DE2161164C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen und Verwendung des proteinhaltigen Produkts - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen unter Verwendung von Methanol als Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und auf die Verwendung des nach dem Verfahren hergestellten, proteinhaltigen Produkts als proteinhaltige Nahrungsmiuelergänzung zur Ernährung von Mensch und Tier.

Zur Zeit herrscht in der ganzen Welt eine Proteinknappheit. In neuerer Zeit bekanntgewordene, mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von Proteinmassen durch Züchten von Mikroorganismen auf verschiedenen kohlenstoffhaltigen Substraten können zur Lösung dieses Problems einen Beitrag leisten. Es ist erwünscht, daß bei solchen Verfahren billige und leicht verfügbare kohlenstoffhaltige Substrate verwendet werden, daß die Proteine mit einer hohen Geschwindigkeit hergestellt werden und daß die erzeugten Proteinmassen eine geeignete Aminosäurev^rteilung besitzen.

Es sind Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Protein aus Methan (FR-PS 20 16 899), bzw. aus n-aliphatischen Kohlenwasserstoffen (FR-PS 14 60 155) bekannt. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß für den Einsatz von Methan und gasförmigen Kohlenwasserstoffen besondere Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen und daß besondere Maßnahmen notwendig sind, um die Kohlenwasserstoffe in dem wäßrigen Nährmedium zu dispergieren.

Aus der DE-OS 17 92 187 ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von proteinhaltigen Produkten aus oxidierten Kohlenwasserstoffen, insbesondere aus Äthanol, bekannt Von den bei diesem Verfahren eingesetzten Mikroorganismen ist nur Micrococcus cerificans zur Verwertung von Methanol als Kohlenstoffquelle geeignet, führt jedoch zu relativ schlechten Ergebnissen.

Aus der DE-OS 20 59 277 ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Protein aus Methanol unter Verwendung von Stämmen der Gattung Pseudomonas bekannt Die bei diesem Verfahren eingesetzten Pseudomonas-Stämme, die im übrigen bis nach dem Anmeldungszeitpunkt der Erfindung der Öffentlichkeit nicht zur Verfügung standen, haben jedoch eine relativ niedrige optimale Wachstumstemperatur (30° C oder niedriger), was nachteiligerweise dazu führt, daß eine relativ starke, mit hohen Betriebskosten verbundene Kühlung erforderlich ist.

Aufgabe der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen unter Verwendung von Methanol als Kohlenstoffquelle, bei dem man eine hohe Produktionsgeschwindigkeit und Ausbeute des Proteins erzielt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen durch aerobes Kultivieren von Bakterien in einem wäßrigen Kulturmedium, das Methanol als Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und anorganische Nährstoffe aufweist, und Gewinnen der Proteinmassen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen methanolausnutzenden Stamm der Arten Pseudomonas methylotropha, Microeyclus polymorphum, Hyphomicrobium variabile und Pseudomonas rosea oder mehrere dieser Stämme verwendet, wobei diese Arten die nachstehend zu diesen Arten angegebenen allgemeinen Eigenschaften besitzen,

Öle Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten proteinhaltigen Produkts in Form von getrockneten Zellen als proteinhaltige Nahrungsmittelergänzung, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Nährmitteln, zur Ernährung von Mensch und Tier.

Die erfindungsgemäß isolierten, methanolausnutzenden Bakterienstämme gehören Arten an, die offenbar

bisher unbekannt waren und denen die Namen Pseudomonas methyloiropha, Pseudomonas rosea, Microcyclus polymorphum und Hyphomicrobiium variabüe gegeben wurden. Sie sind in der Lage, auf Methanol zu wachsen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt man ein gutes Wachstum in kontinuierlicher Kultur, einen hohen Proteingehalt, gute Wachstumsgeschwindigkeiten, eine gute Ausbeute und ein günstiges Aminosäureprofil. Die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme der kennzeichengemäßen Arten haben eine im Vergleich mit bekannten, methanolausnutzenden Bakterien beträchtlich höhere, optimale Wachstumstemperaturen (37⁰C), was dazu führt, daß die Kühlanlagen reduziert werden können und daß das Verfahren technisch-wirtschaftlich vorteilhafter durchführbar ist. Repräsentative Kulturen geeigneter Stämme der neuen 4 Arten sind hinterlegt worden bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland, Großbritannien, wobei ihnen die folgenden NCIB-Zugangsnummern gegeben wurden:

Art: Pseudomonas methyiotropha:

Stämme WKM-3, WKM-I, SA, SB, SD, SE, SF, AS-', MP4, Ft6/1, F16/2, MPI/Sh/37/l und 28/D/37 mit den NCIB-Nummern 10508—15 und 10592—96.

Art: Microcyclus polymorphum:

Stamm Pia 5 - NClB-Nr. 10516.

Art: Hyphomicrobium variabile:

Stamm S/30/4 - NCIB-Nr. 10517.

Art: Pseudomonas /osea:

Stämme MA2/3, BDD/3, MA3D/1, MW4/4, MPID/2, MP3D/2, MP1/2, MA2/2, 2OD, MAI/5, MA3D/3, BDD/2, MPI, ChD, WS, MP3 mit den NCIB-Nummern 10597-10612.

Die allgemeinen mikrobiologischen Eigenschaften der neuen 4 Arten wurden Standardtests bestimmt.

Die Tests, die zur Identifizierung der Stämme angewandt wurden, werden nachstehend beschrieben:

1. Medien

Das für die Tests verwendete Methanol-Mineralsalz-Medium hat folgende Zusammensetzung:

KH₂PO₄
Na₂HPO₄

1,4 g 2.1g

MgSO₄ ■ 7 H₂O

CaCI₂

FeSO₄

MnSO₄

Na₂MoO₄ · 2 H₂O

destilliertes Wasser

Methanol

0,2 g 0,01 g 0,005 g 0,003 g 0,0025 g 1,0 Liter 5,0 ml

Methanols 03% (Gewi.'ht/Volumen) der zu testenden Kohlenstoffquelle hinzusetzt. Negative Ergebnisse dieser Tests bedeuten, daß auf dieser bestimmten Kohlenstoffquelle innerhalb 7tägiger Inkubation bei 37°C kein sichtbares Wachstum des Testorganismus erfolgt. Positive Ergebnisse bedeuten, daß ein deutliches, sichtbares Wachstum des Organismus innerhalb von 7 Tagen erfolgt, und daß das Wachstum wiederum beim Verfolgen der Subkultur in diesem

ίο bestimmten Medium erfolgt.

Im Falle der Stämme von Pseudomonas methyltropha kann eine Anpassurigsperiode über etliche Subkulturen zum Wachstum auf verschiedenen anderen Kohlenstoffquellen führen, die nachstehend für diese Stämme besch-iebenen Ergebnisse beziehen sich auf Tests, die ohne eine vorherige Anpassung, wie sie vorstehend erwähnt wurde, durchgeführt wurden.

Die getesteten Kohlenstoffquellen sind Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Formiat, Acetat, Propionat, Butyrat, Pyruvat, Oxalat, Succinat, Glutarat, Adipat, Methylamin. Dimethylamin, Äthylamin, Saccharose. Lactose, Glucose, Mannose, Mannit, Ribose, Ribit, Xylose, Fructose, Naphthalin, Phenol, Benzoat, Hexan, Hexadecan, Aspartet, Alanin, Glycin, Glutamat, Arginin und Serin.

3. A ädere Tests

Die für die folgenden Tests angewandten Methoden so werden beschrieben in »Abstracts of Microbiological Methods« von V.B;t>. Sherman, veröffentlicht von Wiley-lnterscience, New York, 1969.

Für die Züchtung von Microcyclus polymorphum werden zu dem vorstehend angegebenen Medium 0,01% Hefeextrakt hinzugesetzt. Dieses Medium kann durch den Zusatz von 2% (Gewicht/Volumen) hochreinen Agars (beispielsweise Agar mit Oxid-Markierung »I.D.«) verfestigt werden.

2. Tests der Kohlenstoffquelle

Tests für die Ausnutzung der verschiedenen Kohlenstoffqiiellen werden in dem vorstehend beschriebenen Medium durchgeführt, wobei man anstelle des iii

Oxidasetests — Methode von Kovacs.

Katalasetest — wie beschrieben in »Manual of Microbiological Methods«, veröffentlicht für Soc.

of American Bacteriologists von McGraw-Hill, 1957.

Nitratreduktionstest — dieser wird in dem vorstehend beschriebenen Methanol-Mineralsalz-Medium durchgeführt, jedoch wird Natriumnitrat (03 g/l) anstelle von Ammoniumsulfat als Stickstoffqulle verwendet. Mit diesem Unterschied wird die Methode in Society of American Bacterio· logists Manual of Microbiological Methods beschrieben.

iv Gelatinehydrolyse — es wird die Modifizierung von Manuroy der Methode von Frazier angewandt.

ν Test nach Hugh &. Liefson — es wird die Originalmethode von Hugh & Liefson angewandt,
xi Lipaseproduktion — Hydrolyse von Tween 80

unter Verwendung der Methode von Sierra,
xii Lecithinaseproduklion — es wird die Methode von Knight & Proom angewandt.

xiii Ureaseproduktion — es wird die Methode von Koser angewandt, bestätigt durch die Methode von Monteverde und Mitarbeitern unter Ver-. Wendung des Buenos-Aires-modifizierien Mediums, wie in »The Oxoid Manual« (3. Ausgabe), 1971, veröffentlicht von Oxoid Ltd., Southwark Bridge Road, London, SEI, beschrieben.

xiv Schwefelwasserproduktion — es wird die Methode von Monteverde und Mitarbeitern angewandt, wie

ir, sie in »The Oxoid Manual« (3. Ausgabe) beschrieben wird.

xv Citratausnutzung — es wird die Methode von Koser angewandt.

