DE2643834A1 - Verfahren zum herstellen von einzellprotein - Google Patents
Verfahren zum herstellen von einzellproteinInfo
- Publication number
- DE2643834A1 DE2643834A1 DE19762643834 DE2643834A DE2643834A1 DE 2643834 A1 DE2643834 A1 DE 2643834A1 DE 19762643834 DE19762643834 DE 19762643834 DE 2643834 A DE2643834 A DE 2643834A DE 2643834 A1 DE2643834 A1 DE 2643834A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- medium
- nrrl
- fermentation
- bacillus
- growth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/32—Processes using, or culture media containing, lower alkanols, i.e. C1 to C6
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Patentanwalt
Ludwigstraße 67
6300 Gießen/Lahn H/G (956)
Phillips Petroleum Company, Bartlesville, OkIa., U.S.A.
VERFAHREN ZUM HERSTELLEN VON EINZELLPROTEIN
Priorität: 30. September 1975, USA Serial Nr. 618 191
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein durch eine Kultur von einem Mikroorganismus.
Zu den Anstrengungen für die Behebung der weltweiten Knappheit an Protein gehören verschiedene biosynthetische
Verfahren, bei denen biologisch hergestelltes Einzellprotein durch das Wachstum einer Vielzahl von Mikroorganismen
auf einer Vielzahl von kohlenstoffhaltigen Substraten erzeugt wird. Bei derartigen Verfahren sollten die Kohlenstoff-
und Energiequellen,die als Substrate verwendet werden, in großem Umfang zur Verfügung stehen, relativ
billig, gleichförmig und ungefährlich sein, so daß keine störenden Rückstände in dem als Endprodukt erhaltenen
Protein vorhanden sind. Man hat schon Erdölkohlenwasserstoffe als Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet, doch
traten dabei in der Praxis Schwierigkeiten wegen der geringen Wasserlöslichkeit, des hohen Sauerstoffverbrauchs
und der möglicherweise in den Erdölrohstoffen vorkommenden
krebserregenden Stoffe auf.
709813/0953
-Z-
Bei anderen Verfahren wurde von oxydierten Kohlenwasserstoffderivaten
ausgegangen, die in Wasser löslich sind und sich infolgedessen leicht handhaben lassen, da die
mikrobielle Umwandlung im wesentlichen in wässrigem Medium stattfindet. Solche Ausgangsstoffe stehen leicht zur Verfügung,
wobei als Rohstoffe Erdöl, Erdgas, verschiedene Verarbeitungen von Abfällen und Mull, die Umwandlung von
Methan, die Vergärung von verschiedenen Getreidearten und die trockene Destillation von Holz in Betracht kommen.
Unabhängig von der Rohstoffquelle stehen diese oxydierten Kohlenwasserstoffe in großen Mengen und bei relativ niedrigen
Preisen zur Verfugung. Auf der Tatsache, daß diese Ausgangsstoffe bereits teilweise oxydiert sind, beruht es,
daß ein wesentlich geringerer molekularer Sauerstoffbedarf bei der mikrobiellen Umwandlung und Wachstum erforderlich
ist. Ein anderer Faktor, der Schwierigkeiten bereitete und die praktische Verwendung der Verfahren zum Herstellen von
Einzellproteinen einschränkte, bestand darin, daß diese Verfahren bei relativ niedrigen Temperaturen von etwa 20 bis
50 C, bevorzugt nicht oberhalb von 35 C durchgeführt werden mußten. Da die mikrobielle Umwandlung eine stark exotherme
Oxydationsreaktion ist, bei der große Wärmemengen entstehen,
ist es erforderlich, während der Umwandlung kontinuierlich und wirkungsvoll die Wärme abzuführen, weil sonst die Gefahr
besteht, daß eine Überhitzung des Systems und eine Abtötung oder mindestens eine schwere Schädigung der Mikroorganismen
eintritt, wodurch die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens erheblich reduziert wird.
Zahlreiche dieser mikrobiellen Verfahren haben sich auf die Verwendung von einer oder anderen Hefeart als Mikroorganismus
konzentriert. Es stehen im allgemeinen viele Hefearten
709813/0953
zur Verfügung und die Hefezellen sind im allgemeinen etwas größer als die Bakterienzellen und lassen sich manchmal
leichter von dem Gärungsmedium abtrennen.
Die Bakterien besitzen aber andere Vorzüge, da sie einen höheren Gehalt an Rohprotein und einen geringeren Gehalt
an nichtproteinartigen Materialien in ihren Zellen enthalten.
Die Bakterien haben deshalb in der Regel einen wesentlich höheren echten Proteingehalt und enthalten einen
höheren Anteil an den für die Ernährung wichtigen schwefelhaltigen Aminosäuren und Lysin.
Es besteht deshalb ein Interesse für Gärungsverfahren mit Bakterien, die ein rasches Wachstum und hohe Produktivitätsraten
bei relativ hohen Gärungstemperaturen zeigen. Die Verwendung von hohen Gärungstemperaturen hat zur Folge,
daß weniger Wärme entfernt werden muß, daß die Aufwendungen für Kühleinrichtungen geringer sind und daß auch geringere
Mengen an Wärme für die Sterilisierung, Koagulation und die Trennverfahren benötigt werden. Außerdem wird bei der Durchführung
der Gärung bei höheren Temperaturen die Gefahr der Kontaminierung mit anderen Mikroorganismen stark verringert.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, thermophile oder thermotolerante Bakterien für die Herstellung
von Einzellprotein zur Verfügung zu stellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein durch eine Kultur von einem Mikroorganismus
in einem wässrigen Medium unter Verwendung von mineralischen Nährstoffen, einem oxydierten Kohlenwasserstoff
als Kohlenstoff- und Energiequelle und einer unter den Bedingungen der aeroben Gärung assimilierbaren Stickstoffquelle
709813/0953
und durch Aufarbeiten der erhaltenen Mikroorganismen als Einzellprotein, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet
ist, daß der Mikroorganismus ein Bazillus der Art NRRL B-8065 oder NRRL B-8066 ist.
Diese beiden thermophilen Bakterienarten gehören zur Gruppe
Protophyta, Klasse Schizomycetes, Ordnung Eubacteriales,
Familie Bacillaceae, Stamm Bacillus. Sie besitzen sehr vorteilhafte und nützliche Eigenschaften und vermehren sich
bei höheren Temperaturen stärker als bei den üblichen Temperaturen. Als oxydierte Kohlenwasserstoffe kommen für das
Wachstum dieser Mikroorganismen insbesondere niedrige Alkohole, bevorzugt Methanol oder Äthanol, in Betracht. Das
Wachstum dieser Mikroorganismen findet bei erhöhten Temperaturen statt, bei denen die bekannten Bazillusarten entweder
relativ unproduktiv sind oder diese Temperaturen nicht vertragen oder bei diesen Temperaturen einen oxydierten
Kohlenwasserstoff nicht vertragen oder unproduktiv sind. Es wurden je dreißig lyophilisierte Zubereitungen
von jeder Bazillusart hinterlegt beim United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern
Region Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604. Dort sind diese Proben registriert worden und haben die bereits
angegebene Kennzeichnung erhalten. Die Bazillusart NRRL B-8065 entspricht der Züchtung 47 und die Bazillusart
NRRL B-8066 der Züchtung 72. Diese Bazilluszüchtungen sind bei relativ hohen Gärungstemperaturen sehr produktiv
und erzeugen wertvolle Einzellproteinprodukte mit einem hohen Proteingehalt und einer erwünschten Art und Verteilung der
Aminosäuren. Diese hinsichtlich ihres Verhaltens bei hoher Temperatur einmaligen Bazillusarten ermöglichen die Herstellung von Einzellprotein mit höherer Raumzeitausbeute
7 0 9 813/0953
und geringerem Aufwand an Kühleinrichtungen. Unter den bereits genannten oxydierten Kohlenwasserstoffen ist
als Kohlenstoff- und Energiesubstrat besonders Methanol oder ein im wesentlichen methanolhaltiges Substrat geeignet.
