DE2824390A1 - Verfahren zur gewinnung von nahrungsmittelproteinen und fermentationsvorrichtung - Google Patents

Description

VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER EJSHOLD FUES VONKREISLER^ g KELLER SELT1N£$2439Q

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. van Kreisler "f" 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln

5 KÖLN 1

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

2. Juni 1978 AvK/Ax

Instiut National de la Recherche Agronomique 149, Rue de Grenelle, Paris, Frankreich

Verfahren zur Gewinnung von Nahrungsmittelproteinen und Fermentationsvorrichtung

N... m™ 809883/064S

IJ IU 41

Telefon: (02 21) 23 45 41 - 4 ■ Telex: 888 2307 dopa d ■ Telegramm: Dompatent Köln

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Nahrungsmittelproteinen aus Pilzen oder mehrzelligen Mikroorganismen, insbesondere unter Verwendung eines neuen mehrzelligen Mikroorganismus. Die Erfindung umfaßt ferner die in dieser Weise erzeugten Nahrungsmittelproteine. Die Erfindung ist außerdem auf eine Fermentationsvorrichtung gerichtet, die für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung besonders gut geeignet ist. Ferner umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Mutation von Mikroorganismen, insbesondere von Pilzen.

Die Mikroorganismen (Bakterien, Hefen und Pilze) spielen bei der Verarbeitung von Nahrungsmitteln für Mensch und Tier durch Einwirkung ihrer Enzyme eine Rolle und werden für die großtechnische Erzeugung von organischen Molekülen verwendet, von denen viele allgemein bekannte Metaboliten (Äthanol, Essigsäure, Citronensäure, Glycerin, Lysin, Glutaminsäure, Ascorbinsäure usw.) sind.

Seit Beginn des Hirtenzeitalters werden Mikroorganismen auf verschiedenen Substraten (Melasse, Bagasse, Milchserum, Sulfitablauge usw.) zur Verwertung von Nebenprodukten und zur Gewinnung von Biomassen kultiviert. Die Biomassen wurden vor allem in der Viehfütterung als Zusatz, der Vitamine, Mineralsalze und Proteine enthält, verwendet.

Aus konjunkturellen Gründen blieb die Entwicklung dieser Methoden lange Zeit begrenzt. Die Hauptursachen für diese Stagnation sind die Unregelmäßigkeiten in der Qualität, die Schwierigkeiten der Führung der Kulturen

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und der Erhaltung der Stämme, das Auftreten von billigeren Proteinquellen und Vitaminen, die Strukturveränderung in der Industrie als Folge der Entdeckung fossiler Rohstoffe, die die landwirtschaftliche Entwicklung beschleunigt hat, usw..

In den beiden letzten Jahrzehnten hat die großtechnische Erzeugung von Biomassen einen sehr deutlichen Aufschwung genommen. Die Faktoren, die für den Aufschwung maßgebend sind, sind hauptsächlich der Fortschritt der molekularen Biologie, die Entdeckung von Mikroorganismen, die unkonventionelle Energiequellen (beispielsweise. Paraffine) verbrauchen, die Notwendigkeit der Verwertung und Unterbringung der immer umfangreicher werdenden Abwasser und Rückstände aus der Landwirtschaft und Lebensmittelindustrie, der wachsende Proteinbedarf, das Auftreten neuer Technologien, die auf die Verringerung des Energieverbrauchs gerichtet sind, usw·

Eine intensive Forschung über die Kultur von Biomassen ist seit 1960 ins Leben gerufen worden. Sie erstreckte sich auf die Hefen, die Alkane verbrauchen, die Bakterien, die Methanol oxydieren, die auf kohlensäurehaltigen Medien wachsenden Spiruline und die Pilze, die verschiedene Arten von Abwässern und Rückständen zu verwerten vermögen.

Fütterungsversuche mit zahlreichen Tierarten haben den Nachweis des hohen Nährwerts und der Unschädlichkeit der in dieser Weise hergestellten Biomassen erbracht. Die Mikroorganismen, die Nahrungsmittelproteine zu erzeugen vermögen, sind die Bakterien und Pilze (Hefen und Fadenpilze), die die folgenden Eigenschaften aufweisen müssen:

1) Gute Spezifität gegenüber den Substraten. 809883/0645

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2) Kurze Verdoppelungszeit (20 Minuten bis 5 Stunden).

3) Hoher energetischer Wirkungsgrad (100 g Kohlenhydrate = 25 bis 32 g Proteine).

4) Wachstum bei den gewünschten Temperaturen (20° bis 50°C).

5) Wachstum bei extremen pH-Werten.

6> Wachstum bei geringen oder hohen Substratkonzentrationen.

7) Maximale Erschöpfung des Mediums (Reduzierung von DCO und DBO₅ um 90 bis 98%).

8) Die Isolierung und Trocknung der Biomasse müssen leicht sein.

9) Der Gehalt an Proteinen muß hoch sein (40 bis 65%).

10) Der Gehalt an Nucleinsäuren und Zellwänden muß gering sein.

11) Die verwendeten Mikroorganismen dürfen nicht pathogen sein (Virulenz und Ausscheidung von Toxinen), keine Bakteriozine bilden und keinen unangenehmen Geruch und Geschmack aufweisen.

12) Der Protein-Ausbeutekoeffizient (coefficient d'efficacite protidique (C.E.P.)(PAK) der Biomasse muß hoch sein.

Es wurde nun - soweit der Anmelderin bekannt, zum ersten Mal - gefunden, daß ein fadenförmiger Mikroorganismus als Nahrungsmittel geeignet ist. Zwar werden fadenförmige Bakterien und Pilze z.Zt. in der Nahrungsmitteltechnologie und für die Herstellung verschiedener Metaboliten, Vitamine, Aminosäuren, Antibiotika, Enzyme usw. verwendet, jedoch werden nur die Hefen in genügend großem Umfange kultiviert, um als Nahrungsmittel verbraucht werden zu können. Diese Fähigkeit der Hefen, große Mengen von Biomassen zu liefern, hat sich mit der Entdeckung ihrer Fähigkeit, auf Alkanen zu wachsen,

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bestätigt. Zahlreiche Arbeiten und Zeitschriften berichten über die Herstellung und die Eigenschaften der Nährhefen als Nahrungsmittel.

Der für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendete fadenförmige Mikroorganismus gehört zur Gattung Trichoderma.

Es wurde ferner gefunden, daß ein solcher fadenförmiger Mikroorganismus die Verwertung gewisser proteinhaltiger Substrate, insbesondere gewisser Substrate mit hohem Proteingehalt, deren Verwertung dadurch begrenzt ist, daß sie beispielsweise toxische Produkte und/oder Produkte enthalten, die ihnen einen gewissen bitteren Geschmack verleihen, ermöglicht.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht somit die Gewinnung von Nahrungsmittelproteinen durch Einwirkung dieses fadenförmigen Mikroorganismus auf proteinhaltige Substrate. Die Erfindung umfaßt ferner die in dieser Weise erhaltenen Proteinprodukte, die aus modifizierten (gereinigten, entgifteten oder von bitterem Geschmack befreiten) Proteinen des Substrats gegebenenfalls in Mischung mit Proteinen des fadenförmigen Mikroorganismus oder ausschließlich aus Proteinen des fadenförmigen Mikroorganismus bestehen.

Das Verfahren zur Herstellung von Nahrungsmittelproteinen besteht darin, daß man unter den nachstehend näher genannten Bedingungen einen fadenförmigen allesfressenden Mikroorganismus kultiviert, der insbesondere landwirtschaftliche Produkte und die Rückstände und Abfälle der Nahrungsmittelindustrie zu verstoffwechseln oder proteinhaltige Substrate zu reinigen, zu entgiften und den bitteren Geschmack zu beseitigen vermag.

Gemäß der Erfindung kultiviert man den Pilz Trichoderma album in flüssigen Nährmedien bei einer Temperatur unter

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28°C. Der pH-Wert des Nährmediums wird zwischen etwa 3,7 und 4,8 gehalten. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff beträgt etwa 6 bis 10 mg/1. Die Kultivierung wird unter kräftigem Rühren, das den Mikroorganismus nicht schädigt, unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß praktisch keine Überquellen stattfindet..

Der für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Pilz Trichoderma album ist ein neuer Mikroorganismus, der bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes des Pasteur-Instituts, Paris, am 2.6.1977 unter der Nummer 1-032 hinterlegt worden ist. Dieser Pilz sowie das Verfahren zu seiner Gewinnung werden nachstehend ausführlicher beschrieben.

Als Nährmedien, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, d.h. auf denen Trichoderma album gedeiht, kommen flüssige Medien in Frage, die Eiweißstickstoff, Aminostickstoff oder mineralischen Stickstoff (ammoniakalisch oder Nitratstickstoff), die im allgemeinen als Abfälle und Rückstände verworfen werden. Sie stammen im allgemeinen aus landwirtschaftlichen Produkten, Nebenprodukten und Abfällen und Rückständen der Landwirtschaft und Nahrungsmittelindustrie. Diese Medien können auch aus proteinhaltigen Substraten, die verwertet werden sollen, gebildet werden.

Als Beispiele geeigneter landwirtschaftlicher Produkte seien genannt: Mehle aus Weizen, Roggen, Mais, Gerste, Hafer, Erbsen usw., Knollen- und Wurzelfrüchte wie Kartoffeln, Topinamburen, Maniok, süße Bataten, Zuckerrüben, Melasse und Pulpe von Zuckerrüben, Möhren, Rutabagas usw., Fruchtfleisch und Schalen von Früchten und Obst wie Bananen, Ananas, Orangen, Äpfeln und verschiedene Treber, Faserprodukte wie Bagasse, Stroh und Holz. Diese Medien können als solche verwendet oder vorher pasteurisiert oder sterilisiert werden.