Man erhielt folgende Ergebnisse:

A. Pseudomonas methyltropha

Die allgemeinen Eigenschaften dieser Art sind:

1. Mikroskopische Morphologie (beim Wachsen auf Methanol-Mineralsalz-Agarplaiten oder in Metano'.-ivlineralsalz-Medium): Gestali — gerade Stäbchen; Länge — 0,8 bis 1,5 μπί; Breite — 0,3 bis in 0,5 μπί; Aggregate — Zellen treten einzeln und in Paaren auf; Beweglichkeit — wenn vorhanden durch polare Geißeln; Gramfärbung — gramnegativ, ebenmäßige Färbung, jedoch wird Färbung oft nicht gut aufgenommen; intracellulare Ablage- is rungsprodukte — Poly-/?-hydroxybutyrat wird nicht erzeugt; Endosporen — nicht erzeugt; Kapseln — nicht erzeugt; extracellularer Schleim — Bildung geringer Mengen.

⁷O

2. Kolonienmorphologie

a) auf Methanoi-Mineralsalz-Ag;vplatten, 2 Tage bei 37°C inkubiert Gestalt — kreisförmig: Größe — 1 —2 mm Durchmesser; Erhebung — konvex; Oberfläche — glatt; Kante — vollständig; Gefüge — granulös; Dichte — dicht; Pigment — grau-weiß: Konsistenz — butterähnlich; Emulgierbarkeit — im allgemeinen schwierig zu emulgieren. J<l

b) auf Nähragar (2 Tage bei 37° C) - Wachstum ist im allgemeinen sehr schwach, nur sichtbar als transparenter Schleier oder als winzige, nadelspitzartige Kolonien mit einem Durchmesser von weniger als 0,5 mm. r>

3. Physiologische und biochemische Tests

a) Wachstum in Nährmedium — kein Wachstum oder sehr mangelhaftes Wachstum, hauptsächlich an der Oberfläche. 4»

b) Gelatinestich — weder Wachstum noch Verflüssigung.

c) Reduktion von Nitraten — Nitrate zu Nitriten reduziert.

d) Beziehung zu Sauerstoff — aerob. 4-.

e) Indolproduktion — schwach positiv, schwache Indolproduktion.

f) Temperaturbeziehungen — kein Wachstum bei 4°C oder 42°C, gutes Wachstum bei 30⁰C und 37°C W

g) Stoffwechsel von Kohlenhydraten (Test nach Hugh & Ltefson) — oxidierter Stoffwechsel, wenn Wachstum erfolgt.

h) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80)

— negativ. vs

i) Lecithinaseproduktion (Etdotterreaktion) —

negativ,
j) Ureaseproduktion — variabel, gewöhnlich positiv.

k) Schwefel Wasserstoff produktion — negativ.
1) Citfatausnützühg (Cilrältcsl nach Köscf) negativ.

m) Methylrottest — negativ,
n) Test nach Voges-Proskauer — negativ,
ο) Wachstum in Lackmus-Milch — mangelhaft.

geringe Säureproduktion,
p) f'luoresreinprodtiktion (Kings-Medium A) — nicht erzeugt.

q) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) — nicht erzeugt.

r) Antibiotische Empfindlichkeit — empfindlich gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin und Tetracyclin, beständig gegenüber Penicillin, Novobiocin und Oleandomycin. veränderliche Empfindlichkeit gegenüber Ery ihromyein und Sulfafurazol.

s) Wachstum auf Blutagar — geringes Wachstum, keine Haemolyse.

t) Oxidatetest (nach Kovacs) — positiv.

Stoffwechsel von Kohlenstoffquellen. Die Kohlenstoffquellen, die von den einzelnen Stämmen ausgenutzt werden, variieren in gewissem Ausmaß. Im vorliegenden Fall besitzen die meisten Stämme ein sehr eingeschränktes Ernährungsspektrum und wachsen auf vielen Kohlenstoffquellen nicht gut. Methanol und Fructose werden jedoch von allen Stämmen, auf die in dieser Beschreibung speziell Bezug genommen wird, ausgenutzt. Nach einer AnpassL^gsperiode über einige Subkulturen können andere Kohlcnstoffquellen angewandt werden.

Die Stämme mit den NCI B-Nummern 10508 — 15 und 10592—96, sind einander ähnlich und sind Stämme der g.'sichen Art Denn die allgemeinen Eigenschaften dieser Stämme sind die gleichen wie diejenigen, die vorstehend für die Art beschrieben wurden, mit den folgenden unterscheidenden Merkmalen:

Stamm WKM-3 (NCIB 10508)

Quelle — Ästuarschlick. Es werden ausgenutzt Acetat. Butyrat, Propionat. Pyruvat. Succinat und Adipat als alleinige Quellen von Kohlenstoff und Energie. Katalase negativ, beständig gegen Erythromycin, empfindlich gegen Sulfafurazol.

Stamm WKM-I (NCIB 10509)

Quelle — Ästuarschlick. Es werden ausgenutzt Acetat. Butyrat. Propionat. Pyruvat Succinat. Glutarat und Adipat als alleinige Kohlenstoff/ Energie-Quelle. Urease wird nicht erzeugt. Katalase negativ, beständig gegen Erythromycin und Sulfafurazol.

Stamm SA (NCIB 10510)

4-. Quelle — Abwasserschlamm. Beständig gegen Erythromycin und Sulfafurazol. Katalase positiv.

Stamm SB(NCIB 10511)

Quelle — Abwasserschlamm. Katalase positiv, empfindlich gegen Erythromycin und Sulfafurazol.

Stamm SD(NCIB 10512)

Quelle — Abwasserschlamm. Katalase positiv. Beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm SE (NCIB 10513)

Quelle —· Abwasserschlamm. Kitalasc positiv, empfindlich gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm SF (NCIB 10514)

Quelle — Abwasserschlamm. Katalase positiv t>o Urease negativ, empfindlich gegen Sulfafurazol. beständig gegen Erythromycin.

Stamm ASI (NCIB 10515)

Quelle — Aktivschlamm. Katalane positiv, empfindlich gegen Sulfafurazol und F.rylhromycin.

Stamm MP4 (NCIB 10592)

Quelle — Wasserstaubccken. Katalase positiv, beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm F16/1 (NCIB 10593)

Quelle — Teichschlamm. Katalase positiv, beständig gegen Sulfafuraz.ol und Erythromycin.

Stamm FI6/2 (NCIB 10594)

Quelle — Teichwasser. Katalase positiv, beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm MPI/Sh/37/l (NCIB 10595)

Quelle — Wasserstaubecken. Katalase negativ, beständig gegen Sulfafura/ol und Rrythrnmycin.

Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Quelle — Flußwasser. Kaialase positiv. Urease negativ, empfindlich gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Ähnliche Stämme wie die vorstehend beschriebenen können aus mannigfachen unterschiedlichen natürlichen Ollpllon ivnllprt wprfjpn /il rjnnpn KrrjKr^Hpn f··'.;-lendc Vegetation. Teichwasser und Flußwasser gehören. Zu geeigneten Isolieriingstechniken für das Gewinnen solcher Stämme zählen das Ausstreifen der Probe auf Methanol-Mincnilsalz-Agarplatten und das Abnehmen geeigneter Kolonien zur weiteren Reinigung oder die statische Anreicherung oder Schiittclanreicherung in flüssiger Kultur (mit oder ohne laufende Subkulturen) im Methanol-Mineralsalz-Medium. Das Isolieren kann bei Temperaturen von 25 bis 45 C" durchgeführt werden, wird jedoch vorzugsweise bei 37 C und bei pH-Werten von 5.5 bis 8.0. vorzugsweise von b.5 bis 7.2. durchgeführt.

Identität der Stämme mit den NCIB-N'ummern
10508-Ii und IO592-9b

Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme verweisen sie gemäß ßergev's Manual of Determinative Bacteriology (7. Ausgabe). Herausgeber Breed. Murray & Smith, veröffentlicht von Williams & Wilkins. Baltimore !957. in die Gattung Pscudomonas.

Wenn man dem l.eitweg zu den Arten dieser Gattung folgt, findet man in Bergevs Manual keine Art. die die vorstehend beschriebenen Eigenschaften auf-WLMM. in uci L-HtTiIUiI findet man keine Bezugnahme auf Bakterien mit ähnlichen Eigenschaften.

Daraus wurde geschlossen, daß diese Stämme einer bisher unbekannten Art angehören, da die Unterschiede zwischen diesen Stämmen hinreichend gering sind, um sie als Stämme der gleichen Art zu betrachten (ähnliche Variation zwischen Stämmen einer gegebenen Art findet man bei Arten der Gattung Pseudomonas wie von R. T. Stanier. N. V Palleroni & M. Dondoroff in »The aerobic pseudomonas: a toxanomic study«, lournal of General Microbiolog) 1966. Band 43, Seite 159. gezeigt wird). Die neue Art wird in dieser Beschreibung als Pseudomonas methylotropha bezeichnet.

B. Microcyclus polymorphum

Die allgemeinen Eigenschaften dieser neuen An. beschrieben am Beispiel von Microcyclus polymorphum. Stamm P1a5 (NCIB-Nr. !0516) sind wie folgt:

Dieser Mikroorganismus ist in seinen mikrobiologischen Eigenschaften sehr verschieden von Pseudomonas methylotropha und von den in der Literatur bekannten, methanolausnutzenden Bakterien.

1. Mikroskopische Morphologie:

a) Methanol-Mineralsalz-Hefeextrakt-Agarplatten nach 3 Tagen Inkubation bei 37^: C: Schmale, stark gekrümmte, gramnegative Stäbchen. die sich während des Wachstums an den Enden vereinigen und geschlossene Ringe von etwa 1.5 um Durchmesser bilden. Die Breite der Stäbchen beträgt etwa 0.3 bis 0.5 μιη. Es sind auch hufeisenförmige Gestaltungen, die sich an den Enden nicht vereinigt haben, und gekrümmte Stäbchen sichtbar. Nicht beweglich, keine sichtbaren Speichergranula, keine Sporenbildung, keine Bildung von Kapseln oder merklichen Mengen von Schleim,
b) Nähragar — 3 Tage Inkubation bei 37"C: gramnegative Stäbchen, etwas größer als im Falle ihres Wachstums auf Mcthanol-Mineralsalz-Hefeextrakt-Agar. Die Stäbchen sind gerade oder gekrümmt, treten einzeln auf und scheinen im allgemeinen keine geschlossenen Ringe oder Hufeisenformen zu bilden.