Für die Herstellung von Einzellproteinen mit Hilfe dieser Bazillusarten sind mit Schaum gefüllte Gärungseinrichtungen
von besonderem Interesse.
Die Kultur Nr. 72 NRRL B-8066 ist ein grampositiver, sporenbildender Bazillus von enger, stabförmiger Erscheinung.
In den Zellen sind keine farbigen Pigmente erkennbar.
Die Kultur Nr. 47 NRRL B-8065 ist ein grampositiver,
sporenbildender Bazillus von dicker, stabförmiger Erscheinung. Auch bei dieser Bazillusart sind keine farbigen
Pigmente in den Zellen erkennbar.
Die neu isolierten Mikroorganismen können durch die in der folgenden Tabelle angeführten Merkmale charakterisiert
werden. Zum Vergleich sind in diese Tabelle auch die Eigenschaften von einigen bekannten Bazilluskultüren aufgenommen.
709813/0953
BAZILLUS KULTUREN
| Kultureigenschaft od. Testergebnis |
Kultur 47 NRRL B-8065 |
Kultur 72 NRRL B-8066 |
B. licheniformis NRRL B-1001 |
B. coagulans NRRL B-1103 |
B. subtilis ATCC 10774 |
B. stear0thermo· philis ATCC 1298: |
| Gram-Färbung | Positiv | Positiv | Positiv | Positiv | Positiv | Variabel |
| Spor enbi1dung | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Aerob | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Ungef.Größe,/u | 0,5x1-2,5 | 0,6x1-5 | 0,6-0,8x1,5-3 | 0,6-2,5x1-5 | 0,7-0,8x2-3 | 0,6-1x2-5 |
| Bewegbarkeit | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Opt.Temp., °C | 55 | 55 | 32-45 | 33-45 | 28-40 | 30 |
| Max.Temp., 0C | 60-65 | 60-65 | 50-56 | 55-60 | 50-55 | 50-55 |
| pH-Bereich | 5-9 | 5-9 | 5,2-8,2 | 5-7 | 5-8,6 | 4,5-6,6 |
| Opt. pH (IM2 Medium) |
6,2-6,8 | 6,2-6,5 | kW | kW | kW | kW |
| Wachstumsfaktoren | Nicht er forderlich |
Nicht er forderlich |
Nicht er forderlich |
Thiamin, Biotin |
Nicht er forderlich |
kW |
| Pigmente in IM2 Medium + 1,5% CH3OH |
braun, H2O lösl.,unlösl. in org.Lösg- mittel |
gelb, H2O lösl., unlösl, in org.Lösgs- mittel |
kW • |
kW | kW | kW |
| Zellaussehen | Stäbchen bis lange Ketten |
Stäbchen | Stäbchen, keine Ketten |
Stäbchen, keine Ketten |
Stäbchen, keine Ketten |
S täbchen, manch mal fadeafönni |
| Kulturaussehen im IM2 Medium + 1,5% CH3OH |
rund erhaben, leicht braun |
'rund erhaben, matt-weiß |
kW | kW | kW | kW K3 CD -£>- CO |
709813/0953
OO CO
KuItüreigenschaft od. Testergebnis
Kultur NRRL B-8065
cc*
en
co
Wachstum bei 55 C auf: Nährlösung
Nährlösung
+ 1% CH3OH -
IM2+0,5% CH3OH +
IM2+1,5% CH3OH +
Glukose
CH3OH +
CH3CH2OH +
HCHO +
BHM+1,5% CH3OH + 0,1% NaCl
BHM + 5% CH3OH
"Plate count"
+ 1,5% CH3OH
+ 1,5% CH3OH
durchscheinend "spreading edges"
Kultur 72 NRRL B-8066
B.l ichenif ortnis B.coagulans B.subtilis B. stearothermo-NRRL B-IOOl NRRL B-1103 ATCC 10774 philis ATCC
durchscheinend glitzernd
klein
+ = erkennbares Wachstum durch Zunahme der Trübung der Ausgangsmischung
- = kein Wachstum erkennbar
+ = sich selbst erhaltend, aber kein erkennbares zusätzliches Wachstum
kW - kein Wachstum auf diesem Medium
N3
σ>
CjO
OO CaJ
Diese Vergleiche wurden so durchgeführt, daß man eine möglichst direkte Vergleichbarkeit der einzelnen Arten
hat. Wie bei allen Mikroorganismen können aber bestimmte charakteristische Merkmale gewissen Änderungen in Abhängigkeit
von dem Medium unter besonderen Bedingungen unterworfen sein.
Als Kohlenstoff- und Energiequelle oder Substrat für das Gärungsverfahren dient bei der vorliegenden Erfindung
eine oder mehrere wasserlösliche Verbindungen, die Kohlenstoff, Sauerstoff und Wasserstoff enthalten. Der Ausdruck
"oxydierter Kohlenwasserstoff" umfaßt derartige Verbindungen im allgemeinen und stellt nicht eine Beschränkung
des Substrats dar. Beispiele für geeignete oxydierte Kohlenwasserstoffe sind Alkohole, Ketone, Ester, Äther,
Säuren und Aldehyde, die im wesentlichen wasserlöslich sind und deshalb bis zu etwa 10 Kohlenstoffatome im Molekül
enthalten können.
Typische Verbindungen dieser Art sind Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Hexanol, 1,7-Heptandiol,
2-Heptanol, 2-Methyl-4-pentanol, Pentansäure, 2-Methylbutansäure,
2-Pentanol, 2-Methyl-4-butanol, 2-Methyl-3-butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-l-propanol, 2-Methyl-2-propanol,
2-Propanol, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Formaldehyd, Acetaldehyd, Propanal, Butanal, 2-Methylpropanal,
Buttersäure, 2-Methylpropionsäure, Pentansäure, Glutarsäure, Hexansäure, 2-Methylpentansäure, Heptand!carbonsäure,
Heptansäure, 4-Heptanon, 2-Heptanon, Octansäure, 2-Äthylhexansäure,
Glyzerin, Äthylenglycol, Propylenglycol,
2-Propanon, 2-Butanon, Diäthyläther, Methyläthyläther, Dimethylather, Di-n-propylather und n-Propylisopropylather
709813/0 9 53
und Mischungen von zwei oder mehreren dieser Stoffe.
Eine bevorzugte Gruppe von solchen Kohlenstoff- und Energiequellen sind die wasserlöslichen aliphatischen
einwertigen Kohlenwasserstoffalkohole aufgrund ihrer Löslichkeit in Wasser, wobei besonders die niedrigen
Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Molekül wegen ihrer leichten Zugänglichkeit bevorzugt sind. Unter diesen
Alkoholen sind Äthynol und Methanol von besonderem Interesse, wobei Methanol wegen seines niedrigen Preises
am meisten bevorzugt wird.
Es lassen sich auch Mischungen von beliebigen dieser oxydierten Kohlenwasserstoffe verwenden. So ist z.B. eine
handelsübliche Mischung geeignet, die aus Methanol und einem niedrigen Prozentsatz an höheren Alkoholen besteht
(vgl. C. & E.N., 17. September 1973, Seite 23). Eine andere Kohlenstoff- und Energiequelle ist oxydiertes Erdgas,
das Methan, Äthan und dergleichen enthält, wobei Mischungen entstehen, die vorwiegend die entsprechenden
Alkohole und außerdem verschiedene Ketone, Aldehyde, Äther und Säuren enthält. In ähnlicher Weise können oxydierte
Kohlenwasserstoff-Fraktionen aus verschiedenen .Erdölquellen
als Substrat verwendet werden.
Die Züchtung der neuen Bakterienarten kann auf dem oxydierten Kohlenwasserstoffsubstrat mit Vorteil in einem
Temperaturbereich von 45 bis 65 C durchgeführt werden, wobei Temperaturen von 50 bis 600C bevorzugt und eine
Temperatur von etwa 55 C ganz besonders bevorzugt sind.
Die Züchtung wird in einem Medium durchgeführt, das ein
wässriges Mineralsalz, die Kohlenstoff- und Energiequelle,
709813/Ö953
molekularen Sauerstoff und die Impfung der besonderen Bakterienart enthält.
