DE1957980A1 - Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Zuechtung eines Streptomyces - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Zuechtung eines StreptomycesInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung des mit der Nummer 13 057 R.P. bezeichneten Antibioticums,
das den Namen Daunorubicin(früher: Rubidomycin) erhalten hat.
In der französischen Patentschrift 1 533 151 sind das mit
der Nummer 9 865 R.P. bezeichnete Antibioticum, seine drei
Hauptbestandteile, die mit den Nummern 13 213 R.P., 13 057 R.P. (oder Daunorubicin) und 13 330 R.P. bezeichnet werden,
009833/1323
die Herstellung des Antibioticums 9 8o5 R.P. durch Züchtung
von Streptomyces 8 899 oder Streptomyces 31 723 in geeignetem
Medium und die Fraktionierung des Antibioticums 9 8b5
R.P. in seine drei Bestandteile beschrieben.
In der französischen Patentschrift 1 551 195 ist ebenfalls
die Herstellung des Antibioticums 13 057 R.P. oder Daunorubicins
durch Züchtung eines neuen Streptomyces-Stamrr.es beschrieben, der mit Streptornyces griseus, Varietät Rubidofaciens,
Stamm DS 32 O41 (NRRL 33-33) bezeichnet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Züchtung eines im folgenden
näher identifizierten Mikroorganismus, der dem Genus Strep tomyces angehört und mit "streptomyces bifurcus, DS 23 219
bezeichnet wird, unter aeroben Bedingungen. Dieser neue Organismus wurde aus einer in Frankreich im Departement
Val-de-Marne, entnommenen Erdprobe erhalten.
Die Isolierung dieses Stammes wurde unter Anwendung der folgenden üblichen Methode vorgenommen: Die Erdprobe wird in sterilem
destilliertem Wasser suspendiert, die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt, und kleine Volumina
jeder Verdünnung werden auf die Oberfläche von Petrischalen verteilt, die ein geeignetes Agarnährmedium enthalten.
Nach einer Inkubation von 15 Tagen bei 26°C werden die Kolonien von Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schrägagar
versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten. '
Aus den im folgenden dargelegten Gründen muss der Stamm Streptomyces
DS 23 219 als Repräsentant einer neuen Species angesehen werden, die mit Streptomyces bifurcus aufgrund der Tatsache bezeichnet
wird, dass man in seinen Kulturen sehr häufig eine recht besondere Form von Sporophoren antrifft, die am Ende
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BAD ORIGINAL
eine Dichotomie aufweisen und dann zwei ländliche fts te aufweisen,
die air. Snde eines Hauptfadens sitzen.
Streptomyces bifur^us, L'tamrn DS 2j5 219» bildet, zylindrische
Sporen mit Abr.es.sunken von 0,k bis 0,5/1,0 bis 1,2 μ. P.oine
geraden oder schwach gebogenen Sporenfäden sind auf Luft-ausgesetzten
Fäden angeordnet, die sie isoliert oder als Trauben tragen, die eine beschränkte Anzahl von Elementen umfassen.
Häufig bildet der Hauptfaden an seinem Ende nur zwei längliche Fäden, was den Sporophoren ein ganz besonderes gespaltenes
Aussehen gibt.
Allgemein entwickelt streptoniyces bifurcus, Stamm DS 2j5 219,
auf synthetische.'^ iJährnsedipr. ein gell-Hohes bis hellrora, bräun lichrosa
oder· r'H Ii oh braunes vegetatives Mycel ur; i pr .-hj:;inrt lösliche
Pigmente von orangerosa bis'violettrocn Färbung. Auf den
organischen Medien ist sein vegetatives Mycel gelbbraun bis
orangebraun, und die löslichen Pigmente, die er erzeugt, färben den Agar orangebraun bis rötlichbraun. Er erzeugt kein
Melaninpigment auf organischen Medien und kein HpS. Er bildet
aus Nitraten sowohl auf organischen Keulen als auch auf synthetischen
Medien Nitrite, verflüssigt Gelatine, peptonisiert Milch langsam und verwertet Cellulose.