2. Kolonienmorphologie:

a) auf Methanol-Mineralsalz-Agar und Hefecxtraktplattcn. 2 Tage bei 37 C inkubiert. Gestall — kreisförmig: Größe — weniger als I mm Durchmesser: Erhebung — konvex: Oberfläche — glatt: Kante — vollständig: Dichte — durchscheinend: Farbe — kremfarbig: Konsistenz — butlerähnlich: Emulgier-Kirkeit — leicht ermilgicrbar.

b) auf Nähragarplatten. 2 Tage bei 37 C inkubiert. Gestalt — kreisförmig: Größe — 1 bis 3 πιπί Durchmesser: Erhebung — konvex: Oberfläche — glatt: Kan-en — vollkommen: Dich;e — dicht: Pigment — kremfarbig bis braun, nicht wasserlöslich: Konsistenz — butterähnlich: Emulgierbarkeit — schwierig zu emulgieren.

3. Physiologische und biochemische Eigenschaften:

a) Wachstum in Nährbrühe — Wachstum ziemlich homogen mit etwas Sediment, jedoch kein Häiiichen.

b) GeIalinestich — Wachstum, jedoch keine Verflüssigung.

c) Reduktion von Nitraten — Nitrate zu Nitriten reduziert.

d) Indolproduktion — Indol wird erzeugt (schvi ach positiv).

e) Temperaturbeziehungen — kein Wachstum bei 4X oder 42C. Optimale Temperatur 37 = C.

f) Beziehung zu Sauerstoff — aerob bis fliegen! ich aerob.

g) Stoffwechsel von Kohlenhydraten (Test nach Hugh & Liefson) — oxidativ mit etwas erzeugter Säure.

h) Stoffwechsel von verschiedenen Kohlenstoffquellen — von den getesteten werden die folgenden Kohlenstoffquellen von diesem Stamm ausgenutzt. Methanol. Äthanol. Propanol. Acetat. Pyruvat. Oxalat. Succinat. GIutarat. Sucrose. Lactose. Glucose. Mannit. Ribose. Ribit. Xylose. Fructose. Hexan. Hexadecan. Serin.

i) Lipasproduktion (Hydrolyse von Tween 80) — negativ.

i) l.ecithinaseproduktion (Eidotterreaktion) — negativ.

k) Ureaseproduktion — negativ.

I) .Schwefelwasserstoffproduktion — negativ.

m) Citratausniitzung (Citrattest nach Koscr) — negativ.

η) Methylrottest — negativ,
ο) Test nach Voges Proskauer — negativ,
p) Wachstum in Lackmusmüch — Wachsen,

etwas Alkali erzeugt,
q) Fluorescinproduktion (Kings-Medium Λ) —

nicht erzeugt,
r) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) —

nicht erzeugt,
s) Antibiotische Empfindlichkeit — empfindlich gegen Chloramphenicol. Streptomycin und Tetracyclin, beständig gegen Penicillin.

F.rythromycin. Siilfafurazol. Novobiocin und

Oleandomycin.
t) Wachstum auf Blutagar — Wachstum, jedoch keine Haemolyse.

u) Oxidasetest nach Kovacs — positiv,
v) Katalasetest — positiv.

4. Quelle - Flußschlick

Identität des Stammes Pia 5 (NCIB 10516)

Aus den mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stammes ergibt sich, daß er der Gattung Microcyclus gemäß Berge\'s Manual of Derteminative Bacteriology angehört. Nur eine Art dieser Gattung wird in Bergey's Manual beschrieben, und der Stamm NCIB 10516 unterscheidet sich insofern von dieser Art. daß NCIB 10516 kleiner ist. bei 37⁰C gut wächst, und einen Wachstumsfaktor erfordert. In der Literatur findet sich keine Bezugnahme auf eine Art der Gattung Microcyclus. die die gleichen Eigenschaften besitzt wie der Stamm NCIB 10516. Daraus wird geschlossen, daß dieser Stamm einer bisher nicht bekannten Art angehört.

C. Hyphomicrobium variabile

Die allgemeinen Eigenschaften dieser neuen Art. beschrieben am Beispiel von Hyphomicrobium variabile. Stamm S/30/4 (NCIB-Nr. 10517) sind wie folgt:

Dieser Mikroorganismus unterscheidet sich beträchtlich von den vorstehend beschriebenen Stämmen und

VUIl UdKtCIICIl. UIC lit UCt UIlCI dtUl UiIlUt UcKdllltl .MItU.

daß sie Methanol als Kohlenstoffquelle ausnutzen.

1. Mikroskopische Morphologie (7 Tage Wachstum bei 30⁵C auf Methanol-Mineralsalz-Agar-Platten):

gramunterschiedliche, kurze, kräftige Stäbchen mit spitzen Enden. Breite: 0,6 bis 1.0 μίτι. Länge: 1.0 bis 1.5 μΓΠ. Jeder Mikroorganismus kann 1 Granulum (oder gelegentlich mehrere) Poly-^-hydroxybutyrat enthalten. Die Stäbchen erzeugen schmale Fäden von 0.2 bis 0.3 μπι Breite, die in der Länge variieren, an deren Ende sich jedoch eine Toch'erzelle entwickelt, die sich gelegentlich unter Bildung einer getrennten Einheit abspaltet.

2. Kolonienmorphologie (7 Tage Wachstum bei 30° C auf Methanol-Mineralsalz-Agar-Platten):

kleine Kolonien (I bis 2 mm Durchmesser) mit kreisförmiger Gestalt und einem vollkommenen Rand, konvex, glatt, opak, kremfarbig.

3. Physiologie:

a) Beziehung zu Sauerstoff: aerob.

b) Temperaturbeziehungen: optimale Temperatur 30° C, wächst bei 37'C. Kein Wachstum bei 4° C oder 42° C

c) Wachstum in N.ihrbrühc — Wachstum homogen, kein Häutchen oder Sediment.

d) Gelatinestich — Wachstum, jedoch keine Verflüssigung.

e) Reduktion von Nitraten — Nitrate nicht zu Nitriten reduziert.

f) Indolproduktion — Indol nicht erzeugt.

g) Stoffwechsel von Kohlenhydraten (Test nach Hugh & Liefson) — oxidativ mit erzeugter Säure.

h) Stoffwechsel von verschiedenen Kohlenstoffquellen .— die folgenden Kohlenstoffquellen (von den getesteten) werden ausgenutzt: Methanol, Äthanol. Propanol. Butanol. Formiat. Acetat. Propionat. Butyral. Pvruvat, Oxalal. Succinat, Glutarat, Adipat, Sucrose. Lactose. Mannose, Mannit, Ribose. Ribit. Xylose, Fructose. Naphthalin, Benzoat, Hexadecan.

i) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80) — negativ.

j) Lecithinaseproduktion (Eidotterreaktion) — negativ.

k) Ureaseproduktion — positiv.
I) Schwefelwasserstoffproduktion — negativ.

m) Citratausniitzung (Citrattest nach Koser) — negativ.

n) Methylrottest — negativ.

o) Test nach Voges-Proskauer — negativ.

p) Wachstum in Lackmusmüch — Wachstum, alkalische Reaktion, etwas klumpenbildend.

q) Fluoresceinproduktion (Kings-Medium A) — Fluorescein nicht erzeugt.

r) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) — Pyocyanin nicht erzeugt.

s) Antibiotische Empfindlichkeit — empfindlich gegen Penicillin. Chloramphenicol. Oleandomycin. Streptomycin. Tetracyclin,
t) Wachstum auf Blutagar — Wachstum, jedoch keine Haemolyse.

u) Oxidasetest nach Kovacs — positiv.

v) Katalasetest — positiv.

4. Ouelle — faulendes Silofutter
Identität des Stammes NCIB 10517

Dieser Organismus kann leicht als ein Angehöriger der Gattung Hyphomicrobium identifiziert werden, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology beschrieben wird, doch hinsichtlich des Größenunterschieds, der variierenden Reaktion gegenüber der Gramfärbung und anderer vorstehend aufgeführter Eigenschaften unterscheidet sich dieser Stamm von der einen Art, die in Bergey's Manual beschrieben wird. In der Literatur findet man keine Bezugnahme auf eine Art von Hyphomicrobium, die die gleichen Eigenschaften wie NCIB 10517 besitzt. Daraus wird geschlossen, daß der Stamm NCIB 10517 einer bisher nicht bekannten Art angehört.

D. Pseudomonas rosea
Die allgemeinen Eigenschaften dieser Art sind:

1. Mikroskopische Morphologie (von Zellen, die in MeOH-Mineralsalz-Medium gewachsen sind):

Große, gramnegative, gerade oder leicht gekrümmte. 2—3 um lang und 1 ,um breit, die einzeln auftreten. Die Stäbchen sind durch polare Geißeln beweglich. Poly-/?-hydroxybutyrat wird erzeugt

Il

und intraccllular gelagert unter Bildung eines oder mehrerer gesonderter Speichergranula. Sporen. Schleim und Kapseln sind nicht ersichtlich.

2. Kolonienmorphologie:

a) auf Methanol-Mineralsalz-Agarplatten. 2 Tage bei 37°C inkubiert. Kreisförmige Kolonien mit kojvexer Erhebung. Durchmesser I bis 2 mm, kante vollständig, Oberfläche glatt. Die Kolonien werden leicht emulgiert, und ihre Konsistenz ist butterähnlich. Es wird ein lachsfarbenrosa bis rotes, wasserunlösliches Pigment erzeugt.

b) auf Nähragarplatten, 2 Tage bei 37"C inkubiert. Die Kolonienmorphologie ist die gleiche wie diejenige, die für das Wachstum auf Methanol-Mincralsalz-Agar beschrieben wurde, jedoch sind die Nähragarkolonien gewöhnlich etwas kleiner als die Methanol-Mineralsal/'-Agar-Kolonien.