Hohe Konzentrationen von einigen der beschriebenen Kohlenstoff- und Energiesubstraten wie Methanol oder Formaldehyd
können das Wachstum der Mikroorganismen behindern oder sogar toxisch gegenüber den neuen Mikroorganismen sein.
Relativ hohe Konzentrationen dieser Substrate sollten deshalb vermieden werden, so daß es vorteilhaft ist, die Substratkonzentration
in dem Gärungsmedium bei einem Niveau von etwa 0,01 bis 5 Vol./Vol.%, bevorzugt etwa 0,01 bis
0,5 Vol./Vol.% zu halten, so daß die Mikroorganismen weder abgetötet noch in ihrem Wachstum behindert werden.
Dem Gärungsmedium kann Sauerstoff in beliebiger, durch die Mikroorganismen assimilierbarer Form zugeführt werden. Es
ist zwar möglich, für diesen Zweck Verbindungen zu benutzen, die molekularen Sauerstoff abgeben, doch ist dies aus wirtschaftlichen
Gründen in der Regel nicht von Interesse. Man zieht es vielmehr vor, den molekularen Sauerstoff in Form
eines Gases, das molekularen Sauerstoff enthält, zuzuführen, wobei üblicherweise Luft bei atmosphärischem oder erhöhtem
Druck oder mit Sauerstoff angereicherte Luft verwendet wird. Wie bereits eingangs ausgeführt wurde, wird ein Teil des
erforderlichen Sauerstoffs durch das oxydierte Kohlenwasserstoff substrat geliefert. Trotzdem müssen weitere Mengen an
molekularem Sauerstoff für das Wachstum der Mikroorganismen zugeführt werden, da die Assimilation des -Substrats und
das entsprechende Wachstum der Mikroorganismen ein Verbrennungsvorgang
ist. Üblicherweise werden zwischen 0,1 und (bevorzugt zwischen 0,7 und 2,5) Volumina von Luft von normalem
Sauerstoffgehalt pro Minute dem Reaktor pro Volumen
709813/0953
Flüssigkeit in der Gäreinrichtung zugeführt. Auf Sauerstoff
bezogen liegen diese Bereiche bei 0,02 bis 2,1 und 0,14 bis 0,55.
Der bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendete Druck kann innerhalb eines weiten Bereiches schwanken und man
kann Drücke von 0,1 bis 100 Atm, bevorzugt 1 bis 30 Atm, benutzen. Besonders bevorzugt sind gegenüber dem atmosphärischen
Druck leicht erhöhte Drücke, weil dabei das Verhältnis der Anlagekosten in Relation zu der Steigerung der Löslichkeit
von Sauerstoff durch Druckerhöhung günstig liegt. Allgemein läßt sich sagen, daß höhere Drücke als atmosphärischer
Druck vorteilhaft sind, weil dadurch die Konzentration des in dem wässrigen Gärungsmedium gelösten Sauerstoffs erhöht
wird, wodurch andererseits das Wachstum, der Mikroorganismen gesteigert wird. Erhöhte Drücke werden außerdem auch
deshalb bevorzugt, weil bei höheren Züchtungstemperaturen die Löslichkeit des Sauerstoffs in dem wässrigen Medium abnimmt.
Die Durchführung der Züchtung in einem schaumförmigen Medium hat den Vorteil, daß der Sauerstofftransfer, der für
höhere Zelldichten und ein schnelles Wachstum erforderlich ist, gefördert wird.
Die bei der Erfindung verwendeten neuen Bazillusarten erfordern außer dem Sauerstoff und einer Kohlenstoff- und
Energiequelle mineralische Nährstoffe und eine assimilierbare Stickstoffverbindung. Die Stickstoffverbindung kann
eine beliebige stickstoffhaltige Verbindung sein, die in der Lage ist Stickstoff in einer Form abzugeben, die für die
Verwendung im Stoffwechsel der Bazillen geeignet ist. Für diesen Zweck kann eine Vielzahl von organischen Stickstoffverbindungen
wie Proteine, Harnstoff und dergleichen benutzt
709813/0953
werden, doch werden in der Regel aus wirtschaftlichen Gründen anorganische Stickstoffverbindungen benutzt.
Geeignete anorganische Stickstoffverbindungen sind beispielsweise Ammoniak, Ammoniumhydroxyd, verschiedene
Ammoniumsalze wie Ammoniumeitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphyrophosphat oder verschiedene
ähnliche Verbindungen. Es kann auch gasförmiges Ammoniak verwendet werden, das man in kleinen Mengen durch das
wässrige Züchtungsmedium hindurchleitet.
Der pH-Wert des wässrigen Züchtungsmediums sollte in der Regel im Bereich von etwa 5 bis 9, bevorzugt etwa 6 bis 8
und besonders bevorzugt etwa 6 bis 7,5 liegen. Die Bazillus art NRRL B-8065 gedeiht am besten im pH-Bereich von etwa
6,2 bis 6,8 und die Bazillusart NRRL B-8066 im pH-Bereich von etwa 6,2 bis 6,5, wobei diese Angaben besonders für
das "IM2" Medium gelten. Da die optimalen pH-Bereiche der
Mikroorganismen in Abhängigkeit von dem verwendeten Medium bekanntlich schwanken, sind in dieser Beziehung bei Änderung
des Mediums auch Änderungen des optimalen pH-Bereiches möglich.
Wenn die Kohlenstoff- und Energiequelle ein Aldehyd ist und dieser Aldehyd in dem Züchtungsmedium in für den Mikroorganismus
schädlichen Mengen vorhanden ist, kann die schädliche Wirkung des Aldehyds dadurch verhindert werden, daß
das Substrat mit einer geeigneten Menge einer stickstoffhaltigen Verbindung, insbesondere Ammoniak', Ammoniumhydroxyd
oder einer anderen Ammoniumverbindung behandelt wird. Dabei werden in der Regel 0,01 bis 10 Moläquivalente der stickstoffhaltigen
Verbindung für jedes Mol Aldehyd verwendet. Ein derartig behandeltes Substrat ist dann nicht nur die
709813/0 9 53
ΛΗ 264383
Kohlenstoff- und Energiequelle, sondern enthält auch die Stickstoffquelle teilweise oder vollständig.
Um ein gutes Wachstum der Mikroorganismen sicherzustellen
und die Assimilation der oxydierten Kohlenwasserstoffe durch die Zellen zu gewährleisten, sind noch mineralische
Nährstoffe in dem Medium außer den bereits genannten Stoffen erforderlich.
Zu derartigen mineralischen Nährstoffen gehören Phosphate oder andere Phosphorverbindungen und Verbindungen von Magnesium,
Calcium, Natrium, Mangan, Molybdän und Kupfer, die bevorzugt in ionischer Form vorliegen sollen. Die nachstehende
Aufstellung kann dazu verwendet werden, um die neuen Bazillusarten zu züchten, obwohl diese auch auf anderen
als methanolhaltigen Substraten wachsen.
Komponente KH2PO4
K2HPO4 MgSO4-7H2O
CaCl2-2H2O NaCl
(NH4)2S04 Agar-Agar
(NH4)2S04 Agar-Agar
(a)
Lösung der mineralischen Spurenelemente
Destilliertes Wasser Steriles Methanol um zu ergeben
(a) Vergleiche nachstehende Aufstellung
(b) unmittelbar vor der Verwendung zugegeben
709813/0 9 53
| Menge | g | g |
| 2,0 | g | g |
| 3,0 | g ,' | |
| 0,4 | 0,04 g | ml |
| 0,1 | ml | |
| 2,0 | Vol.% | |
| 15 g | ||
| • 0,5 | ||
| 1 000 | ||
| 1,5 |
| Komponente | 5H | 2° |
| CuSO4. | ||
| KJ | H2 | 0 |
| MnSO,. 4 |
4* | 2H |
| Na2MoO | ||
| H3BO3 | 7H | 2° |
| ZnSO,. 4 |
6H ι i |
2° |
| FeCl3. | JLl | er |
| Des LXJL H2SO4 |
Menge
0,06 g 0,08 g 0,3 g 0,2 g 0,02 g 2,0 g 4,8 g 1 000 g 3 ml
Es können auch andere Stoffe zugegeben werden, wie Hefeextrakte, Vitamine, Biotin und andere Wachstumsfaktoren
oder Stoffe, die in Spurenmengen bei der Züchtung von Mikroorganismen bekannt sind.