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Als landwirtschaftliche und technische Abfallprodukte und Abwasser, die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, eignen sich insbesondere Kot von Geflügel, Jauche, Haushaltsabfälle, Abwasser, Abwasser von Konservenfabriken, proteinverarbeitenden Betrieben, Schlempe von Brennereien, Maisquellwasser, Diffusionswasser von Zuckerfabriken und von der Meeresfauna stammende Produkte, insbesondere Fisch, und Krustentiere, z.B. Krill. Bei diesen Produkten handelt es sich insbesondere um das Pressenwasser (fish soluble) und die Konzentrate von löslichem Fischeiweiß. Als Beispiele von Proteinsubstraten sind insbesondere die Pulpe der Zuckerrübe und die Konzentrate von löslichem Fischeiweiß zu nennen. Als NShrmedien eignen sich ferner Gemische der vorstehend genannten Produkte.

Wenn Eiweißsubstrate verwendet werden, die verwertet werden sollen, wird der Pilz Trichoderma album unter den vorstehend genannten Bedingungen kultiviert, bis die unerwünschten Eigenschaften dieser Substrate beseitigt worden sind. Wenn beispielsweise als Nährraedium ein Konzentrat von löslichem Fischeiweiß verwendet wird, das bittere Stoffe enthält, wird das Verfahren gemäß der Erfindung angewendet, bis das Proteinsubstrat frei von bitterern Geschmack ist. Das erhaltene Proteinsubstrat enthält natürlich das Mycel von Trichoderma album, das nach üblichen Trennmethoden entfernt werden kann.

Die Konzentrate von löslichem Fischeiweiß enthalten im allgemeinen etwa 90% Proteine, die einen bestimmten Nährwert haben. Es ist daher nicht notwendig, diese Fischproteine in Proteine von Trichoderma album umzuwandeln. Aus diesem Grunde läßt man bei der Verwertung dieser Substrate den Pilz nur während der Zeit einwirken, die notwendig ist, um den bitteren Geschmack zu beseitigen. Die zur Beseitigung dieses bitteren Geschmacks erforderliche Zeit kann leicht vom Fachmann

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bestimmt werden. Versuche haben ergeben, daß es im allgemeinen genügt, Trichoderma album der Entwicklung auf solchen Medien unter den bereits genannten Bedingungen während einer Zeit von etwa 3 bis 5 Stunden zu überlassen.

Ein weiteres Proteinsubstrat, das für die Zwecke der Erfindung verwendet werden kann, ist die Pulpe der Zuckerrübe. Diese Pulpe enthält im allgemeinen etwa 90% Wasser. Dieses Wasser läßt sich schwierig entfernen, Durch Pressen der Zuckerrübenpulpe nach dem bekannten Verfahren erhält man gepreßte Zuckerrübenpulpe mit etwa 80% Wasser. Es wurde gefunden, daß nach dem Pressen eine Pulpe, die nur 50% Wasser enthält, erhalten werden kann, wenn man Trichoderma album auf die Zuckerrübenpulpe einwirken läßt. Diese Produkte eignen sich für die Viehfütterung, insbesondere als Futtermittel für Rinder.

In diesem Fall wird angenommen, daß Trichoderma album durch hydrolytische Wirkung seiner Enzyme die in der Zuckerrübenpulpe enthaltenen Enzyme, die das Wasser zurückhalten, entfernt.

Es kann vorteilhaft sein, bei Verwendung eines Proteinsubstrats von schlechter Qualität ein Proteinprodukt mit höherem Proteinwert zu erhalten. Dies kann erfindungsgemäß erreicht werden, indem man Trichoderma album der Entwicklung auf dem Medium überläßt, das vorher durch Einwirkung von Trichoderma album gereinigt, entgiftet oder von seinem bitteren Geschmack befreit worden ist. Es ist hierbei wichtig, das in Frage kommende Medium ins Gleichgewicht zu bringen, indem ihm Kohlenhydrate oder Stickstoff zugesetzt werden· Hierbei wird ein Proteinprodukt erhalten, das aus dem modifizierten Substrat und je nach dem im Augenblick des Abbruchs des Verfahrens gemäß der Erfindung erreichten Entwicklungsgrad des Pilzes eine mehr oder weniger große Menge

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von Proteinen von Trichoderma album enthält.

Bei Verwendung von Medien ohne Wert als Nahrungsmittel überläßt man den Pilz der Vermehrung auf diesem Medium, um dieses maximal zu erschöpfen. Hierbei werden Proteine von Trichoderma album erhalben. Es ist wichtig, diese Medien zu äquilibrieren.

Die Konzentration an Trockensubstanz in diesen beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten flüssigen Nährmedien wird durch den Erschöpfungsgrad dieser Medien eingestellt. Wenn die Medien vollständig erschöpft werden, kann der Gehalt an Trocksubstanz hoch sein, es gibt jedoch einen begrenzenden Faktor, den Gehalt an gelöstem Sauerstoff, der zwischen 6 und mg/1 Medium gehalten werden muß. Der Erschöpfungsgrad jedes Mediums wird nach Wägemethoden durch Vergleich des erhaltenen Mycelgewichts und der Menge an restlicher Trockensubstanz ermittelt.

Der Stickstoffgehalt (atomarer Stickstoff) der Nährmedien muß etwa 4 bis 5% der Trockenmasse betragen.

Theoretisch sind 5 g Stickstoff notwendig, um 1OO g Kohlenhydrate zu verbrauchen und etwa 32 g Proteine zu bilden. Es ist somit notwendig, den Stickstoffgehalt der Nährmedien auf einen Wert in der Nähe dieses theoretischen Wertes einzustellen. Wenn der Stickstoffgehalt der Nährmedien zu hoch ist, werden Kohlenhydrate zugesetzt. Wenn dagegen der Stickstoffgehalt zu niedrig ist, wird Stickstoff in geeigneter Form, insbesondere in Form von Ammoniumsulfat oder Ammoniumnitrat in einer solchen Menge zugesetzt, daß der Stickstoffgehalt etwa 4 bis 5 g pro 100 g Trockensubstanz beträgt.

Die flüssigen Nährmedien können aus landwirtschaftlichen Produkten, Nebenprodukten und Abfallprodukten oder Rückständen der Nahrungsmittelindustrie beispielsweise nach dem Verfahren, das in Fig.l dargestellt ist und

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die Gewinnung von Proteinen von Trichoderma album veranschaulicht, erhalten werden· Bei diesem Verfahren werden die Produkte, Nebenprodukte oder Abfallprodukte und Rückstände einmal oder mehrmals gemahlen, einmal oder mehrmals homogenisiert und verschiedenen Trennungen unterworfen. Die erhaltenen festen Fraktionen werden anschließend nach an sich üblichen Verfahren behandelt, um als Düngemittel verwertbare Humusstoffe zu gewinnen. Die gewonnenen flüssigen Fraktionen werden vereinigt, konzentriert und gegebenenfalls pasteurisiert oder sterilisiert. Ihr Stickstoffgehalt wird auf einen Wert von etwa 4 bis 5% Trockensubstanz eingestellt, bevor s-ie in das Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzt werden. Das gewonnene Mycel wird anschliessend getrocknet und aufgearbeitet, wobei es ein Proteinmehl ergibt, das im allgemeinen 50 bis 65% Proteine enthält. Die erhaltenen flüssigen Rückstände werden als Düngemittel oder Enzymkonzentrat verwendet.

Der pH-Wert des Kulturmediums muß zwischen 3,7 und 4,8 liegen und während der gesamten Kultivierung in diesem Bereich gehalten werden. Vorversuche haben ergeben, daß die Erschöpfung des Nährmediums bei einem schnellen Abfall des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und bei erheblichen Schwankungen des pH-Werts selten 50% übersteigt. Es ist somit unerlässlich, den pH-Wert im vorstehend genannten Bereich zu halten, um eine Optimierung der Kulturen zu erzielen. Der pH-Wert wird automatisch durch Dosiervorrichtungen eingehalten, die es ermöglichen, dem Nährmedium eine Base oder Säure in Abhängigkeit vom pH-Wert zuzusetzen. Beispielsweise können Natriumhydroxyd, Salzsäure, Schwefelsäure oder beliebige andere geeignete Säuren oder Basen verwendet werden. Ebenso muß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff zwischen etwa 6 und 10 mg/1, vorzugsweise bei 8 mg/1

35 liegen.

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Die Kultivierung von Trichodertna album wird bei einer unter 28⁰C, vorzugsweise zwischen 24 und 28°C liegenden Temperatur durchgeführt. Bei einer über 28°C liegenden Temperatur entwickelt Trichoderma album sich nicht mehr. Dagegen entwickelt der Mikroorganismus sich bei einer Temperatur unterhalb von 24°C, aber mit sehr geringer Geschwindigkeit. Es ist somit vorteilhaft, bei einer Temperatur zwischen 24° und 28⁰C zu arbeiten.

Die Kultivierung muß unter wirksamem, nicht traumatisierendem Rühren, d.h. unter Rühren, das das Wachstum des Mikroorganismus nicht hemmt und bei dem er nicht geschädigt wird, durchgeführt werden.

Trichoderma album kann in Rührwerksbehältern oder in Fermentern kultiviert wenden. Es ist wichtig, die vorstehend genannten Arbeitsbedingungen einzuhalten. Es ist jedoch zu bemerken, daß das Wachstum von Mikroorganismen in Submerskultur, d.h. in Fermentern, im allgemeinen viel schneller verläuft und die Erschöpfung der Nährmedien vollständiger ist, wenn die Probleme des Rührens, der Belüftung und des Überquellens beherrscht werden.

Die zur Kultivierung von Bakterien und Hefen verwendeten Arten von Fermentern sind für die Züchtung von Fadenpilzen nicht sehr wirksam. Die Erscheinungen, die bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung am schwierigsten zu beherrschen sind, sind die Rührung, die Belüftung und das Überquellen (foisonnement).

Während Hefen und Bakterien heftiges Rühren vertragen, wird das Wachstum von Trichoderma album oberhalb einer Drehzahl von 150 UpM stark gehemmt. Bei 400 UpM wird der Mikroorganismus geschädigt. Diese Erscheinung ist ein wichtiger begrenzender Faktor, da es nicht möglich ist, die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei 4 mg/1 zu halten, wenn mit einer Drehzahl von weniger

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als 100 UpM gerührt wird.