3. Physiologie:

a) Wachstum in Nährbriihe (nach 3 Tagen Inkuoation bei 37ⁿC): hauptsächlich am Boden des Rohres.

b) Gelatinehydrolyse: Gelatine wird in 7 Tagen nicht hydrolysiert.

c) Nitratreduktion: Nitrate werden im allgemeinen nicht zu Nitrit reduziert, obgleich Nilrat eine annehmbare Stickstoffquelle bildet.

d) Indolproduktion: Indol wird nicht erzeugt.

e) Temperaturbeziehungen: Optimaltemperatur 37'C. bei 4°C in 7 Tagen kein Wachstum ersichtlich, in 7 Tagen bei 42"C Wachstum.

f) Test nach Hugh & Leifson (Glucose als Kohlenstoffquelle) — Wachstum oxidativ mit etwas erzeugtem Alkali.

g) Oxidasetest — Oxidase negativ,
h) Katalasetest — Katalase positiv.

i) Methylrottest — negativ.

j) Tesi nach Voges —Proskauer — negativ.

k) Lackmusmilch — Wachstum, jedoch keine

Ll £CUgUllg VUII JdUIC CIUCI ΛνίΛΛΙΙ.

I) Produktion von Fluorescein und Pyocyanin in Kings-Medium (A und B) — Wachstum, jedoch kein Pigment erzeugt,
m) Antibiotische Empfindlichkeit (unter Anwendung von »Oxid-<, Markierung »Multodisks«)

— beständig gegen Penicillin. Chloramphenicol, Erythromycin, Sulfafurazol, Novobiocin und Oleandomycin; empfindlich gegen Streptomycin und Tetracyclin.

n) Wachstum auf Blutagar — Wachstum, jedoch

keine Haemolyse.
o) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80)

— negativ.

p) Lecithinaseproduktion — unterschiedliche Reaktion.

q) Ureaseproduktion — unterschiedliche Reaktion.

r) Schwefelwasserstoffproduktion — negativ.

s) Citratausnutzung — unterschiedliche Reaktion.

Stoffwechsel von Kohlenstoffquellen

Zwischen den einzelnen Stämmen tritt eine gewisse Variation auf. doch im allgemeinen werden die folgenden Verbindungen als alleinige Kohlcnstoff/Encrgic-Quellen ausgenutzt

Methanol. Äthanol, Propanol. f-Ormi.it, Acetat, Pyruvat, Succinat, Glucose, Fructose, Arginin und ' Serin.

Die folgenden Verbindungen weiden im allgemeinen nicht als alleinige Kohlenstoff-/Energie-Quellen ausgenutzt:

Butanol, Propionat. Butyrat, Adipat. Methylamin, Dimethylamin, Äthylamin. Lactose, Mnnnii. Ribit. Xylose. Naphthalin, Phenol. Benzont. Hexan. Aspartat, Alanin und Glycin.

ι . Die Stämme mit den NCIB-Nunimern 10597- 10612 sind einander ähnlich und sind Stämme der gleichen Art. Denn die allgemeinen Eigenschaften dieser Stämme sind die gleichen wie diejenigen, die vorstehend für die Art beschrieben wurden, jedoch mit den folgenden

.'■ι unterscheidenden Merkmalen:

Stamm MA2/3 (NCIB 10597)

Wächst langsam bei 4°C, ist empfindlich gegenüber Novobiocin, jedoch nicht gegen Streptomycin: Formiat, Oxalat. Mannose oder Ribose werden -'*' nicht ausgenutzt, jedoch werden Glutarat, Citrai.

Sucrose und Glutamat ausgenutzt. Quelle: Schlick von Fabrikplätzen, Lecithinase positiv. Urease positiv.

Stamm BDD/3 (NCIB 10598)

"' Wächst langsam bei 4^CC. ist empfindlich gegen

Sulfafurazol und Novobiocin, jedoch nicht gegen Streptomycin oder Tetracyclin. Citrat oder Pyruvat werden nicht ausgenutzt, jedoch werden Butanol. Oxalat, Glutarat. Sucrose. Mannose. Ribose. Alanin. Glycin und Glutamat ausgenutzt. Urease positiv. Lecithinase negativ, Quelle: Hühnerdung.

Stamm MA3D/! (NCIB 10599)

Oxalat, Glutarat, Sucrose. Mannose, Ribose und tu Glutamat werden ausgenutzt. Lecithinase positiv. Urease positiv. Quelle: Schlick von Fabrikplätzen. Citrat wird nicht ausgenutzt.

Stamm MW4/4 (NCIB 10600)

Wächst langsam bei 4°C und nutzt Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose. Alanin. Glycin und Glutamat aus. Lecithinase positiv. Urease positiv. Citrat wird nicht ausgenutzt. Quelle: Sumpfwasser.

Stamm MPI D/2 (NCIB 10601)
in Wächst langsam bei 4°C und ist empfindlich gegen

Erythromycin. Pyruvat wird nicht ausgenutzt.

jedoch werden Oxalat. Citrat, Glutarat. Sucrose.

Mannose. Ribose, Xylose. Alanin und Glutamat ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease positiv: Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm MP3D/2 (NCiB 10602)

Beständig gegen Tetracyclin: Citrat, Oxalat. Glutarat Sucrose. Mannose oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch wird Ribose ausgenutzt. Lecithinase positiv. Urease negativ. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm MPl/2 (NClB 10603)

Empfindlich gegen Streptomycin; Propanol. Formiat Oxalat Glutarat Sucrose, Mannose, Ribose. GiutErnEt oder Arginin werden nicht aus^enutzt-Lecithinase negativ. Urease positiv: Citrat wird ausgenutzt Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm MA2/2 (NCIB 10604)

Propanol. F'ormiat, Oxalai. Glutarat. Sucrose. Mannose. Ribose. Glutamal oder Arginin werden nicht ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease negativ; Citrat wird ausgenutzt. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm 20/D(NCIB 10605)

Empfindlich gegen Novobiocin; Propanol. Oxalat. Glutarat. Mannose oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch werden Sucrose, Citrat und Ribose, ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease negativ. Quelle: faulende Pflanzen.

Stamm MAI/5 (NCIB 10606)

Empfindlich gegen Erythromycin; Oxalat. Glutarai. Sucrose, Mannose. Ribose. Arginin oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat und Glutamat ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease nicht ausgenutzt, doch werden Citrat. Oxalat. Sucrose, Mannose, Mannit, Ribose. Ribit und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease negativ. Quelle: Hühnerdung.

Stamm WS(NCIB 1061!)

Empfindlich gegen Novobiocin; Oxalat. Glutarat. Arginin, Serin oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat, Sucrose. Mannose. Mannit, Ribose. Ribit und Xylose ausgenutzt. Lecithinase positiv, Urease positiv. Quelle: Waldboden.

Stamm MP3 (NCIB 10612)

Empfindlich gegen Novobiocin; Äthanol, Glutnra'.. Sucrose. Mannose. Ribose. Arginin. Senn oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch werden Oxalat. Citrat. Mannit und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease negativ. Quelle: Fabnk-

Stamm MA3D/3 (NCIB 10607)

Empfindlich gegen Penicillin und Chloramphenicol; Butanol. Propanol. Formiat. Oxalat. Glutarat. Sucrose, Mannose. Glutamat, Arginin oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat und Ribose ausgenutzt. Lecithinase positiv. Urease positiv. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm BDD/2 (NCIB 10608)

Empfindlich gegen Novobiocin: Glutarat. Mannose oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden n. Oxalat. Sucrose. Citrat. Ribose. Alanin Lind Glutamat ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease positiv. Quelle: Hühnerdung.

Stamm MPI (NCIB 10609)

Dieser Stamm nutz'. Acetat. Glutarat. Glutamat. '' Arginin oder Serin nicht aus. doch werden Oxalat. Citrat. Mannose. Mannit. Sucrose. Ribit. Ribose und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease negativ. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm ChD(NCIB 10610)

Empfindlich gegen Chloramphenicol. Erythromycin. NovoDiocin und Uicandomycin. l-ormiai. Glutarat. Glutamat. Arginin oder Serin werden Identität der Stamme mit den NCI B-Nummern 10597-1061:

Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme verweisen diese gemäß Bergcy's Manual of Determinative Bacteriology in die Gattung Pscudomonas. Wenn man dem l.eitweg zu den Arten dieser Gattung folgt, so findet man in Bergcy's Manual keine Art. die die \orstehend beschriebenen Eigenschaften besitzt. Ähnliche Arten sind Pscudomonas (Vibrio) cMorqiiens und Protaminobacter ruber. Bestimmte andere rosa pigmentierte, methanolausnutzende Bakterien sind in der mikrobiologischen Literatur beschrieben worden, hauptsächlich Pseudomonas sp. Stamm ΛΜ1 (Peelft Quayle. 1961. Biochcm. |.. 81. 465). Von Fachleuten wird allgemein angenommen, daß Pseudomonas ovtorqucns. Protaminobacter ruber. Pseudomonas sp Stamm AMI und andere ähnliche bekannte Summe rosa pigmenterter. methanolausnutzcndcr Bakterien in Wirklichkeit unterschiedliche Stämme der gleichen \rt sind (Stocks & McCleskey. l%4. |. Bactenoi. S8. lObi)

Die Stämme NCIB 10597-10612 unterscheiden sich charakteristisch von diesen bekannten Stammen auf der Basis ikr lo!gc"ion Merkmale:

Oxidasetest
Wachstum bei 42°C
Optimale Temperatur
Wachstum auf Methylamin
Wachstum auf Lactose
Wachstum auf Naphthalin
Koloniegröße auf Methanol
Salzagar (48 Stunden Wachstum)
Pigment

Bekannte Pseudomonas extorqiiens-Stämme

schwach positi\ kein Wachstum 30 C

Wachstum Wachstum Wachstum

< 1 mm Durchmesser tief rosa bis rot

Stämme NCIR
1O597-IOM2

negativ

Wachstum

37"C

kein Wachstum

kein Wachstum

kein Wachstum

!—2mm Durchmesser lachsfarben bis tief rosenrosa

Daher wird geschlossen, daß die Stämme 10597 bis 10612 einer bisher unbekannten Art angehören. Die Unterschiede zwischen diesen Stämmen sind hinreichend gering, um sie als Stämme der gleichen Art zu betrachten ^ähnliche Variationen zwischen Stämmen einer gegebenen An findet man bei anderen Arten der Gattung Pseudomonas. wie durch die vorstehend erwähnte Arbeit von Stanier und Mitarbeitern gezeig! wird).