Das Verfahren nach der Erfindung kann kontinuierlich und diskontinuierlich durchgeführt werden, wobei die kontinuierliche
Arbeitsweise insbesondere in einem mit einer schaumförmigen Masse gefüllten Reaktor besonders bevorzugt
ist. Für die Herstellung von großen Mengen an· Einzellprotein besitzt die kontinuierliche Arbeitsweise eine ganze
Reihe von Vorteilen.
Sowohl beim diskontinuierlichen als auch beim kontinuierlichen
Verfahren wird die gesamte Ausrüstung einschl. Reaktor, Leitungssystem und Kühleinrichtungen sterilisiert, wozu
üblicherweise Dampf, z.B. von 121 C, für einige Minuten, wie etwa 15 Minuten verwendet wird. Der sterilisierte
Reaktor wird mit einer Kultur der Mikroorganismen in Gegen-
709813/0 9 53
wart aller erforderlichen Nährstoffe, einschl. von Sauerstoff und der oxydierten Kohlenwasserstoffquelle geimpft.
Bei der kontinuierlichen Durchführung des Verfahrens wird, sobald die Kultur zu wachsen beginnt,die kontinuierliche
Einführung von Sauerstoff, des Nährstoffmediuras, der Stickstoffquelle, falls sie getrennt zugegeben wird, und des
oxydierten Nährstoffes wie des Alkohols aufrechterhalten. Die Zugabegeschwindigkeit der verschiedenen Ströme kann
variiert werden, so daß ein so schnelles Wachstum wie möglich unter wirksamer Verwendung des oxydierten Kohlenwasserstoffs
und eine maximale Ausbeute an Zellgewicht pro Gewicht der Kohlenstoff- und Sauerstoffquelle erhalten
wird. Die Zuführungsgeschwindigkeit der Kohlenstoff- und Energiequelle sollte so eingestellt werden, daß die dem
Gärungsgefäß zugeführten Mengen etwa gleich mit dem Verbrauch durch den Mikroorganismus sind. Dadurch wird eine
Überfütterung der Mikroorganismen,insbesondere mit toxischen Materialien wie Alkoholen oder Aldehyden, die das Wachstum
der Mikroorganismen inhibieren oder sie sogar töten können, vermieden. Befriedigende Betriebsbedingungen erkennt man
in der Regel daran, daß in dem Abgang aus dem Gärungsgefäß wenig oder keine Kohlenstoff- und Energiequelle vorhanden
ist, obwohl man eine befriedigende Überprüfung auch dadurch erreichen kann, daß man den Gehalt an der Kohlenstoff- und
Energiequelle in dem Abgang aus dem Gärungsgefäß überwacht und ihn bei einem gewünschten niedrigen Niveau, wie z.B.
0,1 bis 0,5 Vol./Vol.% hält. Die Ströme der Ausgangsstoffe können selbstverständlich entweder anteilsweise oder kontinuierlich
nach den jeweils gewünschten Bedingungen zugeführt werden.
709813/0953
Bei der Gärung sollten die erforderlichen Einrichtungen vorhanden sein, um die Zelldichte, pH, Gehalt an gelöstem
Sauerstoff, Konzentration an Alkohol oder anderer Nährstoff quelle in dem Gärungsgefäß, Temperatur, Zuführungsgeschwindigkeit der Ausgangsstoffe und Endprodukte und
dergleichen zu messen. Die dem Gärungsgefäß zugeführten Materialien werden bevorzugt vor ihrer Einführung sterilisiert.
Wenn der sauerstoffhaltige Kohlenwasserstoffnährstoff ein Material ist, das in der Lage ist andere
Materialien zu sterilisieren, wie in manchen Fällen Methanol, Äthanol oder Formaldehyd, kann es vorteilhaft sein, diesen
Ausgangsstoff anderen Strömen, wie den mineralischen Medien, in sterilisierenden Mengen zuzusetzen, um dadurch gleichzeitig
mehrere Zielsetzungen zu erreichen und die Sterilisierung der mineralischen Medien durch andere Maßnahmen,
wie durch Erwärmen, zu vermeiden.
Die Art des verwendeten Gärungsgefäßes ist nicht wesentlich bei dieser Erfindung, obwohl bevorzugt ein Gärungsgefäß
mit dem Gärungsmedium in Schaumform verwendet wird. Dadurch wird eine hohe Produktivität der reinen Kulturen mit den
erfindungsgemäßen thermophilen Bazillusarten unter Verwendung eines oxydierten Kohlenwasserstoffes in einem kontinuierlichen
Verfahren erzielt. Die reinen Kulturen haben bei den empfohlenen Gärungstemperaturen eine hohe Wachstumsrate und ergeben beständige Schaumsysteme. Es ist selbstverständlich
erforderlich, die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen zu kontrollieren, um ein Überschäumen des
Gärungsgefaßes zu vermeiden, wodurch das Flüssigkeitsvolumen erniedrigt werden könnte und gewisse Verluste auftreten
könnten. Wenn nur möglich sollte die Zugabe von Antischaummitteln vermieden werden, da die Antischaummittel,
709813/0 9 53
- let -
wie z.B. die Silikone, den Gehalt an gelöstem Sauerstoff bei den empfohlenen hohen Temperaturen herabsetzen könnten
und die Wachstumsgeschwindigkeit und die Produktivität der Mikroorganismen erniedrigen könnten oder sogar die Mikroorganismen
abtöten könnten. Der mit den erfindungsgemäßen Bazillusarten erzeugte Schaum beeinträchtigt das Wachstum
nicht und ist vorteilhaft für die Aufrechterhaltung der Mikroorganismen in einem System mit einem hohen Gehalt an
gelöstem Sauerstoff. Für die Durchführung der Erfindung ist deshalb die Verwendung eines Gärungsgefäßes für die
Gärung in Schaumform von Vorteil, weil dadurch der erhöhte Sauerstofftransfer erleichtert wird, der erforderlich ist,
um eine hohe Zelldichte und ein schnelles Wachstum mit diesen thermophilen Mikroorganismen zu erreichen. Auf diese
Weise wird das Einzellprotein mit den thermophilen Bazillusarten gemäß der Erfindung in Schaumform in wirksamster Weise
hergestellt.
Die Durchführung der Gärung in einem mit Schaum gefüllten
Gefäß ist besonders dann vorteilhaft, wenn große Gasmengen in engem Kontakt mit der flüssigen Phase gehalten werden
sollen, so daß eine Umsetzung an relativ großen Grenzflächen stattfinden kann. Dadurch wird nicht nur die Gärung als
solche, sondern auch der Wärmeübergang verbessert und durch die gleichförmige Temperatur wird das Auftreten von überhitzten
Stellen vermieden.
Zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung wird z.Zt. ein Gärungsgefäß bevorzugt, daß in Fig.l von Seite
der Zeitschrift "Process Biochemistry, June, 1972" gezeigt wird. Diesem Gefäß kann eine Leitung zum Einführen von einem
Gas, das molekularen Sauerstoff enthält, hinzugefügt werden. Die Einführung dieses Gases kann an einem beliebigen geeig-
709813/0953
neten Punkt erfolgen, doch ist das Saugrohr gerade oberhalb
der Mischeinrichtung bevorzugt, da die Saugwirkung der Mischeinrichtung dann mit Vorteil dazu verwendet werden
kann, um die Einführung des sauer stoffhalt igen Gases in den Inhalt des Gefäßes zu unterstützen. Dieses Gärungsgefäß
läßt sich mit hoher Wirksamkeit dazu verwenden, um seinen Inhalt im wesentlichen vollständig in Schaum oder eine
Emulsion von niedriger Dichte umzuwandeln, wodurch eine hohe Geschwindigkeit des Sauerstoffüberganges erreicht wird.
