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Herstellung und Gewinnung des Antibioticuins 5278 R. P. Die Erfindung
betrifft die Herstellung und Gewinnung eines neuen Antibioticums, das im folgenden
mit 5278 R. P. bezeichnet wird.
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Das neue Produkt ist insbesondere wegen seiner ausgesprochenen Wirksamkeit
gegen Cancer von Bedeutung. Außerdem besitzt es beträchtliche antibakterielle Wirksamkeit
sowohl gegenüber grampositiven als auch gegenüber gramnegativen Keimen. Diese Eigenschaft
wird dadurch noch interessanter, daß es gegen Keime und insbesondere gegenüber Staphylokolekenstämmen
wirkt, die gegen übliche Antibiotica resistent sind.
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Dieses neue Antibioticum wird durch Züchtung eines im nachfolgenden,
vollständiger identifizierten Mikroorganismus, der dem Genus Streptomyces angehört
und mit Streptomyces 662 oder Streptomyces rufochromogenus bezeichnet ist, unter
geeigneten Bedingungen erzeugt. Der Mikroorganismus ist unter der Nummer NRRL 2816
bei Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, I11., V. St.
A., hinterlegt.
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Das Antibioticum 5278 R. P. besitzt saure Natur und wurde in Form
der freien Säure und in Form von Salzen, wie beispielsweise dem Natrium-, Kalium-
und Caleiumsalz, isoliert. Die freie Säure und das Natriumsalz, die in Nadeln kristallisieren,
braunrotgefärbt.
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Das in Form der freien Säure kristallisierte Antibioticum 5278 R.
P. ist in Pyridin, Dimethylformamirl, Aceton (etwa 0,25 g in 100 ccm bei 25° C)
und Essigsäureäthylester (etwa 0,15 g in 100 ccm bei 25°C) löslich, in Methylalkohol,
n-Butylalkohol, Chloroform, Benzol, Äther und Eisessig schwach löslich und in Wasser
und Petroläther praktisch unlöslich. Das Natriumsalz ist in Wasser stark löslich
(mehr als 10 g in 1P0 ccm bei 25° C), in Methylalkohol und Aceton schwach löslich
und in Chloroform, Äther und Benzol unlöslich. Das Calciumsalz ist in Wasser praktisch
unlöslich.
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Das Antibioticum besteht in Form der freien Säure nur aus Kohlenstoff,
Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Die Elementaranalyse ist die folgende: C=59,2
bis 59,6°%, H= 4,8 bis 5,2'Olo, O=25,0 bis 25,2%, N=10,8 bis 11,10/Q. Dio funktionelle
Analyse zeigt das Vorhandensein von C H2 - 0-Gruppen.
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O-CH3 (Zeisel) = 17,70/0.
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Das durch elektrometische Titration einer 6611/eigen Lösung in Dimethylfo@rmamid
mit Hilfe einer eingestellten Natriumhydroxydlösung bestimmte Neutraläquivalent
beträgt 505. Der pK,- Wert entspricht 6,9. Die Elementaranalyse und das Neutraläquivalent
stimmen für die Bruttoformel (C25 Heg C>8 N4)R. Berechnet ........... C=58,9"/o,
H= 5,1"/o, 0=25,1"/o, N=10,9%.
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Molekulargewicht=(510)n; 3 O-CH3=18,20/0. Das Antibioticum 5278 R.
P. in Form der freien Säure wird durch die nachfolgenden physikalischen Eigenschaften
charakterisiert: Schmelzpunkt=301 bis 303° C (Block Maquenne) Ultraviolettspektrum
(mit einer Lösung in Methanol, durchgeführte Bestimmung) Absorptionsmaximum bei
382 m[,, E' IL = 322, Absorptionsminimum bei 332 m[., E,'! = 133, Absorptionsmaximum
bei 247 m[,, El lm = 750. Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antib@ioti.-cums
5278 R. P. in Form der .Säure wurde bestimmt und ist in der Figur dargestellt, in
welcher als Abszisse einerseits die Wellenlängen, ausgedrückt in Mikron (unterer
Maßstab), und andererseits die
Wellenza.Iii in cm-1 (oberer-, Maßstab)
und als Ordinate die Transmission `if Pözeüten -abgegeben sind.