In dieser Beschreibung wird die neue -\rt als Pseudomonas rosea bezeichnet.

Fs ist zu berücksichtigen, d^ß andere Stärnme mn den allgemeinen Eigenschaften der vier neuen, \orstehend beschriebenen Arten, die jedoch leicht unterschiedliche

TO

Eigenschaften von den beschriebenen Stemmen aufweisen mögen, aus natürlichen Quellen isoliert werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann als ansatzmäßiges Kuhurver'ahren, als einstufiges kontinuierliches Kulturverfahren oder als mehrstufiges kontinuierliches Kulturverfahren durchgeführt werden. Das Verfahrensprodukt ist eine Proteinmasse, die zusammen mit anderen Fermentationsprodukien, beispielsweise Aminosäuren, organischen Säuren, Nucleotiden oder deren Derivaten, bakterielle Zellen aufweist

Das als Kohlenstoffquelle für das erfindungsgemäße Verfahren dienende Methanol kann als Rohprodukt ebes Methanolsyntheseverfahrens zugeführt werden.

Das Kulturmedium enthält Methanol, vorzugsweise π in Mengen zwischen 0,05 und 10 Gew.-%, insbesondere zwischen O.i und 7.5 Gew.-%.

Das Kulturmedium enthält eine stickstoffhaltige Verbindung, geeigneterweise Ammoniak, Harnstoff, ein Ammoniumsalz, beispielsweise (NH^SO*. oder ein 2» Nilrai, beispielsweise KNOj, vorzugsweise Ammoniak oder ein Ammoniumsalz. Vorzugsweise liegt die stickstoffhaltige Verbindung im Medium in Mengen entsprechend 0,001 Gew.-% bis 3 Gew.-%, insbesondere 0,01 bis 1 Gew.-%, elementaren Stickstoffs vor. Zusatzlieh zu der stickstoffhaltigen Verbindung enthält das Medium auch anorganische Quellen von Elementen wie Kalium, Phosphor, Schwefel und Magnesium. Diese Elemente können in das Medium eingemischt werden, indem man Verbindungen wie beispielsweise Kalium- κ> chlorid. Magnesiumsulfat. Kaliumphosphate und Phosphorsäure hinzusetzt.

Die anorganischen Verbindungen, die diese Elemente enthalten, werden dem Medium vorzugsweise in Mengen zugesetzt, die ausreichen, um die folgenden r> lonenkonzentrationen (Gew.-°/o) hervorzurufen:

S(V-

0.01 bis 025 0.001 bis 0.1 0.01 bis 05 0.01 bis 0.25

Das Kulturmedium kann auch Spurenmengen von Ionen anderer metallischer Elemente wie beispielsweise Calcium, Kupfer, Eisen. Kobalt oder Mangan (die dem Medium als Salze wie Chloride oder Sulfate zugesetzt r> werden können) und besonders Natrium enthaf'en. das beispielsweise als Chlorid, Sulfat oder Phosphat zugesetzt werden kann, und zwar vorzugsweise in einer Menge, die zu einer lonenkonzcnlration von 0,002 bis 0,06 Gcw.-°/o führt. Das Kulturmedium kann auch »> geringere Mengen von organischen Nährstoffen enthalten wie beispielsweise Hefeextrakt, Maiseinweichlauge. Pepton, Vitamin, Aminosäuren oder Baumwollsamenmehl.

Ein geeignetes Kulturmedium (nachstehend als v> Medium I bezeichnet) hat die folgende Zusammensetzung:

CHjOH	Μ,Ο
HjPO4	H »Ο
(NH4JiSO4	HjO
MgSO4 ■ 7
FcSO4 · 7	HjO
CuSO4 5	IU)
H1BO,
MnSO4 4
ZnSO4 · 7

Na₂MoO₄

20,0 g/l 0,0165 molar

9.0 g/l 1.05 g/l 5.0 mg/1 0.1 mg/1 0.07 mg/1 0.5 mg/1 0.^r) mg/1 0.1 mg/1

b0 CaCIj 2 HjO CoCI; 6 H>O Wasser

13,24 mg/1

0.1 mg/1

ad 1 Liter

In diesem Medium wird der pH-Wert fur da Wachstum eingestellt, indem man ein I : 1-Gemisch voi 4 η KOH/4 η NaOH hinzusetzt.

Bei kontinuierlichen Kulturverfahren, kann da Medium, in das ein Organismus eingeimpft wird, s< zusammengesetzt sein, daß die elementaren Nährstoffi beispielsweise Stickstoff, Phosphor, Magnesium ode Eisen oder die Kohlenstoffquelle, in bezug auf dii anderen Bestandteile des Mediums in solchen Mengei vorliegen, daß sie das Wachstum beschränken. Voi dieser Tatsache kann zum Regulieren des Wachstum einer Kultur Gebrauch gemacht werden.

Zum Anlaufenlassen eines kontinuierlichen Kultur prozesses, wird eine Impfmenge des zu verwendende! Organismus bzw. der zu verwendenden Organismen zi einem Medium hinzugegeben, das die KohlenstoffquelU und andere Nährstoffe enthält, wfan iäBt die Kultur ah Ansatzkultur wachsen und überführt sie zu in wesentlichen kontinuierlichen Kulturbedingungen, in dem man beginnt, das Medium in eine Fermentiervor richtung einzuführen. Während der Fermentierunj verläßt das Medium kontinuierlich die Fermentiervor richtung mit einer Geschwindigkeit, die derjeniger ähnlich ist, mit der frisches Medium eintritt. Die Kon zentration des wachstumsbeschränkenden Nährstoff; wird stufenweise gesteigert, bis sich die Kultur in einen stationären Zustand befindet und das Medium, das in die Fermentiervorrichtung eintritt, die gewünschte Zu sammensetzung für den Fermentierungsprozeß besitzt

Der begrenzende Nährstoff kann die Stickstoff- odei Phosphorquelle, oder, vorzugsweise, die Kohlenstoffquelle sein und kann auch zwischen zwei oder allen dre Vertretern dieser Nährstoffe hin- und herschwanken.

Vorzugsweise wird der pH-Wert des Mediums, ir dem die Fermentierung stattfindet, auf einer gewünschten Höhe gehalten, indem man stufenweise oder kontinuierlich ein geeignetes Mittel zur Regulierung des pH hinzusetzt. Zu geeigneten Mitteln zählen Natrium hydroxid, Kaliumhydroxid, sekundäres Natriumphosphat und Ammoniak, entweder als solche oder ir wäßriger Lösung. Gemische dieser pH-Regulierungsmittel können angewandt werden. Zu anderen geeigneten pH-Regulierungsmitteln zählen wäßrige Lösungen von Chlorwasserstoff, Schwefelsäure. Phosphorsäure und Salpetersäure. Vorzugsweise wird dei pH-Wert sowohl bei ansatzweisen als auch bei konti nuierlichen Verfahren innerhalb einer halben pH-Einheit um den gewünschten pH-Wert herum, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 8.0. insbesondere von 5,8 bis 7,6, eingestellt.

Die optimale Wachstumstemperatur des erfindungsgemäßen Mikroorganismus variiert je nach dem angewandten Organismus und wird gewöhnlich innerhalb eines Grades um die gewünschte Temperatur herum eingestellt, die vorzugsweise innerhalb des Bereiche: von 20 bis 50⁰C liegt. Besonders geeignete Temperaturen zur Durchführung des erfiriduhgsgernäßeri Verfahrens liegen innerhalb des Bereiches von 34 bis 45⁼C

Sowohl bei der ansatzweisen als auch bei der kontinuierlichen Züchtung kann der Partialdruck des im Kulturmedium aufgelösten Sauerstoffs innerhalb des Bereichs von 4 bis 800 mbar. vorzugsweise von 40 bi.< 200 mbar, eingestellt werden. Der Tcildruck de< Kohlendioxids im abgehenden Gas wird innerhalb de«

130 228/5-

Bereichs von 0 bis 200 mbar und vorzugsweise innerhalb des Bereichs von 0 bis 53 mbar gehalten. Pas erfindungsgemäße Verfahren kann unter Anwendung jedes geeigneten Typs einer Fermentiervorrichtung durchgeführt werden. Eine sehr geeignete Fermentiervor- richtung zur Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens ist in der britischen Patentanmeldung 35 285/70 beschrieben. Die Proteinmasse bildet sich als Aufschlämmung in der Fermentiervorrichtung und wird z. B. durch Zentrifugieren und/oder Abfiltrieren und in Ausflocken aus der flüssigen Phase, die andere Produkte, beispielsweise gebildete Aminosäuren, enthält, abgetrennt. Die Proteinmasse kann getrocknet werden und bildet eine Proteinergänzung zur Verwendung in Nahrungsmitteln für den Menschen oder für Tiere.

Falls erwünscht, kann Protein aus der Proteinmasse extrahiert werden, und man kann das extrahierte Protein als Ergänzung für Nahrungsmittel verwenden, die für den Menschen oder für Tiere vorgesehen sind.

Die Erfindung wird durch Beispiele näher erläutert:

CH3OH	•7 H2O	2HjO	5,0 g/l
H3PO4	7HjO	6H2O	0,0165 molar
(NH4J2S	5H2O	9,0 g/l
MgSO4		1,05 g/l
FeSO4 ·	-4H2O	5,0 g/l
CuSO4 ·	7HjO	0,1 mg/l
H3BO3	Na2MoO4	0,07 mg/l
MnSO4	CaClj -	03 mg/l
ZnSO4 ■	CoCLj ·	03 mg/l
	0,1 mg/l
	13,24 mg/l
	0,1 mg/l

Der pH-Wert dieses Mediums wird vor dem Animpfen auf 6,8 eingestellt. Nach dem Animpfen dieses Mediums mit der Impfkultur wird die Kultur in der Fermentiervorrichtung bewegt und belüftet und zwar bei einer automatisch gesteuerten Kulturtemperatur von 37°C, wobei man den pH-Wert der Kultur automatisch auf 6,8 einstellt. Zu jedem I der Kultur werden nach etwa 36stündigem Wachstum, nach 40stündigem Wachstum und schließlich nach 44 Stunden jeweils weitere 5 g Methanol hinzugesetzt. Nach einer Gesamtdauer der Fermentierung von 48 Stunden werden die Zellen abgeerntet und getrocknet. Aus 2 I der Kultur

20

die nachstehenden

A. Pseudomonas methylotropha — Versuche mit

ansatzmäßiger Kultur

Beispiel 1 Stamm WKM-3 (NCIB 10508)

Es wird eine Impfkultur bereitet, indem man 10 cm³ einer sterilen Salzlösung zu einer Kultur des Mikro- w Organismus hinzusetzt, der auf Methanol-Mineralsalz-Agar im Schrägrohr wächst (Zusammensetzung wie vorstehend bei der Beschreibung der Stämme angegehen). Eine Suspension der Zellen wird bereitet, und man verwendet die gesamte Suspension zur Animpfung » eines Impfkulturkolbens (1-i-Erlenmeyer), der 100 cm³ des gleichen Mediums enthält. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor der Animpfung auf 6,8 eingestellt Diese Impfkultur inkubiert man dann 36 h lang auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37° C.