Eine andere Art eines geeigneten Gärungsgefäßes ist der sogenannte "Airlift"-Vergärer, der in einem Aufsatz von
Wang et al in der Zeitschrift "Proceedings Eighth World Petroleum Congress", Band 5, Seiten 149-156 (1971), veröffentlich
von Applied Science Publishers Ltd., London, England beschrieben ist.
Ein weiteres geeignetes Gärungsgefäß ist ein Druckzyklus-Vergärer,
wie er auf Seite 63 der Zeitschrift "Chemical Engineering", 7. Januar 1974, beschrieben ist.
Schließlich ist noch der gut bekannte Vergärer geeignet, der einen Behälter mit einem Blattrührer und eine submerse
Belüftungseinrichtung besitzt. Ein Vergärer dieser Art ist in der US-PS 29 83 652 beschrieben.
Sowohl die zellulären als auch die extrazellulären Produkte der Kultur der neuen Bazillusarten können bei dem
Verfahren nach der Erfindung in üblicher Weise aufgearbeitet werden. Man kann die Zellen aus dem Abgang aus dem Gärungsgefäß durch Zentrifugieren, Filtrieren und ähnliche Maßnahmen
abtrennen. Der zellfreie Abgang kann mit Aceton oder einem niedrigen Alkohol wie Methanol oder Äthanol
70 9813/095 3
behandelt werden, urn etwa vorhandene extrazelluläre
polymere Materialien auszufällen. Der zellfreie Abgang kann auch einer Lösungsmittelextraktion und/oder einer
Basenextraktion unterworfen werden, um etwa gewünschte extrazelluläre Produkte wie Pigmente, Vitamine oder organische
Säuren, die während der Gärung entstanden sind, zu gewinnen. Die mikrobiellen Zellen werden in der Regel
durch Erwärmen oder durch chemische Mittel abgetötet und dieses kann vor oder nach der Abtrennung der Zellen aus
dem Abgang des Gärungsgefäßes erfolgen. Die Bakterienzellen sind eine wertvolle Eiweißquelle für Menschen und
Tiere. Für die menschliche Nahrung können die Zellen behandelt werden, um den Gehalt an Nukleinsäuren herabzusetzen,
wogegen eine derartige Behandlung für Viehfutter nicht erforderlich zu sein scheint.
Dieses Beispiel enthält zuerst einige Vergleichsversuche und dann ein Beispiel für die Durchführung der Erfindung.
Es wurden einige Kulturen von bekannten thermophilen Mikroorganismen
aus zwei Hinterlegungsstellen besorgt. Bei diesen Hinterlegungsstellen handelt es sich um The United
States Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois USA und The American Type
Culture Collection ATCC, Washington, D.C, USA. Diese Kulturen wurden in lyophilisiertem Zustand erhalten. Die Kulturen
wurden auf ihr Wachstum bei 55 C in einer Vielzahl von verschiedenen Medien geprüft. Die Ergebnisse dieser
Prüfungen sind in Tabelle I angegeben. Es wurden die folgenden Kulturen benutzt:
70981 3/0953
Bacillus subtilis ATCC 10774
Bacillus stearothermophilis ATCC 12987
Bacillus stearothermophilis NRRL B1102
Bacillus coagulans NRRL B1103
Bacillus coagulans NRRL B1168
Bacillus licheniformis NRRL BlOOl
| Tabelle I | oder - im 3(c) |
Medium Nr. 4(d) 5(e) |
|
| Kultur Nr. | Wachstum + ,(a) 2(b) |
+ | + |
| NRRL BlOOl | + + | + | + |
| NRRL B1103 | + + | + | + |
| ATCC 12987 | + + | + | + |
| NRRL B1168 | + + | ||
| NRRL B1102 | - | ||
| ATCC 10774 | + | ||
(a) Nährstofflösung (NL)
(b) NL + 1% Methanol
(c) NL (1/2 Stärke) + 1% Methanol
(d) NL (1/4 Stärke) + 1% Methanol
(e) IM2 Medium +0,5% Methanol
Die bei diesen Versuchen verwendete Nährstofflösung ist
ein übliches Kulturmedium, das 3 g/Liter Rindfleischextrakt und 5 g/Liter Pepton enthält. Das Medium IM2 ist das bereits beschriebene Medium mit der Ausnahme, daß es kein Agar-Agar enthält, da diese Versuche im flüssigen Medium durchgeführt wurden. NRRL B1102 wuchs auch auf der Nährlösung nicht.
ein übliches Kulturmedium, das 3 g/Liter Rindfleischextrakt und 5 g/Liter Pepton enthält. Das Medium IM2 ist das bereits beschriebene Medium mit der Ausnahme, daß es kein Agar-Agar enthält, da diese Versuche im flüssigen Medium durchgeführt wurden. NRRL B1102 wuchs auch auf der Nährlösung nicht.
709813/0953
ATCC 10744 wuchs in Gegenwart von Methanol nicht (Medium 2).
Obwohl die anderen Kulturen in Gegenwart von Methanol wuchsen, waren sie offensichtlich nicht in der Lage, Methanol
als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle für ihr Wachstum zu verwenden. Wie der nachstehend angeführte Versuch nach
der Erfindung zeigen wird, stehen diese negativen Ergebnisse in scharfem Gegensatz zu den Ergebnissen mit den besonderen
Bazillusarten gemäß der Erfindung, die in der Lage waren, Methanol in wirksamer Weise als einzige Kohlenstoff- und
Energiequelle zu benutzen.
Zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung wurde
eine Impfung von 500 ml einer wässrigen Dispersion von Zellen der Kultur Nr. 72, NRRL B-8066 verwendet, die 24 Stunden
auf dem Medium BH-M mit 1,5 Vo 1.% Methanol gewachsen war. Die Zusammensetzung dieses Mediums war wie folgt:
| Medium BH-M | Menge | |
| Komponente | 2,0 g/l | |
| KH2PO4 | 3,0 g/l | |
| K2HPO4 | 0,4 g/l | |
| MgSO4.7H2O | 0,04 g/l | |
| CaCl2.2H2O | 2 g/l | |
| (NH4)2S04 | 10 ml/1 | |
| Lösung der Spur | enm inera 1 i en | |
Die Lösung der Spurenmineralien hatte
folgende Zusammensetzung:
folgende Zusammensetzung:
FeSO4.7H2O 0,11 g/l
ZnSO4.7H2O 0,03 g/l
CuSO4.5H2O 0,02 g/l
MnSO4.H2O 0,02 g/l
H2SO4 (konz.) 1 ml/l
709813/0953
Die charakterisierte Impfung wurde einem Gärungsgefäß zugeführt. Das Gärungsgefäß besaß Einrichtungen zum
Rühren und zur Belüftung und enthielt zwei Liter eines mit Leitungswasser hergestellten Mediums folgender Zusammens
etzung:
| FM-12 Medium | Komponente | Menge |
| H3PO4 (857ο) | 2,0 ml | |
| KCl | 1,0 g | |
| MgSO4.7H2O | 1,5 g | |
| CaCl2.2H2O | 0,2 g | |
| NaCl | 0,1 g | |
| Lösung der Spurenmineralien" | 10,0 ml | |
Destilliertes Wasser Zum Auffüllen auf 1 Liter
Diese Lösung der Spurenmineralien hatte folgende Zusammensetzung:
0,06 0,08 4,80 0,30 0,20 2,00 0,02 3 ml
Destilliertes Wasser Zum Auffüllen auf 1 Liter
Der Methanolgehalt lag zu Beginn bei 1,57» (V/V), das pH bei
6,7 und die Temperatur bei etwa 55 C. Die Rührgeschwindigkeit betrug etwa 1000 Upm und Luft wurde mit einer Geschwindigkeit
von etwa 2 Litern pro Minute eingeführt. Es wurde
709813/0 953
| CuSO4. | 5H2O |
| KJ | |
| FeCl3. MnSO.. 4 |
6H2O |
| Na2MoO | 4*2H2° |
| ZnSO4. | 7H2O |
| H3BO3 H SO |
(konz.) |
Ammoniumhydroxyd kontinuierlich zugegeben, um den pH-Wert im Bereich von etwa 6,7 bis 6,9 zu halten und um auch
gleichzeitig eine Stickstoffquelle zur Verfügung zu stellen.
