DE1211017B - Verfahren zum Zuechten von einzelligen Gruenalgen, wie Chlorella - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

AOIh

Deutsche Kl.: 45 d-13/00

Nummer: 1211017

Aktenzeichen: K 57033III/45 d

Anmeldetag: 2. September 1965

Auslegetag: 17. Februar 1966

Die Erfindung betrifft die heterotrophe Züchtung von einzelligen Grünalgen, wie Chlorella, Senedesmus u. dgl. (nachstehend als Chlorella u. dgl. bezeichnet), die als wichtige Rohstoffe für Lebensmittel, Futtermittel, Heilmittel, Chlorophyll, wachstumsfördernde Faktoren für Milchsäurebakterien, physiologisch aktive Faktoren u. dgl. angesehen werden. Erfindungsgemäß soll ein wirksames Verfahren zur industriellen Massenkultur auf der Grundlage der Auswahl der Stämme geschaffen werden.

Chlorella u. dgl. sind als autotrophe Organismen bekannt, die unter Ausnutzung der Lichtenergie in Gegenwart von anorganischen Salzen, Wasser und Kohlendioxyd durch Photosynthese wachsen; bisher wurde im allgemeinen zu deren Massenzüchtung das Verfahren der Teichkultur in einem offenen, umgewälzten System angewendet.

Da jedoch dieses Verfahren sehr vom Licht abhängt und nur geringe Ausbeuten liefert, ist es wegen seiner vielen Nachteile für die industrielle Herstellung ungeeignet. Auf der anderen Seite ist bekannt, daß Chlorella u. dgl. in der Dunkelheit und in Anwesenheit von organischen Substanzen wachsen. Die Wachstumsausbeute ist jedoch sehr gering, und eine Züchtung von Chlorella nach diesem Verfahren in großem Ausmaß war nicht denkbar.

Die Erfinder haben nun die heterotrophe Züchtung von Chlorella u. dgl. untersucht und haben erkannt, daß eine Massengewinnung durch Tankkultur möglich ist, wenn Stamme von Chlorella u. dgl., die unabhängig vom Licht zu einem starken Wachstum in der Lage sind, ausgewählt und geeignete Zuchtbedingungen gefunden werden. Auf diese Weise können Proteine, Vitamine u. dgl., die hinsichtlich ihres Nährwertes wertvoll sind, für die jedoch die Ausgangssubstanzen nicht ausreichen, sehr wirtschaftlich und billig hergestellt werden, wobei Kohlehydrate, wie Zucker, die in großen Mengen zur Verfügung stehen, als Energiequellen verwendet werden.

Als Ergebnis dieser Untersuchungen gelang es, einen Stamm zu isolieren, der ohne Belichtung sehr schnell wächst und sehr ergiebig ist. Zu diesem Zweck wurde Chlorella u. dgl. unter aeroben Bedingungen unter Zusatz von Zuckern oder organischen Säuren sowie von Cystin, Cystein, Methionin, Serin, Glycin, Lysin und Tryptophan oder von Natursubstanzen, die diese Aminosäuren enthalten, in den üblichen, anorganische Salze enthaltenden Medien gezüchtet, ohne daß Kohlendioxyd gesondert eingeleitet wurde. Weiterhin kann eine heterotrophe Kultur dieses Stammes unter geeigneten Bedingungen Chlorella u. dgl. in so hohen Ausbeuten liefern, wie

Verfahren zum Züchten von einzelligen Grünalgen, wie Chlorella

Anmelder:

Fa. Kabushiki Kaisha Yakult Honsha, Tokio

Vertreter:

Dr. Ing. E. Hpffmann, Dipl.-Ing. W. Eitle und Dr. rer. nat. K. Hoffmann, Patentanwälte, München 8, Maria-Theresia-Str. 6

Als Erfinder benannt:
Minoru Shirota, Sakyo-ku,
Hiroshi Endo, Kohrigaoka,
Kei Nakajima, Sakyo-ku (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 11. September 1964 (51387)

sie nach der bekannten Teichkultur nicht möglich waren; hierauf beruht die vorliegende Erfindung.

Die praktische Durchführung der Erfindung ist nachstehend ausführlich beschrieben.

1. Verfahren zur selektiven Isolierung der Stämme Ein flüssiges Medium, das verschiedene Zucker oder organische Säuren als Kohlenstoffquellen, Nitrate, Ammoniak, Ammoniumsalze und Harnstoff als. Stickstoffquellen und Phosphor, Kalium, Schwefel, Magnesium, Mangan, Eisen, Bor, Zink, Molybdän,.

Kobalt und Kupfer in Form von anorganischen Salzen und mehrere Aminosäuren, wie Cystin, Cystein, Methionin, Serin, Glycin, Lysin und Tryptophan oder Natursubstanzen, in denen diese Aminosäuren vorkommen, enthält, wird in Kolben mit Wattestopfen eingefüllt und dann unter Erhitzen' sterilisiert.

Die in den Kolben befindlichen Medien werden dann mit einer Vielzahl von Stämmen von Chlorella u. dgl., die vorher aus Flüssen, Teichen, Reisfeldern, Abwasserkanälen u. dgl. in an sich bekannter Weise in Reinkultur isoliert und autotroph in Agarmedien mit anorganischen Salzen gezüchtet wurden, beimpft und unter Schütteln bei 20 bis 30° C in der Dunkelheit gezüchtet. Nach einigen Tagen werden die Stämme mit dem stärksten Wachstum ausgewählt und in ähnlicher Weise wie oben mehrmals weitergezüchtet, worauf man schließlich den Stamm mit

609 508/?

dem schnellsten Wachstum und mit der größten Vermehrung auswählt. Das beschriebene Verfahren beschränkt sich nicht auf flüssige Medien, sondern kann auch auf eine Standkultur angewendet werden, die auf Medien in Form von Agarplatten mit einer ähnlichen Zusammensetzung geimpft wurde. In diesem Falle wird eine Kolonie mit gutem Wachstum ausgewählt, und die Isolierung wird in ähnlicher Weise wiederholt.

Durch Zusatz von Aminosäuren kann man heterotroph wachsende Stämme in einer äußerst kurzen Zeit erhalten. Die in diesem Fall zu verwendenden Aminosäuren können aus Natursubstanzen, wie Sojabohnen, Hefe, Fischmehl, Fleichextrakt, Milch, Casein, Abfälle von vergorener Milch, Weizenkleie und Extrakten von Reiskleie, gewonnen werden. Der Einfluß der Aminosäurezusätze auf die Wachstumsgeschwindigkeit ist in der Tabelle angegeben.

Einfluß von Aminosäurezusätzen auf das Wachstum (Änderung der Wachstumsmenge nach Tagen)

Medien	2	4	Zeit (Tage) 6	8	14	.Wachstunis geschwindig keit pro Tag
Anorganische Salze enthaltendes Medium mit Zu satz von Glukose ,	0,022 0,034	0,028 0,26	0,04 2,4	0,056 5,8	0,24 6,4	0,17 1,34
Anorganische Salze enthaltendes Medium mit Zu satz,,-von Aminosäuren und Glukose ... ...

Anmerkung: Die Zahlen in der Tabelle beziehen sich auf die Menge von getrockneter Chlorella (g/l).

Wie aus der Tabelle hervorgeht, ist das.Wachstum mit Aminosäurezusatz stärker als ohne Zusatz, wodurch heterotroph wachsende Stämme sehr wirksam ausgewählt werden können. Weiterhin wird, wenn heterotroph gewachsene Stämme unter Verwendung von Medien mit anorganischen Salzen und Glukose, die jedoch keine Aminosäuren enthalten, isoliert werden, das Wachstum schwach, nachdem die zweite Generation in der Dunkelheit gezüchtet wurde, und schließlich geht eine Vielzahl von Stämmen zugrunde. Eine Weiterzüchtung ist dagegen möglich, wenn man Aminosäuren zusetzt, und man nimmt an, daß der Zusatz von Aminosäuren bei der großtechnischen Züchtung einen wichtigen Einfluß hat. '

Weiterhin bewirkt der Zusatz von Aminosäuren zu dem Medium, daß die Komponenten des Mediums schneller verwertet werden, weshalb man durch Erhöhung der Zucker- und Stickstoffkonzentration im Medium ein starkes Wachstum in der Dunkelheit erhält, wobei die maximale Vermehrung bis zu 20 bis 30 g/l beträgt. In diesem Fall soll das Verhältnis der Konzentration der Kohlenstoff quelle zu der der Stickstoffquelle (Verhältnis C: N) im Medium unterhalb 6 gehalten werden, damit der Proteingehalt in den Algenzellen auf mehr als 50% erhöht werden kann.

Der so isolierte Stamm wächst in der Dunkelheit, braucht kein Licht, ergibt eine große Wachstumsgeschwindigkeit und ermöglicht eine Weiterzüchtung und Wiederholung des Wachstums, wodurch das industrielle Tankkulturverfahren praktisch durchführbar wird.

2. Züchtungsverfahren

Der wie oben angegeben ausgewählte Stamm wird in ein übliches Medium mit anorganischen Salzen und Aminosäurezusätzen eingeimpft, wobei die zulässige Höchstmenge an Zuckern oder organischen Säuren im Vergleich mit der Stickstoffquelle ein G: N-Verhältnis von 6 nicht überschreiten soll. Das Medium wird in einen in der Gärungsindustrie üblichen Gärtank eingebracht und unter Belüften und Rühren bei 30° C, ohne daß eigens belichtet wird,

gezüchtet. Hat die Chorella ihr stärkstes Wachstum erreicht, so wird die Menge des Mediums stufenweise jeweils um einen Faktor von 10 erhöht, bis man schließlich eine Reinkultur in einem Tank von einigen Tonnen erhält, die dann herausgenommen wird.