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In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption
dieses Produkts wiedergegeben.
| " - Tabelle I |
| (Das -Spektrum--wurde mit dem festen, mit Kalium- |
| _ , bromid verpreßten-Prndukt gemessen) |
| 3480 st 1554 1205m |
| 3400 st 15(J5 m 1177 sch |
| 3300 st 1467 st - _ 1155 |
| 2950 i=n 145Z m- 1100 st |
| 2870 sch 143 m 1082 st |
| 1743 st 1404 m 1076 |
| 1683 st 1380m - 1040 m |
| 1637 1348 st-. -1006 st |
| 1613 sst 1290 st 960 ssch |
| 1594 1278. 920 m |
| 1568 m 1233 st- 888 sch |
| Tabelle I (Fortsetzung) |
| 877 m 771 sch 733 sch |
| 864 m 752 m 704 m |
| 817 m. 744 684 ,sch |
| 786 sch - |
| ssch=sehr schwach, |
| sch= schwach, |
| m= mittel, |
| st= stark, |
| sst=sehr stark. |
Das Antibioticum 5278 R. P. kann durch Papierchromatographie identifiziert werden.
Es wurde mit Papier Arches Nr. 302 unter Entwicklung bei 30o C nach der absteigenden
Technik mit Hilfe verschiedener Lösungsmittel chromatographiert. Die Chromatogramme
wurden durch Bioautographie auf mit B. subtilis beimpften Nähragar-Platten ausgewertet.
Die erhaltenen R-Werte sind in der nachfolgenden Tabelle II angegeben.
| " - Tabelle II |
| Entwicklungslösungsmittel Papier Rp |
| Mit Wasser gesättigtes .Chloroform getränkt, Phosphatpuffer,
pH 4,8 0,70 |
| Mit Wasser gesättigtes Chloroform getränkt, Phosphatpuffer,
pff 7 0;40 |
| Mit Wasser gesättigtes -n-Butanol getränkt; Phosphatpuffer,
pH 7 0,65 |
| Leichte Phase des Gemisches Benzol-Essigsäure- |
| äthylester-Wasser -(75: 25-: 25 Volumina) getränkt,
Phosphatpuffer, pg 7 0,60 |
| Leichte Phase des Gemisches Benzol-Methyliso- |
| butylceton-Wasser (90-:10:25 Volumina) getränkt, Phosphatpuffer,
p$ 7 0,20 |
| Leichte Phase des Gemisches Benzol-Methyliso- - |
| butylceton-Wasser (7 :_30 : 25 Volumina) getränkt, Phosphatpuffer,
p$ 7 0,60 |
Die Chromatographien zeigen, daß das Antibioticum 5278 R. P. nur einen wirksärrien
Bestandteil enthält: Das Vorhandensein von .nur einem wirksamen Bestandteil in 'dem
Antibioticüm 5278 R. P. wird durch die Anälyse- nach der Gegenstromverteilung bestätigt.
Wenn das Produkt im Gegenstrom bei 251-C in ein-er-Apparatur 'näch Craig mit dreißig
Rohren zwischen den getrennten Phasen-' des Gemisches Btztanol-Phösphatpüffer _
vom pg 7,5 (1:1 Volumina) verteilt wird,- zeigt die' nach -der- "triälogischen Wirksamkeit
aufgetragene Verteilungskurve eine einzige Spitze.
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Diese Kurve deckt sic-h'nit der theoretisch für einen-'Verteilungskoeffizienten
:von 3,14 berechneten Kurve. ä-" : -- - -Das Antibioticum 5278 R. P. in Form der
freien Säure ist sehr stabil. ES''kohnte mehrere Jahre bei Zimmertemperatur aufbewahrt
werden, ohne daß man eine Herabsetzung der Wiiksämkeit feststellen könnte. Die wäßrige
Lösung des :"Tatriumsalzes bei einem pn-Wert zwischen 7 und- S . behält ihre Wirksamkeit
nach -einstündigem Erhitzen auf 560 C öder bei kurzdauerndem Erhitzen auf
Siedetemperatur bei.
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Die bakteriostatische.Wirksamkeit von 5278 R. P. gegenüber einer Anzahl
von Kennen wurde durch eine der üblicherweise für diesen Zweck verwendeter. Verdünnungsmethoden
bestiriihiLFür jeden Keim wurde die kleinste Konzentration-" axt Substanz bestimmt,
die jegliche sichtbare Eritwicklürig in einer geeigneten Nährbouillon verhindert.
=;Ergebnisse der verschie-. denen Bestimmungen sind-- in der nachfolgenden. Tabelle
III -zusammengestellt, in der die minimalen bakteriostatischen Konzentrationen in
y Substanz je ccm Versuchsmedium -ausgedrückt sind.
| Tabelle III |
| Bakterio- |
| - statische |
| Untersuchte Bakterienstämme Kon- |
| zentration |
| in ylccm |
| Staphylococcus aureus; Stamm 209P - |
| ATCC 6538P . . . . . . . . . . . . . . . .". . . . . 0,45 |
| Staphylococcus aureus, Stamm 133 (In- |
| stitut Pasteur) . . . . . . . . . . . . , ...... 0,7
- |
| Micrococcus citxeus - ATCC 8411. . . 71 |
| Gaffkya tetragena (Fac. Pharmacie, |
| Paris) ............................ 0,6 |
| Sarcina lutea - ATCC 9341 . . . . . . : . . 1,1 |
| St reptococcus faecalis - ATCC 9790 .. 100' |
| Streptococcusviridans (Institut Pasteur) 18,5 |
| Neisseria catarrhalis (Fac.. Pharmacie, |
| Paris) ................ ............. . 2,6 |
| Bäcillus subtilis - ATCC 6633 ....... - . 0,07 |
| Bacillus megatherium - NRRL-B-938 0,07 |
| Tabelle III (Fortsetzung) |
| Bakterio- |
| statische |
| Untersuchte . Bakterienstämme- Kon- |
| zentration |
| in y/ccm- |
| Bacillus cereus - ATCC 6630 . . . . . . . . 0,5 - |
| Mycobacterium species - ATCC 607.. 0,7 |
| Escherichia coli - ATCC 9637 ...... 0,25 |
| Shigella dysenteriae - Shiga L (In- |
| stitut Pasteur) .................... 1,3 |
| Salmonella typhimurium (Institut |
| Pasteur) .......................... 3,8 |
| Salmonella paratyphi A (Lacasse, In= |
| stitut Pasteur) .................... 0,35 |
| Salmonella schottmuelleri (Paratyphi B |
| - Fougenc, Institut Pasteur) ...... 1,7 |
| Aerobacter aerogenes - ATCC 8308 .. 4,2 |
| Proteus vulgaris (Fac. Pharmacie, |
| Paris) .........................:.. 4 |
| Klebsiella pneumoniae - ATCC 10031 0,16 |
| Serratia marcescens (A. 476, Lausanne) 0,8 |
| Pseudomonas aeruginosa (Stamm Bass, |
| Institut Pasteur) ................ 9,4 |
| Brucella bronchiseptica (CN 387 - " |
| Wellcome, Institut) . . . . . . . . . . . . . . . . 1,3 |
Diese verschiedenen Bestimmungen zeigen, daß die Wirksamkeit von 5278 R. P. sich
auf zahlreiche Bakterien erstreckt, und zwar sowohl auf diejenigen, die eine Gram-Färbung
ergeben, als auch auf solche, die eine negative Reaktion bei dieser Färbung liefern.
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Außerdem ist das Antibioticum 5278 R. P. gegenüber Staphylokokkenstämmen
wirksam, die gegenüber einem oder mehreren der nachfolgenden Antibiotica resistent
sind: Penicillin, Tetracyclin, Streptomycin, Streptotricin, Neomycin, Congocidin,
Erytromycin, Carbomycin, Spiramycin, Streptogramin, Actinomycin, Chloramphenicol,
Novobiocin.
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Die Wirksamkeit von 5278 R. P. gegen Cancer wurde im Laboratorium
nachgewiesen, wo sich das Antibioticum insbesondere gegenüber pfropfbaren Tumoren
bei der Maus als wirksam erwies: Ascitus-Tumor von Ehrlich, Sarcom 180 (feste Form),
Mamma-Adenocarcinom der Maus (Stamm R III), Sarcom mit Benzpyren u. dgl.
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Die Toxizität des Antibioticums 5278 R. P. wurde insbesondere bei
der Maus untersucht. Die, letale Dosis 50°/o (DL..) wurde durch Verabreichung
des Produkts auf oralem, subcutanem und intravenösem Weg bestimmt oral . . . . .
. . . DL... zwischen 4 und 6 mg/kg, subtucan . . : . DL",- zwischen 1 und
3 mg/kg, intravenös . . D L5o-zwischen 0,5 und 2 mg/kg. Der das Antibioticum 5278
R. P. erzeugende Organismus gehört zum Genus Streptomyces und ist mit dem Namen
Streptomyces 662 bezeichnet worden. Dieser Organismus wurde aus einer aus Portugal
entnommene. Erdprobe isoliert. Die Isolierungsmethode ist die folgende: Die Erdprobe
wird in sterilem, destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension dann auf verschiedene
Konzentration verdünnt. Ein kleines Volumen jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche
von Petrischalen .aufgebracht, die ein Agarnährmedium enthalten. Nach einer Inkubation
von einigen Tagen bei 26° C werden die Kolonien der Mikroorganismen, die man isolieren
will, auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten: Nach der Klassifizierung
von »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 6. Auflage (1949),- für den
Genus Streptomyces findet man keine Beschreibung einer Speckes, deren Kulturcharakteristika
und biochemischen Eigenschaften mit denjenigen des Streptomyces Nr.662 übereinstimmen.
Dieser Orga. nismus kann daher als eine neue Speckes betrachtet werden, die den
Namen Streptomyces rufochromogenus wegen der Eigenschaft, ein rotes Pigment auf
gewissen Züchtungsmedien zu erzeugen, erhalten hat.
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Der Stamm Streptomyces rufochromogenus tritt mit ovalen Sporen auf,
die auf ziemlich langen, gewundenen, sporentragenden Fäden liegen, die sich gewöhnlich
an ihren äußersten Enden unter Bildung einer Krümmung umbiegen oder sich sogar unter
Bildung einer oder zwei Spiralenwindungen aufrollen.. Die Gewinde sind locker, nicht
dicht. Das zur Sporulationsreife gelangte Luftmycel weist - eine weiße, schwach
cremige Farbe auf. Auf -einer gewissen Anzahl von Kulturmedien beobachtet man die
Bildung eines roten Pigments, das je nach Fall hellrot bis sehr dunkelbraunrot gefärbt
ist.
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Die Kulturcharakteristika und die biochemischen Eigenschaften des
Streptomyces rufochromogenus wurden auf Nähragar und Nährbrühen untersucht, wie
sie :üblicherweise zur -Untersuchung des Aussehens der Streptomycesstämme verwendet
werden. Die Beobachtungen sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt.
Sie betreffen 2 oder 3 Wochen alte Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht
haben. Der größte Teil der verwendeten Kulturmedien wurde nach den in »The Actinomycetes
«, S. A. W a k s m a n, S. 193 bis 197, Chronica Botanica Company, Walthäni Mass,
USA, 1950, beschriebenen Zubereitungen hergestellt. In diesen Fällen sind die Medien
durch die ihnen in- »The Actinomycetes« zugeteilten Nummern angegeben.
| Tabelle IV |
| Luftapparatur, |
| . Ent- Vegetatives Mycel enthaltend |
| Kulturmedien wicklungs- oder Rückseite die Gesamtheit Lösliches
Pigment Biochemische Eigenschaften |
| grad der Kultur des Luftmycels |
| und der Sporulation |
| Agar nach E m e r s o n sehr gut braungelbe bis elfenbeinweiß
sehr dunkel- |
| (23) .- braunrote braunrot, er- |
| Rückseite scheinen fast |
| schwärzlich |
| gegen den |
| Agar -- |
| Tabelle IV (Fortsetzung) |
| Luftapparatur, |
| Ent- Vegetatives Mycel enthaltend |
| Kulturmedien widilungs- oder Rückseite die Gesamtheit Lösliches
Pigment Biochemische Eigenschaften |
| grad der Kultur des Luftmycels |
| und der Sporulation |
| Agar nach Bennett gut gelbbräunliche elfenbeinweiß hellbraungelb |
| (Anm. A) . Rückseite wenig intensiv |
| Glucose-Pepton-Agar sehr gut sehr dunkel- elfenbeinweiß sehr
dunkel- |
| (7) - braunrote bis hell- braunrot, fast |
| . Rückseite cremefarbig schwärzlich |
| Nähragar (5) gut gelbe Rückseite weiß keines |
| Trypton-Maltose-Agar sehr gut gelbbraungräu- weiß, leicht schwach,
ziem- |
| (Anm. B) liehe Rück- gräulich lieh hellgrau- |
| seite gelbbräunlich |
| Glucose-Asparagin- mittel gelbe Rückseite weiß, mäßig schTach
gelb- |
| Agar (2) entwickelt bräunlich |