Nachdem ein gutes Wachstum der Impfung festgestellt worden war, wurde die kontinuierliche Zugabe eines Nährmediums
mit einem Methanolgehalt von 5 Vol.% aufgenommen und eine
entsprechende Menge an Abgang wurde aus dem Gärungsgefäß abgezogen. Die Zuführungsrate der Nährstoffmischung schwankte
zwischen 150 bis 800 ml/h im Verlauf des Versuches von etwa 500 Stunden. Die mittlere Verweilzeit der Zellen in dem
Gärungsgefäß schwankte zwischen etwa 2,4 bis 5 Stunden. Aus dem Abgang aus dem Gärungsgefäß wurden von Zeit zu
Zeit Proben entnommen, aus denen die Zellen abgetrennt, getrocknet, gewogen und einer Proteinanalyse unterworfen
wurden. In diesen Proben aus dem Abgang wurden nur die Zellen aufgearbeitet, nicht jedoch die gelösten Bestandteile.
Die Werte für die Zellkonzentration lagen bei etwa 12 g/l (trockene Zellen) im ersten Teil des Versuches
(25 Stunden) bis 18 g/l bei 190 Stunden und etwa 24 g/l gegen das Ende des Versuches. Die Methanolumwandlung zu
isolierbaren Zellen lag bei 44% des Einsatzes. Der Proteingehalt der Zellproben, die während des Versuches entnommen
wurden, ist schon bei der vorstehenden Diskussion der Produktaufarbeitung behandelt worden.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß die neue Bazillusart NRRL B-8066 kontinuierlich bei 55°C mit Methanol als
Energie- und Kohlenstoffquelle kultiviert werden konnte.
Außerdem wurde bereits vorher gezeigt, daß diese Bazillusart einen hohen Proteingehalt hat.
709813/0953
Es wurde ein weiterer Versuch unter Verwendung der Kultur NRRL B-8066 von Beispiel 1 durchgeführt. Bei diesem Versuch
wurde das Gärgefäß mit 500 ml einer wässrigen Dispersion der Kultur geimpft, die 26 Stunden auf dem IM2-Medium plus
1,5 Vo1.% Methanol gewachsen war.
| IM2-Medium | Komponente | Menge |
| KH2PO4 | 2,0 g/l | |
| K2HPO4 | 3,0 g/l | |
| MgSO4.7H2O | 0,4 g/l | |
| CaCl2.2H2O | 0,04 g/l | |
| NaCl | 0,1 g/l | |
| (NH,)„S0. 4 Z 4- Α |
2,0 g/l | |
| Lösung der Spurenmineralien" | 0,5 ml/1 | |
JU
Die Lösung der Spurenmineralien hatte folgende Zusammensetzung für einen Liter
wässrige Lösung:
0,06 g '
0,08 g
4,80 g
0,30 g
.0,20 g
2,00 g
0,02 g 3 ml
Diese Impfung wurde in ein Gärgefäß der gleichen Art wie das von Beispiel 1 eingebracht. Das Gärgefäß enthielt 2 Liter
709813/0953
| CuSO4 | .7H2O |
| KJ | |
| FeCl3 | (konz.) |
| MnSO. 4 _ |
|
| .5H2O | |
| .6H2O | |
| .H2O | |
| Na2MoO4.2H2O | |
| ZnSO4 | |
| H3BO3 | |
| H2SO4 |
des gleichen Mediums FM-12, wie in Beispiel 1 mit der
Ausnahme, daß nur 5 ml pro Liter der vorstehenden Lösung der Spurenmineralien zu dem Medium zugegeben wurden.
Der Methanolgehalt war zu Beginn auf 1,5% (V/V) beschränkt, der pH-Wert lag bei etwa 7,1 und die Temperatur bei etwa
53 C. Während der ersten beiden Stunden wurde das Rühren und das eingeführte Luftvolumen langsam erhöht auf 800 Upm
und 2 Liter pro Minute. Es wurde Ammoniumhydroxyd wie im Beispiel 1 zugegeben, um den pH-Wert im Bereich von 7,0 bis
7,2 zu halten und gleichzeitig eine Stickstoffquelle zur Verfügung zu stellen.
Nachdem ein gutes Wachstum der Impfung in den ersten 24 Stunden beobachtet worden war, wurde die kontinuierliche
Zugabe des Nährmediums mit einem Methanolgehalt
von 7,5 Vol.% und einem Gehalt an 0,05 g/l MnSO,.H 0
aufgenommen und ein entsprechendes Volumen wurde als Abgang aus dem Gärungsgefäß abgezogen. Die Zuführungsgeschwindigkeit
für die Mischung des Nährstoff mediums betrug etwa 200 bis 400 ml/h während einer Versuchszeit von etwa 94
Stunden. Die mittlere Verweilzeit in dem Gärungsgefäß betrug etwa 3 bis 5 Stunden. Aus dem Abgang wurden von Zeit
zu Zeit Proben entnommen, aus denen die Zellen isoliert, getrocknet und gewogen wurden. Die Proben aus dem Abgang
wurden nur auf ihren Zellgehalt und nicht auf den Gehalt an löslichen Bestandteilen analysiert. Die Zellkonzentrationen
lagen nach 24 Stunden zwischen 17 bis 26 g/l (trockene Zellen). Die Methanolumwandlung in isolierbare
Zellen betrug 43% des Einsatzes.
Auch diese Ergebnisse demonstrieren, daß mit der neuen
70981 3/0953
Bazillusart eine gute Ausbeute an mikorbiellen Zellen bei Verwendung von Methanol als einziger Quelle für Energie
und Kohlenstoff und bei hohen Gärungs tempera tür en erhalten
wird.
Es wurde ein kontinuierlicher Gärungsversuch mit der Kultur 47 NRRL B-8065 durchgeführt.
Es wurde das gleiche Gärungsgefäß wie in den vorherigen Beispielen verwendet. Das Gärungsgefäß enthielt 2 Liter
des FM-12 Mediums wie in Beispiel 2, doch wurde dieses Medium in diesem Fall mit entionisiertem Wasser angesetzt.
Es wurden 500 ml einer wässrigen Dispersion der Kultur NRRL B-8065, die 11 Stunden auf dem gleichen IM2 Medium
wie in Beispiel 2 mit 1,5 VoIoX Methanol gewachsen waren,
in das Gärungsgefäß eingeführt«
Der Methanolgehalt lag zu Beginn bei I55% (V/V), der pH-Wert
zu Beginn bei etwa 6,45 und die Temperatur wurde bei etwa 54 C gehalten. Wie in den Beispielen 1 und 2 wurde
Ammoniumhydroxyd zugegeben^ um den pH=Wert bei etwa'6,3
bis 6,6 zu halten, wobei auch in diesem Fall das Ammoniumhydroxyd gleichzeitig die Stickstoffquelle war. Die Rührgeschwindigkeit
und die Zuführgeschwindigkeit der Luft wurden allmählich bis auf 400 Upm und O5S Liter pro Minute
im Verlauf yon etwa 7 Stunden erhöht. Nach -etwa 11 Stunden wurde die kontinuierliche Zugabe des mit Leitungswasser
hergestellten Nährmediums FM-12, das 2,5 Vol.% Methanol
und zusätzlich 1 g/l KH2PO,, lg/1 K-HPO, und eine kleine
Menge von Antischaummittel enthielt, aufgenommen. Nach
709813/0953
28 Stunden wurde die Ausgangslösung modifiziert, indem
weiteres MnSO,.H 0 zugegeben wurde, um seine Konzentration zu verdoppeln. Diese Änderung scheint in einem gewissen
Umfang die Aufnahme von Sauerstoff durch die Zellen zu stimulieren. Die neuen Bazillusarten gemäß der Erfindung
scheinen einen relativ h
males Wachstum zu haben.
males Wachstum zu haben.