In der nachfolgenden Tabelle I sind die Züchtungscharakteristiken
und die "biochemischen Eigenschaften, die Streptorr.yces bifurcus, Stamm DS 2j5 219, auf einer gewissen Anzahl von üblicherweise
zur Prüfung des Aussehens von Streptoniyces-Stämmen verwendeten Nähragarmadien und Nährbouillons aufweist,
angegeben. Ohne genauere Angaben sind diese Eigenschaften diejenigen, die Kulturen von etwa 2 bis 3 V.'ochen bei 25CC, die
ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, aufweisen. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den
Rezepturen hergestellt, die in "The Actinorr.ycetes" (S.A. WAKS-KAN,
"Chroniea ßotanica Company, Waltharri, Mass., USA, 1950,
0 0 9 8 3 3/1323 BAD ORIGINAL
Seite 193-197) angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in
"The Actinornycetes" gegeben wurde, bezeichnet.
"The Actinornycetes" gegeben wurde, bezeichnet.
Die Literaturstellen für die anderen ZUchtungsmedien oder die
Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:
Anm. A: "Hickey and Tresner's Agar", T.G. PRIDHAM u. Mitarb.,
Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950
Anm. B: K.L. JONES, Journal of Bacteriology, 57, 142, 1949
Anm. C: Rezeptur W-2J5, versetzt mit 2 % Agar
Anm. D: "Yeast Extract Agar", T.G. PRIDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950
Anm. E: "Tomato.Paste Oatmeal Agar", T.G. PRIDHAM u. Mitarb.,
Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950
Anm. F: W.E. GRUNDY u. Mitarb., Antibiotics and Chem., 2, 4O1,
1952
Anm. G: "inorganic Salts - Starch Agar", T.G. PRIDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 951
Anm. H: entspricht der Rezeptur W-1, wobei JO g Saccharose
durch 15 g Glucose ersetzt sind
Anm. I: entspricht der Rezeptur W-1, wobei 30 g Saccharose
durch 15g Glycerin ersetzt sind
Anm. J: "Plain gelatin", hergestellt nach den Angaben des
"Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva,
N.Y., H50-18
N.Y., H50-18
Anrr.. K: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria"
der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,
Anm. L: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,
I:C5O-19
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Anm. M: entspricht der Rezeptur W-18, wobei 30 g Saccharose
durch 15 g Glucose ersetzt sind
Anm. N: entspricht der Rezeptur W-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapiers^reifen
ersetzt ist, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen
Anrn. 0: Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers zubereitet
Anm. P: The Actinomycetes, Band 2, Seite 333, Nr. 42, S.A.
WAKSMAN, The Williams and-Wilkins Company, Baltimore,
1961
Anm. Q: H.D. TRESNER und F. DANGA, Journal of Bacteriology,
76, 239-24'i, 1958
BAD ORIGINAL 009833/1323
CO 00 CO CO
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Kulturmedium | Entwicklungs- | gut | Vegetatives | Luft-ausgesetzter | Lösliches | ! Beobachtungen i |
"ren mit Abmes | CXD |
grad | Mycel oder | Teil (umfasst Ge | Pigment | und biochemische | sungen von 0,4 | er | ||
Unterseite | samtheit von Luft- | Eigenschaften | bis 0,5/1»0 bis | |||||
der Kultur | ausgesetztem My | 1,2 μ; gerade | ||||||
(D | (2) | (5) | cel und SpornIa- tion) (i}) |
(5) | (6) . . | oder schwach ge | α | |
Agar nach | hellgelb | hellgrau; sehr | I I sehr schwach!zylindrische Spo- |
bogene Sporenfä | ||||
Hickey und | braunes ve | massig entwickelt | rosa bräun | den; häufig 3po- | ||||
Tresner | getatives | lich | rophoren von | |||||
(Anm. A) | Mycel; gut | zweigeteilter | ||||||
entwickelt | Form | |||||||
ziemlich | ||||||||
gut | ||||||||
Agar nach | ziemlich | gelbliches | keiner· | keines | ||||
Bennett | gut | bis hellgelb- | ||||||
(Anm. B) | lichbraunes | |||||||
vegetatives | ||||||||
Mycel | ||||||||
Agar nach | gelbliches | keiner | schwach | |||||
Emerson | bis hellgelb- | rosabraun | ||||||
(Anm. C) | lichbraunes | |||||||
vegetatives | ||||||||
Mycel | ||||||||
σ·.