Diese Kultur wird dann verwendet, um eine Fermentiervorrichtung anzuimpfen, die 21 des folgenden Mediums enthält:

ergeben sich 10,4 g getrockneier Zellen mil einem Gehalt von 65 Gew.-% Rohprotein (N χ 6,25).

Beispiel 2 Stamm WKM-I (NCIB 10509)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt Man erhält 93 g getrockneter Zellen. Der Proteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 68 Gew.-%.

Beispiel 3 Stamm SE (NCIB 10513)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt Man erhält 10,6 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 67 Gew.-%.

Beispiel 4 Stamm SF (NCIB 10514)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt Man erhäil 123 g getrockneier Zellen. Der Rohproteingehalt der Zellen (N χ 6,25) beträgt 62 Gew.-°/o.

Beispiel 5 Stamm AS-I (NCIB 10515)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt Man erhält 11,6 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 67 Gew.-%.

Beispiel 6 Stamm AS-I (NCIB 10515)

Der Versuch wird im wesentlichen wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben durchgeführt. Wenn die Fermentierung vollständig ist, wird nach dem Abernten der Zellen die überstehende Flüssigkeit der Kultur auf Anwesenheit freier Aminosäuren analysiert, wobei man eine automatische Aminosäure-Analysiervorrichtung verwendet Man findet die folgenden Aminosäuren in den angegebenen Mengen:

Glutaminsäure	Beispiel 7	135 mg/l
Alanin	32 mg/l
Valin	111 mg/l
iso-Leucin	53 mg/l
Leucin	40 mg/l
Lysin	20 mg/l

55

Stamm MP4 (NCIB 10592)

Der Versuch wird in Schüttelkolbenkulturen wie folgt durchgeführt: Es wird eine Impfkultur bereitet, indem man 10 cm³ einer sterilen Mineralsalzlösung zu einer Schrägkultur des Mikroorganismus hinzufügt, der auf Methanol-Mineralsalz-Agar (Zusammensetzung wie vorstehend bei der Beschreibung der Stämme angegeben) in Schrägrohren wächst. Es wird eine Suspension der Zellen bereitet, und man verwendet die gesamte Suspension zum Animpfen eines 1-1-Erlenmeyer-Kolbens, der 200 cm³ der gleichen Methanoi-Mineraisalzsubstanz [0,5% Methanol (Gew./Vol.)] enthält. Den pH-Wert dieses Mediums stellt man vor dem Animpfen auf 6,8 ein. Dann inkubiert man diese Kultur 24 h lang auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37°C. Die Zellen werden dann durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet, wobei sich aus den 200 cm³

der Kultur 0,171 g Zellen (Trockengewicht) ergeben. Die Zellen enthalten 62 Gew.-% Rohprotein (N χ 6.25).

Beispiel 8
Stamm Fl 6/1 (NCIB 10593)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt. Man erhält 0,222 g getrockneter Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 66 Gew.-°/o (N χ 6,25).

Beispiel 9
Stamm F16/2 (NCIB 10594)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt. Man erhält 0,182 g getrocknete Zellen. Der Rohproteingehalt der Zellen (N χ 6,25) beträgt 69 Gew.-%.

Beispiel 10
Stamm MPl/Sh/37/1 (NCIB 10595)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt. 0,270 g getrockneter Zellen werden erhalten. Der Proteingehalt der Zellen (N χ 6,25) beträgt 64 Gew.-°/o.

Beispiel 11
Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt. Man erhält 0,240 g getrockneter Zellen. Der Proteingchalt der Zellen beträgt 67 Gew.-°/o (N χ 625).

B. Pseudomonas methylotropha — Versuche mit
kontinuierlicher Kultur

Beispiel 12
Stamm MP4 (NCIB 105-2)

Man erzeugte eine Biomasse durch Züchtung des Bakteriums in einem kohlenstoffbegrenzten kontinuierlichen Kultivierungsprozeß bei einer Temperatur von 40⁰C Die Kultur wird belüftet und gerührt, und der pH-Wert wird automatisch auf 6,8 eingestellt. Das Schäumen wird durch automatisch programmierte Zusätze von Siliconöl reguliert. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt: Eine Impfansatzkultur des Organismus läßt man anfangs wie in Beispiel 7 beschrieben wachsen. Diese Impfkultur wird nach 24stündigem Wachstum verwendet, um eine Fermentiervorrichtung anzuimpfen, die 2,01 eines Mediums (Medium II) mit der folgenden Zusammensetzung enthält:

der Kultur automatisch auf 40°C und den pH-Wert der Kultur automatisch auf 6,8 einstellt.

Die Kultur läßt man als ansatzmäßige Kultur etwa 36 h lang wachsen. Nach dieser Zeit ist das Methanol im

ί Medium vom Mikroorganismus vollständig ausgenutzt worden, und die Konzentration des Methanois im Medium beträgt nahezu Null. Zu dieser Zeit wird die Kultur kontinuierlich gemacht, indem man damit beginnt, der Kultur kontinuierlich Medium zuzuführen.

in Das Medium hat die gleiche Zusammensetzung wie das Medium II, und man führt es in zwei Teilen in die Kultur ein. Der eine Teil enthält die Mineralsalze, und der andere ist Methanol in Form einer 50°/oigen wäßrigen Lösung. Das Medium wird mit einer solchen Geschwindigkeit zugeführt, daß die Verdünnungsrate 0.1 Suh.de-' beträgt. Die Kultur läßt man dann etwa 24 h lang wachsen, so daß sie einen stabilen, kohlenstoffbegrenzten stationären Zustand erreichen kann. Die Zellen werden dann kontinuierlich gewonnen und ge-

>o trocknet. Das Trockengewicht der Zellen im stationären Zustand beträgt 4,1 g/l, und die Zellausbeute beträgt 0,41 g getrockneter Zeilen je gausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen, ausgedrückt als wasserfreie Aminosäuren in Prozent des Gesamtaminosäuregehaltes, ist in Tabelle I angegeben.

Methanol	10,0 g/l
(NH4J2SO4	1,15 g/l
H3PO4	0,0066 molar
MgSO4 · 7 H2O	0,42 g/l
FeSO4 · 7 H2O	5,0 mg/1
CuSO4 · 5 H2O	0,1 mg/1
HjBO3	0,07 mg/1
MnSO4 · 7 H3O	03 mg/1
ZnSO4 ■ 7 H2O	0,5 mg/1
Na2MoO4	0,1 mg/1
CaCI2 · 2 H2O	13,2 mg/1
CoCl2 · 6 H2O	0,1 mg/i

Der pH-Wert dieses Mediums wird auf 6,8 eingestellt, indem man ein 1 :1-Gemisch von 4 η KOH :4 η NaOH hinzusetzt. Nach dem Animpfen des Mediums Il mit der Impfkultur wird die Kultur in der Fermentiervorrichtung bewegt und belüftet, wobei man die Temperatur Beispiel 13
Stamm Fl 6/1 (NClB 10593)

Die Arbeitsweise des Beispiels 12 wird wiederholt, jedoch wird die Fermentierungstemperatur auf 37° C eingeregelt.

J5 Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,8 g je I, und die Zellenausbeute beträgt 0,38 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 78 Gew.-%. Der Amino-Säuregehalt der Zellen ist in Tabelle I«' ngegeben.

Beispiel 14
Stamm F16/2 (NCIB 10594)

-i". Das Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht im stationären Zustand beträgt 3,7 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 037 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Roh-

w proleingehalt von 76 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 15 Stamm MP1/Sh/37/1 (NCIB 10595)

Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen im stationären Zustand beträgt 3,7 g/l, und die Zellenausbeute in bezug auf Methanol beträgt 037 g/g. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 76 Gew.-% (N χ 6,25), Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 16
Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,8 g je 1, und die Zellenausbeute

beträgt 0,38 g getrockneter Zellen je g des ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 78 Gew.-% (N χ 6.25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 17
Stamm ASl (NCIB 10515)

Durch Züchten des Bakteriums in einem kohlenstoffbegrenzten, kontinuierlichen Kultivierungsprozeß wird bei einer Temperatur von 37°C Biomasse erzeugt. Die Kultur wird belüftet und bewegt und der pH-Wert automatisch auf einen Wert von 6,8 einreguliert. Das Schäumen reguliert man durch automatisch programmierte Zusätze von Siliconöl. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt:

Inipfkulturen des Organismus läßt man anfangs wie im ersten Ansatz des Beispiels 1 beschrieben wachsen, um 03 g Impfmaterial (Trockengewicht) je I zu schaffen. Diese lmpfkulturen werden dam; zum Animpfen einer Fermentiervorrichtung verwendet, die 201 eines Mediums (Medium IH) der folgenden Zusammensetzung enthält.

CH3OH	-7H2O	2H2O	3,0 g/I
H3PO4		6H2O	0,0099 molar
MgSO4		0,67 g/l
Na2SO4	7H2O	0,03 mg/1
K2SO4	5H2O	2,5 mg/1
FeSO4 ■		5.0 mg/1
CuSO4 ·	-7H2O	0,1 mg/1
H3BO3	7H2O	0,07 mg/1
MnSO4	Na2MoO4	03 mg/1
ZnSO4 ■	CaCl2 ·	03 mg/1
	CoCI2 ■	0,1 mg/1
	13.2 mg/1
0,1 mg/1

Den pH-Wert dieses Mediums stellt man durch geregelles Hinzusetzen von gasförmigem Ammoniak auf 6,8 ein. Nach der Animpfung des Mediums Hl mit den lmpfkulturen wird die Kultur in der Fermentiereinrichtung bewegt und belüftet, wobei man die Kulturtemperatur automatisch auf 37°C einstellt und den pH-Wert der Kultur automatisch reguliert.