J I
scheinen einen relativ hohen Bedarf an Mn für ein opti-
Während des Verlaufs von 101,5 Stunden wurden weitere Mengen an anderen Spurenmineralien zugegeben, doch schienen diese
keinen stimulierenden Effekt auf das Zellwachstum zu haben. Außer Luft wurde dem Gärungsgefäß nach 28 Stunden Sauerstoff
mit einer zunehmenden Geschwindigkeit von 0,12 bis 0,4 Liter pro Minute zugeführt. Die Rührgeschwindigkeit
wurde entsprechend von 400 auf 800 Upm während dieses Zeitraumes erhöht. Aus dem Abgang wurden von Zeit zu Zeit Zellen
entnommen, getrocknet und gewogen.
Die Ausgangsstoffe wurden dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 300 ml/h bei 28 Stunden bis 850 ml/h bei 71 Stunden
und 1070 ml/h bei 95 Stunden zugeführt. Die Verweilzeiten für die Zellen schwankten zwischen etwa 1,8 bis
2,5 Stunden während der letzten 30 Stunden. Die Zellkonzentrationen schwankten zwischen etwa 7 bis 10 g pro Liter
(trockene Zellen) und die Methanolumwandlung in isolierbare Zellen betrug etwa 50% des Einsatzes.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Kultur Nr. 47 NRRL B-8065 ebenfalls mikrobielle Zellen in guter Ausbeute ergibt, wenn
diese auf Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle bei relativ hohen Gärungstemperatüren wachsen.
70981 3/0953
Der Rohproteingehalt der Zellen der neuen Bazillusarten gemäß der Erfindung liegt im Bereich von etwa 70 bis
85 Gew.%. Man erhält den Rohproteingehalt,indem man die Gew.% N (nach Kjeldahl) der getrockneten Zellen mit dem Faktor 6,25 multipliziert. Die Hydrolyse der getrockneten Zellen mit anschließender Analyse der Aminosäuren durch Gas-Chromatographie zeigt, daß der Proteingehalt im Bereich von etwa 55 bis 70 Gew.% liegt. Die Verteilung der Aminosäuren für eine Probe der Bakterienzellen der Kultur Nr. 72 NRRL B-8066 wird nachstehend gezeigt:
85 Gew.%. Man erhält den Rohproteingehalt,indem man die Gew.% N (nach Kjeldahl) der getrockneten Zellen mit dem Faktor 6,25 multipliziert. Die Hydrolyse der getrockneten Zellen mit anschließender Analyse der Aminosäuren durch Gas-Chromatographie zeigt, daß der Proteingehalt im Bereich von etwa 55 bis 70 Gew.% liegt. Die Verteilung der Aminosäuren für eine Probe der Bakterienzellen der Kultur Nr. 72 NRRL B-8066 wird nachstehend gezeigt:
Wesentliche Aminosäure
Leucin
Isoleucin
Lys in
Methionin
Cystin
Threonin
Phenylalanin
Tyrosin
Tryptophan
Valin
Nicht wesentliche Aminosäure
Alanin
Arginin
Asparaginsäure
Glycin
Glutaminsäure
Histidin
g/100 g getrocknete Zellen
5,52 4,68 5,36 1,38 0,05 2,93 2,72 2,00 0,79 5,25
g/100 g getrocknete Zellen
•5,83
2,93
6,38
3,76
9,95 Nl,18
709813/0953
- VF-
Prolin 2,37
Serin 1,96
Summe 64,04
Summe wesentlicher Aminosäuren 30,68
Aus dieser Aufstellung geht hervor, daß der Gehalt an schwefelhaltigen Aminosäuren, z.B. Cystin und Methionin,
relativ niedrig ist. Einige Proben der Zellen von dieser Bazillusart haben einen Gehalt von 0,00 g Cystin pro 100 g
getrocknete Zellen gezeigt. Diese Erscheinung ist für Einzellproteine nicht ungewöhnlich und kann dadurch ausgeglichen
werden, daß geeignete Mengen an synthetisch hergestelltem Cystin oder Methionin dem Einzellprotein zugefügt
werden.
709813/0953
Claims (4)
1. Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein durch eine
Kultur von einem Mikroorganismus in einem wässrigen Medium unter Verwendung von mineralischen Nährstoffen,
einem oxydierten Kohlenwasserstoff als Kohlenstoff- und Energiequelle und einer unter den Bedingungen der
aeroben Gärung assimilierbaren Stickstoffquelle und durch Aufarbeiten der erhaltenen Mikroorganismen als
Einzellprotein, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Bazillus der Art
NRRL B-8065 oder NRRL B-8066 ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Kultur der Mikroorganismen
bei einer Gärungstemperatür im Bereich von 45 bis 65 C
durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Temperatur im Bereich von
50 bis 60°C liegt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
das Kulturmedium mit einer Manganverbindung während des Wachstums der Bazillusarten behandelt wird.
709813/0953
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/618,191 US3981774A (en) | 1975-09-30 | 1975-09-30 | Fermentation of oxygenated hydrocarbon compounds with thermophilic microorganisms |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2643834A1 true DE2643834A1 (de) | 1977-03-31 |
| DE2643834B2 DE2643834B2 (de) | 1978-03-23 |
| DE2643834C3 DE2643834C3 (de) | 1978-11-30 |
Family
ID=24476697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2643834A Expired DE2643834C3 (de) | 1975-09-30 | 1976-09-29 | Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3981774A (de) |
| JP (1) | JPS5244294A (de) |
| BE (1) | BE846776A (de) |
| CA (1) | CA1069072A (de) |
| DE (1) | DE2643834C3 (de) |
| DK (1) | DK438276A (de) |
| ES (1) | ES451936A1 (de) |
| FR (1) | FR2326469A1 (de) |
| GB (1) | GB1546691A (de) |
| IN (1) | IN144617B (de) |
| MX (1) | MX4347E (de) |
| MY (1) | MY8100001A (de) |
| NL (1) | NL168880C (de) |
| NO (1) | NO146331C (de) |
| SE (1) | SE7609517L (de) |
| SU (1) | SU701545A3 (de) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4302542A (en) * | 1976-06-21 | 1981-11-24 | Phillips Petroleum Co. | Fermentation with thermophilic mixed cultures |
| JPS5484668U (de) * | 1977-11-28 | 1979-06-15 | ||
| US4414329A (en) * | 1980-01-15 | 1983-11-08 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
| JPS57130747A (en) * | 1981-02-04 | 1982-08-13 | Nippon Kokan Kk <Nkk> | Continuous casting method for steel |
| US4439525A (en) * | 1981-09-09 | 1984-03-27 | Phillips Petroleum Company | High methionine content Pichia pastoris yeasts |
| JPS58112642A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-05 | Nippon Kokan Kk <Nkk> | 鋼の連続鋳造法 |
| DE3409138A1 (de) * | 1984-03-13 | 1985-09-19 | Linde Ag, 6200 Wiesbaden | Verfahren zur herstellung proteinhaltigen materials |
| US4795708A (en) * | 1986-03-10 | 1989-01-03 | Phillips Petroleum Company | Novel backteria and single cell protein production therewith |
| US5314820A (en) * | 1987-11-13 | 1994-05-24 | Kuwait Institute For Scientific Research | Process and microorganisms for producing single cell protein |
| US5071762A (en) * | 1990-08-13 | 1991-12-10 | Phillips Petroleum Company | Enhancing the flavor of protein products derived from microorganisms |
| AU9805698A (en) * | 1997-10-17 | 1999-05-10 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of glutamate using salt tolerant, methanol utilizing (bacillus) |
| US6083728A (en) * | 1997-10-17 | 2000-07-04 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of glutamate using wild type Bacillus methanolicus |
| MX2014010565A (es) | 2012-03-09 | 2014-12-08 | Kraft Foods Group Brands Llc | Eliminacion de nota de sabor oxidado en comestibles. |
