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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Substanzen mit antibiotischen Eigenschaften. Insbesondere bezieht sie sich auf die Herstellung des neuen Antibiotikums Rifomycin und seiner Komponenten, A, B, C, D, E.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass man einen neuen Streptomyceten-Stamm (Streptomyces mediterraneus - A TCC Nr. 13685) bzw. seine Varianten oder Mutanten in einem üblichen wasserigen Nährmedium bei pH-Werten zwischen 4 und 8 und bei Temperaturen zwischen 25 und 370C 24-120 Stunden züchtet, das gebildete Rifomycin aus dem Nährboden nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in seine Bestandteile A, B, C, D und E trennt.
Der Stamm Streptomyces mediterraneus wurde aus einer Erdprobe isoliert, die nahe bei St. Raphael (Frankreich) gesammelt worden war und die folgenden Eigenschaften zeigte, die auf verschiedenen Medien in Schrägnährboden-Kulturen bis zu 20 Tagen bei 28 C beobachtet worden waren. Die Farbbestimmungen wurden dem Farb-Diktionär von Maerz und Paul (McGraw Hill 1950) durchgeführt.
Hafermehl-Agar : Gutes Wachstum, Kultur mit glatter Oberfläche. Vegetatives Mycel hyalin bis gelblich mit rosa Rückseite. Weissliches Luftmycel mit rosa Stich. Spuren von gelblichem löslichem Pigment.
Hefeextrakt-Glukose-Agar : Ausgedehntes Wachstum, Kolonien gelblich bis rosa mit rauher Oberfläche.
Spärliche Luftmycel. Keine Pigmentierung der Medien.
Emerson-Glukose-Agar : Ausgedehntes Wachstum, Kolonien gelblich bis blassorange mit rauher Oberfläche. Luftmycel wird gegen rosa verfärbt (2/B/8). Hell bernsteinfarbiges lösliches Pigment.
Hafermehl-Misch-Agar : *) Gutes Wachstum, Kolonien glatt, gelblich mit leicht orange Stich, Luftmycel weisslich bis rosa. Bernsteinfarbiges lösliches Pigment.
Benett's-Agar : Gutes Wachstum, Kolonien gelblich, das sich in orangegelb umwandelt, Luftmycel wird rosastichig. Leicht bernsteinfarbiges Pigment.
Penassay-Agar (Difco) : Schlechtes Wachstum.
Hefeextrakt-Melasse-Agar : * *) Ausgedehnte, rauhe Kolonien, farblos bis gelb. Weisses Luftmycel.
Tief bernsteinfarbiges lösliches Pigment (12/H/10).
Czapek Dox-Sukrose-Agar : Schlechtes Wachstum, Kolonien dünn und farblos bis licht melonenfarbig (11/A/8). Spuren von rosa-weissem Luftmycel. Kein lösliches Pigment.
Kartoffel-Agar : Schlechtes Wachstum, Kolonien dünn und farblos. Spuren von weisslichem Luftmycel.
Kein lösliches Pigment.
Kartoffel-Unterlage : Schlecht entwickeltes Hyalin, Farbe der Unterlage nicht verändert.
Glukose-Asparagin-Agar : Gutes Wachstum mit glatter Oberfläche. Dünnes vegetatives Mycel von hell *) Hafermehl-Misch-Agar enthielt zusätzlich zu Hafermehl (20 g Filtrat gekochter Haferflocken) 1 Enzy- matisches Kaseinhydrolysat 5 g ; Rindfleischextrakt 3 g ; Sukrose 10 g ; Agar 40 g in 1000 ml destilliertem Wasser. pH-Wert eingestellt auf 6,9.
* *) Hefeextrakt-Melasse-Agar enthielt : Glyzerin 7, 5g ; Melasse 7,5 g : Hefeextrakt 5 g ; NaCl 4 g ; AgarAgar 30 g ; destilliertes Wasser 1000 ml. pH-Wert eingestellt auf 6,0.
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:säuren und Gemische hievon. Peptide und Proteine und ihre Hydrolysate wie Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Getreideweichflüssigkeit, lösliche Anteile von Fisch, wässerige Fraktionen von Saatkörnern, lösliche Anteile aus der Brennerei usw. Die Gärung kann 24 - 120 Stunden durchgeftlhrt werden. Das Anfangs-PH, welches üblicherweise auf etwa 7 - 8 eingestellt wird, sinkt im Laufe der Gärung auf 5 - 7. Die besten Ergebnisse werden gewöhnlich nach einer Gärzeit von 48 bis 72 Stunden erhalten. Nach dieser Zeit wird eine ausgezeichnete Ausbeute an dem Antibiotikum erhalten. Nach Vervoll-
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:: rat wird rasch auf ein saures pH eingestellt, um die beste Beständigkeit der antibiotischen Substanz sicherzustellen.
Der Aktivanteil wird mit wasserunlöslichen Lösungsmitteln wie Butanol, Äthyl-, Propyl-, Butyl- oder Amylazetat, Chloroform, extrahiert. Das Volumsverhältnis zwischen dem Medium und dem Lösungsmittel kann in Abhängigkeit von der Art des letzteren schwanken ; üblicherweise wird ein Verhältnis von
2 : 1 bis 10 : 1 angewendet.
Ein Teil der antibiotischen Substanz ist im sauren Medium unlöslich und kann aus dem Medium direkt gewonnen werden, u. zw. durch Filtration, wenn dies gewünscht wird. In jedem Fall muss das Filtrat mit dem organischen Lösungsmittel extrahiert werden, um den Hauptanteil der antibiotisch aktiven Substanzen zu gewinnen. Der unlösliche Anteil kann in dem gleichen Lösungsmittel gelöst und mit dem organischen Extrakt aus der Extraktion des Filtrats vereinigt werden. Nach der Extraktion zeigt das verbleibende wässerige Medium immer noch mikro biologische Aktivität ; diese Wirkstoffe können mit den üblichen organischen Lösungsmitteln nicht extrahiert werden. Sie können jedoch auf Aktivkohle adsorbiert werden, wenn das pH schwachsauer ist, und können durch Auswaschen mit wasserlöslichen Alkoholen wie Methanol oder Äthanol gewonnen werden.
Auch das Mycel hält etwas mikrobiologisch aktive Substanzen zurück. Diese können aus dem Mycel durch die oben erwähnten Lösungsmittel oder einfach durch mehrmaliges Waschen mit Wasser gewonnen werden. Aus der angesäuerten wässerigen Lösung werden die antibiotisch aktiven Substanzen in die oben genannten Lösungsmittel übergeführt.
Das Lösungsmittel wird im Vakuum im Stickstoffstrom bei einer Temperatur unter 30 C bis auf ein kleines Volumen abdestilliert. Durch Zugabe von Petroläther oder andern Kohlenwasserstoffgemischen wird eine braune Substanz ausgeschieden, welche eine hohe Aktivität gegen grampositive und Mycobakterien zeigt. Dieses Rohprodukt ist ein amorphes Pulver von hell- bis dunkelbrauner Farbe, welches manchmal einen grünlichen Stich hat. Es besteht aus einer Mischung von Substanzen mit antibiotische Wirksamkeit.
Eine Chromatographie auf Whatman Papier Nr. l unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, enthaltend 3O/ NH Cl und 1% Ascorbinsäure, entwickelt auf einer Agar-Platte, die mit Sarcina lutea beimpft war, zeigt mindestens 5 Hemmungszonen, welche mit den Buchstaben A - E mit steigender Grössenordnung des Rf-Wertes, beginnend vom Punkt der Aufbringung, bezeichnet wurden. Die Flecken C und D sind gewöhnlich grösser als die andern. Die Existenz anderer Fraktionen kann nicht ausgeschlossen werden. Fig. l zeigt ein wie vorstehend beschrieben erhaltenes Chromatogramm.
Statt des Ausfällens des antibiotisch wirksamen Gemisches aus dem Extraktionslösungsmittel kann
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den. Die Einstellung des PH erlaubt eine annähernde Trennung der verschiedenen Fraktionen, welche das gesamte Rohpulver bilden. Bei PH 7, 0 - 7, 5 wird Rifomycin B von ausgeprägt saurer Natur selektiv extrahiert. Die andern Fraktionen werden bei höherem pH extrahiert.
Wegen der geringen Stabilität der Antibiotika in neutralem und alkalischem Medium ist es erforderlich, Pufferlösungen zu verwenden, die z. B. 0, 5-3% Ascorbinsäure enthalten. Das Volumsverhältnis zwischen dem Lösungsmittel und der alkalischen Pufferlösung schwankt weit mit dem benützten Lösungsmittel und dem pH-Wert. Aus einer Lösung in Äthylazetat, welche 1 der aktiven Substanzen enthält, werden drei Extraktionen mit 1/10 des Volumens der Pufferlösung bei PH 7, 0 - 7, 5 vorgenommen, um die Fraktion B in die wässerige Phase zu übertragen, und drei Extraktionen mit 1/5 des Volumens der Pufferlösung bei PH 10, 0 - 10, 5 mit le Ascorbinsäure sind erforderlich, um die andem Komponenten in die wässerige Phase zu bringen.
Aus der wässerigen Phase werden die Antibiotika in halbreinem Zustand durch Ansäuern und Extraktion mit einem Lösungsmittel wie Äthylazetat oder Chloroform, Verdampfen des Lösungsmittels und Ausfällen mit Petroläther erhalten. Die Antibiotika können aus der wässerigen Phase auch durch Ansäuern ausgefällt und gewonnen werden.
Die Reinigung des Rohgemisches kann chromatographisch auf verschiedenen Adsorbentienwiez. B.
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Die Salze folgender organischer Basen sind ebenfalls hergestellt worden : Dibenzylamin, Chinin, 1 - p- -Chlorobenzyl-2-pyrroUdylmethylbenzimidazol, Dibenzyläthylendiamin, 2-Methyl-6-aminoheptan und andere. Alle diese Salze haben eine geringe Löslichkeit in Wasser und schienen für therapeutische Verwendung vielversprechend zu sein.
Rifomycin C und D : Diese Fraktionen zeigen fast identische Rf-Werte in der angegebenen chromat- schen Mischung (Rf = 0, 45-0, 55). Die Hernmungszonen sind zusammenhängend und durch eine grosse, halsförmige Verbindungsstelle verknüpft. Rifomycin C und D werden in halbreinem Zustand aus dem Rohgemisch durch Gegenstromtrennungineinem Zweiphasensystem isoliert, welches gebildet wird aus Methanol: 0,01n HCl : Benzol : Petroläther (10:5:15:5). Bei 85 Übergängen wird das Maximum an Rifomycin C zwischen der 55. und 65. Röhre und das an Rifomycin D zwischen der 35. und 45. Röhre gebildet.
Durch Extraktion des Röhreninhalts mit Benzol oder Äthylazetat oder Chloroform oder andem ähnlichen Lösungmitteln, Konzentrierung der Auszüge und Ausfällung mit Petroläther oder ändern Kohlenwasserstoffgemi- schen werden die beiden Rifomycine als amorphe Pulver in hoher Reinheit erhalten.
Rifomycin C und D erscheinen als dunkelbraune Pulver mit grünlichem Stich. Sie sind in den üblichen organischen Lösungsmitteln löslich, in Wasser praktisch unlöslich. Eine wässerige Lösung in einem Paffergemisch bei pH 8, 0-10, 0 wird durch Zugabe von Ascorbinsäure als Stabilisierungsmittel erhalten. Das UV und sichtbare Spektrum der beiden Rifomycine C und D sind gleichartig. Die Maxima bei
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zeigt das Spektrum wieder das Maximum bei 460 m u. Dies zeigt, dass Rifomycin C und D Substanzen mit reversiblen Oxydo-Reduktions-Eigenschaften sind, so wie die Chinone.
Eigenschaften von Rifomycin C :
Elementaranalyse : 61, 51% C, 6, 73% H, 4, 2l% N, 27, 55% 0 (aus der Differenz). Rifomycin C gibt positive Reaktionen mit Tollens und Fehling Reagenz, mit FeCls, Jodoform und Permanganat. Die Ninhydrinreaktion ist negativ, wird aber nach starker Säurehydrolyse positiv. Das sichtbare Spektrum in Äthyl-
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Wasser, Mineralsäuren und Bikarbonat, löslich in Natriumkarbonat, Methanol, Äthylazetat, Chloroform und Azeton, unlöslich in Äthyläther und Petroläther.
Eigenschaften von Rifomycin D : Elementaranalyse : 62, 17% C, 6, 58% H, 3, 53% N, 27. 72* 0 (aus der Differenz). Rifomycin D gibt positive Reaktionen mit Tollens und Fehling Reagenz, mit FeCl,, Jodoform und Permanganat. Die Ninhy-
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istChloroform und Azeton.
Rifomycin E : Diese Fraktion zeigt einen Rf-Wert von etwa 0, 7 bis 0, 8 an chromatographischen Streifen. Sie wird aus dem Rohgemisch durch Gegenstromtrennung mit der Mischung Methanol : 0, Oln HC1 : Benzol : Petroläther (10:5:15:5) isoliert.Bei 160 Übergängen wird die Hauptmenge des Rifomycin E in den ersten 10 Röhren abgetrennt durch Extraktion der sauren wässerigen Phase mit Äthylazetat, Konzentrierung des Extrakts und Ausfällung mit Petroläther. Die Fraktion E ist ein lichtbraunes, amorphes Pulver. Das
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Wie bereits oben festgestellt, zeigen Rifomycin und seine Komponenten einen hohen Grad von Aktivität gegen grampositive Bakterien und Mykobakterien. Biologische Teste wurden getrennt ausgeführt mit Rifomycin B und mit einem Gemisch der Rifomycine A, C, D und E, welche im folgenden als "RifomycinKomplex" bezeichnet werden.
Die folgende Tabelle veranschaulicht die antibakterielle Wirkung des Rifomycins B und der Rifomy- cin-Komplexe in vitro auf eine grosse Zahl von grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen. Die Zahlen geben die minimalen Hemmungskonzentrationen in y/ml an.
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<tb>
<tb>
Stamm <SEP> Rifomycin <SEP> Rifomycin
<tb> E <SEP> Komplex
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 13301 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 9144 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> val. <SEP> albus <SEP> ATCC <SEP> 12228 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> gray <SEP> Weinstein <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> S. <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 10541 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> S. <SEP> haemolyticus <SEP> C <SEP> 203 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> 0, <SEP> 0025 <SEP>
<tb> S.
<SEP> mastitidis <SEP> ATCC <SEP> 7077 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> S. <SEP> bovis <SEP> ATCC <SEP> 9809 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> ATCC <SEP> 8176 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Neisseria <SEP> gonorrhoes <SEP> ATCC <SEP> 9826 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> XXXVII <SEP> L <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> ATCC <SEP> 9341 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> subflava <SEP> ATCC <SEP> 7468 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> M. <SEP> flavus <SEP> ATCC <SEP> 10240. <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 2. <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> B. <SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 10876 <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> B.
<SEP> anthracis <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Clostridium <SEP> perfringens <SEP> ATCC <SEP> 3226 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> ATCC <SEP> 10031 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 20
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> capsulata <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 100
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> McLood <SEP> 10536 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 50
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> Gottlieb <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 75
<tb> Pseudomonas <SEP> fluorescens <SEP> ATCC <SEP> 11251 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 25
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> X <SEP> 19 <SEP> H <SEP> ATCC <SEP> 881 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 50
<tb> Proteus <SEP> morganii <SEP> ATCC <SEP> 9237 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 50
<tb> Proteus <SEP> rettgeri <SEP> ATCC <SEP> 9919 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 50
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> ATCC <SEP> 9290 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 75
<tb> Shigella
<SEP> dysenteriae <SEP> ATCC <SEP> 9585 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 20
<tb> Salmonella <SEP> typhi <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 150
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> ATCC <SEP> 9150 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 150
<tb> Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> ATCC <SEP> 9149 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 150
<tb> Brucella <SEP> abortus <SEP> 150 <SEP> 10
<tb> Brucella <SEP> melitensis <SEP> ATCC <SEP> 4309 <SEP> 75 <SEP> 10
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> ATCC <SEP> 87 <SEP> NIH <SEP> 100 <SEP> 10
<tb>
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<tb>
<tb> Stamm <SEP> Rifomycin <SEP> Rifomycin <SEP>
<tb> E <SEP> Komplex
<tb> Mycobacterium <SEP> ranae <SEP> 50 <SEP> 10
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> ATCC <SEP> 10142 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0,5
<tb> M <SEP> ycobacterium <SEP> minetti <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Mycobacterium <SEP> app.
<SEP> 607 <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> i <SEP> Nocardia <SEP> asteröides <SEP> > <SEP> 200 <SEP> 50
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> var. <SEP> homini <SEP> : <SEP> 37RvATCC9360 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 2
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ATCC <SEP> 10231 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> > <SEP> 200
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> ATCC <SEP> 8757 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> > <SEP> 200
<tb>
Aus den vorstehenden Zahlen kann ersehen werden, dass die Antibiotika besonders auf grampositive Mikroorganismen aktiv sind, wobei ein gewisser Grad an Aktivität auf die Bazillen besteht.
Die akute Toxizität von Rifomycin B ist untersucht und als ausserordentlich gering befunden worden, besonders wenn man in Betracht zieht, dass das Antibiotikum einen hohen Aktivitätsgrad besitzt. Die folgende Tabelle gibt die erhaltenen Resultate wieder :
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<tb>
<tb> Tier <SEP> : <SEP> Weg <SEP> : <SEP> LD <SEP> in <SEP> mg/kg <SEP> : <SEP>
<tb> Maus <SEP> intravenös <SEP> 2040
<tb> intraperitoneal <SEP> > <SEP> 2000
<tb> subkutan <SEP> > <SEP> 2000
<tb> Ratte <SEP> intravenös <SEP> 1680
<tb> intraperitoneal <SEP> > <SEP> 2000
<tb> subkutan <SEP> > <SEP> 2000
<tb>
Die akute Toxizität des Rifomycin-Komplexes, obwohl nicht ganz so günstig, ist immer noch sehr gering und verbürgt einen weiten Sicherheitsbereich. Dieintravenöse Anwendung bei Mäusen ergab eine LD von 262 mg/kg.
Die Aktivität des Rifomycin-Komplexes und des Rifomycin B in vivo wurde mit sehr befriedigenden Ergebnissen an Mäusen getestet, welchen starke Injektionen verschiedener grampositiver pathogener Mikroorganismen verabreicht worden waren. Alle die hier angeführten Injektionen wurden intraperitoneal durchgeführt mit der 10 - 100fachen letalen Dosis von 15 bis 20 Stunden alten Kulturen der pathogenen Mikroorganismen. Während die Kontrolltiere 2 - 3 Tage nach der Infektion starben, betrug die Überle- benszeit der behandelten Tiere stets 12 Tage nach Beginn der Versuche.
Einige der erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst :
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In-vivo-Aktivität des Rifomycin-Komplexes und des Rifomycin B bei subkutaner Verabreichung während sieben Tagen.
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<tb>
<tb>
Infektion <SEP> Antibioti-Tägliche <SEP> Dosis <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Verabrei-Überleben <SEP> nach
<tb> kum <SEP> mg/kg <SEP> chungen <SEP> pro <SEP> Tag <SEP> 12 <SEP> Tagen
<tb> Streptococcus <SEP> Rifomycin-100 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> haemolyticus <SEP> 6203 <SEP> Komplex
<tb> 75 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> 50 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> 30 <SEP> 2 <SEP> 19/20 <SEP> 95%
<tb> 20 <SEP> 2 <SEP> 13/20 <SEP> 65%
<tb> 10 <SEP> 2 <SEP> 4/20 <SEP> 20%
<tb> Staphylococcus <SEP> Rifom <SEP> yein <SEP> - <SEP> 100 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> aureus <SEP> Weinstein <SEP> Komplex
<tb> 75 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> 30 <SEP> 2 <SEP> 19/20 <SEP> 95% <SEP>
<tb> 20 <SEP> 2 <SEP> 9/20 <SEP> 45%
<tb> 10 <SEP> 2 <SEP> 2/20 <SEP> 10%
<tb> Streptococcus <SEP> Rifomycin <SEP> 400 <SEP> 4 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> haemolyticus <SEP> E <SEP> 203
<SEP> B
<tb> 300 <SEP> 4 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> 300 <SEP> 4 <SEP> 16/20 <SEP> 80%
<tb> 200 <SEP> 4 <SEP> 6/20 <SEP> 80%
<tb> 400 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> 300 <SEP> 2'19/20 <SEP> 95%
<tb> 300 <SEP> 2 <SEP> 13/20 <SEP> 65%
<tb> 200 <SEP> 2 <SEP> 4/20 <SEP> 20%
<tb> Diplococcus <SEP> Rifomycin <SEP> 350 <SEP> 4 <SEP> 10/20 <SEP> 50%
<tb> pneumoniae <SEP> XXXVII <SEP> L <SEP> B
<tb> 350. <SEP> 2 <SEP> 4/20 <SEP> 20%
<tb> Dibenzyl- <SEP> 350 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100%
<tb> äthylen <SEP> - <SEP>
<tb> diamin
<tb> Salz <SEP> von
<tb> Rifomycin <SEP> B <SEP>
<tb>
Es zeigt sich, dass der Rifomycin-Komplex eine sehr starke Aktivität in der Kontrolle von Infektionen bei Mäusen durch Streptococcus und Staphylococcus und im allgemeinen gegen grampositive Bakterien aufweist.
Eine lOOge therapeutische Dosis von 50 mg/kg erscheint sehr gering für ein Antibiotikum, welches eine intravenöseLDso in der Grössenordnung von 250 bis 300 mg/kg hat. Obwohl Rifomycin B weniger aktiv ist, zeigt es im Hinblick auf seine extrem geringe Toxizität doch einen noch besseren therapeutischen Koeffizienten. Bei Menschen werden gute Blutspiegelwerte des Antibiotikums mit Tagesdosen von 500 bis 1000 mg bei intramuskulärer Anwendung erreicht.
Das Antibiotikum hat sich von ausserordentlichem Wert erwiesen bei Patienten, welche an Abszessen verschiedener Lokalisation, Mastitis, eitriger Mittelohrentzündung, litten. Die angewendete Tagesdosis
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4 tägiger Behandlung. Die oberflächliche Anwendung auf infizierte Wunden verschiedener Art unter Verwendung einer wässerigen Lösung des Antibiotikums war gleichfalls erfolgreich und führte zum raschen Rückgang von Eiterung und Sekretion im allgemeinen mit darauffolgendem raschen Hellen der Wunden.
Diese Ergebnisse wurden oft erreicht, nachdem die Behandlung mit andem Antibioticis ohne Erfolg gewesen war.
Um den Erfindungsgegenstand besser zu veranschaulichen werden nachfolgend zwei Beispiele für die Gärung von Streptomyces mediterraneus angeführt :
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der 100 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung enthielt :
EMI9.3
<tb>
<tb> Rindfleisch-Extrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 5g
<tb> Kasein-Hydrolysat <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> H20 <SEP> auf <SEP> Liter <SEP>
<tb>
Das pH wurde mit NaOH auf 7,3 eingestellt.
Die so beimpften Kolben wurden 48 Stunden bei 28 C auf einer Schüttelvorrichtung geschüttelt. Der Inhalt eines Nährkolbens wurde in einem 101 Vorgarer, enthaltend 41 des angegebenen Nährmediums, überimpft. Die Gärung wurde bei 28 C mit einer Rührrequenz von 800 upmund Belüftung von 1 Vol. / Vol. laufen gelassen. Nach 24stündigem Wachstum hatte das Mycel ein stark aufgelockertes Aussehen.
Der Wert an dichtgepackten Zellen war 3 - fl'/o. Im nächsten Stadium wurde ein Glas-Gärgeflss von 20 1 Fassungsraum, enthaltend 10 1 des folgenden Gärmediums, verwendet :
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<tb>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g
<tb> (NHSO4 <SEP> 7 <SEP> g
<tb> MgSO4. <SEP> 70 <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 3g
<tb> CaCOs <SEP> 9 <SEP> g <SEP>
<tb> CuSO. <SEP> 5HO <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> mg
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> ZnSO". <SEP> 71\0 <SEP> 50 <SEP> mg
<tb> MnSO". <SEP> 4Hp <SEP> 4 <SEP> mg
<tb> H20 <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> Liter <SEP>
<tb>
Das pH wurde mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Es wurde 30 Minuten bei 120 C sterilisiert.
Als Beimpfungsmedium wurden 10% des Inhaltes des Vorgärers verwendet.
Die Gärung wurde bei 28 C mit einer Rührfrequenz von 800 upm und einer Belüftung von 0, 8 Vol./ Vol./min durchgeführt. Silikon A wurde als Antischaummittel verwendet. Im Laufe der Gärung nahm die Brühe eine charakteristisch orangerote Farbe an.Nach 48 Stunden Wachstum wurde ein Volumen an dichtgepackten Zellen von 20 bis 25% erhalten. Das PH der Brühe betrug 5, 6-5, 4. Die höchste antibiotische Aktivität wurde nach 40-50 Stunden (300-400 y/ml des Antibiotika-Gemisches) erhalten, wenn die Brühe aufgearbeitet wurde.
Beispiel 2 : Eine Kultur von Streptomyces mediterraneus wurde in einem Schüttelkolben wie in
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Beispiel 1 hergestellt. Für die Vorkultur wurde sie vermehrt in einem 10 1 Glas-Gärgefäss mit 41 Medium enthaltend :
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<tb>
<tb> Laktose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Glukose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 7g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> MgS04. <SEP> 7H2O <SEP> 1 <SEP> g
<tb> KHO <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 20 <SEP> mg
<tb> CuSO4.5H2O <SEP> 5 <SEP> mg
<tb>
EMI10.2
- 8%.
Ein 10%igesaus :
EMI10.3
<tb>
<tb> Korneinweichflüssigkeit <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g
<tb> (NH4) <SEP> O4 <SEP> 6 <SEP> g
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g
<tb> KH2PO4 <SEP> 3g
<tb> CaC03 <SEP> 9 <SEP> g
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> CuSO. <SEP> 5H2O <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> H20 <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> Liter
<tb>
Das pH wurde mit NaOH auf 7, 0 eingestellt. Sterilisation erfolgte 30 Minuten bei 120 C. Die Dauer der Gärung war 60 Stunden bei 28 C. Das pH der Gärbrühe bei der Aufarbeitung war 5, 6-5, 8. Die schliesslich erreichte antibiotische Aktivität war 400 y/ml.