Durch starke Belüftung (1 bis 3 1 Luft/1 Medium/Minute) allein kann die Konzentration an gelöstem Sauerstoff nicht länger als 3 bis 6 Stunden bei 5 mg/1 gehalten werden. Außerdem ist es bei starker Belüftung unmöglich, das Überquellen des Mikroorganismus zu beherrschen.

Im Verlauf von Fermentationen werden immer Probleme durch Schaumbildung aufgeworfen. Im vorliegenden Fall müssen die Schaumverhütungsmittel Nährstoffe darstellen. Demzufolge sind Schaumverhütungsmittel auf Basis von Siliconen auszuschließen. Mit Gemischen von Pflanzenölen und Salzen von Fettsäuren wurden nur sehr mäßige Ergebnisse erhalten. Es ist daher notwendig, die Ruh— rung» die Belüftung und die Mengen der Schaumverhütungsmittel so aufeinander abzustimmen, daß ein befriedigender Kompromiss verwirklicht wird. Um diesen befriedigenden Kompromiss zu erzielen, wurde eine neue Fermentationsvorrichtung entwickelt, die einen weiteren

20 Gegenstand der Erfindung darstellt.

Die Fermentationsvorrichtung gemäß der Erfindung umfaßt die folgenden wesentlichen Teile: einen Fermenter, Vorrichtungen zur Sauerstoffversorgung und Vorrichtungen, die das Überquellen verhindern. Der Fermenter ist ferner mit Einrichtungen zur Regelung der Temperatur, des pH-Werts und des Gehalts an gelöstem Sauerstoff versehen.

Der Fermenter muß mit einer langsam bewegten Mischvorrichtung zum Mischen von Mycel und Kulturmedium versehen sein. Dieses Mischsystem kann beispielsweise aus mehreren perforierten Platten bestehen, auf denen sich das Mycel befindet, und die parallel zueinander und mit einem System, das es ermöglicht, sie im Kulturmedium zu bewegen, verbunden sind.

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Die Vorrichtungen zur Sauerstoffversorgung müssen entsprechend ihrer Aufgabe, dem Kulturmedium Sauerstoff zuzuführen, ausgebildet sein. Sie können vorteilhaft aus einer Kammerzentrifuge bestehen, die eine Sauer— stoffzufuhr außerhalb des Fermenters ermöglicht.

Andere außerhalb des Fermenters angeordnete Einrichtungen zur SauerstoffVersorgung, z.B. Kreiselpumpen, Venturidüsen, statische und bewegte Mischer für die Sauerstoffzufuhr können sich im Falle einer Änderung der aufrecht erhaltenen Umwälzgrade, die von den Substraten und ihrer Konzentration abhängen, als geeigneter erweisen.

Die Einrichtungen zur Verhütung des Überquellens müssen die Aufnahme des gebildeten Schaums beispielsweise in der Kammerzentrifuge ermöglichen. Diese Einrichtungen müssen die Ausbildung einer Flüssigkeitssäule, die im Verhältnis zur Sauerstoffversorgungseinrichtung nach oben auslädt, gestatten und sind gegebenenfalls durch übliche chemische und mechanische Mittel und

20 Einrichtungen ergänzt.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung kann für die Kultivierung von Bakterien, Hefen und Fadenpilzen verwendet werden. Zur Kultivierung von Fadenpilzen müssen Einrichtungen zur Entschlammung vorgesehen werden. Diese können aus einem Ausdehnungsgefäß oder aus pneumatischen Mitteln bestehen. Die Entschlammung kann auch kontinuierlich beispielsweise mit einem äußeren Bandfilter oder unter Vakuum erfolgen. Die abgetrennten Mikroorganismen werden in diesem Fall mit Hilfe einer Dosierpumpe oder eines Förderbandes in den Fermenter zurückgeführt. Zwar sind diese Einrichtungen bei der Kultivierung von Hefen oder Bakterien nicht unerlässlich, jedoch ist es häufig vorteilhaft, ein Ausdehnungsgefäß zwischen Fermenter und Sauerstoffversorgungsein-

35 richtungen einzufügen.

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Eine Ausführungsform der Fermentationsvorrichtung gemäß der Erfindung, die sich für die Kultivierung von Fadenpilzen eignet, wird nachstehend ausführlich unter Bezugnahme auf Fig.2, die eine schematische Ansicht dieser Vorrichtung darstellt, und Fig.3, die eine besondere Ausführungsform einer Variante darstellt, beschrieben.

Der Fermenter der Vorrichtung gemäß der Erfindung besteht aus einem allgemein zylindrischen Tank 1, dessen Boden vorzugsweise kegelstumpfförmig ausgebildet und mit einer Abzugsleitung 2 versehen ist. Dieser Tank 1 ist mit einem Belüftungssystem 3 versehen, das die Belüftung des Kulturmediums zu Beginn der Kultivierung von Fadenpilzen ermöglicht· Im Tank ist ferner eine Baugruppe aus perforierten Platten 4 angeordnet, die durch den Halter 5 und Stäbe 6 miteinander verbunden sind. Der Halter 5 ist mit einem Exzentersystem 7 verbunden, das von einem Motor 21, der es ermöglicht, die Baugruppe der Platten zu bewegen, indem ihnen eine Auf- und Abbewegung verliehen wird, angetrieben wird. Das Exzentersystem und die Baugruppe der perforierten Platten stellen eine Art Rührer dar, der es ermöglicht, das Mycel nach oben bis über das Flüssigkeitsniveau zu heben. Natürlich kann dieses Rührsystem durch jedes analoge System ersetzt werden. Beispielsweise kann das in Fig.3 dargestellte Rührsystem verwendet werden. Dieses Rührsystem, das eine erfindungsgemäße Variante darstellt, besteht aus einer Baugruppe von Platten 4, die mit einer waagerechten Achse 5 verbunden sind, die beispielsweise in der durch den Pfeil angedeuteten Richtung gedreht wird.

An den Fermentationsbehälter 1 schließt sich ferner eine Leitung 8 zur Abführung von Gas (Luft und Kohlensäure) an. Der Fermenter ist über eine Leitung 10 von großem Durchmesser mit einem Ausdehnungsgefäß 9 ver-

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bunden. Die Leitung 10 ist an dem Ende, an dem sie mit dem Fermenter verbunden ist, mit einem Rückhaltesieb 11 und einem Verschlußschieber 12 versehen. Das Ausdehnungsgefäß 9 ist mit einem Rückhaltesieb 13 versehen. Es ist mit der Kammerzentrifuge 14 durch eine Leitung 15 verbunden, die gegebenenfalls mit einem schmalen Hals 20 versehen ist. Im Verlauf der Leitung 15 sind eine Umwälzpumpe 16 und ein Luftanschluß 17 angeordnet. Die Kammerzentrifuge 14 ist mit dem Tank 1 durch die Leitung 18 verbunden, die am oberen Teil des Tanks 1 angeschlossen ist. Durch die Leitung 17 kann Luft nach Bedarf eingeblasen werden.

Die Leitung 18 muß zwangsläufig einen größeren Durchmesser als die Zuführungsleitung zur Zentrifuge haben und über die Zentrifuge hinweg ausladen, um zur Vermeidung des Überquellens die Bildung einer Flüssigkeitssäule zu ermöglichen. In dieser Weise wird der gebildete Schaum im aufsteigenden Teil der Leitung 18 aufgenommen.

Während der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung in der vorstehend beschriebenen Fermentationsvorrichtung werden das Kulturmedium und der Mikroorganismus Trichoderma album langsam mit etwa 15 bis 20 Bewegungen pro Minute mit Hilfe der Baugruppe aus perforierten Platten 4 gemischt, die das Mycel bis über die Flüssigkeitsoberfläche heben.

Während der ersten 3 bis 4 Stunden der Kultivierung erfolgt die Belüftung am Boden des Tanks mit Hilfe des Belüftungssystems 3. Die Belüftung wird in dieser Weise zu Beginn vorgenommen, um den Übergang der Fäden und das Wachstum im Ausdehnungsgefäß zu vermeiden. Dann wird, während das Mycel sich in seiner Exponentialwachstumsphase befindet, der Schieber 12 geöffnet. Die Umwälzpumpe 16 und die Kammerzentrifuge 14, in der die

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Sauerstoffversorgung vorgenommen wird, werden eingeschaltet. Der Ausstoß der Flüssigkeit erfolgt nach oben in die Leitung 18 mit dem größeren Durchmesser, so daß der Schaum in der wiedergebildeten Flüssigkeitssäule zerstreut werden kann. Das wieder mit Sauerstoff versorgte Medium ergießt sich in den Fermentertank 1 etwa 30 cm oberhalb des Flüssigkeitsniveaus· Die obere Platte des Mischers nimmt eine schwache Schaumschicht in das Medium mit. Mit Hilfe der beiden Siebe 11 und 13 kann das Nährmedium filtriert und das Mycel im Fermenter gehalten werden. Die Durchlaufmenge wird in Abhängigkeit vom Sauerstoffbedarf geregelt. Mit Hilfe dieser Vorrichtung ist es leicht, im Kulturmedium eine geeignete Konzentration an gelöstem Sauer— stoff (6 bis 10 mg/1) aufrecht zu erhalten und optimales Wachstum des Mikroorganismus und maximale Erschöpfung des Kulturmediums sicherzustellen.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ermöglicht die kontinuierliche Kultivierung. In diesem Fall werden die Siebe geöffnet. Das in der Zentrifuge gewonnene Mycel wird ausgeräumt. Der abgezogene Teil der Flüssigkeit wird durch frisches Nährmedium ersetzt.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung, die eine wirksame Sauerstoffversorgung von Kulturmedien und die Vermeidung des Überquellens ermöglicht, eignet sich vollkommen für die Kultur von Bakterien und Hefen. Diese Fermentationsvorrichtung gemäß der Erfindung ist somit für die Fermentation von Mikroorganismen im allgemeinen (Bakterien, Hefen und Pilze) anwendbar.

Bei der Kultivierung von Bakterien und Hefen durchlaufen unterschiedliche Mengen der Mikroorganismen die Zentrifuge. Zu Beginn der Kultivierung werden sie durch Ausschlämmen wieder in den Fermenter zurückgeführt und anschließend während der Weiterführung der Kultur ge-

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wonnen. Der entfernte Teil des Kulturmediums wird durch frisches Nährmedium ersetzt.