| CN104168777B (zh) | 2012-03-09 | 2017-03-01 | 卡夫食品集团品牌有限责任公司 | 含1, 3‑丙二醇的食物和饮料产品以及使用1, 3‑丙二醇改良风味释放的方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH358195A (de) * | 1958-02-21 | 1961-11-15 | Bertrams Ag Hch | Fermenter |
| US3355296A (en) * | 1964-05-06 | 1967-11-28 | Exxon Research Engineering Co | Process of cultiv ating high protein containing micro-organisms on hydrocarbon feed mixtures |
| CA923059A (en) * | 1967-08-05 | 1973-03-20 | Kurasawa Shogo | Fermentation process for the production of amino acids |
| ES356699A1 (es) | 1967-09-14 | 1970-02-16 | Exxon Research Engineering Co | Procedimiento de fermentacion aerobia mejorado para la pro-duccion de un producto con alto contenido de proteinas. |
| US3546071A (en) * | 1967-10-09 | 1970-12-08 | Exxon Research Engineering Co | Aerobic fermentation process |
| IT1044179B (it) | 1968-04-15 | 1980-03-20 | Ajinomoto Kk | Procedimento per la produzione di cellule di lievito e oppure prodotti di fermentazione |
| US3644175A (en) * | 1968-07-08 | 1972-02-22 | Exxon Research Engineering Co | Detoxification of gram-negative bacteria grown in a fermentation process |
| US3642578A (en) | 1968-08-12 | 1972-02-15 | Phillips Petroleum Co | Microbial synthesis from aldehyde-containing hydrocarbon-derived products |
| CH488803A (de) * | 1969-09-05 | 1970-04-15 | Mueller Hans | Verfahren zur Verhütung von Explosionen bei der Fermentation von Nährmedien mit brennbaren Komponenten |
| GB1326582A (en) | 1969-12-15 | 1973-08-15 | Exxon Research Engineering Co | Fermentation process using methanol and particular microorganisms |
| US3677895A (en) * | 1970-01-22 | 1972-07-18 | Union Oil Co | Alkane utilization in foam system |
| JPS4937274B1 (de) * | 1970-10-28 | 1974-10-07 | ||
| US3681200A (en) * | 1970-11-09 | 1972-08-01 | Standard Oil Co | Shell-and-tube fermentor |
| JPS538794B1 (de) * | 1970-12-11 | 1978-03-31 | ||
| US3778349A (en) * | 1971-06-07 | 1973-12-11 | Research Corp | Production of single cell protein material |
| JPS4898092A (de) * | 1972-03-31 | 1973-12-13 |
-
1975
- 1975-09-30 US US05/618,191 patent/US3981774A/en not_active Expired - Lifetime
-
1976
- 1976-08-25 IN IN1562/CAL/76A patent/IN144617B/en unknown
- 1976-08-27 SE SE7609517A patent/SE7609517L/xx not_active Application Discontinuation
- 1976-08-31 MX MX764871U patent/MX4347E/es unknown
- 1976-09-08 CA CA260,719A patent/CA1069072A/en not_active Expired
- 1976-09-27 NO NO763303A patent/NO146331C/no unknown
- 1976-09-28 SU SU762406805A patent/SU701545A3/ru active
- 1976-09-29 NL NLAANVRAGE7610783,A patent/NL168880C/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-09-29 DE DE2643834A patent/DE2643834C3/de not_active Expired
- 1976-09-29 JP JP51117089A patent/JPS5244294A/ja active Pending
- 1976-09-29 DK DK438276A patent/DK438276A/da unknown
- 1976-09-29 ES ES451936A patent/ES451936A1/es not_active Expired
- 1976-09-29 GB GB40449/76A patent/GB1546691A/en not_active Expired
- 1976-09-30 FR FR7629464A patent/FR2326469A1/fr active Granted
- 1976-09-30 BE BE171097A patent/BE846776A/xx unknown
-
1981
- 1981-12-30 MY MY1/81A patent/MY8100001A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1069072A (en) | 1980-01-01 |
| BE846776A (fr) | 1977-03-30 |
| DE2643834B2 (de) | 1978-03-23 |
| NO763303L (de) | 1977-03-31 |
| FR2326469B1 (de) | 1978-06-30 |
| ES451936A1 (es) | 1977-11-01 |
| NO146331C (no) | 1982-09-08 |
| FR2326469A1 (fr) | 1977-04-29 |
| NL168880C (nl) | 1982-05-17 |
| NL168880B (nl) | 1981-12-16 |
| JPS5244294A (en) | 1977-04-07 |
| MY8100001A (en) | 1981-12-31 |
| MX4347E (es) | 1982-04-05 |
| DK438276A (da) | 1977-03-31 |
| NL7610783A (nl) | 1977-04-01 |
| GB1546691A (en) | 1979-05-31 |
| IN144617B (de) | 1978-05-20 |
| DE2643834C3 (de) | 1978-11-30 |
| SE7609517L (sv) | 1977-03-31 |
| SU701545A3 (ru) | 1979-11-30 |
| US3981774A (en) | 1976-09-21 |
| NO146331B (no) | 1982-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2161164C3 (de) | Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen und Verwendung des proteinhaltigen Produkts | |
| DE2643834C3 (de) | Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein | |
| DE2444849A1 (de) | Verfahren zur herstellung organischer saeuren durch biologische hydrolyse | |
| DE2357119C3 (de) | Verfahren zur Herstellung eines stabilen L-Lysin-Konzentrats mit hohem Gehalt an essentiellen Biofaktoren | |
| DE3343576A1 (de) | Verfahren zur biotechnologischen herstellung von poly-d(-)-3-hydroxybuttersaeure | |
| DE2824390C2 (de) | ||
| DE2401519A1 (de) | Mikrobiologisches verfahren zur herstellung fluessigen und trockenen futterkonzentrates von l-lysin und kristallinen l-lysins | |
| DE19637591A1 (de) | Osmokontrolliertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Acarbose | |
| DE2402217B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinmaterial | |
| DE1792187A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus oxygenierten Kohlenwasserstoffen | |
| DE2407740C2 (de) | Herstellung einer als Protein-Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz geeigneten Biomasse | |
| DE2442533A1 (de) | Verfahren zur behandlung der bei der destillation von weissweinen anfallenden rueckstaende | |
| USRE30965E (en) | Fermentation of oxygenated hydrocarbon compounds with thermophilic microorganisms and microorganisms therefor | |
| DE2754072C2 (de) | Herstellung von Einzellprotein | |
| DD154930A3 (de) | Wachstumsstimulator fuer den chamignon-anbau | |
| AT395226B (de) | Verfahren zur fermentationsbehandlung der nebenprodukte und/oder abfaelle von schlachthaeusern, zur herstellung von futter | |
| EP0014364A2 (de) | Verfahren zum mikrobiologischen Abbau von Acrylnitril in wässrigen Dispersionen | |
| DE1903162A1 (de) | Gaerungsverfahren zur Herstellung von Aminosaeuren | |
| DE820900C (de) | Verfahren zur Herstellung eines Impfduengemittels fuer landwirtschaftliche Kulturboeden | |
| DE933846C (de) | Verfahren zur Herstellung von fuer die Aufbesserung von tiereiweissarmem Futter geeigneten Vitaminsubstanzen | |
| DE2102793B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Lbeta,3,4-Dihydroxyphenyl-alpha alanin durch Fermentation | |
| DE814890C (de) | Verfahren zur Herstellung von Butandiol-(2, 3) und Butanolon-(2, 3) durch Gaerung | |
| DE2700698C3 (de) | Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung von Einzellerprotein auf Basis von Äthanol | |
| EP0452689A2 (de) | Proteinquelle mit einem Gehalt an weiteren essentiellen, biologisch aktiven Stoffen für Nährzwecke, insbesondere zum Füttern von Tieren sowie ein Verfahren zur Herstellung von dieser Proteinquelle | |
| AT215077B (de) | Verfahren zur Herstellung 5, 6-Dimethylbenzimidazolcobalamin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |