem Versuch wurde das folgende System verwendet : Die erste Chromatographie wur- de in absteigender Weise unter Verwendung von nichtbehandeltem Whatman Nr. 1 Chromatographiepapier durchgeführt. Als Elutionslösungsmittelverwendete manAcetonitril : Wasser (80 : 20%). Der Boden der Chro- matographiekammer war mit einer Lösungsmittelmischung, die 300 ml einer Lösung aus 37, 5% n-Propanol, 25% Pyridin, 7, 5% Essigsäure und 30% Wasser enthielt und die auf 100 ml mit Acetonitril verdünntwar, be- schichtet. Die Lokalisierung von Deacetoxycephalosporin C auf dem Chromatogramm erfolgte, indem man
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BioautogrammPATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässerigen Kulturnährmedium unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen einen Pe- nicillin N bildenden, zur Gattung Cephalosporium gehörenden Mikroorganismus NRRL 5445, ATCC 14615,
NRRL 5712, NRRL 5716, NRRL 5718, NRRL 5719, NRRL 5720, NRRL 5721, NRRL 5722, NRRL 5723,
NRRL 5724 oder NRRL 5725 züchtet, bis eine wesentliche Menge an Deacetoxycephalosporin C von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet wird, und man dann das Deacetoxycephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert.