DE2407740C2

DE2407740C2 - Herstellung einer als Protein-Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz geeigneten Biomasse

Info

Publication number: DE2407740C2
Application number: DE2407740A
Authority: DE
Inventors: David Ernest Forester Faversham Kent Harrison; John Harry Harwood; Barry Neil Herbert; Stuart Joseph Sittingbourne Kent Wren
Original assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Current assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Priority date: 1973-02-20
Filing date: 1974-02-18
Publication date: 1983-10-13
Also published as: SU671738A3; CH594052A5; CS193482B2; JPS49116281A; DK135632C; JPS605279B2; IN137570B; IT1002935B; BE810941A; FR2218384A1; ES423365A1; CA1012911A; DK135632B; IE39015L; GB1450412A; IE39015B1; FR2218384B1; DE2407740A1; NL7402176A; HU170334B

Description

Es sind viele Mikroorganismen bekannt, die Kohlenwasserstoffe oder bestimmte oxidierte oder sonstige Derivate davon als Kohlenstoff- und/oder Energiequel-Ie verwenden können. Die durch die Züchtung derartiger Mikroorganismen erhältliche Biomasse ist häufig reich an Protein und wurde als mögliches Nahrungsmittel oder als Nahrungsmittelzusatz für Menschen und Tiere in Betracht gezogen. In diesem Zusammenhang sind von besonderem Interesse die Mikroorganismen, die im Stande sind, eine organische Verbindung, die ein einziges Kohlenstoffatom im Molekül enthält wie zum Beispiel Methan oder Methanol, zu verwerten.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer als Protein-Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz geeigneten Biomasse zu entwickeln.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Anspruch gekennzeichnete Verfahren.

Dabei handelt es sich bei dem Mikroorganismus NCIB 11040 um einen Methanol verwerteten Mikroorganismus, während die Mikroorganismen NCIB 11019, 11020, 11021 und 11022 kein Methanol verwerten, jedoch im Stande sind, eine durch das Wachstum des Methanol verwertenden Mikroorganismus gebildete Substanz in ihrem Stoffwechsel zu verwerten. Die einzelnen Mikroorganismen werden später näher beschrieben.

Es hat sich gezeigt, daß das Vorhandensein der kein Methanol verbrauchenden Mikroorganismen in gemischten Kulturen zusammen mit dem Methanol verbrauchenden Mikroorganismus zu einer synergistischen Wirkung zu führen scheint, die eine höhere Wachstumsgeschwindigkeit und Ausbeute an Mikroorganismen ergibt als wenn der Methanol verbrauchende Mikroorganismus allein gezüchtet wird. Bestimmte andere Vorteile können erreicht werden durch Verfahren bei denen derartige gemischte Kulturen angewandt werden, wie eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen und eine verminderte Schaumbildung, verglichen mit Verfahren bei denen einzelne Mikroorganismenstämme angewandt werden.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme wurden in Form einer Mischkultur, die als JMS 72 bezeichnet wird, aus einer natürlichen Quelle isoliert und es zeigte sich, daß sie aus dem neuen, bisher nicht beschriebenen, Methanol verbrauchenden Organismus NCIB 11040 und den vier, kein Methanol verbrauchenden Mikroorganismen besteht, von denen zwei zu der Gattung Pseudomonas (NCIB 11019 und 11022), einer zu der Gattung Acinetobacter (NICB 11020) und einer zu der

Gattung Curtobacterium (NCIB 11021) gehören.

Der Methanol verbrauchende Mikroorganismus NCIB 11040 ist ein aerobes, gramnegatives, nicht bewegliches, keine Sporen bildendes, stäbchenförmiges Bakterium.

Das flüssige Wachstümsmedium enthält günstigerweise 1 bis 200 g Methanol/l und am besten 20 bis 100 g/l.
Das Medium enthält auch eine stickstoffhaltige

ίο Verbindung, die Ammoniak, ein Ammoniumsalz wie das Sulfat oder Chlorid, ein Nitrat, zum Beispiel ein Alkalinitrat oder Harnstoff sein kann. Die Verbindung ist günstigerweise in einer Konzentration von 3 bis 50 g/l vorhanden.

Andere Elemente, die im Medium vorhanden sein können, sind Phosphor, Schwefel, Magnesium und Eisen. Die Phosphorquelle besteht zweckmäßig aus einem oder mehreren Phosphaten, zum Beispiel K₂HPO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄ oder (NH₄)₂HPO₄ oder Phosphorsäure, am besten in einer Konzentration von 3 bis 20 g/l. Die Schwefelquelle kann Schwefelsäure oder ein Sulfat wie (NH₄J₂SO₄ sein, günstigerweise in einer Konzentration von 0,5 bis 5,0 g/l. Die beiden Metalle werden angewandt in Form des einen oder anderen ihrer Salze, zum Beispiel als MgSO₄ ■ 7 H₂O in einer Konzentration von 0,2 bis 2,0 g/I und FeCl₃ · 6 H₂O in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 g/l.

Das Medium kann auch Spuren von anderen Elementen in Form geeigneter Salze enthalten. Zum Beispiel Calcium, Mangan, Zink, Kobalt, Molybdän und Bor. Beispiele für geeignete Medien sind in den Beispielen 1 und 4 angegeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise, halbkontinuierlich oder in kontinuierlichem Strom durchgeführt werden.

Wenn das Verfahren kontinuierlich durchgeführt wird, kann es entweder ansatzweise gestartet werden oder mit Hilfe des schnelleren Startverfahrens, das in der GB-PS 14 47 761 beschrieben ist. Wenn ein Gleichgewichtszustand erreicht ist, wird eine kontinuierliche Kultur erreicht, indem man den Mikroorganismus von dem Medium gewinnt, das kontinuierlich von der Wachstumskultur entfernt wird, während gleichzeitig ein konstantes Volumen der Kultur durch kontinuierliehe Zugabe von frischem Medium aufrecht erhalten wird. Während der kontinuierlichen Kultur wird die Methanolkonzentration in der überstehenden Flüssigkeit der Wachstumskultur in einer das Wachstum begrenzenden Menge aufrecht erhalten, unabhängig von der Menge Methanol in dem Medium, das zu der Kultur zugegeben wird. Diese Konzentration wird zweckmäßig gering gehalten und geht nicht über 0,01 % (VoL/Vol.) hinaus.

Die Kultivierung kann in einem geeigneten Fermentationsgefäß erfolgen, zum Beispiel in einem mit Prallflächen versehenen Fermentationsgefäß in dem gerührt werden kann oder in einem Fermentationsturm mit Fritten, das entweder von innen gekühlt oder mit einer äußeren Umlaufkühlschleife versehen ist. Die Belüftung der Kultur kann mit Hilfe von Luft, Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherter Luft durchgeführt werden.

Die Temperatur der Kultur wird zwischen 30 und 50°C, zweckmäßig bei 38 bis 45⁰C gehalten. Der pH-Wert wird auf 6,0 bis 8,0, am besten 6,4 bis 7,4 eingestellt durch entsprechende Zugabe von Alkali, zum Beispiel NaOH, KOH, NH₄OH und/oder einer Säure wie H₂SO₄ oder H₃PO₄.

Die Zellen des Mikroorganismus können von dem Wachstunumedium nach irgendeinem üblicherweise angewandten Standardverfahren gewonnen werden, zum Beispiel durch Ausflockung, Sedimentation und/oder Ausfällung und anschließendes Zentrifugieren und/oder Filtrieren. Die Biomasse wird dann getrocknet, zum Beispiel durch Gefrier- oder Sprühtrocknen und kann in dieser Form als Protein-Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz für Menschen und Tiere verwendet werden.

Isolierung der gemischten Kultur JMS 72:
Das bei diesem Verfahren angewandte Wachstumsmedium wird als DCR2 bezeichnet und besitzt die folgende Zusammensetzung:

Methanol	5-50 g/l
Na₂HPO₄	3,0 g/I
KH₂PO₄	3,0 g/i
(NH₄)₂SO4	4,5-9,0 g/l
Na-citrat	0,125 g/I
MgSO₄ · 7 H₂O	0,50 g/l
FeCl₃ · 6 H₂O	0,167 g/l
CaCl₂ ■ H₂O	0,66 mg/1
ZnSO₄ · 7 H₂O	0,18 mg/1
CuSO₄ · 7 H₂O	0,16 mg/1
MnSO₄ · 4 H₂O	0,15 mg/1
CoCI₂ · 6 H₂O	0,18 mg/1
H₃BO₃	0,10 mg/1
Na₂MoO₄ · 2 H₂O	0,30 mg/I
Wasser	auf 1 1

Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zugabe einer entsprechenden alkalischen Substanz wie Natriumhydroxid auf 6,8 eingestellt.

Ein Fermentationsgefäß im Labormaßstab mit einem Volumen von 2,4 1, enthaltend DCR2 Medium bei 42°C und einem pH-Wert von 6,8, wurde mit 300 bis 1000 UpM gerührt und Luft mit einer Geschwindigkeit von 21 pro min durch eine Fritte eingeleitet. Das Fermentationsgefäß wurde mit ICOg Ausgangsmaterial beimpft und Methanol in einer Konzentration von 0,5% Vol/Vol zugegeben. Wenn eine zunehmende Trübung der Kultur beobachtet wurde, wurde weiteres Methanol (0,5 Vol.-°/o) zugegeben. Bei einer weiteren Zunahme der Trübung wurde in das Fermentationsgefäß kontinuierlich DCR2 Medium, enthaltend 1 Vol.-% Methanol, mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,08 h-' eingeleitet. Wenn Gleichgewichtsbedingungen erreicht waren, wie aus einem konstanten Wert für die optische Dichte der Kultur hervorgeht, wurde die Verdünnungsgeschwindigkeit nach und nach auf 0,2 h~' erhöht. Nach diesem Verfahren wurde die als JMS 72 bezeichnete Kultur aus dem Auslauf einer Abwasserleitung in Sittingbourne, England, isoliert.

Abtrennung und Charakterisierung der gemischten Kultur JMS 72:

l-cm³-Proben der entsprechend nach dem oben angegebenen Verfahren gewonnenen Kultur JMS 72 wurden aus dem Fermentationsgefäß entnommen, in kleine Glasflaschen gegeben und mit DCR2 Medium, enthaltend kein Methanol, auf die 10"⁶, 10~⁷ oder 10"⁸fache Konzentration wie in dem Fermentationsgefäß verdünnt. 0,1-cm³-Proben wurden aus den Flaschen entnommen und auf Agarplatten von a) DCR2-Medium und b) Lab Lemco-Medium s. Oxoid Manual, 3. Aufl. S. 222-225) aufgestrichen. Jede Platte wurde mit einem Deckglas bedeckt, auf das im Falle der DCR2-Platten eine kleine Menge Methanol gegeben wurde. Die

Platten wurden dann umgedreht und 48 h bei 42°C inkubiert. Die Untersuchung der Platten am Ende dieser Zeit ergab, daß

a) ein einzelner Mikroorganismus (als EN bezeichnet) auf den DCR2-Platten wuchs und

b) vier unterschiedliche Mikroorganismen (bezeichnet als Mu, FG, YL, GR) auf den Lab Lemco-Platten wuchsen.

Mit Hilfe einer Schleife aus Platindraht wurden einzelne Kolonien jedes Mikroorganismus auf frische Platten übertragen, die das geeignete Wachstumsmedium enthielten. Dort konnten sie wachsen und ergaben Reinkulturen.

Die fünf Mikroorganismen, die aus dem JMS 72 isoliert worden waren, wurden einer Reihe von Standardversuchen (1-30 in Tabelle 1) unterworfen, um zu bestimmen, zu welcher der verschiedenen Mikroorganismusarten sie gehörten. Die angewandten Versuche sind in Standardwerken beschrieben wie

a) »Manual für the Identification of Medical Bacteria«, S. T. Cowan und K. J. Steel, Cambridge University Press (1966)

b) »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe, Williams und Wilkins(1959)

c) »A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria«, V. B. D. Skerman, 2. Ausgabe, Williams und Wilkins (1967)

Für einige dieser Versuche können Alternativverfahren angewandt werden und weitere kurze Details sind im folgenden angegeben, um das in diesen Fällen tatsächlich angewandte Versuchsverfahren zu zeigen.

9.. = OxidaseTest - Kovacs, 1956;

13. = Wachstum auf KCN-Brühe - modifiziert nach

Moller, 1954; Rogers und Taylor 1961;

18. = Lyjin-decarboxylase I Oxoid-Medien;

19. = Arginin-dihydrolase Moller 1955·

20. = Ornithin-decarboxylase J

21. = Gelatine-Hydrolyse - Kohn, 1953;

22. = Indol-Bildung - Kovacs Reagens, 1928; ⁴S 23. = Voges-Proskauer Test - Barritt, 1936;

24. = H₂S-Bildung - 3-fach Zucker-Eisen-Agar;

25. = Urease-Bildung - Oxoid Medium, Christen-

sen-Medium, 1946;

26. = Citrat-Verbrauch - Wachstum auf Simons-Ci-

trat-Schrägen, bestätigt in Koser's-Brühe; 28. = Nitrat-Reduktion - Stärke-Jod-Tüpfelprobe auf Nitrit.

Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Dabei bedeutet + eine positive Reaktion gegenüber dem Versuch und — eine negative Reaktion. Aufgrund dieser Versuche wurden vier der Mikroorganismen klassifiziert als:

MU Pseudomonassp
FG Curtobacterium
YL Pseudomonas sp
GR Acinetobacter

(NCIB 11019) (NCIB 11021) (NCIB 11022) (NClB 11020)

Der methanol-verbrauchende Mikroorganismus EN (NCIB 11040) konnte auf der Grundlage dieser Eigenschaften nicht zufriedenstellend einer der bekannten Mikroorganismenarten zugeordnet werden.

5 6

Die Reaktion der Mikroorganismen gegenüber einer Anzahl von bekannten Antibiotika wurde ebenfalls bestimmt, und die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 1

Versuch	Mikroorganismus	NCIB 11021	NCIB 11022	NCIB 11020	Methanol
		_	+/-		verbrauchend
	kein Methanol verbrauchend		variabel		NCIB 11040
		Stäbchen	Stäbchen	Stäbchen
1. Gram	NCIB 11019			und Kokken
Färbung	_	-	-	-	Stäbchen
2. Form		flach	gelb	grau
	Stäbchen	graublaß gelb			-
3. Sporen		auf Stärke-			-
4. Pigment	-	Agar
	-	-	-	-

					-
5. Diffusion		+	+	-
des	-	+	+	+
Pigments					-
6. Motilität					+
7. Wachstum	+	+	+	+
an der	+	-	+	+
Luft		sehr leicht	sehr leicht	sehr leicht	-
8. Katalase		+	+	+	-
9. Oxidase	+	oxidativ	oxidativ	oxidativ	sehr leicht
10. Glucose	+				+
(sauer)	sehr leicht				—
11. Hugh und	+	+	+	+
Leifson	oxidativ			nach
(O-F Test)				7 Tagen	_
12. Wachstum		_	_	_
auf McCon-	+
key Agar					_
13. Wachstum		+	+	+
auf KCN-	—
Brühe					_
14. Wachstum		(Nährstoff-	(Nährstoff-	(Nährstoff-
auf Nähr-	+	Agar)	Agar)	Agar)
stoff-Agar					(DCR2/0,5%
15. Temperatur					Methanol)
Abhängig	(Nährstoff-	+	+	+
keit des	Agar)	T	+	+
Wachstums		-	-	-	+
42°C			_		+
37°C	+				-
5°C	+				_
16. Wachstum	-	+	-	—
auf Me	_
thylamin		-	-	-	-
17. Haemolyse
(Blutagar)	-	+	-	-	_
18. Lysin-de-
carboxylase	-	+	-	leicht	_
19. Arginin-				+
dihydrolase	-				_
20. Ornithin-
decarboxy-	-
lase

I

7

Fortsetzung

24 07 740

kein Methanol verbrauchend

NCIB 11021 NClB

-

Mikroorganismus

11022

NCIB 11021

8

NCIB 11022

Methanol

Versuch Mikroorganismus

variabel +

S

verbrauchend

NCIB 11019

- -

S

NCIB 11040

21. Gelatine- leicht

-

S

_

hydrolyse +

+ +

S

22. Indol-

-

S

NCIB 11020

S

-

Bildung

+ +

S

_

S

23. Voges-

entfärbt +

S

kein

Proskauer

S

-

S

Wachstum

24. H₂S-BiI-

+

-

S

kein

dung

S

-

S

Wachstum

25. Urease-

S

sehr leicht

I Bildung

S

entfärbt

R

+

I 26. Citrat +

R

S

-

Verbrauch

S

nicht

S

27. Stärke

R

untersucht

S

kein

hydrolyse

R

-

S

Wachstum

28. Nitrat- +

S

kein

reduktion

S

-

S

Wachstum

29. Wachstum +

S

+

auf Glycerin

S

+

S

(sauer)

30. Wachstum

sehr leicht

-

auf Xylose

+

(sauer)

Tabelle 2

kein Methanol verbrauchend

-

Antibiotikum

NCIB 11019

Methanol

S

verbrauchend

S

NCIB 11040

Chloramphenicol

R

S

Erythromycin

R

S

Sulphafurazol

R

S

Novobiocin

R

S

Oleandomycin

S

R

Penicillin G

sehr S

R

I Streptomycin

R

S

Tetracyclin

R

sehr S

Cephaloridin

R

Kanamycin

R

S

Sulphamethoxazol/Trimethoprim

S

Ampilillin

R

Nalidixinsäure

S

Lincomycin

S

R

Furazolidon

R

S

Nitrofurantoin

S

Methicillin

S

R

Neomycin

R

Oxytetracyclin

S

Fusidinsäure

R

Fortsetzung

ίο

Antibiotikum

Mikroorganismus

kein Methanol	verbrauchend	NClB 11022	Methanol
		R	verbrauchend
NCIB 11019	NCIB 11021	sehr S	NCIB 11040
R	S	S	R
R	sehr S	S	S
R	S	S	S
sehr S	S	R
S	S	S

Cloxacillin

Colistin-methansulfonat

Polymyxin

Carbenicillin

Gentamicin

S = empfindlich.
R = resistent.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Versuche unter Verwendung des Methanol verbrauchenden Mikroorganismus NCIB 11040 aus JMS 72.

25

a) Die Vorrichtung bestand aus einem H-förmigen Rohr, das durch eine Dialysemembran, die sich in dem horizontalen Teil des Rohres befand, in zwei Teile geteilt war. Jeder Teil des Rohres wurde mit 25 cm³ DCR2 Medium und 0,2% Methanol gefüllt. In drei getrennten Versuchen wurde ein Teil des Rohres beimpft mit

(i) Organismus NCIB 11040, (ii) Organismus NCIB 11040 und (iii) kein Organismus
und der andere Teil mit

(i) kein Organismus, (ii) und (iii) ein Gemisch der kein Methanol verbrauchenden Organismen NCIB 11019,11020,11021 und 11022.
Bei jedem Versuch wurde die Vorrichtung bei 42°C auf einem Schütteltisch inkubiert Die für die optische Dichte (OD) bei jedem Versuch erhaltenen Werte sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

(i) Organismus
NCIB 11040
OD = 1,7

(ii) Organismus
NCIB 11040

OD = 2,05
(iii) kein Organismus

OD = 0,0

kein Organismus

OD = 0,0

Gemisch der Organismen
NCIB 11019, 11020,11021
und 11022
OD = 0,55

Gemisch der Organismen
NCIB 11019, 11020, 11021
und 11022
OD = 0,06

30

b)

35

40

45

55

60

Mikroorganismuswachstum erzielt wurde, wenn NCIB 11040 in Berührung mit dem Gemisch der kein Methanol verbrauchenden Mikroorganismen MU, FG, YL, GR gezüchtet wurde. Die Ergebnisse zeigen auch, daß eine Substanz, die durch den Organismus NCIB 11040 gebildet wird, durch die Trennmembran hindurch diffundieren kann und von den Organismen NCIB 11019,11021,11022 und 11020 verwertet wird.

(i) Der reine Methanol verbrauchende Mikroorganismus NCIB 11040 wurde in einem Schüttelkolben, enthaltend 500 cm³ DCR2 Medium und 0,1 Vol-°/o mit C¹⁴ markiertes Methanol, gezüchtet Der Kolben wurde dann auf einem Rotationsschüttler mit einem Bahnradius von 2,5 cm bei 42° C mit 200 UpM geschüttelt. Etwaiges während der Kultur entstehendes Kohlendioxid wurde mit Hilfe von. Natriumhydroxidperlen absorbiert, die sich in einem Gärröhrchen, das mit dem Kolben verbunden war, befangen. Nach zwei Tagen blieb die optische Dichte der Kultur konstant (Zeichen für das Ende des Wachstums), und in der Kulturflüssigkeit konnte kein Methanol mehr nachgewiesen werden. Die Kultur wurde dann mit 10 000 UpM zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit steril filtriert

(ii) 100 cm³ dieser überstehenden Flüssigkeit wurden mit 1,0 cm³ der Kultur JMS 72 beimpft und die Kultur in einem Schüttelkolben auf ähnliche Weise wie oben beschrieben gezüchtet.

Bei jeder der oben beschriebenen Stufen (i) und (ii) wurde die Radioaktivität aufgrund des C¹⁴ notiert
A zu Beginn

in den gebildeten Zellen
in der am Schluß überstehenden Flüssigkeit
in dem gebildeten CO2.

B C

Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß das stärkste Da in Stufe (ii) kein Methanol vorhanden war, muß das gesamte Mikroorganismuswachstum von den kein

Methanol verbrauchenden Mikroorganismen in dem JMS 72 herrühren. Die Ergebnisse sind in dem

folgenden Schema zusammengefaßt:

	⁺	Stufe (i)

1,0 g Methanol
		0,08 g Kohlenstoff in der überstehenden Flüssigkeit

		Stufe (ii)
	ca. 0,049 g Trocken gewicht der kein Methanol verbrau chenden Organismen


0,36 g Trockengewicht des Methanol verbrau chenden Organismus







	gesamte Biomasse = 0,409 g Trockengewicht

Aus diesen Ergebnissen geht deutlich hervor, daß das Wachstum der kein Methanol verbrauchenden Bakterien zu einer Zunahme der gesamten Biomasse führt. Der Versuch zeigt auch, daß die von dem Methanol verbrauchenden Organismus für die kein Methanol verbrauchenden Mikroorganismen zur Verfügung gestellte Substanz ein Kohlenstoffsubstrat für das Wachstum dieser Mikroorganismen ist

Beispiel 2
Kontinuierliche Kultur von JMS 72.

Ein 7-1-Fermentationsgefäß mit einem zur Verfügung stehenden Volumen von 4,2 1 wurde mit DCR2 Medium, enthaltend 4,0 g Methanol/l, beschickt und mit 100 cm³ einer Kultur von JMS 72 beimpft, die vorher einen Tag

bei 42°C inkubiert worden war. Der pH-Wert des Mediums wurde bei einer Temperatur von 42° C auf 6,8 eingestellt. Die Kultur wurde mit einer Geschwindigkeit von 1000 UpM gerührt und mit einer Geschwindigkeit von 1 l/h belüftet Die Kultur wurde ansatzweise gestartet, bis die optische Dichte der Kultur 1,5 (bei 625 nm) erreicht hatte. Die kontinuierliche Kultur wurde dann mit Verdünnungsgeschwindigkeiten im Bereich von 0,05 bis 0,66 h-' begonnen. Der Gleichgewichtszustand wurde mindestens 2 Tage bei jeder Verdünnungsgeschwindigkeit mit Ausnahme von 0,66 h-¹ aufrechterhalten und die Kultur insgesamt über 700 h gehalten. Die Ausbeutekoeffizienten (g trockene Biomasse/g Methanol) und der Proteingehalt der bei jeder Verdünnungsgeschwindigkeit erhaltenen Biomasse sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4	Ausbcutc-	rföicii'i-
Verdünnungs	koeffizient	Gehalt
geschwindigkeit	(g trockene
(H-¹)	Biomasse/
	g Methanol)
	0,31	76,25
0,065	0,40	79,37
0,162	0,43	77,50
0,232	0,49	79,37
0,319	0,46	76,88
0,364	0,47	80,60
0,426	0,45	78,75
0,545	0,507	68,12
0,589	0^37	66,88
0,638	Auswaschen
0.66

Der oben beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei der Methanol verbrauchende Organismus NCIB 11040 allein und zusammen mit dem kein Methanol verbrauchenden Organismus NCIB 11021 angewandt wurde. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Verdünnungs	Ausbeutekoeffizient	NCIB
geschwindigkeit	(g trockene Biomasse/g Methanol	11040 + 11021
	NCIB 11040	0,35
		-
0,06		-
0,10	0,29	0,35
0,12	0,29	-
0,13	-	0,35
0,16	0,30	Auswaschen
0,19	Auswaschen
0,24	-

10

15

20

Bei einem Vergleich der in Tabelle 2 und 3 angegebenen Ergebnisse kann man deutlich sehen, daß die Kombination von NCIB 11040 mit allen vier kein Methanol verbrauchenden Organismen zu einer höheren Ausbeute an Biomasse/g Methanol führt als eine reine Kultur von NCIB 11040 oder eine Kultur, enthaltend NCIB 11040 und nur einen dieser kein Methanol verbrauchenden Organismen. Die Anwendung von JMS 72 ermöglicht es auch, das Verfahren bei höheren Verdünnungsgeschwindigkeiten durchzuführen.

Der Aminosäuregehalt des JMS 72 und des NCIB 11040 sind in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Aminosäure

Gehalt % JMS 72

NCIB 11040

Asparaginsäure	9,41	9,67
Threonin	4,29	4,60
Serin	3,18	3,33

40

45 Aminosäure

Glutaminsäure

Prolin

Glycin

Alanin

Cystin φ

Methionin Isoleucin

Leucin

Tyrosin Phenylalanin

Histidin

Arginin

Gehalt %	NCIB 11040
JMS 72	10,13
9,84	2,73
3,17	5,63
5,63	7,00
6,78	6,21
5,72	0,29
0,29	1,92
1,85	5,01
4,46	7,95
7,71	3,46
2,97	3,96
3,93	6,68
7,30	2,05
1,75	5,00
4,98

Diese Werte zeigen, daß das Vorhandensein der kein Methanol verbrauchenden Mikroorganismen in dem JMS 72 den Aminosäuregehalt des Produktes nicht wesentlich beeinflußt.

Beispiel 3

Anteile der Mikroorganismen in JMS 72 während der kontinuierlichen Züchtung.

Eine kontinuierliche Kultur von JMS 72 wurde auf ähnliche Weise wie oben beschrieben durchgeführt. Während des Versuchs wurden Plattenauszählungen bei jeder Verdünnungsgeschwindigkeit durchgeführt, um die relative Größe und Dichte der Besiedelung der verschiedenen Mikroorganismen zu bestimmen. Proben der Kultur, die direkt aus dem Fermentationsgefäß entnommen wurden, wurden mit steriler Salzlösung (0,85%) verdünnt und 0,1 cm³ der XlO⁶, XlO⁷ bzw. 10⁸ Verdünnung wurde jeweils auf die Oberfläche von getrockneten doppelten Lab Lemco-Platten aufgestrichen. Die Platten wurden 48 h bei 42° C inkubiert und die unterschiedlichen Kolonienarten ausgezählt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

Verdünnungsgeschwindig-
keit (IT¹)

Anzahl der Kolonien

NCIB 11021 NCiB 11019

NCIB 11022 NCIB 1IO40

%NCIB 11040 in der gesamten Kultur

0,065	16,7	21	28
0,113	5	20	0
0,162	3,3	23	29
0,196	10	11	20
0,232	6	12	19
0,319	2	2	1
0,364	0	9	7
0,447	2	4	16
0,478	0	4	2
0,545	0	0	0
0.589	1	2	2

26

11

12

738
780
1442
320
453
558
198
350
375
505
112

81,8 96,9 96,3 88,6 87,8 97,2 87,6 94,1 98,2 100 94.9

Diese Ergebnisse zeigen, daß zu allen Zeiten der größte Anteil der gebildeten Biomasse aus dem Methanol verbrauchenden Organismus besteht. Der Prozentsatz der kein Methanol verbrauchenden Organismen variiert entsprechend der Verdünnungsgeschwindigkeit zwischen 0 und 18,2% der gesamten Kultur.

Beispiel 4

Kontinuierliche Kultur von JMS 72 unter Anwendung des schnellen Startverfahrens

Das bei diesem Versuch angewandte Medium besaß die folgende Zusammensetzung:

Na₂HPO₄
KH₂PO₄
(NH₄J₂SO₄
MgSO₄ · 7 H₂O
FeCl₃ · 6 H,O
CaCl₂ · H₂O
ZnSO₄ ■ 7 H₂O
CaSO₄ · 5 H₂O
MnSO₄ · 4 H.O
CoCl₃ ■ 6 H ,Ο
H₃BO₃

Na₂MoO₄ ■ 2 H₂O
Methanol
Wasser

3.0 g/l 3.0 g/l 20,0 g/l 0.75 g/l 0,167 g/l

5.3 mg/1

1.4 mg/1

1.3 mg/1 1.2 mg/1

1.4 mg/1 0,8 mg/1 2.4 mg/1

80 g/l auf 11

Tabelle 8

Zeit nach dem
Beimpfen

Verdünnungsgeschwindigkeit

lh"¹)

Trockengewicht der Zellen

(g/l)

10

20-190
190-240
240-265
265-340
340-570

Ein 7-1-Fermentationsgeiäß wurde mit 4,2 1 dieses Mediums beschickt, das dann mit einer Kultur von JMS 72 beimpft wurde. Es wurde das in der GB-PS 47 761 beschriebene Startverfahren angewandt, um Zellen in einer Konzentration, bezogen auf das Trockengewicht, von 16 g/l zu bilden. Die Methanolkonzentration wurde dann stufenweise in Anteilen von 1.0 g/l erhöht, bis eine Zellkonzentration, bezogen auf das Trockengewicht, von mehr als 25 g/l erreicht worden war. Die Bedingungen während des Versuchs

40

Temperatur 42° C

ρ H 6,6, geregeit durch Zugabe von KO H ■» >

Rührgeschwindigkeit 1500 UpM Belüftung 5 l/min

Verdünnungsgeschwindigkeit 0,07 bis 0,3 h -'

Die einzelnen Ergebnisse dieses Versuchs sind in der folgenden Tabelle 8 angegeben.

0,22	2,0
(schneller Start)
0,12	18,0
0,17	20,0
0,33	21,5
0,04	22,0
0,08	27,4
Beispiel 5

a) Eine ansatzweise Kultur von NCIB 11040 wurde in 2,4 1 DCR2 Medium, enthaltend 1,5% Methanol, in einem 3-1-Fermentationsgefäß im Labormaßstab bei 42° C gezüchtet, ohne aseptische Vorsichtsmaßnahmen nach der Beimpfung zu beachten. Wenn die Zelldichte 3,0 g/l Trockengewicht erreicht hatte, wurde eine kontinuierliche Kultur mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,05 h"¹ begonnen. Innerhalb von zwei Tagen wurde die Kultur durch einen sporentragenden Organismus infiziert und ausgewaschen.

Wenn der gleiche Versuch durchgeführt wurde unter Anwendung der gemischten Kultur JMS 72, wurde die Kultur nicht mit dem sporentragenden Organismus infiziert innerhalb von 300 Tagen kontinuierlicher Kultur. Diese Versuche zeigen, daß die gemischte Kultur eine größere Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Infektion besitzt als eine reine Kultur des Methanol verbrauchenden Organismus.

b) Kontinuierliche Kulturen des Organismus NCIB 11040 wurden in 2,4 1 DCR2 Medium, enthaltend 1% Methanol, bei einem pH-Wert von 6,8 und bei 42° C durchgeführt. Die Schaumbildung wurde während der Kulturzeit beobachtet, und sie wurde so stark, daß innerhalb von 6 Tagen dreimalige Zugabe von Antischaummitteln auf Siliconbasis erforderlich wurde.

Wenn der gleiche Versuch unter Anwendung der JMS 72 Kultur durchgeführt wurde, war keine Zugabe von Antischaummitteln innerhalb von mehr als 100 Tagen kontinuierlicher Kultur erforderlich.

308 141/52

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung einer als Protein-Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz geeigneten Biomasse durch Zü:htung eines Mikroorganismus, Gewinnung des Mikroorganismus aus dem Wachstumsmedium nach einem üblicherweise angewandten Standardverfahren und Trocknen der gewonnenen Biomasse, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Mikroorganismus NCIB 11040 zusammen mit NCIB 11019, NCIB 11020, NCIB 11021 und/oder NCIB 11022 einsetzt