Die Kultur läßt man als ansitzinäßige Kultur etwa 1 h lang wachsen. Zu dieser Zeit ist das Methanol im Medium durch die Mikroorganismen vollständig ausgenutzt worden, und die Methanolkonzentralion im Medium beträgt etwa Q. Zu dieser Zeit führt man Methanol der Kultur kontinuierlich mit langsam steigernder Geschwindigkeit zu, so daß das Wachstum der Kultur immer durch die Konzentration des Methanois im Medium begrenzt wird. Wenn die Geschwindigkeit der Methanolzufuhr nach etwa 2 h etwa 10 g/l erreicht, macht man die Kultur kontinuierlich, indem mat? damit beginnt, das Medium kontinuierlich zu der Kultur hinzuzufügen. Das Medium hat die gleiche Zusammensetzung wie Medium III und wird irr zwei Teilen in die Kultur eingeführt. Der eine Teil enthält die Mineralsalze, und der andere Teil ist Methanol in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung. Das Medium wird mil einer solchen Geschwindigkeit zugeführt, daß die Verdiin· nungsraie 0.1 Stunde ' beträgt. Die Zellenausbcutc beträgt 0,38 g getrocknete Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die geirockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 78 Gcw.-%. Der Aminosäi.rcgehalt der Zellen i»'i in Tabelle I angegeben.

Beispiel 18
Stamm SE (NCIB 10513)

Das Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stam-ί mes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,5 g/l und die Zellenausbeute 0^5 g getrocknete Zeilen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 81 Gew.-%. Der Aminosäure-Ui gehalt ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 19
Stamm WKM-I (NCIB 10509)

Ii Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht des stationären Zustands beträgt 2,7 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0.27 g getrocknete Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt

2n (N χ 6,25) von 88 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 20
Stamm SF (NCIB 10514)

Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3.4 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 034 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten «ι Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 77 Gew.-°/o. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

C. Microcyclus polymorphium.
^r' Stamm Pia 5 (NCIB 10516)

Beispiel 21
Kontinuierliche Kultur

Jd Das Beispiel 17 wird unter Verwendung des Stammes Pla5 wiederholt. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen, jedoch wird bei einer Verdünnungsratc von 0,05 Stunden -' ein kohlcnstoffbegrenzter stationärer Zustand herbeigeführt. Zusätzlich enthalt das Medium

■r, 0,05% eines Hefeextrakts.

Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 2.2 g/l und die Zellenausbeute 0.22 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt

-,» (N χ 6,25) von 87 Gew.-%. Der Aminosäuregehall der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 22
Ansaizmäüige Kultur

Unter Verwindung des Stammes PI« wird ein Versuch im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschriebenen durchgeführt, jedoch läßt man in diesem Falle die Impfkultur 48 h lang wachsen, und beim Fermentieren wird

m> zu verschiedenen Zeiten weiteres Methanol zugesetzt.

Der erste Zusatz von weiteren 5 g Methanol je 1 I der Kullur erfolgt nach 48 Stunden der /weile Zusatz nach 56 Stunden und der letzte Zusatz nacn b4 Slundcn.

Die Zellen werden nach einer Gesumifcrmentic-

*-. rungszeil von 72 Stunden gewonnen und getrocknet, wobei sich aus den 2 I der Kullur 9.6 g ergeben. Der Proleingehalt (N χ 6.25) der Zellen beträgt b7.5 Gew.-⁰-« Prolein.

D. Hyphomicrobium variable. Stamm S/30/4
(NCIB 10517)

Beispiel 2J
Ansatzmäßige Kultur

Unter Anwendung des Stammes S/30/4 wird im wesentlichen wie in Beispiel I beschrieben ein Versuch durchgeführt, jedoch läßt man bei diesem Versuch die Impfkultur 72 h lang wachsen, und beim Fermentieren κ wird zu verschiedenen Zehen weiteres Methanol züge setzt. Der erste Zusatz um weiteren ig Methanol zu jedem I der Kultur erfolgt nach 5-4 Stunden, der zweite /.iisatz nach 64 Stunden und der lelzte Zusatz nach 74 Stunden. Die Inkiibiitionslemperaüir betrügt in diesem ι-, Beispiel in allen fallen 30 C. Die /eilen werden nach einer Gcsamtfermenticrungszcit von 96 Stunden gewonnen und getrocknet, und aus den 2 I der Kultur ergcuctt ML-Ii !0.7 £ geiiockfieie /.ciicii. iJet rmieingehait (N χ 6.25) der getrockneten /eilen beträgt 70 Gew.-^Oi.. j.-i

Beispiel 24
Kontinuierliche Kiillur

Beispiel 17 wird unter Verwendung des Stammes ;. S'30/4 wiederholt. Die Versiichsbedingungen sind die gleichen, jedoch wird bei einer Verdünnungsrate \<>n 0.05 Stunden mit einer Methanolkonzentration im einströmenden Medium von 3g I ein kohlenstoffhegrenzter stationärer Zustund herbeigeführt. ;n

Das Trockengewicht der /eilen des stationären Zu· stands beträgt 1.5 g/l. und die Zellenausbeule beträgt OJg getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten /eilen haben einen Rnhprotcingehalt (N χ 6.25) von 80 Gew.-⁰Ii. Der Aminosäuregehalt der >, Zellen ist in Tabelle I angegeben.

[■!. Pseudomonas rosea — Versuche mit
ansatzmäßiger Kultur

B e ι s ρ i e I 25 '"

Stamm ΜΛ2 3 (NC IB 10517)

Der Versuch w ird in Schüttelkolbenkulturen wie folgt durchgeführt: Ks wird eine Impfkuliur bereitet, indem man 10cm' sterile Mincralsal/Iösung zu einer Schräg- j. kultiir des Mikroorganismus hinzusetzt, der auf Methanol-Mineralsalz-Agar-Schrägrohren (Zusammensetzung wie vorstehend bei den Tests zur Identifizierung der Stämme beschrieben) wächst. F.s wird eine Suspension der Zellen bereitet, und man verwendet die ge- -,ι. samte Suspension zum Aninipfert eines I-I-Erlenme\erkolbens. der 200 cm¹ der gleichen Methanol-Mineralsaiz-Subsian/ [O.5°,o Methanol (Gewicht/Volumen)] enthält. Den pH-Wert dieses Mediums stellt man vor dem Animpfen auf 6.8 ein. Diese Kultur wird dann auf -,-, einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37"C 24 h lang inkubiert. Die Zellen werden dann durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet: aus den 200 cm' der Kultur ergeben sich 0.227 g Zellen (Trokkengewicht). Die Zellen enthalten 55 Gew.-% Roh- «i protein (N χ 6.25).

Beispiel 26
Stamm BDD/3 (NCIB 10598)

1, ..-.—^i ..-.n'JA—U.nl· £.~> «UV* V% IL VJt I MUH.

Man erhält 0.226 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zeilen beträgt 58 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 27

Stamm MA3D'1 (NCIB 10599) Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederhol Man erzielt 0,221 g Zellen (Trockengewicht). Der Prr teingehalt der Zellen beträgt 53 Gew. % (N χ 6.25).

Beispiel 28 Stamm Mw4/4 (NCIB 10600)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederhol Man erhält 0.224g Zellen (Trockengewicht). Der Pr< teingehalt der Zellen beträgt 55 Gew.-"» (N χ 6.25).

Beispiel 29 Stamm MPID 2 (NCIB 10601)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederhol Man erhält O.2O2g Zellen (Trockengewicht). Der Pn teingehait der Zeilen betragt 54 Gew.·"« (S ·«· t\25j.

Beispiel 30 Stamm MP3D2 (NCIB 10602)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederhol Man erhält O.2O7g Zellen (Trockengewicht). Der Pro teingehall tier Zellen betragt 5b Gew.-¹¹O (N χ ο.25).

Beispiel 31 Samm MPl '2 (NCIB 10603)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederhol Man erhält 0.200g Zellen (Trockengewicht). Der Pro leingehalt der Zellen beträgt 54 Gew.-ⁿ'<> (N χ 6.25).

Beispiel H Stamm ΜΛ22 (NCIB 10604)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederhol· Man erhält 0.225g Zellen (Trockengewicht). Der Pro tein--.'halt der Zellen beträgt 58 Gew.-% (N χ 6.25).

B e i s D i e I 33 Stamm 20 D (NCIB 10605)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 «ird wiederhol· Man erhält 0.220g Zellen (Trockengewicht). Der Pro teingehalt der Zellen beträgt 57 Gew.-"r> (N χ 6.25).

Beispiel 34 Stamm Μ·\! '5 (NCIB 10606)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederhol· Man erhält 0.161 g Zellen (Trockengewicht). Der Pro teingehalt der Zellen beträgt 61 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 35 Stamm MA3D3(NCIB 10607)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt Man erhält 0.156 g Zelien (Trockengewicht). Der Pro teingehalt der Zellen beträgt 63 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 36 Stamm BDD/2 (NCIB 10608)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt Man erhält 0.188g Zellen (Trockengewicht). Der Pro teingehalt der Zellen beträgt 6i Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 37
Stamm MPI (NCIB 10609)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,?l7g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 59 Gew.-⁰Zo (N χ 6.25).

Beispiel 38
Stamm ChD(NCIB 10610)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,210 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 64 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 39
Stamm WS(NCIB 10611)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0.250 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 64 Gew-% (N ν 6.25).

Beispiel 40
Stamm MP3 (NCIB 10612)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiedeiholt. Man erhält 0,209 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 59 Gew.-⁰/» (N '6.25).