CO CO U) U)
U) fsj
(1) | (2) | (3) | (4) | (5) | (6) | T | 195798 |
Agar m£t Kefoextrakt nach Pridham (Anm. D) |
gut | hellorange- braunes ve getatives Mycel |
hellblaugrau; massig entwik- kelt |
hellrötlich- orangebraun |
|||
Ajrar mit Hafer und Tomate" nach Pridham (Anm. E) |
gut | hellorange- braunes ve getatives Mycel |
blaugrau; ziemlich gut entwickelt |
orangebraun | gute Loslichma- chung von CaI- ciummalat |
||
Glucose- Pcpton- Agar (W-6) |
ziemlich gut |
bräunlich oranges ve getatives Mycel |
keiner | schwach rosa orange braun |
|||
Nähragar (W-^) |
sehr massig |
he11bräunlich- gelbes vege tatives Mycel |
keiner | keines | |||
Agar mit Calcium- malat nach Krainsky (Anm. P) |
massig | farbloses bis hellbräunlich- rosa vegeta tives Mycel |
keiner | hellgräulich- rosa |
|||
A^ar mit Ovalbumin (W-1i?) |
schlecht | farbloses bis hellrosa vegetatives Mycel |
keiner | keines |
(1) | (2) | (3) | (2O | I | (5) | • | (6) | ! | Hydrolyse von |
Glucose- | ziemlich | hellorangebraunes | blaugrau; | hellrötlich- | Stärke: posi | ||||
Asparagin- | gut | bis hellrotbrau | sehr massig | orange | tiv | ||||
Agar | nes vegetatives | entwickelt | zylindrische | ||||||
(W-2) | Mycel | Sporen mit o*j | |||||||
Glycerin- | ziemlich | rosabraungelb | rosagrau bis | orangerosa bis | Abmessungen ^i | ||||
Asparagin- | gut | bis rot | blaugrau; ziem | rot | von 0,4 bis | ||||
Agar | lich spärlich | 0,5/1,0 bis | |||||||
(w-3) | entwickelt | 1,2 μ; gerade | |||||||
Stärke- | massig | rötlichrosa bis | hellgräulich; | hellviolettrosa- | oder schwach | ||||
Nitrat- | hellrosabraunes | spärlich ent | braun | gebogene Spo | |||||
Agar (W-10) |
vegetatives Mycel | wickelt | renfäden ; | ||||||
Agar mit | ziemlich | rötlichorangebrau- | hellbläulich- | hellrötlich- | häufig Sporo- | ||||
Stärke | gut | ne Unterseite | grau Dis hell- | braun | phoren von | ||||
nach | rosagrau; mas | zweigeteilter | |||||||
Pridham | sig entwickelt | Formj Hydroly | |||||||
(Anm. G) | se von Stärke: | ||||||||
positiv | |||||||||
(D | (2) | (3) | (4) ■ | (5) (6) | I | intensiv |
Synthe | gut | hellgelbliches | keiner | violettrosa | purpurviolett; | |
tischer | bis rötlichrosa | reichlich | ||||
Agar nach | vegetatives | |||||
Czapek | Mycel | |||||
mit | ||||||
Saccharose | ||||||
(w-1) | ||||||
Synthe | gut | hellgelbliches | keiner | |||
tischer | bis hellrosabrau- | • | ||||
Agar nach | nes vegetatives | |||||
Czapek | Mycel | blassrosa | ||||
mit | bis blass | |||||
Glucose | orange | |||||
(Anm. H) | ||||||
Synthe | gut | violettrotes | rosagrau | |||
tischer | vegetatives | bis violett | ||||
Agar nach | Mycel | grau; massig | ||||
Czapek | entwickelt | |||||
mit | ||||||
Glycerin | ||||||
(Anm. I) | ||||||
CD OD O.
O O CD OO
co ω
co
Λ Q Z
co
(1) | (2) | ■ | (3) | (M . | (5) | (6) | i |
Kultur | gut | sehr gut ent | keiner | rotlichbraun | |||
auf Kar | wickeltes, | ||||||
toffeln | sehr dickes | ||||||
(W-27) | und stark ge | ||||||
faltetes vege | |||||||
tatives Mycelj | |||||||
hellbräunIich | |||||||
bis hellrötlich- | |||||||
braun | |||||||
reine | massig | weissliches | keiner | keines | Verflüssigung: | ||
Gelatine | vegetatives My- | positiv | |||||
mit 12 % ■ | cel | ||||||
(Anm. J) | |||||||
Nitrat- | ziemlich | gelblicher Ring | keiner | keines | Reduktion von | ||
Nähragar | gut | Nitraten zu Ni | |||||
(Anm. K) | triten: stark | ||||||
positiv | |||||||
Glucose- | massig | kleine gräuliche | keiner· | keines | Reduktion von | ||
Nitrat- | Kolonien, die | Nitraten zu Ni | |||||
Bouillon | sich an der Ober | triten: positiv | |||||
nach | fläche agglome | ||||||
Dimmick | rieren | ||||||
(Anm. L) |
CD
cn
CO CX) O
σο u> co
(1) | (2) | O) | (*) | (5) ·. | (6) i |
Bouillon nach Czapek mit Saccharose (W-18) |
mittel | rosa Schleier, dick, gut ent wickelt |
keiner | keines ■ |
Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv |
Bouillon nach Czapek mit Glucose (Anm. M) |
mittel | rosaviolett | keiner | keines | Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv |
Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. N) |
mittel | kleine rosaweisse Kolonien auf dem aus der Bouillon herausragenden Papier |
•rosa-weiss ' | keines | Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv; Verwertung von Cellu lose: positiv |
Magermilch (Anm. O) |
gut | gelblicher Ring | keiner | Keine Koagulation; langsame Peptonisatlon, erst nach 1 Monat Züch tung beginnend; pH un verändert in 1 Monat |
O O CD
OO
(1) | (2) | O) | (4) | (5) | (6) |
Tyrosin- | massig | hellbräunlich- | rosa-weiss | he11bräun- | Bildung von Melanin: |
Hefeextrakt- | rosa | bis rosa | lichrosa | negativ | |
Agar zur | grau j massig | ||||
Bildung | entwickelt | ||||
von | |||||
Melanin | |||||
(Anm. P) | |||||
Agar nach | gut | hellbräunlich- | keiner | hellbräun- | Produktion von HpS: |
Tresner | gelb | lichgelb | negativ | ||
und üanga | |||||
(Anm. Q) ■ |
co
IS) OJ
Γ"
CD
cn
CD OO CD
Die Fähigkeit von Streptomyoes bifurcus, Stamm DS 2>
219* verschiedene Kohlenstoff que Ilen und Stickstoffquellen zur
Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact.
56, 107-114, 1948) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium beobachtet,
wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenst off que Ilen oder das (NHh)2SOj, durch die verschiedenen
jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle II angegeben.
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Tabelle II
Geprüfte Kohlen stoffquellen |
Ver wertung |
- | + | - | + | Geprüfte Stick stoffquellen |
Ver wertung |
- |
D-Xylose | + | + | - | + | NaNO3 | + | - | |
L-Arabinose | + | + | - | + | NaNO2 | + | + aber langsam |
|
L-Rhamnose | + | + aber langsam + |
+ | (NH^)2SO4 | + | + . | ||
D-Glucose | + | + | (NH4J2HPO4 · | + | + | |||
D-Galactose | + | + | Adenin | + | + | |||
D-Fructose | + | + | Adenosin | + | + | |||
D-Mannose | + | + | Uracil | + | ||||
L-Sorbose | + | Harnstoff | + | |||||
Lactose | + | L-Asparagin | + | |||||
Kaitose | Glykokoll | + | ||||||
Saccharose | Sarcosin | + | ||||||
Trehalose Cellobiose |
DL-Alanin DL-VaIin |
+ | ||||||
Raffinose | DL-Asparaginsäure | + | ||||||
Dextrin | L-Glutaminsäure | + | ||||||
Inulin | L-Arginin | + | ||||||
Stärke | L-Lysin | + | ||||||
Glykogen | DL-Serin | + | ||||||
Glycerin | DL-Threonin | + | ||||||
Erythrit | DL-Methionin | |||||||
Adonit | Taurin | |||||||
Dulcit | DL-Phenylalanin | |||||||
D-Mannit | L-Tyrosin | |||||||
D-Sorbit | DL-Prolin | |||||||
Inosit | L-Hyd roxypro1in | |||||||
Salicin | Betain |
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Die Gesamtheit der Charakteristiken, die Streptomyces bifurcus,
Stamm J)G 23 219, aufweist, hat nicht ermöglicht, ihn
als eine der bereits beschriebenen Species zu identifizieren.