Wie bereits erwähnt, können die Fermentationen nach dem Verfahren gemäß der Erfindung zur Gewinnung von Proteinen kontinuierlich oder chargenweise durchgeführt werden.

Bei chargenweiser Durchführung der Fermentationen werden etwa 9/10 der Kultur etwa alle 15 bis 20 Stunden abgezogen, und diese 9/10 der Kultur werden durch frisches eingestelltes und pasteurisiertes NMhrmedium ersetzt. In vielen Fällen ist die Kreislaufführung der Abläufe möglich*.

Das beim Verfahren zur Gewinnung von Proteinen erhaltene Proteinprodukt kann gemäß dem folgenden Schema vorteilhaft gewonnen werden.

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Einwirkung von

Trichoderma

album Kulturmedium, gegebenenfalls äquilibriert und

Abziehen

Gewinnung auf der Filterpresse

Pressen

Mycelkuchen = Proteine des Subf strats und/oder Proteine von Trichoderma album Ablauf

Abfallprodukt

Trocknung

Mahlung

Nachbehandlung

Proteinmehl

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Aus dem abgezogenen Kulturmedium wird die Mikroorganismenmasse mit einer Filterpresse oder einer beliebigen anderen geeigneten Filtervorrichtung gewonnen. Nach der Filtration wird die Mikroorganismenmasse gepreßt, wobei ein Mycelkuchen gebildet wird, der 30 bis 50 Gew.-% Trockensubstanz enthält. Dieser Mycelkuchen wird anschließend getrocknet, gegebenenfalls gemahlen und zur Konservierung oder für den Transport nachbehandelt.

Die Trocknung des Proteinprodukts durch Gefriertrocknen, Sprühtrocknen, im Wirbelschichttrockner, auf dem Trommeltrockner (Typ "Hatmaker"), mit dem Bandtrockner oder pneumatischen Trockner verläuft sehr schnell. Diese Trockenverfahren ermöglichen die Gewinnung eines Nahrungsmittels mit außergewöhnlicher Qualität und lassen keine Zelle lebensfähig.

Im Gegensatz hierzu wird durch die statischen Trockenverfahren der Nährwert des Produkts verändert. Durch Plasmolyse werden einfache Aminoverbindungen und Kohlenhydrate frei, die nach der ^MMaillard"-Reaktion reagieren. Statische Trockenverfahren sind somit zu vermeiden.

Am Ausgang der Filterpresse hat das Proteinprodukt, das insbesondere das Mycel vonTrichoderma album enthält, eine gut identifizierbare Fadenstruktur. Während der Trocknung wird diese Struktur sehr brüchig und zerfällt spontan.

Wenn das Proteinprodukt ausschließlich aus Proteinen von Trichoderma album besteht, hat das trockene und gemahlene Mycel die Form eines weißen Pulvers, dessen Dichte zwischen 0,6 und 0,9 schwankt. Dieses nichtquellende Pulver ist fettig, sehr leicht benetzbar und frei von Geruch und Geschmack. Gewisse Kulturmedien können ihm jedoch einen speziellen Geschmack und Geruch verleihen.

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Mikroskopisch ist keinerlei Mycelstruktur feststellbar. Lediglich Trümmer und Fragmente in verschiedenen Formen mit Abmessungen zwischen 5 und 50 um sind zu beobachten.

Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Proteine von Trichoderma album haben die Form eines Pulvers, das 50 bis 65% Proteine enthält. Die prozentuale Zusammensetzung des nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen und getrockneten Mycels von Trichoderma album und seine Zusammensetzung nach Aminosäuren sind in den folgenden Tabellen I. bzw.II genannt. In Tabelle II sind die Zusammensetzungen anderer proteinreicher Produkte, die nach den bekannten Verfahren hergestellt worden sind, angegeben.

Die aus einem Gemisch von Proteinen des Substrats und des Mycel bestehenden proteinhaltigen Produkte haben einen Proteingehalt, der in Abhängigkeit vom Ausgangssubstrat und der Mycelmenge variiert.

Tabelle I

Zusammensetzung des trockenen Mycels von Trichoderma album (Gew.-%)

Proteine (N χ 6,25) 55 bis 63

Nichteiweiß-Stickstoff 3 bis 5

Fette 6 bis 12

Unlösliche Zucker 8 bis 10

Lösliche Zucker 7 bis 10

Nucleinsäuren 4 bis 6

Asche 6 bis 9

Wasser 3 bis 5

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►—·	l·-· ro		Soj apreßkuchen
	COcnoH-vo^ocnccovo^-i^^ro	Sesampreßkuchen
cn ro
er,	^ro^oroceioiNaowoi-OJs.^iTNi*.	Lupinenmehl "New Land"
cn co		Champignons de Paris
VO		Trichoderma album, auf Trommeltrockner getrockne
co -a.		Trichoderma album gefriergetrocknet
I«	WH-roceooiMWoi^wWÄO^w	Trichoderma album, wasser lösliche plasmolysierte Fraktion
40	ro	Trichoderma album, waser- unlösliche plasmolysier te Fraktion
cn		Trichoderma album, freie Aminosäuren
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Wie bereits erwähnt, ist die für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Spezies Trichoderma album eine neue Art der Fadenpilze, die in den Laboratorien des Institut National de Recherche Agronomique ausgewählt worden ist· Die nachstehend beschriebene Methode der Auswahl des Stammes fällt ebenfalls in den Rahmen der Erfindung. Sie kann bei Bakterien, Streptomyces und anderen Pilzen angewandt werden, insbesondere bei den Phycomyceten (Rhizopus), den Basidiomyceten (Ustilago, Corticum, Fomes, Taphrina, Sclerotinia, Rhabdocline, Phacidiella, Epichloe, Nectria, Ophiobolus, Endothia)und den Adelomyceten (Phoma, Ascochyta, Septoria, Colletotrichum, Gloeosporium, Monilia, Sterigmatocystis, Gliocladium, Geotrichum, Acrostalagmus, Trichoderma Botrytis, Cephalosporium, Verticilium, Trichothecium, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Pullularia, Torula, Thielaviopsis, Alternaria, Cercospora, Sporodesmium, Helminthosporium, Epicoccum und Graphium).

Zunächst seien einige Erläuterungen zur Taxonomie und Biologie der Pilze gegeben.

Die Pilze gehören zur Pflanzenwelt der chlorophyllfreien Kryptogame, Eucaryoten und Thallophyten. Mehr als 100.000 Pilzspezies sind bekannt. Sie sind durch eine sehr große Vielfalt der Formen gekennzeichnet, die von der Einzelzelle (Hefen) bis zu der komplexen Organisation der Karpophoren (Steinpilze) reicht. Es gibt erhebliche Unterschiede in der Größe, im Aussehen, in der Struktur, in den Stoffwechselaktivitäten und in der Lebensweise.

Man unterscheidet bei den Pilzen die Saprophyten, pathogene Pilze, symbiotische Pilze und die Mycorhiza-Pilze.

Bei den Mikroorganismen unterscheidet man zytologisch

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einen Kern, Mitochondrien, Vakuolen, Lipidkügelchen und Glykogen. Die Zellwände bestehen aus Cellulose, Pektinen, Callose und Chitin. Das Pilzprotoplasma ist beweglich. Es bewegt sich vom zentralen Teil, der Vakuolen bildet, zur Peripherie.

Der Thallus erzeugt die Vermehrungsorgane (die Sporen) mit zuweilen sehr einfacher Genese: Zellteilung (Arthrosporen) oder Sprossung Cbei den Hefen).

Die Sporen können auch durch sehr differenzierte Fruktifikationsorgane, z.B. den Hut der Blätterpilze oder das Perithezium der Pyrenomyzeten gebildet werden. Die Sporen, deren Bildung die vorherige Verschmelzung von zwei verträglichen Kernen mit anschließender Reduktionsteilung voraussetzt, bewirken die geschlechtliche oder vollkommene Fortpflanzung.

Der Einteilung der Pilze liegt die Art des vegetativen Thallus zu Grunde, der 1) bei den Myxomyceten plasmodial und 2) bei den Eumyceten zellulär oder fadenförmig sein kann· In der zweiten Gruppe unterscheidet man

a) die niederen Pilze (Siphomycetes oder Phycomycetes), bei denen nur eine mehrkernige fadenförmige Riesenzelle vorhanden ist. Die Fäden sind langgestreckt und verzweigen sich ohne Querwand und im allgemeinen ohne Verästelung. Die Zytoplasmamasse und die Kerne fließen frei in das Innere der schlauchförmigen Wände.

Die Klasse der Phycomycetes vermehrt sich durch eingekapselte Eier (Oosporen, Zygosporen), die auf dem Mycel im Anschluß an eine Vereinigung zwischen freien Gameten oder zwischen mehr oder weniger differenzierten fadenförmigen Geschlechtszellen gebildet werden.

b) Die höheren Pilze oder Septomycetes (Ascomycetes, Hemiascomycetes, Basidiomycetes, Fungi imperfect!). 809883/0645

Diese Pilze weisen ein aus mikroskopischen Fäden (Hyphen) bestehendes Mycel auf. Die verzweigten, nebeneinanderliegenden, anastomesierten, aber nie zu Geweben organisierten Hyphen sind durch Querwände in ein- und mehrkernige Segmente unterteilt. Diese häufig unvollständig geschlossenen Membranen ermöglichen die Zirkulation des Protoplasmas und der Kerne von einer Zelle zur anderen. Die Anastomosen sind häufig zwischen Hyphen einer Spezies oder affinen Spezies, wodurch Heterocaryose begünstigt wird. Die Heterocaryose besteht in der Wiedervereinigung - im gleichen Mycel von Kernen, die Träger von verschiedenen genetischen .Möglichkeiten sind, weil sie entweder aus Mutationen stammen oder aus verschiedenen Organismen herrühren.

Die höheren Pilze erzeugen im allgemeinen ihre Geschlechtssporen in oder auf den lokalisierten Fruktifikationsorganen. Die Differenzierung ihrer Geschlechtszellen ist im allgemeinen gering, und die Befruchtung erfolgt im allgemeinen einfach durch Vereinigung von paarigen Kernen in den nicht spezialisierten Fäden.

