DE2042571C3 - Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus einer bakteriellen Biomasse - Google Patents

Description

Ein spezielles Problem bei der Verwendung von Mikroorganismenzellen als Nahrungsmittel besieht in der Extraktion der Proteine aus den Zellen. Das Aufschließen von Zellen durch physikalische Methoden, wie es zur Freilegung von aktiven Enzymen angewandt wird, ist für industrielle Zwecke nicht geeignet. Enzymatische Methoden sind im allgemeinen unökonomisch und führen häufig zu abgebauten Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht und niedriger Gesamtausbeute. Vorgeschlagene chemische Extraktionsverfahren erfordern schwierige Behandlungen und hohe Konzentrationen an Extraktionsmitteln, welche wiederum leicht zu einem abgebauten Produkt mit niedrigem Nährwert führen.

Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Gewinnung von Proteinen aus Mikroorganismen besteht in der Auswahl geeigneter Mikroorganismen. Neben der Beachtung der Substratverwendung, Hauptwachstumsraten und Durchführbarkeit von kontinuierlichen Kulturen, hat das auf Hefen gerichtete Interesse zum Aufbau von Industrien geführt, die große Mengen von Hefeproteinmaterial zur Anreicherung von Futtermitteln herstellen. Zur Gewinnung von Proteinen für den menschlichen Verbrauch werden offenbar grampositive Bakterien vorgezogen, weil sie frei von Endotoxinen sind. Unbeschadet dieser Überlegungen führt die Isolierung von essbaren Proteinen aus Mikroorganismen zu Problemen bei der Isolierung von unerwünschten Zellenbestandteilen, speziell der Purinbasen und wachstumshindernden Faktoren.

Aus der DT-PS 9 73 635 ist ein Verfahren zum Aufschluß schwer autolysierbarer Mikroorganismen, insbesondere von Pilzmycel bekannt, bei dem eine Cytolyse der aufzuschließenden Mikroorganismen durch Zusatz von artfremden Organismen wie Torulahefe oder Bactsubtilis erfolgt. Nach Beispiel 1 dauert der Aufschluß 48 Stunden.

Ziel der Erfindung ist demgegenüber ein Verfahren zur Isolierung von Bakterienproteinen, welches auf einfache Weise in äußerst kurzer Zeit durchführbar ist

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Biomasse einer kurzen Alkalibehandlung bei einer Alkalikonzentration von 0,1 η bis 2,0 η unterworfen wird, wobei die Behandlungsdauer mit Alkali wenige Minuten dauert und 10 Minuten nicht überschreitet, daß anschließend eine Säure, insbesondere Schwefelsäure, Salzsäure oder Phosphorsäure, zugegeben wird, um eine Konzentration an freier Säure von 0,1 η bis 2,0 η zu erhalten, daß die Säurebedingungen lange genug aufrechterhalten werden, bis ein Abbau und eine Auflösung unerwünschter Zellenbestandteile erreicht ist, worauf das freigelegte Zellenprotein abgeschieden wird.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dient als Ausgangsmaterial eine Gärbrühe, die durch aerobische Züchtung eines Bakteriums in einer Nährlösung, enthaltend Kohlenstoff- und Stickstoffmaterial sowie übliche Zusätze wie Mineralsalze, Vitamine, Wachstumsförderer u. dgl., erhalten ist. Die Kohlenstoffquelle kann ein Paraffin-Kohlenwasserstoff (linear oder cyclisch), ein oxygenierter Kohlenwasserstoff wie Äthanol oder ein Kohlenhydrat sein. Die Gärbrühe, enthaltend die Biomasse, hat gewöhnlich einen Zellentrockenmassengehalt von etwa 1 bis 2 Gew.-%. Dieser Gehalt kann unter bestimmten Bedingungen bis zu etwa 4% betragen. Die Masse wird vorteilhaft zunächst, beispielsweise durch Verdampfung oder Zentrifugierung, konzentriert bis zu einem Trockengehalt an Zellen von 7 bis 15%. Der Gärbrühe wird, vorzugsweise nach dem Konzentrieren, ein Alkali in einer solchen Menge zugegeben, daß eine Konzentration von 0,1 bis 2,0 η erreicht wird. Praktisch werden Konzentrationen außerhalb dieses Bereiches möglichst vermieden, da dabei kein besonderer Vorteil erreicht wird. Das Alkali, vorzugsweise Natrium- oder Kaliumhydroxid, kann in Form einer konzentrierten Lösung zugegeben werden. Andere Alkaliverbindungen, wie Ammoniak oder Erdalkalimetalloxide oder -hydroxide, können ebenfalls verwendet werden, jedoch sind Natrium- oder Kaliumhydroxid praktisch am üblichsten. Die Alkalibehandlung der Biomasse soll so durchgeführt werden, daß ein schneller Kontakt erreicht wird. Dies kann beispielsweise durch starkes Rühren erfolgen oder durch Zusammenbringen von dünnen Schichten der Gärbrühe und Alkalilösung. Durch diese Behandlung sollen die Zytoplasmasubstanzen innerhalb der Zellwände freigelegt werden. Bei homogener Verteilung der Alkaliverbindung wird dies innerhalb weniger Minuten erreicht. Eine derartige kurze Behandlung, die 10 Minuten nicht überschreiten soll, vermeidet einen Abbau des Proteins.

Unmittelbar darauf wird der Gärbrühe eine Säure zugegeben, die den Alkalieinfluß auf die Biomasse stoppt und dann zur Lösung der verschiedenen unerwünschten Stoffe in den Zellen führt, insbesondere der Purinbasen und der wachstumshindernden Faktoren. Die Säurebehandlung wird vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, etwa zwischen 50 und 100⁰C, zweckmäßig unter Rühren, durchgeführt. Die Säure

kann eine starke Säure wie Schwefelsäure, Salzsäure oder Phosphorsäure sein, die Konzentration 0,1 —2,0 η betragen. Außerhalb dieses Bereiches werden keine besonderen Vorteile erzielt Die Säurebehandlung soll so lange dauern, bis ein Abbau und eine Lösung der unerwünschten Bestandteile der Biomasse erreicht ist Sie hängt von der angewandten Behandlungstemperatur ab.

Es ist vorteilhaft, während oder nach der Säurebehandlung eine weitere Säure mit reduzierenden und/oder chelierenden Eigenschaften zuzugeben, z. B. Weinsäure, Essigsäure, Citronensäure und Ascorbinsäure. Hierdurch soll eine Oxidation der in der Biomasse vorhandenen Pigmente zu dunkel gefärbten Verbindungen vermieden werden. Die Säuren mit chelierenden Eigenschaften verhindern eine Absorption der Pigmente durch das Protein und damit eine Verfärbung der Produkte.

Die Isolierung des freigemachten Proteins kann auf übliche Weise erfolgen. Da die überstehende Flüssigkeit die gelösten unerwünschten Substanzen enthält, wird vorzugsweise zur Proteinsabscheidung die isoelektrische Fällung bei einem pH angewandt, das dem isoelektrischen Punkt des Proteins entspricht. Dieser variiert natürlich bei den verschiedenen verwendeten Bakterien, liegt aber gewöhnlich zwischen pH 3 und 5. Die isoelektrische Fällung als solche ist so allgemein bekannt, daß sie im einzelnen nicht näher beschrieben zu werden braucht Es ist jedoch zu beachten, daß die isoelektrische Fällung in Verbindung mit dem Verfahren gemäß der Erfindung zu einem Protein von besonders hoher Qualität führt, da es aus einem Medium gefällt wird, was vor der Einstellung auf den isoelektrischen Punkt eher sauer als basisch war. Falls erwünscht, kann die reduzierende und/oder chelierende organische Säure in dieser Verfahrensstufe zugegeben werden.

Das gefällte Protein kann durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Dekantierung erhalten werden. Danach kann es gewaschen und getrocknet we. den, z. B. durch Sprüh-Gefrier- oder Walzentrocknung. Das Trockenprodukt stellt ein weißes Pulver mit einem neutralen Geschmack dar. Es ist leicht assimilierbar und stellt eine ausgezeichnete Proteinquelle für menschiiche und tierische Ernährung dar.

Das Verfahren kann mit irgendeinem brauchbaren Bakterium durchgeführt werden, unabhängig vom Substrat, auf dem es wächst. Zur Bildung von Protein können nach dem Verfahren sowohl gramm-negative als auch gram-positive Bakterien verwendet werden. Das Verfahren ist aber besonders zur Behandlung von so gram-negativen Bakterienstämmen geeignet. Beispiele von Genera von Bakterien, für die das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet ist, sind Micrococcus, Pseudemonas, Alcaligenes- und Arthobacter. Selbstverständlich umfaßt die Erfindung eine allgemeine Methode zur Isolierung von Protein aus einer Bakterienmasse und nicht nur eine Methode zur Behandlung eines bestimmten Bakterienstammes.

In den folgenden Ausführvrigsbeispielen sind die Prozentangaben Gewichtsprozente.

Beispiel 1

200 ml einer 20%igen Lösung von Kaliumhydroxid werden schnell 5 Liter einer heftig gerührten Suspension von Micrococcus cerificans (ATCC 14987) Zellen, (15 enthaltend 425 g Biomasse (auf Trockenzellenbasis) zugegeben, die in einem Substrat, enthaltend C12- bis Ci8-!ineare Paraffine als Kohlenstoffquelle gebildet ist Die Zellensuspension wurde durch Zentrifugieren der nativen Gärbrühe erhalten.

Nach einer Behandlung von einigen Minuten wird die Suspension durch Zugabe von 500 ml einer 20%igen Salzsäurelösung angesäuert zu einer Säurekonzentration von 03 n. 12 g Citronensäure werden weiterhin zugegeben, dann die Suspension 3 Stunden bei 60° C gerührt

Der pH der Suspension wird auf 3,5 durch Zugabe von 20%iger Kaliumhydroxidlösung eingestellt, das gefällte Protein durch Zentrifugieren abgetrennt Die Proteinmasse wird durch Suspendieren in 5 Liter Wasser gewaschen, der pH auf 7,5 gebracht und das Protein bei pH 3,5 wieder gefällt Durch Zentrifugieren und Gefriertrocknen werden 250 g Trockenprodukt mit 12,8% Proteinstickstoff erhalten. Das Produkt ist ein weißes Pulver mit neutralem Geschmack. Es ist leicht assimilierbar und kann fur Nahrungsmittel mit verschieden hohem Proteingehalt verwendet werden.

Beispiel 2

200 ml einer 20%igen Natriumhydroxidlösung werden schnell 5 Liter einer heftig gerührten Suspension von Alcaligenes sp. (ATCC 15525) Zellen, enthaltend 350 g Biomasse (auf Basis Trockenzellen) zugegeben, die in einem Substrat gezüchtet wurde, das Äthanol als Kohlenstoffquelle enthielt Die Zellensuspension wurde durch Verdampfung der Gärbrühe erhalten und auf 50° erhitzt, wenn das Alkali zugegeben wurde.

Nach dem Rühren während 1 Minute wurde die Suspension mit 300 ml einer 40%igen Orthophosphorsäure auf eine Säurekonzentration von 0,4 η angesäuert 25 g Weinsäure wurden weiterhin zugegeben und die Suspension 1 Stunde bei 90° gehalten. Danach wurde die Suspension gekühlt und das Protein durch Einstellung auf pH 4,5 mit Natriumhydroxidlösung gefällt.

Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, durch Suspendieren in 5 Liter Wasser gewaschen, zentrifugiert und gefriergetrocknet Ausbeute: 210 g v/eißes Pulver mit neutralem Geschmack, enthaltend 12,1% Proteinstickstoff. Das leicht assimilierbare Produkt kann zu Nahrungsmitteln mit verschieden hohem Proteingehalt verwendet werden.

Beispiel 3

Die Arbeitsweise wird wie nach Beispiel 2 wiederholt mit der Ausnahme, daß keine Weinsäure zugegeben wurde. Das Trockenprodukt zeigte eine schwache Verfärbung, war aber im übrigen identisch mit dem Produkt nach Beispiel 2.

Beispiel 4

Die Arbeitsweise wie nach Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Citronensäure durch 15 g Ascorbinsäure ersetzt wurde. Das Trockenprodukt war vom Produkt nach Beispiel 1 nicht zu unterscheiden.

Während das isolierte Protein besonders geeignet für menschliche Nahrungsmittel ist, kann es auch zu Fasern versponnen oder zu neuen Nahrungsmitteln verarbeitet werden. Weiterhin kann es als Proteinkomponente bei der Herstellung von synthetischen Harzen, Klebstoffen u. dgl. dienen.

Claims (5)

1. Patentansprüche:

   !. Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus einer bakteriellen Biomasse, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomasse einer kurzen Alkalibehandlung bei einer Alkalikonzentration von 0,1 η bis 2,0 η unterworfen wird, wobei die Behandlungsdauer mit Alkali wenige Minuten dauert und 10 Minuten nicht überschreitet, daß anschließend eine Säure, insbesondere Schwefelsäure, Salzsäure oder Phosphorsäure, zugegeben wird, um eine Konzentration an freier Säure von 0,1 η bis 2,0 η zu erhalten, daß die Säurebedingungen lange genug aufrechterhalten werden, bis ein Abbau und eine Auflösung unerwünschter Zellenbestandteile erreicht ist, worauf das freigelegte Zellenprotein abgeschieden wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkali Natrium- oder Kaliumhydroxid ist.
3. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurebehandlung bei einer Temperatur von 50 bis 100° erfolgt
4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Behandlung mit Alkali außerdem eine Säure mit reduzierenden und/oder chelierenden Eigenschaften zugesetzt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure mit reduzierenden und/oder chelierenden Eigenschaften Weinsäure, Essigsäure, Ascorbinsäure oder Citronensäure ist.

   35