Er muss daher als Repräsentant einer neuen Species angesehen werden.
Nach der in Sergey's Manual of Determinative Bacteriology (7· Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore,
1957) angegebenen Klassifikation von Streptomyces machen ihn seine Eigenschaften, auf organischen Medien kein Melaninpigment
zu bilden, auf Kartoffeln ein lösliches rötlichbraunes Pigment zu entwickeln und auch auf Kartoffeln ein hellrötlichbraunes
vegetatives Mycel zu entwickeln, dem Streptomyces hoursei ähnlich. Er steht jedoch mit diesem letzteren in keinem
Verhältnis, der spiralige Sporophoren bildet und dessen sporuliertes Luft-ausgesetztes Mycel eine rosa Farbe annimmt,
während er nur nichtspiralige Sporenfäden bildet und ein hellblaugraues sporuliertes Luft-ausgesetztes Mycel aufweist.
In The Actinomycetes (Band 2, S.A. WAKSMAN, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, Seite 158) befindet sich eine
Beschreibung von drei anderen Species, die mit Streptomyces noursei die Eigenschaft teilen, auf organischen Medien kein
Melaninpigment zu bilden, auf Kartoffeln ein rötliches lösliches Pigment freizusetzen und auf Kartoffeln ein rosa bis
rötliches vegetatives Mycel zu bilden, nämlich Streptomyces albogriseolus, Streptomyces spiralis und Streptomyces fragilis.
Diese drei Species weisen jedoch gegenüber dem Stamm Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, wesentliche Unterschiede auf,
die zeigen, dass sie unbestreitbar Species sind, die ihm nicht entsprechen können: Streptomyces albogriseolus und Streptomyces
spiralis bilden spiralige Sporophoren und gehören daher in die Sektion Spira der Klassifikation von Pridharn, während
Sti'eptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, der nur gerade ode" schwach
gebogene Sporenfäden bildet, in die Sektion Rectus-Flexibilis
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dieser gleichen Klassifikation gehört. Was Streptomyces
fragilis anbetrifft, so zeigt die rosa Farbe, die sein Luffcausgesetztes
Mycel bei Erreichung der Sporulation annimmt, dass er in keiner Beziehung zu Streptomyces bifurcus, Stamm
DS 23> 219f steht, dessen Luft-ausgesetztes Mycel, wie bereits
ausgeführt wurde, sich hellblaugrau färbt, wenn er sporuliert ist. -
Streptomyces bifurcus, Stamm DS 2J 219* kann daher nicht als
einer der als nächsten kommenden Stämme identifiziert werden.
Das neue Verfahren zur Gewinnung von Daunorubicin besteht im
wesentlichen darin, Streptomyces bifurcus, Stamm DS 25 219>
oder seine Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung
gebildete Antibioticum abzutrennen.
Die Züchtung durch Fermentation von Streptomyces bifurcus,
Stamm DS 25 219» ergibt im wesentlichen Daunorubicin, jedoch
auch die anderen Bestandteile des Antibioticums 9 865 R.P.,
die von dem Daunorubicin im Verlaufe von Extrakt-Ons- und
Reinigungsarbeitsgängen abgetrennt werden und gegebenenfalls isoliert v/erden können. Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung
ist jedoch die Herstellung von Daunorubicin.
Die Züchtung von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 2^ 219»
kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submerszüchtungsmethode erfolgen, doch ist diese letztere
aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die
jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.
009833/1323 BADORiGJNAL
Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung
der Arbeitsgänge einschlagen:
Stamm DS 23 219 - Stammansatz
Kultur auf Agar
Kultur im Kolben unter Bewegung
Impfkultur im Fermenter
Produktionskultur im Fermenter
Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle,
Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten
Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt
werden können.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate,
wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole,
z.B. Mannit und dgl., oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure oder Citronensäure, verwenden.
Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen
mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.
Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind ausserordentlich
verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische oder
organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder Aminosäuren, sein.
009833/ 1323
Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten,
zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten oder deren Hydrolysaten, Sojamehl,
Arachismehl, Fischmehl, Fleicchcxtrakten, Hefeextrakten,
Distillers1 Solubles und Maisquellwasser.
Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse
eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate
oder Calcium- und Magnesiumcarbonat.
Andere führen zu dem zur Entwicklung des Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219» und zur Erzeugung des Antibioticums
erforderlichen Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schliesslich
wirken gewisse in speziellerer Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces DS 23 219. Es sind
dies die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums soll zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7>8, vorzugsweise zwischen 6,5 und
7,5, liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 50°C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen
23 und 33°C eine zufriedenstellende Produktion erhalten. Die
Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, dass Belüftungen von 0,3 bis 3
Luft je 1 Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Antibioticum wird nach 2- bis 8-tägiger
Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.
Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, dass die zur Produktion von Daunorubicin angewendeten allgemeinen Bedin-
009833/ 1323
gungen der Züchtung von Streptomyces bifurcus, Stamm DS
23 219* in ziemlich weitem Masse variieren und jedem besonderen
Erfordernis angepasst werden können.
Das Daunorubicin kann aus den Fermentationsmaischen nach verschiedenen Methoden isoliert werden.
Man kann die Kulturmaische bei einem pH-Wert zwischen 1,5
und 9 filtrieren. Unter diesen Bedingungen geht der Hauptteil
der Aktivität in das Filtrat. Nach Waschen mit V/asser enthält der Filterkuchen praktisch keine Aktivität mehr. Es
ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem Medium und insbesondere unter Ansäuern mit Oxalsäure auf einen pH-Wert zwischen
1,5 und 2 durchzuführen. Es ist auch möglich, die Filtration bei einem pH-Wert zwischen 2 und 7» vorzugsweise bei
einem pH-Wert in der Nähe von 2, in Anwesenheit eines aliphatischen
Alkohols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen vorzunehmen.
Bei den oben genannten Extraktionsarbeitsgängen wird das
Daunorubicin in wässriger oder wässrig-alkoholischer Lösung erhalten, und man führt es anschliessend durch Extraktion
mit einem mit Wasser nichtmischbaren organischen Lösungsmittel,
wie beispielsweise Butanol, Methylisobutylketon, Ä'thylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5*5
und 9» vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 7,5* in eine organische Lösung über. Gegebenenfalls nimmt man vor
dieser Extraktion eine Behandlung mit einem lonenaustauscher- harz vor. In diesem Falle wird die wässrige Lösung auf einen
pH-Wert in der Nähe von 4 eingestellt und das Antibioticum dann an ein Kationenaustauscherharz gebunden. Das Daunorubicin
wird vorzugsweise mit Methanol, das 10 % Wasser und 1 £
Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat wird dann eingeengt, um den Alkohol zu entfernen, und dann wie oben angegeben,
extrahiert.
BAD ORIGINAL 009833/1323
Man kann die.. Fermentationsinaische auch einer Extraktion
mit einem mit Wasser nichtmischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, A'thylacetat oder Chloroform,
bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9,vorzugsweise
bei einem pH-Wert in der Nähe von 7*5, unterziehen. In diesem
Falle geht die gesamte Aktivität in die organische Phase, die von der wässrigen Phase nach üblichen Verfahren abgetrennt
wird. .
Gleichgültig, welche Extraktionsweise gewählt wird, wird das Daunorubicin schliesslich in organischer Lösung erhalten.
Es kann zu diesem Zeitpunkt vorteilhaft sein, eine Reinigung durch aufeinanderfolgende Überführung des Antibio-.ticums
in wässrige Lösung und dann in organische Lösung durch Änderung des pH-Werts vorzunehmen. Das rohe Antibioticum kann
anschliessend -aus der zuletzt erhaltenen organischen Lösung durch Einengen oder durch Ausfällen mit einem schlechten Lösungsmittel,
wie beispielsweise Hexan, isoliert werden.
Zur Herstellung von reinerem Daunorubicin kann man die üblicherweise
angewendeten Methoden, wie beispielsweise Chromatographie an verschiedene Adsorbentien, Gegenstromverteilung
oder Verteilung zwischen verschiedenen Lösungsmitteln, anwenden .
Das Daunorubicin kann auch in Additionssalze mit Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, übergeführt werden.
Diese Salze können durch Anwendung üblicher Methoden gereinigt werden.
Das nach den· erfindungsgemässen Verfahren erhaltene
Daunorubicin und dessen Salze weisen Eigenschaften auf, die mit denjenigen des Antibioticums 13 057 R.P. und seiner Salze,
die in der französischen Patentschrift 1 533 15I beschrieben
sind, identisch sind.
009833/1323 BADOr1GINAL
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
In einen 170 1-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile
ein:
Pepton | 1200 g |
Fleischextrakt | 600 g |
Hydratisierte Glucose | 1200 g |
Agar | 240 g |
Leitungswasser | ad 110 1 |
Der pH-Wert wird mit 120 cnr 10n-Natronlauge auf 7*20 eingestellt.
Man sterilisiert das Medium durch 40-minütiges Durchleiten von Dampf von 122°C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen
der Bouillon 120 1 und der pH-Wert 6,65. Man beimpft dann mit 200 cnr einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur
von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219. Die Kultur
wird bei 270C während 30 Stunden unter Bewegen und unter
Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.
Die Produktionskultur wird in einem 800 1-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:
Distillers' Solubles gekörnte Bohnen Sojaöl
Natriumchlorid
Kobaltchlorid-Hexahydrat
Leitungswasser
009833/1323
4 | kg | 1 |
12 | kg | |
8 | 1 | |
2 | kg | |
8 | g | |
ad 330 |
Nach Einstellen des pH-Werts mit -iOO crcr I0n-Natronlauge
auf 7,70 wird das Medium bei 12P°C während 40 Kinuten sterilisiert.
Nach Abkühlen beträgt das Volumen der 3ouillon 3Ö0 1. Es wird durch Zugabe von 2K) 1 einer sterilen wässri-
.- hydratisierte
gen Lösung, die ö kg/Glucose enthält, auf 400 1 aufgefüllt.
gen Lösung, die ö kg/Glucose enthält, auf 400 1 aufgefüllt.
Der pH-Wert beträgt dann 6,80.
Man beimpft mit 4o 1 der Impfkultur aus dem oben beschriebenen
170 1-Fermenter. Die Züchtung wird bei 27°C I70 Stunden
unter Bewegen mittels eines Turbinenrührers, der mit* 260 U/min betrieben wird und unter Belüftung mit steriler
Luft in einer Menge von 30 nr/Stunde durchgeführt. Der pH-Wert
des Züchtungsmediums beträgt dann 7,30 und das Volumen der Maische 305 1. Die vorhandene Menge an Daunorubicin
(13 057 R.P.) beträgt 22,5 μg//cnr5 0
200 1 der während der in Beispiel 1 beschriebenen Fermentation
erhaltenen Züchtungsmaische werden in einen mit einem Rührer und einer Heizschlange mit Dampf ausgestatteten Bottich
eingebracht. Man setzt 6 kg Oxalsäure zu und erhitzt die Masse auf 500C. Man rührt bei dieser Temperatur 1 1/2 Stunden
weiter. Nach dieser Zeitspanne wird die Suspension auf einer Filterpresse nach Zugabe von 30 kg Filterhilfe filtriert.
Der Filterkuchen wird auf dem Filter mit 100 1 Wasser gewaschen. Das Filtrat, dessen Volumen 2oO 1 beträgt, wird auf '
+150C abgekühlt, und der pH-Wert wird mit 10 ^iger Natronlauge auf 4,5 eingestellt.
BAD ORIGINAL 009833/1323
Das FilLrat wird in eine Säule, die 6 1 Amberlike IRC-50
im Säure/.yklus enthält, so geleitet, dass das Harz bett von
oben nach unten mit einer Hate von 1Jj>
1/Stunde durchströmt
wird. Die Säule wird anschliessend mit. 30 1 V/asser, das
in der gleichen Richtung wie das Filtrat und mit der gleichen
Rate durchgeleitet wird, und dann mit 30 1 Methanol mit einem Gehalt von 50 % Wasser in einer Rate von 15 l/Stunde
von unten nach oben und dann weiterhin mit der gleichen Rate und von unten nach oben mit 50 1 Methanol mit einem
Gehalt von 10 % Wasser gewaschen.