Sie führt zur Bildung von Ascosporen, die in den Ascen oder den durch die Basiden erzeugten Basidiosporen enthalten sind. Bei den Fungi imperfecti ist die Fortpflanzung ungeschlechtlich, bedingt zweifellos durch das Fehlen eines verträglichen Partners. Die Fortpflanzung erfolgt durch Konidien.

Das Reich der Pilze ist weniger ausgedehnt als das der Pflanzen. Die biologischen Eigenschaften dieser Mikroorganismen verleihen ihnen jedoch eine erstaunliche Anpassungsfähigkeit, und es wurde beobachtet, daß sehr zahlreiche Individuen die genetischen Möglichkeiten einer neuen Rasse oder Spezies in sich schließen. Bei diesen Individuen wurde gefunden, daß es möglich ist, die Nachteile zu beseitigen und interessante Eigenschäften, die auf zahlreichen Gebieten, insbesondere

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für die Erzeugung von Biomassen für die Ernährung ausnutzbar sind, zu verwerten·

Das erfindunsgemäße Verfahren zur Auswahl der interessanten Eigenschaften eines Mikroorganismus besteht in seinem ganz allgemeinen Aspekt darin, daß man einen wilden Stamm auf selektiven Nährmedien züchtet, die Kulturen unter bestimmten Temperatur- und Beleuchtungsbedingungen bebrütet, Mikroisolierungen vornimmt und die verbesserten Stämme in Gegenwart oder Abwesenheit von Acridinorange unter erneuter Isolierung von weißen Hyphen mischt·

^ie für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten selektiven Nährmedien werden in Abhängigkeit von den störenden Merkmalen des Wildstammes, die ausgeschaltet werden sollen, gewählt.

Im einzelnen ist das Verfahren gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man

A) die gewählten selektiven Medien mit einem Wildstamm beimpft,

B) jede Kultur unter den folgenden Bedingungen bebrütet:

a) bei 27⁰C für einen Tag,

b) bei 37°C für 2 Tage im Dunkeln und dann 2 Tage am Licht,

c) bei 27°C 2 Tage,

C) anschließend die weißen und kräftigen Stämme, die aus jeder auf den selektiven Medien durchgeführten Kultivierung stammen, 2 Stunden bei 4⁰C mit UV-Licht (250 nm) bestrahlt,

D) die Stämme auf "STARON"-Medium überführt,

E) die erhaltenen Kulturen 2 Tage bei 37⁰C und dann 2 Tage bei 27°C bebrütet, wobei vor der Senkung der Temperatur von 37 auf 27°C die wachsenden Stämme entfernt worden sind,

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F) diese Stämme im flüssigen STARON-Medium unter Rühren 2 Tage bei 27°C bebrütet,

G) sterile Entnahmen vornimmt,

H) die leistungsfähigsten, proteinreichen, an Glykosamin und Antibiotika armen Stämme in Gegenwart von Acridinorange mischt,

I) die erhaltenen Stämme 2 Tage bei 27°C auf STARON-Medium bebrütet,

K) Mikroisolierungen vornimmt und L) die erhaltenen Stämme 2 Tage bei 27°C bebrütet.

Die in dieser Weise erhaltenen Stämme werden erneut dem vorstehend beschriebenen Zyklus (Stufen A bis L) so häufig unterworfen, daß ein Stamm erhalten wird, der die gewünschten Merkmale aufweist. Es ist auch möglich, die Stämme einem Teilzyklus zu unterwerfen·

Die störenden Merkmale, die ausgemerzt werden sollen, verschwinden im allgemeinen einzeln nacheinander. Es ist somit nicht notwendig, im Auswahlzyklus die Stufe zu belassen, die auf die Eliminierung eines bestimmten Merkmals gerichtet ist. Es ist dem Fachmann überlassen, mit Hilfe von Kontrollen, die im Verlauf jedes Zyklus vorgenommen werden, die Stufen zu bestimmen, die im Zyklus belassen bzw. ausgeschaltet werden sollen.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung zur Gewinnung von Trichoderma album wird eine Gruppe von elf Nährmedien verwendet. Acht Medien bestehen aus einer mineralischen Lösung, die einen pH-Wert von 6,8 hat und die folgenden Bestandteile enthält:

KH₂PO₄ 1 g

30 MgSO₄.7 H₃O 0,5 g

KCl 0,2 g

CaCIp 0,2 g

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FeSO₄.7 H₂O 0,03 g ZnSO₄.7 H₂O 0,01 g CuSO₄.5 H₂O 2 mg

Destilliertes Wasser: zur Auffüllung auf 100 ml. Gelose 20 g

Diesem Medium werden die folgenden Verbindungen zugesetzt:

Medium 1: 30 g Glycerin + 2g Harnstoff

Medium 2: 20 g Saccharose +3g Allantoin

Medium 3: 20 g Getreidestärke +5g Ammoniumsulfat

Medium 4: 20 g Glucose +7g Tyrosin

Medium 5: 5g Pektin von Kartoffeln +7g Anthranilsäure

Medium 6: 20 g Getreidestärke +5g Natriumnitrat Medium 7: 10 g Mannit +8g Milchcasein

Medium 8: 20 g Gluconsäure +1Og Gelatine

Das Medium 9 ist das "STARON"-Medium, das 20 g Glucose, 6 g Pepton, 1 g Hefeextrakt, 4 g Maisquellwasser, 0,5 g NaCl, 0,5 g MgSO₄.7 H₃O, 1 g KH₃PO₄, 10 mg FeSO₄.7 H₃O, destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1 1 und bei festen Medien 20 g Gelose enthält.

Das Medium 10 besteht aus Nährkartoffeln, und das Medium 11 enthält 40 g Milchserum pro Liter.

Wie bereits erwähnt, können die Kulturen Teilzyklen unterworfen werden. Beispielsweise kann man bei Trichoderma viride jede auf jedem der 11 Medien durchgeführte Kultur den Stufen A bis D unterwerfen, anschließend 2 Tage bei 27°C bebrüten, dann Mikroisolierungen zur Auswahl der weißen und kräftigen Stämme vornehmen und diese dann noch 2 Tage bei 27°C bebrüten. Die in dieser Weise erhaltenen Stämme werden

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anschließend auf die elf selektiven Medien geimpft, worauf wieder mit den Teilzyklen oder vollständigen Zyklen begonnen wird, wobei die vollständigen Zyklen die Stufen A bis L umfassen.

Die Teilzyklen oder vollständigen Zyklen des Verfahrens gemäß der Erfindung sind schematisch in Fig.4 dargestellt. Die Kontrollen, die während der gesamten in Fig.4 dargestellten Zyklen vorgenommen werden, sind insbesondere

a) Titration des Glykosamins nach Hydrolyse des Mycels in 6n-HCl und Auflösung in einem Autoanalysator der Handelsbezeichnung "Technichon TSM.*",

b) mikrobiologische Titration der antibiotischen Peptide, des Trichodermins und des Gliotoxins nach

15 Extraktion mit n-Butanol,

c) Messung der Intensität der Plasmolyse (Trocknung bei 60°C, Mahlen und Bestimmung der in Wasser bei pH 8 löslichen Fraktion),

d) Wiegen der gebildeten Trockensubstanz und Bestimmung ihrer Konzentration an Proteinen durch Mikrokjeldahl

und

e) quantitative Bestimmung der im Medium verbrauchten Menge der Trockensubstanz.

Die beim Verfahren gemäß der Erfindung bei 27⁰C vorgenommenen Bebrütungen werden immer bei natürlichem Licht durchgeführt. Wenn angegeben wird, daß die Kultivierungen bei 37°C unter Lichteinwirkung durchgeführt werden, handelt es sich um Weißlicht mit einer Intensität von 2 bis 300 W/m².

Die im Verlauf des Verfahrens gemäß der Erfindung durchgeführten Mikroisolierungen bestehen darin, daß die Hyphen mit Hilfe eines optischen Mikroskops abgetrennt

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werden.

Die Zahl der durchzuführenden Zyklen hängt vom Ursprungsstamm und von den gewünschten Merkmalen ab. Die Kontrollmethoden ermöglichen es, festzustellen, ob diese Merkmale erreicht sind.

Mit Hilfe des Auswahlverfahrens gemäß der Erfindung können neue Stämme gewonnen werden, die interessante Merkmale aufweisen, die auf zahlreichen Gebieten, insbesondere für die Erzeugung von Biomassen für die Ernährung, ausgenutzt werden können.

Das Verfahren wurde insbesondere mit Trichoderma viride, Fusarium roseum, Bauveria tenella, Trichoderma poiysporum und Aspergillus oryzae angewandt und wird durch die folgenden Beispiele 5 und 6 veranschaulicht. Weitere Beispiele für die Anwendung des Auswahlverfahrens wurden vorstehend genannt.

Das Verfahren wird durch die folgenden Beispiele ausführlich erläutert.

Beispiel 1 20 Kultivierung im Fermenter

Bei diesem Versuch wurden nach dem Verfahren gemäß der Erfindung flüssige Kulturmedien behandelt, die pro Liter 60 bzw. 90 gVTroSkinsubstanz enthielten und auf Milchserum, Saft der Luzerne, Getreidemehl, Abwasser von eiweißverarbeitenden Betrieben, Kartoffelsaft, Maisquellwasser (Mazerationswasser der Herstellung von Stärke aus Mais) und Zuckerrübenmelasse basierten.

Die Fermentationsvorrichtung gemäß der Erfindung wurde verwendet. In den Tank 1 wurden 100 1 Nährmedium und 10 1 Trichoderma album gegeben, das durch Kultivierung unter Rühren erhalten worden war. Während der ersten 3 bis 5 Stunden der Kultivierung wurde mit dem Belüf-

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tungssystem 3 belüftet, das im vorliegenden Fall aus einem ringförmigen Rohr mit Löchern und einer Luftzuführungsvorrichtung bestand. Luft wurde in einer solchen Menge eingeblasen, daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff zwischen 6 und 10 mg/1 lag. Die Temperatur des Nährmediums wurde zwischen 24 und 28°C und der pH-Wert durch Zugabe einer Säure bzw. einer Base zwischen 3,7 und 4,8 gehalten.

Wenn das Mycel sich in seiner Exponentialwachstumsphase befand, wurde nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise verfahren, d.h. der Schieber 10 wurde geöffnet, und die Umwälzpumpe 15 und die Zentrifuge 12 wurden eingeschaltet. Die der Zentrifuge zugeführte Sauerstoffmenge wurde so geregelt, daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff zwischen 6 und 10 mg/1 gehalten wurde. Nach einer Kultivierungszeit von 15 bis 20 Stunden wurde das Mycel abgezogen und auf der Filterpresse filtriert. Hierbei wurden 7 bis 9 kg Mycelkuchen mit 50% Trockensubstanz erhalten. Dieser Kuchen wurde anschließend auf dem "Hatmaker"-Trommeltrockner oder durch Gefriertrocknen getrocknet, wobei ein 57 bis 65% Proteine enthaltendes faseriges Mehl erhalten wurde. Die prozentuale Zusammensetzung der mit jedem Medium erhaltenen Produkte sowie ihre Zusammensetzung nach Aminosäuren waren im wesentlichen die gleichen, wie sie in Tabelle I und II genannt sind. Die nach 10 bzw. 20 Stunden gebildeten und verbleibenden Mengen an Trockensubstanz sind in Tabelle IV genannt.

Beispiel 2 30 Kultivierung unter Rühren

Trichoderma album wurde unter Rühren (150 UpM) in 500 ml-Erlenmeyerkolben, die 100 ml Nährmedium enthielten, kultiviert. Die Medien enthielten pro Liter 40 bis 70 g Trockensubstanz, die auf 3% N eingestellt war. Der pH-Wert zu Beginn betrug 4,5. Die Kultivierungs-

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dauer betrug 20 bis 40 Stunden bei 27°C. Das Mycel wurde mit Filterpressen gewonnen und gefriergetrocknet. Die Durchschnittswerte der erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle III genannt.

Tabelle III

pH-Wert	pH-Wert	Gelöster	20 40	Gebildete	Verblie
des Me		Sauer	4 4	Trocken	bene
diums zu		stoff, mg/1		substanz,	Trocken
Beginn 4,5;				g/i	substanz,
gelöster			5,0 2,0		g/i
Sauerstoff
zu Beginn
8 mg/1
	Kultivierungsdauer in	Stunden
	20 40	20 40	20 40
40 g Trocken	6,5 7	6 9	30 27
substanz/1
7o g Trocken
masse/l	6,5 6,2	12 18	49 41

Unter den vorstehend genannten Arbeitsbedingungen war eine Optimierung der Kulturen nicht möglich. Trotzdem waren die Ausbeuten an Mycel ausgezeichnet, jedoch überschritt die Erschöpfung der Nährmedien selten 50%, bedingt durch den schnellen Abfall des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und die erheblichen Veränderungen des pH-Werts.

Weitere Versuche, die in der oben beschriebenen Weise durchgeführt wurden, wobei jedoch der pH-Wert zwischen 3,7 und 4,8 und der Gehalt an gelöstem Sauerstoff zwischen 6 und 10 mg/1 gehalten wurde, ergaben, daß bei diesem pH-Wert und bei diesem Gehalt an gelöstem Sauerstoff eine Optimierung erreicht werden kann.

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- 33-

Beispiel 3

Vergleich der Kultivierung im Fermenter gemäß der Erfindung mit der Kultivierung in einem üblichen Fermenter

Trlchoderma album wurde auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise auf den in Beispiel 1 genannten Medien kultiviert. Die Kulturmedien enthielten 60 g bzw. 90 g Trockensubstanz pro Liter. Der pH-Wert wurde bei 4,5 und die Temperatur bei 27°C gehalten. Die nach einer Kultivierungsdauer von 10 bis 20 Stunden gebildeten und verbliebenen Mengen an Trockensubstanz wurden ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle IV genannt.

Pasteurisiertes Medium mit 4% N in der Trockensubstanz; pH-Wert bei 4,5 gehalten, Temperatur 27°C

Tabelle IV

Gelöster

Sauerstoff,

mg/1

Gebildete
Trockensubstanz,

g/i

Verbliebene Trockensubstanz, g/l

	Kultivierungsdauer in	20	10	20	Stunden	20
	10				10
Fermentation im üblichen Fermenter (Milchserum, Weizenmehl)		3	15	19		20
60 g TS/1·	5	1,5	21	25	33	30
90 g TS/1	4				50
Fermentation im Fermenter gem. der Erfindung (7 Substrate von Beispiel 1)		7	27	35		3
60 g TS/1	8	6	30	45	15	10
90 g TS/1	6	38

•TS β Trockensubstanz

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Die Ergebnisse in Tabelle IV zeigen, daß alle mit der Vorrichtung gemäß der Erfindung durchgeführten Kultivierungen beherrscht wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind als sehr gut zu bezeichnen. Im Gegensatz hierzu konnten die Kultivierungen, die in üblicher Weise, d.h. in einem auf die Gewinnung von Bakterien, Hefen oder die Erzeugung von Antibiotika, Enzymen usw. abgestellten Fermenter durchgeführt wurden, nur auf zwei Substraten, d.h. dem Milchserum und dem Weizenmehl, mit brauchbaren Ergebnissen durchgeführt werden.

^Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ermöglicht somit die Erzielung einer höheren Produktion an Biomasse und eine stärkere Erschöpfung der Kulturmedien.

Beispiel 4 15 Nährwert des Mycels von Trichoderma album

Der Nährwert des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Mycels von Trichoderma album wurde mit dem Nährwert von Milchcasein, Preßkuchen von Sojabohnen, Preßkuchen von Sesamöl, "Champignons de Paris" und rohem Lupinensamen verglichen.

Die Gewichtszunahme, bezogen auf aufgenommene Proteine, wurde an jungen männliche entwöhnten SPF-Ratten des Sprague-Dawley-Stammes ermittelt. Die Versuchsdauer betrug 17 Tage und der Gehalt an Proteinen im Futter 10%. Jedes Futter wurde mit essentiellen Aminosäuren (acides amines indispensables limitants) wieder ins Gleichgewicht gebracht. Jede Versuchsgruppe bestand aus 20 Tieren. Die Zusammensetzung des Futters und die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V genannt.

Die Analyse der Ergebnisse in Tabelle V zeigt, daß die Proteine von Trichoderma album den gleichen Nährwert wie Milchcasein, das durch Methionin ergänzt war, und einen höheren Nährwert als die gekochten Soja- und

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Sesampreßkuchen hatte. Der niedrige Proteinwirkungsgrad des rohen Lupinenmehls ist auf nährwertmindernde Faktoren, die in diesem Samen enthalten sind, zurückzuführen. Der geringe Nährwert der "Champignons de Paris" für die Ratte kann zweifellos durch den hohen Gehalt der Karpophoren an Zellwänden erklärt werden. In diesem Fall ist der Verbrauch offensichtlich hoch.

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Tabelle V
Zusammensetzung des Futterd in %: GMQ: Gewichtszunahme

Futter I	: II	•III :	IV	: V	: VI	: VII
Milchcasein 12	: 0	: 0 :	0	: 0	: 0	: 0
Gekochter Soja preßkuchen o	: 22	: 0	: 0	:0	:0	: 0
Gekochter Sesam preßkuchen 0	: 0	: 20	: 0	: 6	:0	: 0
Rohes Lupinenmehl "New Land" 0 ,	: 0 ·	: 0	: 28	: 0	: 0	: 0
Champignons de Paris °	: 0	: 0	: 0	• 25	: 0	: 0
Trichoderma album, auf Trommeltrock- 0 ner aetrocknet	: 0 •	: 0	* : 0	: 0	: 20	: 0
Trichoderma album, q gefriergetrocknet :	: 0	: 0	; 0	0	: 0	: Ib
Maisstärke 53,75	,44,75	46,50	:3S,35 :	41,60	41.65	4S,75
Glucose 20 :	20 : ■ •	20	: 20 :	20 :	20 :	20
Arachidinöl 8 :	* 8 :	8	8 : ■	8 :	8 :	8
Cellulose 2 :	1 :	1 :	• • 1 :	1 :	1 :	1
Vitamin- und '. Mineralzusatz 4 '.	4 :	4 :	4 Ι	4 :	4 :	4
DL-Methionin η on '.	0,25 :	0 :	Ο,35 :	0,4 :	0,35 :	0,25
L-Lysin.HCl 0 :	0 :	0,5 :	0,20:	0 :	0 :	0
L—Threonin 0 :	0	0 :	0,10 :	0 :	0 :	0

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Tabelle V (Forts.)

Futter I

Kittleres Gewicht der Ratten zu 52 Beginn, g

Mittleres Gewicht der Ratten nach129 17 Taqen.q

Proteinauf-το c nähme/Tag,g

GMQ 4,5

Auf Protein aufnahme be*3,7 : zogene Ge- ;

: II

: 51

111

10,4

3,5

2,9 1

: III

: 51

119

10,8

4,0

3,0 :

: IV

: 51

70 · *

5,9 •

1,1 '

• 1,7 :

: V

> » : 51

85

9,2:

2,0 :

2,oi

: VI

. 51

132 ,

12

4,8 ':

3,7 :

: VII

: 51

131

12

4,7

3,6

wichtszunahme

Beispiel 5 Auswahl des Stammes Trlchoderma album

^Mit Hilfe des Auswahlverfahrens gemäß der Erfindung würde die neue Spezies Trichoderma album, die beim Verfahren gemäß der Erfindung zur Gewinnung von Proteinen verwendet wird, aus Trichoderma viride isoliert. Die Spezies Trichoderma album enthält wenig Zellwände. Sie bildet im G_eg_ensat_z zur Spezies Trichoderma viride, von der sie stammt, weder Antibiotika noch diffundierbare Pigmente. Sie weist keine farbigen und thermophilen Hyphen auf.