F. Pseudomonas rosea — Versuche mit
kontinuierlicher Kultur

Beispiel 41
Stamm MPI (NCIB 10609)

Beispiel 12 wird unter Verwendung des Stammes MPl wiederholt. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen, jedoch wird der Versuch bei 37 C durchgeführt, wird die Kultur als ansatzweise Kultur 48 h lang wachsen gelassen und läßt man die Kultur, nachdem sie kontinuierlich gemacht worden ist, etwa 36 h lang wachsen, um die Erzielung eines stabilen, stationären Zustands zu ermöglichen. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3.38 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0.338 g getrockneter Zellen je 5 άιΐ35<1Γίϋΐ/-ΐι.Γι ivictnatiui:». Uu- ι ι u\_Ncit/.uiicii iidunii einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6.25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 42
Stamm MP3 (NCIB 10612)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stam mes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3.53 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0.353 g getrockneter 7ellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 69 Gew.-% (N χ 6.25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 43
Stamm ChD (NCIB 10610)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 325 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0325 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols, Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-% (N χ 625).

Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 44
Stamm WS(NCIB 10611)

Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,25 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0,325 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zillen haben einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-°/o (N χ 6,25).

Beispiel 45
Stamm MA2/3 (NCIB 10597)

Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3.16 g/l. und die Zellenaus beute beträgt 0.316 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 72 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 46
Stamm BDD/3 (NCIB 10598)

Das Beispiel 4i wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3.42 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0.342 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 74 Gew. ¹Vo (N χ 6.25).

Beispiel 47
Stamm MA3D/1 (NCIB 10599)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3.30 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0,330 g getrockneter Zellen je g aus genutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 68 Gew.% (N χ 6.25).

U C ι Λ μ ι c ι 4ο

Stamm MW4/4 (NCIB 10600)

Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 2.94 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0.294 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-°/o (N χ 6.25).

Beispiel 49
Stamm MPl D/2 (NCIB 10601)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,71 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0371 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zeilen haben einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 50
Stamm MP1/2 (NCIB 10603)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt Das Gewicht der trockenen Zellen des

stationären Zustands beträgt 3,02 g je I, und die Zellcnausbeute beträgt 0,302 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 51
Star, m MA2/2 (NCIB 10604)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stationären Zustands beträgt 2.71 g/l. und die Zelleiuiusbeute beträgt 0,271 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 52
Stamm 20/D (NCI B 10605)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stationäien Zustands beträgt 3.69 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0,369 g getrockneter Zellen je g ausgenut/ten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 67 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 53
Stamm MAI/5 (NCIB 10606)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stationären Zustands beträgt 3,42 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0.342 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 54
Stamm MA3D/3 (NCIB 10607)

Beispiel 55
Stamrr BDD/2 (NCIB 10608)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,62 g/l, und die Zellenausbcute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,362 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 74 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 56
Ritteriingsversiich bei Hühnchen

Ls wird ein Versuch unter Anwendung von drei Gruppen Hühnchen durchgeführt. Die ersten 10 Tage werden alle Gruppen mit »Promin«-Diät 1 gefüttert, bestehend aus Probe Sojabohnenmehl 21.7% (91% Rohprotein in der Diät). d.l-Methionin 0.4h4%. Molken 2.5%. Mineralstoffe 6.75%. Vitamine 2.0'Vo. Äthoxychin 0.015%, Maisöl 8,0%. Dextrose 40,0%, Getreidestärke 18.391% und Glycin 0.2%. Für die nächsten 7 Tage wird die Diät 1 bei einer Gruppe fortgeführt, während die andere Gruppe mit den Diäten 2 und 3 gefüttert wird, welche aus »Prom;n«-Diät bestehen, in welchen getrocknete Proteinmasse von Pseudomonas methvlotropha bzw. getrocknete Bäckerhefe eingesetzt wurde, um 25% des Rohprocins in der Diät zu bilden. Die Frgebnisse sind nachstellend angegeben:

Ergebnisse

Futter-	Durchschnitt	Durch	Futterumwandlungs
mi-	liche Zunahme	schnitt	verhältnis:
schung ,-, (Diät)	des I.ebenJ- gewichis	liche Nah rungsauf	Zunahme des Le bendgewichts (g/g)
		nahme	Nahrungsaufnahme
	(g)	(?)
«ι 1	87.6	150	0.585
2	95.3	160	0.595
3	85.0	167	0.508

ti wiru unter Anwendung uieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3.12 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0312 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 74 Gew.-% (N χ 6.25).

wie man sieni, wirci unier verwendung uer ermidungsgemäßen Proteinmasse (Futtermischung 2) ein Futierumwdndlungsverhältnis erzielt, das im Vergleich mit dem Futterumwandlungsverhältnis, das man unter Verwendung der anderen getesteten Proteinquellen erzielt, günstiger ist.

Tabelle I

Aminosäure	Wasserfreie	18	Aminosäure	(in %	des Gesamtgehalts	24	an wasserfreien	15	Aminosäuren)	13	41	42	43
	Beispiel Nr.	113				11.1		103		10.6	10.1	10.1	10.0
	17	5,1	19	20	21	4.7	12	5.5	16	5.9	4.7	5.1	53
Asparaginsäure	11,1	3,4	113	12,0	83	3.4	10.7	4.4	103	42	42	3.5	4.3
Threonin	5,4	123	53	5,1	4,4	13,4	5,4	123	6.0	113	133	12.4	123
Serin	33	33	3,6	33	33	5.ί	43	52	4,7	5.4	53	63	5.6
Glutaminsäure	123	6,4	123	12,8	12,7	53	12,2	52	123	53	5.6	5.8	5.6
Prolin	43	8,1	53	4,2	5,8	7,0	5,0	7.8	52	7.5	8.2	7.4	7.3
Glycin	5,7	6,6	6,7	63	5,0	6.1	5,4	6.0	53	63	6.0	63	6.5
Alanin	7,7	3,4	83	7,8	7.7	3.1	7,8	3,0	8.2	33	2.4	2j	3.0
Valin	62	6,4	63	5.8	6.4	6.0
Methionin	33	33	2,7	22	23	Z8

Amino-äjre	Wasserfreie Aminosäure	Nr.	19	(in %	des Gesamtgehalts	24	pn wasserfreien	15	Aminosäuren)	IJ	41	'■2	43
	Beispiel	18	5.6			5.0		5.2		5.2	4,0	4.6	5.3
	17	5.6	8,5	20	?.\	7.7	12	8.5	16	8,3	8.6	8.5	e.f>
Isoleucin	5.7	8.8	4,2	5.8	5.5	4,5	5.5	4.6	4.6	4.8	3.5	4.1	4.2
Leucin	9.0	4.2	4.0	9.1	9.9	5.0	9.2	5.0	8.7	4.8	4.0	4.0	4.4
Tyrosin	4,2	4.9	7.2	3,6	5.6	8.2	4,2	7.8	4.8	7.5	7.5	7.3	7.5
Phenylalanin	4.8	7.7	2.3	4.6	5.6	2.7	4.4	2.7	4.5	2.5	2.1	2.4	2.5
Lysin	8.1	2.4	5.1	7.7	7.0	7.1	7.5	6.1	7.3	6.3	9.6	8.!	' . I
Histidin	2.4	5.7	0.5	2.0	2.2	n.t.	2.2	0.6	2.3	0.6	0.8	O.8	0.7
Arginin	5.8	0.5	n.t.	5.9	8.5	n.t.	6.2	1.6	6.1	n.t.	1.1	1.6	1.5
Halbcystin	0.6	2.0	61.1	n.t.	n.t.	50.7	0.6	55.6	0.7	58.4	46.7	54.3	5 5.2
Tryptophan	n.t.	58.1		n.t.	n.t.		1.5		n.t.
Gesamte	56.4			55.2	41.9		44.0		50.0
wasserfreie
Aminosäuren
(in °/o der
Trocken
substanz)

n.t. = nicht getestet.

Aminosäurebestimmung durch die übliche Säulenchmni.itogr.iphieiechtnk η .ich Moore & Sicm. UeMimmiini: \< >n ΙΙ.ιΙΚλμι" als Cystinsäure nach Oxidation mit Perametsensaure. Tr> plnph.iit.inii!> se unter Anwendung .ilk.ilischer Hulrolwc

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen durch aerobes Kultivieren von ϊ Bakterien in einem wäßrigen Kulturmedium, das Methanol als Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und anorganische Nährstoffe aufweist, und Gewinnen der Proteinmassen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen methanolausnutzenden Stamm der Arten Pseudomonas methylotropha, Microcyclus polymorphum, Hyphomicrobium variabile und Pseudomonas rosea oder mehrere dieser Stämme verwendet, wobei diese Arten die nachstehend zu diesen Arten angegebenen allgemeinen Eigenschaften besitzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der Stämme mit den NCIB-Nummern 10 508 bis 10 517 und 10 592 bis 10 612 oder mehrere dieser Stämme einsetzt

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein solches verwendet, das Ammoniak, ein Ammoniumsalz, Harnstoff oder ein Nitrat als Siickstoffquelle enthält.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das Ionen von Calcium, Kupfer, Eisen, Kobalt oder Mangan enthält.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden An- jo Sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das anorganische Quellen von Schwefel, Phosphor, Magnesium und Kalium und/oder Natrium enthält.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden a Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das Methanol in Mengen zwischen 0,05 und 10 Gew.-%, insbesondere 0,1 und 7,5 Gew.-%, die Stickstoffquelle in Mengen zwischen 0,001 und 3 Gew.-%, insbesondere 0,01 und 1 Gew.-% elementaren Stickstoffs und die anorganischen Quellen an Phosphor, Schwefel, Magnesium, Kalium und Natrium in solchen Mengen enthält, die ausreichend sind, um folgende lonenkonzentrationen (in Gew.-%) zu schaffen: PO«³- 0,01 bis 0,5, 4i SO«²- 0,01 bis 0,25, Mg²⁺ 0,001 bis 0,1, K+ 0,01 bis 0,25, und Na+ 0,002 bis 0,06.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kultivieren bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 20 bis 50⁰C, insbesondere von 34 bis 45°C ausführt.

8. Verwendung des nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellten proteinhaltigen Produktes in Form getrockneter Zellen als protein- y, haltige Nahrungsmittelergänzung, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Nährmitteln, zur Ernähung von Mensch und Tier.