3. Vergleich zwischen einer heterotrophen Tankkultur gemäß der Erfindung und der üblichen Teichkultur

Das Verfahren gemäß der Erfindung ergibt bemerkenswerte Vorteile, wie sie nachstehend angegeben sind. .

a) Die Wachstumsgeschwindigkeit nach dem Verfahren gemäß der Erfindung beträgt 16 g je Liter und Tag, während man nach der Teichkultur eine Ausbeute von nur 0,086 g je Liter und Tag erhält. Die Ausbeute ist also etwa 200mal größer. Weiterhin ändert sich nach dem Verfahren gemäß der Erfindung der Eiweißgehalt der erzeugten Algen nicht, und der Gehalt an Vitamin-B-Komplex ist viel höher.

b) Vom Standpunkt der industriellen Herstellung lassen sich die Substrate nach dem Verfahren gemäß der Erfindung besser ausnutzen, wenn die Produktion gut überwacht wird; die Ernte ist einfach, und· man kann unter hygienischen Bedingungen arbeiten. Weiterhin sind die Investitions- und Herstellungskosten sehr niedrig. Bei den Verfahren der Teichkultur wirken wilde Keime stark verunreinigend, die Qualität des Produktes ändert sich, die Geschwindigkeit, mit der die Substrate verwertet werden, ist gering, und das Wetter spielt eine große Rolle, wodurch dieses Verfahren für industrielle Anwendungszwecke ungeeignet ist.

c) Die Auswahl und Abtrennung von heterotrophen Stämmen kann durch Zusatz von Aminosäuren in kurzer Zeit leicht durchgeführt werden, und diese Stämme zeigen eine starke, reproduzierbare Vermehrung.

Zur Erläuterung der Erfindung sind nachstehend einige Beispiele angegeben:

Beispiel 1

Es wurde ein Medium mit der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt:

KNO₃ 1,25 g/l

MgSO₄-7H₂O 1,25 g/l

KH₂PO₄ 1,25 g/l

Fe-Lösung * und modifizierte A₅-Lo-

sung

je 1 ml

Glukose 10,0 g/l

Aminosäuren des Caseins 5,0 g/l

Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt.

* Fe-Lösung:

FeSO₄ · 7 H₂O 2,0 g/l

Konzentrierte H₂SO₄ 4 Tropfen/1

** Modifizierte As-Lösung:

H₃BO₃ 2,86 g/l

MnCl₂-4 H₂O 1,81 g/l

ZnSO₄-7 H₂O 0,222 g/l

MoO₃ 0,0177 g/l

CuSO₄ -5H₂O 0,079 g/l

CoCl₂ 1,00 g/l

Die Medien mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurden in Kolben gefüllt, die Kolben mit Watte verstopft, durch Erhitzen unter Druck sterilisiert, einzeln mit einer Vielzahl von vorher in Reinkultur isolierten und autotroph auf einem Agarmedium mit anorganischen Salzen unter Schütteln bei 30° C im Dunkeln gezüchteten Chlorellastämmen beimpft. Der Stamm, der nach 6 Tagen das stärkste Wachstum zeigte, wurde als Impfmaterial für die nächste Kultur verwendet, worauf diese Arbeitsweise mehr als dreimal wiederholt wurde, wobei die erhaltene Kultur dann als Impfkultur verwendet wurde.

Dann wurde unter Verwendung der nachstehenden Komponenten ein weiteres Medium hergestellt:

KNO₃ 5,0 g/l

MgSO₄ ·7H₂O 1,25 g/l

KH₂PO₄ 2,00 g/l

Fe-Lösung und modifizierte A₅-Lo-

sung je 5 ml

Glukose 50 g/l

Extrakt aus entfetteten Sojabohnen 50 ml

Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt.

Das Medium wurde unter Druck sterilisiert, mit der Impfkultur (3 g/l) versetzt und bei 30° C unter Schütteln gezüchtet; nach 2 Tagen wurde eine vorher sterilisierte KNO₃-Lösung (7 g/100 ml, N = 400 mg) aseptisch zu der Kulturlösung gegeben, wobei der pH-Wert mit konzentrierter H₂SO₄ auf 6,0 eingestellt wurde, worauf nach weiteren 2 Tagen die Algen geerntet wurden. Während der Züchtung wurde nicht eigens belichtet.

Ausbeute (Trockensubstanz): 22,5 g/l.

Bei der industriellen Herstellung wurde das Kulturmedium stufenweise jeweils um einen Faktor von 10 vergrößert. In diesem Fall war jeder Kulturtank mit einem Rührer, einer Belüftungsvorrichtung und einer Nachheizvorrichtung versehen. Das Medium mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurde in den Tank eingefüllt, der dann nach dem Sterilisieren unter Druck und nach dem Abkühlen mit der Kultur beimpft wurde; die Züchtung wurde bei 30⁰C unter Rühren und Einleiten von aseptischer Luft durchgeführt. Die nächste Kultur wurde nach dem gleichen Schema durchgeführt. Die Tanks wurden nicht absichtlich belichtet.

j. Beispiel 2

Es wurde ein Kulturmedium mit der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt:

Harnstoff 1,00 g/l

MgSO₄-7H₂O 0,25 g/l

KH₂PO₄ 0,25 g/l

KCl 0,25 g/l

Fe-Lösung und modifizierte A₅-Lo-

sung je 1,0 ml

Glukose 10,0 g/l

Aminosäuren des Caseins 5,0 g/l

100 ml Kulturmedium mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurden in 500-ml-Kolben eingefüllt, mit einem Wattestopfen verschlossen, unter einem Druck von etwa 1,05 atü 15 Minuten sterilisiert, mit einer Vielzahl von vorher in Reinkultur isolierten und autotorph auf einem Agarmedium mit anorganischen Salzen gezüchteten Senedesmus-Stämmen beimpft, worauf die Züchtung unter Schütteln bei 30° C im Dunkeln durchgeführt wurde.

Nach einer Kulturdauer von 6 Tagen wurde der Stamm mit dem aktivsten Wachstum zum Beimpfen der nächsten Kultur verwendet, worauf diese Arbeitsweise noch mehr als dreimal wiederholt wurde, um die Impfkultur zu gewinnen.

Dann wurde ein sterilisiertes Kulturmedium mit der nachstehenden Zusammensetzung mit der Impfkultur (3 g/l) versetzt:

Harnstoff 2,0 g/l

MgSO₄-7H₂O 2,OgA

KH₂PO₄ 3,0 g/l

KCl 0,25 g/l

Fe-Lösung und modifizierte A₃-

Lösung 5,0 ml

Glukose 50,0 g/l

Abfallflüssigkeit von vergorener

Milch 50ml

(N=400mg)

Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt.

Die Züchtung wurde 36 Stunden bei 30° C unter Schütteln durchgeführt, worauf eine vorher zubereitete und sterilisierte Harnstofflösung mit 3 g Harnstoff je 50 ml aseptisch zu der Kultur gegeben wurde. Dann wurde noch 12 Stunden ununterbrochen weitergezüchtet, worauf die Algen geerntet wurden. Ausbeute (Trockensubstanz): 32,5 g/l.

Bei der großtechnischen Gewinnung soll die Menge der Kluturlösung, wie bei der großtechnischen Gewinnung nach Beispiel 1, fortlaufend erhöht werden. Auf der letzten Kulturstufe (40001) wird eine vorher zubereitete und sterilisierte Harnstofflösung (12 kg Harnstoff, gelöst in 401 Wasser) etwa 36 Stunden nach Beginn der Züchtung aseptisch der Kulturbrühe zugegeben, worauf die Algen nach weiteren 12 Stunden geerntet werden.

Ausbeute: 120 kg/41.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zum industriellen Züchten von einzelligen Grünalgen, dadurch gekennzeich-

   net, daß man einzellige Grünalgen, wie Chlorella oder Senedesmus, in ein sterilisiertes Medium mit .anorganischen Salzen und Zusätzen von Zuckern oder organischen Säuren und von mindestens einer bzw. allen Aminosäuren, wie Cystin, '5 Cystein, Methionin, Serin, Glycin, Lysin, Tryptophan oder Natursubstanzen, die diese Aminosäuren enthalten, einträgt, die Algen einige Tage unter Schütteln oder Rühren sowie unter Belüftung im Dunkehi bei optimalen Temperaturen. ohne besondere Zufuhr von Kohlendioxyd, züchtet, die Stämme mit starker Vermehrung isoliert, die Züchtung der isolierten Stämme noch mehrmals in der angegebenen Weise wiederholt, den Stamm mit der stärksten Vermehrung als Impfstamm auswählt, diesen Stamm in ein Medium aus anorganischen Salzen, dem die genannten Aminosäuren sowie eine maximale Menge an Zuckern, organischen Säuren und einer verwertbaren Stickstoffquelle zugesetzt sind, einimpft und ihn aseptisch bei geeigneten Temperaturen unter Schütteln oder Rühren, sowie unter Belüftung züchtet, ohne daß man eigens Licht oder Kohlendioxyd zuführt.

   609 508/3 2.66 ® Bundesdruckerei Berlin