Die Gattung Trichoderma gehört zur Klasse der unvollkommenen Fadenpilze (Fungi imperfect!) (Adelomycetes « Hyphomycetes), zur Ordnung Moniliales und zur Familie Moniliacae. Das mit Querwänden versehene verzweigte Mycel ist weiß bis hellgrün. Die im allgemeinen grünen Konidien sind isoliert, rund, einzellig. Sie werden von

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quirlig angeordneten Konidiophoren getragen.

Die Mikroorganismen der Gattung Trichoderma sind Saprophyten des Bodens. Sie gelten als nützlich, da sie häufig Antagonisten von phytopathogenen Pilzen sind. Sie erzeugen zahlreiche Enzyme und Antibiotika.

Die neue Spezies wurde mit Hilfe des Verfahrens gemäß der Erfindung isoliert. Nach 1400 Zyklen (teilweise oder vollständig), die gemäß dem in Fig.3 dargestellten Zyklus durchgeführt wurden, wurde ein allesfressender, leistungsfähiger, gutartiger Stamm von Trichoderma erhalten, dessen Mycel einen hohen Nährwert für Tiere aufweist.

Die Ausschaltung von störenden Merkmalen, die der Ursprungsstamm in sich birgt, und die sehr weit getriebene Selektion der Leistungsfähigkeit und der ernährungsmäßigen Eigenschaften bestätigen sehr gut die außergewöhnlichen genetischen Möglichkeiten, die die Pilze aufweisen.

Wie die folgende Tabelle VI eindeutig zeigt, besitzt die isolierte Spezies Trichoderma album eine hohe Fortpflanzungsgeschwindigkeit und einen hohen energetischen Wirkungsgrad. Diese neue Gattung weist wenig Zellwände auf, ein Zeichen für eine starke Plasmolyse in der Wärme. Außerdem besitzt sie keine Hyphen, die antibiotische Peptide, Gliotoxin, Trichodermin und Pigmente bilden. Sie umfaßt keine thermophilen Induviduen mit farbigem Mycel. Außerdem bildet sie sehr schlecht Hybride mit ihrem Ursprungsstamm. Dies bestätigt, daß eine genetische Neubildung stattgefunden hat.

In Tabelle VI sind die Ergebnisse von Analysen der Kulturen nach 1Θ0, 300, 1000 und 1400 Zyklen gemäß dem Verfahren sowie die Ergebnisse von Analysen am Ursprungs-

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_, U er-

stamm Trichoderma viride genannt.

Der Stamm Trichoderma album kann durch Überführung auf neue Medien konserviert werden.

Tabelle VI

Zahl der Passagen Wild- 100 300 1000 1400

stamm

Verdoppelungszeit, Stunden 6,0 5,00 3,50 2,30 1-2

Energetischer Wirkungsgrad (notwendige Menge Trockensubstanz zur Gewinnung von 1 g Trockenmycel) 5,00 4,00 3.50 2,00 1,60

Wirkungsgrad der Proteinsynthese (notwendige. Menge Trockensubstanz zur Gewinnung von 1 g Protein), g 12,5 9 7,4 3,4 2,5

Mittlere Konzentration des Proteinmaterials im Mycel

in % der Trockensubstanz 40 45 47 60 65-70

Menge der in 48 Std. aus 40 g Trockensubstanz

gebildeten Proteine 1 1,5 2,7 7

Plasmolysenindex (in Wasser bei pH 8 lösliche Fraktion nach 20-stündiger

Trocknung bei 60°C), % 10 20 40 55 60-70

Proteine in der plasmoly-

sierten Fraktion, % 35 45 50 50 50-60

Glykosamin (in % pro

16 g N) 18 15 9,5 2,2 0,7

Ausgeschiedene antibiotische Peptide (in g pro

Liter Kulturmedium) 2-5 1-2 0,5 0

Thermophile Fragmente

(in Promille) 12 2 0,5 0

Erschöpfungsgrad des Nährmediums in 48 Std. pro 40 g Trockensubstanz/1, pH 4; 27°C; 4 bis 8 mg gelöster Sauerstoff/l (in % der Trockensubstanz) 20-25 35 50 60-70 70-75

Proteinwirkungsgrad bei der Ratte nach 17 Tagen mit äquilibriertem Futter,

das 10% Proteine enthält - - - 3,7 3,9

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- ASr-

Beispiel 6

Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung auf die Stämme Fusarium roseum, Bauvaria tenella, Trichoderma polysporum und Asperqillus orizae

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Auswahl von Mikroorganismen ist auf die Verbesserung anderer Mikroorganismen (Pilze, Hefen und Bakterien) anwendbar. Es ermöglicht die Auswahl von Mikroorganismen mit speziellen, wohldefinierten Eigenschaften. In jedem Fall genügt es, die Auswahlkriterien und die Nährmedien gut auszuwählen und geeignete Kontrollmethoden anzuwenden. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden die folgenden Mikroorganismen erhalten:

a) Ein Stamm von Trichoderma polysporum, der ein Antagonist von phytopathogenen Pilzen ist,

b) ein systemischer Stamm von Fusarium roseum, der nicht pathogen ist und Pflanzen gegen phytopathogene Fusarium-Arten schützt,

c) Stämme von Aspergillus flavus, die keine Aflatoxine bilden,

d) ein Stamm von Penicillium coconeum, der Aromen von Schafskäse bildet,

e) Streptomyces-Stämme, die gemischte Antibiotika bilden,

f) Bakterien und Streptomyceten, die Endopeptidasen bilden, und

g) Stämme von Acrostalacmus afidum, die für Blattläuse hyperpathogen sind.

Einige Ergebnisse sind in Tabelle VII genannt.

Diese Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, aus biologischem Material unterschiedlicher Herkunft sehr verschiedene und sehr präzise Ziele zu erreichen. Die Auswahl der gewählten interessanten Eigenschaften .

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und die Eliminierung der störenden Eigenschaften erfordern je nach den getesteten wilden Mikroorganismen mehr oder weniger lange Zeit. Zuweilen sind die Hindernisse groß, so daß es vorzuziehen ist, den Ursprungsstamm zu wechseln, um das festgesetzte Ziel zu erreichen. In allen Fällen werden interessante Ergebnisse erzielt.

Tabelle VII

Zahl der
Zyklen

Wild- 50 stamm

200 500 1000

Trichoderma polysporum

Schutz der Bohne gegen Colletothricum lindemuthianum, Zahl der geschützten Sämlinge, %

Aspergillus flavus

Pro Liter Kulturmedium gebildete Aflatoxine, mg

Fusarium roseum

Schutz der Erbse gegen pathogene Fusariumarten, Zahl der geschützten Sämlinge, %

Streptomyces aureus

Pro Liter Kulturmedium gebildete Menge der Endopeptidase in mg

Streptomyces griseus

1200

60

25

95 98

0 0

15

25 55

1250 4300

6200

Nigericin-Bildner	Grisorixin	0	200	650	2300	2300
Pro Liter gebildete Menge	Niaericin	800	350	0	0	0
Grisorixin und Nigericin
in mg

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Beispiel 7 Verwertung von Konzentraten von löslichem Fischeiweiß

Ein Konzentrat von löslichem Fischeiweiß, das 90% Proteine in der Trockensubstanz enthielt, wurde verwendet. Dieses Konzentrat wurde in vier Raumteilen Wasser (Gewicht/Volumen) gelöst.

In die Vorrichtung gemäß der Erfindung wurden 30 1 der Lösung des vorstehend genannten Konzentrats und 1 bis 2 1 Trichoderma album gegeben, der durch KuItivierung unter Rühren erhalten worden war. Die Temperatur wurde bei 24 bis 28°C und der pH-Wert des Mediums zwischen 3,7 und 4,8 gehalten.

Periodisch wurden Proben entnommen, um den bitteren Geschmack des Konzentrats der löslichen Fischproteine zu bestimmen. Die Reaktion wurde abgebrochen, sobald das Konzentrat frei von bitterem Geschmack war, d.h. nach etwa 3 bis 5 Stunden. Das erhaltene Produkt war ein aus Konzentrat und Mycel bestehendes Gemisch, das gegebenenfalls durch Filtration oder Zentrifugieren

20 getrennt werden kann.

Bei dem vorstehend beschriebenen Laboratoriumsversuch wurde als Ausgangsprodukt ein Konzentrat von löslichem Fischprotein verwendet, das zur Bildung eines flüssigen Nährmediums in Wasser gelöst wurde. In der Praxis kann man Trichoderma album unmittelbar nach Hydrolyse mit Papain nach der Abtrennung der unlöslichen Bestandteile einwirken lassen. Hierdurch werden eine unnötige Trockenstufe und eine unnötige Auflösungsstufe vermieden.

30 Beispiel 8

Reinigung des Diffusionssaftes von Zuckerfabriken

Der Saturationssaft, d.h. der aus Rübenschnitzeln erhaltene Diffusionssaft, kristallisiert schwierig auf

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Grund der Anwesenheit von Verunreinigungen wie Phenolen und Aminosäuren. Wenn das Verfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Diffusionssaftes als Nährmedium durchgeführt wird, erhält man einerseits einen geklärten Saft, der gut kristallisiert und daher das bekannte Verfahren zur Herstellung von Zucker und andererseits von Proteinen von Trichoderma album vereinfacht. Der verwendete Pilz verbraucht den gesamten als Verunreinigung in diesem Saft enthaltenen Stickstoff und Kohlenhydrate, wobei ein Mycel erhalten wird, das die in Tabelle I genannten Eigenschaften aufweist.

Wenn beispielsweise ein Diffusionssaft, der 17% Trockensubstanz und, bezogen auf Trockensubstanz, 1% N enthält,

.verwendet wird, _{s 3} , ,.. . „,-„,

/kann man einerseits einen geklarten Saft, der 15% Trockensubstanz enthält, und andererseits pro Liter 50%igen Diffusionssaft 15 bis 20 g Proteine von Trichoderma album erhalten.

Ebenso erhält man an Stelle von Melassen, die Nebenprodukte der Zuckerindustrie sind, mit Hilfe des Verfahrens gemäß der Erfindung eine Eiweißfraktion, die 50 bis 65% Proteine enthält, und verbessert hierbei die Kristallisation des Zuckers.