Der Abfluss und die Waschi'lüssigkeiten werden verworfen,
und die Säule wird mit einer von oben nach unten durch das Harz geleiteten«Lösung der folgenden Zusammensetzung
eluiert:
Natriumchlorid 10 g
Wasser 100 cirr
Methanol ad 1000 cm·'
Das Eluat wird ab dem Auftreten einer orange-roten Färbung
und bis zum Verschwinden dieser Färbung gesammelt. Man erhält so ein Volumen von 50 1, die den Hauptteil des Antibioticums
enthalten.
Das Eluat wird unter vermindertem Druck (2 mm Hg) bei 35°C auf ein Volumen von 10 1 eingeengt.
Das Konzentrat wird bei pH 8,5 nacheinander dreimal mit je 5 1 Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird bei
300C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) auf ein Volumen von
50 cnr eingeengt. Das Antibioticum wird in Form der Base mit
500 cnr Hexan ausgefällt, abgesaugt, gewaschen und getrocknet
BAD ORIGINAL 009833/ 1 323
Man erhält schliesslich 4,9 g rohe Base mit einem Gehalt von 64 % Daunorubicin.
6,8 g des wie in Beispiel 2 erhaltenen Produkts mit einem
Gehalt von 64 % Daunorubicin werden in 4o cnr Wasser sus-
•7t.
pendiert und durch fortschreitende Zugabe von 7 cnr InSalzsäure
gelöst. Die Lösung wird durch Filtrieren geklärt, und Daunorubicin-hydrochlorid wird durch langsame Zugabe
von 1 1 Aceton kristallisiert. Die so erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mit 50 cnr Aceton gewaschen und bei 500C
unter vermindertem Druck (5 mm Hg) 15 Stunden getrocknet. Man erhält 3*3 g kristallisiertes Hydrochlorid mit einem
Gehalt von 90 % Daunorubicin in einer Ausbeute von 68 %.
3 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen Produkts werden in
10 cnr Methanol gelöst. Dann werden 100 cnr Chloroform nach und nach zugegeben, was die Kristallisation von Daunorubicin-hydrochlorid
bewirkt. Die so erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mit 20 cnr Chloroform gewaschen und
unter vermindertem Druck (5 mm Hg) 15 Stunden bei 500C getrocknet.
Man erhält 1,Bg umkristallisiertes Hydrochlorid mit einem Gehalt von 90 % Daunorubicin. Die Ausfällung der
Kristallisationsmutterlaugen mit 200 cnr Hexan ermöglicht,
eine zweite Fraktion Daunorubicin zu erhalten. Nach Filtrieren, Waschen mit 50 cnr Hexan und Trocknen bei 500C unter
vermindertem Druck (5 mm Hg) erhält man 1 g Daunorubicin, das in den Arbeitsgang von Beispiel 3 zurückgeführt werden
kann.
009833/1323 BADOBIGiNAL
2,4 g des wie in Beispiel 4 beschrieben erhaltenen Daunoru-
■7.
bicin-hydrochlorids werden in 40 cnr Butanol suspendiert.
Nach 1/2-stündigem Rühren werden die Kristalle abfiltriert, mit 10 crrr 3utanol gev/aschen und bei 6o°C unter vermindertem Druck (0,5 mm Hg) während 8 Stunden getrocknet. Man
erhält 2,1 g reines Daunorubicin-hydrochlorid mit einer Ausbeute von 88 '·%.
Nach 1/2-stündigem Rühren werden die Kristalle abfiltriert, mit 10 crrr 3utanol gev/aschen und bei 6o°C unter vermindertem Druck (0,5 mm Hg) während 8 Stunden getrocknet. Man
erhält 2,1 g reines Daunorubicin-hydrochlorid mit einer Ausbeute von 88 '·%.
009833/1323
Claims (1)
- PatentanspruchVerfahren zur Herstellung des Daunorubicin genannten Antibioticums 1j5 057 R.P. durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass man einen neuen "Streptorcyces bifurcus, Stamm DS 23 219 / genannten Stamm verwendet. (NRRL 3539)"0 0 9 8 3 3/1323 : BAD OfUGlNAL
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