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Claims (23)

Patentansprüche

1) Verfahren zur Gewinnung von Nahrungsmittelproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Pilz Trichoderma album bei einer unter 28⁰C liegenden Temperatur in flüssigen Nährmedien kultiviert, deren pH-Wert man zwischen etwa 3,7 und 4,8 hält und deren Gehalt an gelöstem Sauerstoff etwa 6 bis 10 mg/1 beträgt, wobei man die Kultivierung unter wirksamem, nicht traumatisierendem Rühren unter solchen Bedingungen durchführt, daß praktisch kein Überquellen stattfindet.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur zwischen 24 und 28°C arbeitet.

3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Nährmedien auf Basis von landwirtschaftlichen Produkten, Nebenprodukten und Abfallprodukten der Landwirtschaft und Nahrungsmittelindustrie und von zu verwertenden proteinhaltigen Substraten verwendet.

4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als landwirtschaftliche Produkte Mehle, insbesondere aus Weizen, Roggen, Mais, Gerste, Hafer und Erbsen,

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Knollen- und Wurzelfrüchte, insbesondere Kartoffeln, Topinamburen, Maniok, süße Bataten, Zuckerrüben, Melasse und Pulpe von Zuckerrüben, Möhren, "Rutabagas" ' usw., Fruchtfleisch und Schalen von Obst und Früchten, insbesondere Bananen, Ananas, Orangen, Äpfeln, verschiedene Treber und Faserprodukte wie Bagasse, Stroh und Holz verwendet.

5) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nebenprodukte und Abfallprodukte der Landwirtschaft und Nahrungsmittelindustrie insbesondere Geflügelkot, Jauche, Haushaltsabfälle, Abwasser, Abwasser von Konservenfabriken, eiweißverarbeitenden Betrieben, Schlempe von Brennereien, Maisquellwasser, Diffusionswasser von Zuckerfabriken und von der Meeresfauna stammende Produkte, insbesondere Fisch, verwendet.

6) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als von der Meeresfauna stammende Produkte das Pressenwasser und Konzentrate von löslichem Fischeiweiß verwendet.

7) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Proteinsubstrate Zuckerrübenpulpen und Konzentrate von löslichem Fischeiweiß verwendet.

8) Verfahren nach Anspruch 1 zur Gewinnung von Proteinen von Trichoderma album, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stickstoffgehalt (atomarer Stickstoff) der Nährmedien auf einen wert von etwa 4 bis 5%, bezogen auf Trockensubstanz, einstellt.

9) Proteinprodukte, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 8.

10) Proteinprodukte nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Proteinen von modifizierten Substraten

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gegebenenfalls in Mischung mit Proteinen von Trichoderma album bestehen·

11) Proteinhaltige Produkte nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Proteinen des Fadenpilzes Trichoderma album bestehen und 50 bis 65% Proteine (N χ 6,25) bestehen.

12) Fermentationsvorrichtung, gekennzeichnet durch einen Fermenter, Einrichtungen zur Regelung der Temperatur, des pH-Wertes und des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und gegebenenfalls Einrichtungen zur Entschlammung.

13) Vorrichtung nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch

a) einen Fermentationstank (1), der mit einer Abzugsleitung (2), ein Rührwerk (7) und Belüftungseinrichtungen (3) versehen ist,

b) eine Entschlammungseinrichtung, die aus einem Ausdehnungsgefäß (9) besteht, das mit Rückhaltesieben (11, 13) versehen ist, und

c) eine Einrichtung zur Sauerstoffversorgung (14), die mit dem Ausdehnungsgefäß (9) durch eine Leitung (15) verbunden ist, in deren Verlauf eine Umwälzpumpe (16) angeordnet ist, wobei die Sauerstoffversorgungseinrichtung (14) mit dem Tank (1) durch die Leitung (18) verbunden ist, die nach oben über die Sauerstoff versorgungseinrichtung (14) hinaus auslädt und hierdurch im aufsteigenden Teil die Bildung einer Flüssigkeitssäule ermöglicht, die den Schaum resorbiert.

14) Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Rührwerk im Fermentationstank (1) aus einer Baugruppe von perforierten Platten (4) besteht, die durch einen Halter (5) und Stäbe (6) miteinander verbunden sind, wobei der Halter mit einem

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Exzentersystem verbunden ist, das es ermöglicht, die Baugruppe der Platten (4) im Tank (1) auf und ab zu bewegen.

15) Vorrichtung nach Anspruch 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Rührwerk aus einer Baugruppe von Platten (4) besteht, die mit einer waagerechten Achse (5) verbunden sind.

16) Verfahren zur Auswahl von interessanten Eigenschaften und Merkmalen eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wildstamm auf selektiven Nährmedien züchtet, die Kulturen unter bestimmten Temperatur- und Beleuchtungsbedingungen bebrütet, Mikroisolierungen vornimmt und die verbesserten Stämme in Gegenwart oder Abwesenheit von Acridinorange unter erneuter Isolierung der weißen Hyphen mischt.

17) Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) die gewählten selektiven Medien mit einem Wildstamm beimpft,

B) jede Kultur unter den folgenden Bedingungen bebrütet:

a) bei 27°C für einen Tag,

b) bei 37°C für 2 Tage im Dunkeln und dann 2 Tage am Licht,

c) bei 27°C 2 Tage,

C) anschließend die weißen und kräftigen Stämme, die aus jeder auf den selektiven Medien durchgeführten Kultivierung stammen, 2 Stunden bei 4°C mit UV-Licht (250 nm) bestrahlt,

D) die Stämme auf "STARON"-Medium überführt,

E) die erhaltenen Kulturen 2 Tage bei 37°C und dann

2 Tage bei 27°C bebrütet, wobei vor der Senkung der

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Temperatur von 37° auf 27°C die wachsenden Stämme entfernt worden sind,

F) diese Stämme im flüssigen STARON-Medium unter Rühren. 2 Tage bei 27°C bebrütet,

G) sterile Entnahmen vornimmt,

H) die leistungsfähigsten, proteinreichen, an Glykosamin und Antibiotika armen Stämme in Gegenwart von Acridinorange mischt,

I) die erhaltenen Stämme 2 Tage bei 27°C auf STARON-Medium bebrütet,

K) Mikroisolierungen vornimmt und

L) die erhaltenen Stämme 2 Tage bei 27°C bebrütet

und die in dieser Weise erhaltenen Stämme erneut dem vorstehend beschriebenen Zyklus (Stufen A bis L) so häufig unterwirft, daß ein Stamm erhalten wird, der die gewünschten Merkmale aufweist.

18) Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturen gegebenenfalls Teilzyklen unterwirft, deren Stufen in Abhängigkeit von den beim vorhergehenden Zyklus durchgeführten Kontrollen festgelegt werden.

19) Verfahren nach Anspruch 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man elf selektive Nährmedien verwendet, von denen acht Medien aus einer Minerallösung von pH 6,8 bestehen, die 1 g KH₃PO₄, 0,5 g MgSO₄.7 H₃O₁ 0,2 g KCl, 0,2 g CaCl₂, 0,03 g FeSO₄.7 H₃O, 0,01 g ZnSO₄.7 H₃O, 2 mg CuSO₄.5 H₃O, destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1000 ml und 20 g Gelose enthält, der die folgenden Verbindungen zugesetzt worden sind:

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Medium 1: 30 g Glycerin + 2 g Harnstoff,

Medium 2: 20 g Saccharose + 3 g Alanthoin,

Medium 3: 20 g Getreidestärke + 5 g Ammoniumsulfat,

Medium 4: 20 g Glucose + 7 g Tyrosin,

Medium 5: 5 g Kartoffelpektin + 7 g Anthranilsäure,

Medium 6: 20g Getreidestärke + 5 g Natriumnitrat,

Medium 7: 10 g Mannit + 8 g Milchcasein,

Medium 8: 20 g Gluconsäure +1Og Gelatine,

das Medium 9 das "STAR0N"-Medium ist, das 20 g Glucose,

6 g Pepton, 1 g Hefeextrakt, 4 g Maisquellwasser,

0,5 g NaCl, 0,5 g MgSO₄.7 H₃O, 1 g KH₃PO₄, 10 mg FeSO₄.

7 H₂O, destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1 1 und im Falle von festen Medien 20 g Gelose enthält, das Medium 10 aus Nährkartoffeln und das Medium 11 aus Milchserum mit 40 g/l besteht.

20) Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturen gegebenenfalls Teilzyklen unterwirft, die aus den in Anspruch 13 genannten Stufen A bis D bestehen und von Stufen gefolgt sind, die darin bestehen, daß man anschließend eine Bebrütung für 2 Tage bei 27°C, dann Mikroisolierungen zur Auswahl der weißen und kräftigen Stämme vornimmt, diese weißen und kräftigen Stämme weitere 2 Tage bei 27⁰C bebrütet und die hierbei erhaltenen Stämme anschließend auf elf selektive Medien impft und einem vollständigen oder teilweise! Zyklus unterwirft.

21) Verfahren nach Anspruch 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wildstämme aus Bakterien, Streptomyces und Pilzen auswählt und insbesondere Phycomycetes (Rhizopus), Basidiomycetes (Ustilago, Corticium, Fomes, Taphrina, Sclerotinia, Rhabdocline, Phacidiella, Epichloe, Nectria, Onhiobolus, Endothia), Adelomycetes (Phoma, Ascochyta, Septoria, Colletotrichum, Gloeosporium,

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Monilia, Sterigmatocystis, Gliocladium, Geotrichum, Acrostalagmus, Trichoderma, Botrytis, Cephalosporium, Verticillium, Trichothecium, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Fullularia, Torula, Thielaviopsis, Alternaria, Cercospora, Sporodesmium, Helminthosporium, Epicoccum und Graphium) verwendet.

22) Verfahren nach Anspruch 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wildstämme Trichoderma viride, Fusarium roseum, Bauveria tenella, Trichoderma polysporum und/oder Aspergillus orizae verwendet.

23) Mikroorganismen, insbesondere Pilze, gewonnen nach dem Verfahren gemäß Anspruch 16 bis 22.

(24)J Trichoderma album.

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