| Glycerin-Asparagin- mäßig hellgebliche weiß, Spuren keines |
| Agar (3) . Rückseite |
| Kartoffel-(27) - ziemlich graugelblich weiß schwach grau- |
| gut gelblich |
| Agar mit Tyrosin gut graugelblich weiß schwach gelb- Löslichmachung
von |
| bräunlich Tyrosin sehr |
| schwach (etwa 1 mm |
| unterhalb derKultur) |
| Agar mit Calcium- mittel hellorange weiß, mäßig blaßrotorange
ziemlich gute Löslich- |
| malat nach Rückseite entwickelt machung von Cal- |
| Krainsky ciummalat |
| Synthetischer Agar sehr weißlich Spuren, weißlich keines |
| nach C z ap ek mit spärlich |
| Sacchaxose (1) - |
| Synthetischer Agar sehr weißlich Spuren, weißlich keines |
| nach C z ap ek mit spärlich |
| Glucose |
| Reine Gelatine, 12oloig Kultur an gelbgräulich weiß hellgelb
fast vollständige Ver- |
| der Ober- flüssigung |
| ' fläche gut |
| entwickelt |
| Magermilch Ring rosa bis weißlich keine Beginn der Peptoni- |
| a) bei 26° C mittel- sation in 24 Tagen; |
| mäßig p$ fast unverändert |
| entwickelt |
| b) bei 37' G gut ent- orangebraun bis keine Koagulation;
p$ von |
| wickelter rosaviolett 6,3 auf 5,9 gehend |
| Schleier |
| Bouillon nach C z ap ek fast keiner einige sehr keine keines
Untersuchung von Ni- |
| mit Saccharose (18) schwache triten negativ öder |
| - weiße Flocken sehr schwach posi- |
| tiv in den gealterten |
| Kulturen |
| Bouillon nach C z ap ek -fast keiner einige sehr keine keines
Untersuchung von Ni- |
| mit Glucose schwache triten negativ oder |
| weiße Flocken sehr schwach positiv |
| in den gealterten |
| Kulturen |
| Nitrat-Nährbouillon Schleier hellgelbliche weiß, gut hellgelb
Untersuchung von Ni- |
| gut ent- Rückseite entwickelt triten negativ |
| wickelt |
| Anm. A *- L. J. K e n n e th, Journal of Bacteriology, 1949,
Bd. 57, S. 142; |
| Anm. B - A. M. Williams und E. M c. C o y, Applied Microbiology,
1953, Bd. 1, S. 307. |
Das Verfahren zur Herstellung des Antibioticums 5278 R. P. besteht
im wesentlichen darin, Streptomyces 662 oder seine Mutanten auf einem geeigneten
Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschließend das im Verlauf
der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.
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Die Züchtung des Streptomyces 662 kann nach jeder aeroben Oberflächen-
oder Submerszüchtungsmethode -durchgeführt werden, doch ist die letztere aus Bequemlichkeitsgründen
zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die
zur Zeit in der Fermentationstechnik in Gebrauch sind.
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Zur Durchführung der Arbeitsgänge kann man insbesondere den folgenden.
Weg einschlagen Streptomyces 662 - Stammansatz, Kultur auf Agar, .
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Kultur in Schüttel- bzw. Rührflaschen, Impfkultur im Fermentationsgefäß,
Produktionskultur im Fermentationsgefäß. Das Fermentationsmedium besteht im wesentlichen
aus einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle, einer assimilierbaren Stickstoffquelle,
Mineralstoffen und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, wobei alle diese Bestandteile
in Form wohldefinierter Verbindungen oder auch komplexer Gemische, wie man sie beispielsweise
in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs findet, vorliegen können.
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Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise
Glucose, Saccharose, Lactose, Dextrine, Stärke, Melasse oder andere Kohlenhydratderivate,
wie Zuckeralkohole, z. B. Glycerin oder Mannit, oder gewisse organische Säuren,
z. B. Milchsäure, Citronensäure oder Weinsäure, verwenden. Gewisse tierische oder
pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können mit Vorteil diese
verschiedenen Kohlenhydratderivate ersetzen oder ihnen zugefügt werden.
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Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen können außerordentlich
verschieden sein. Sie können sehr einfache chemische Substanzen sein, wie Nitrate,
anorganische und organische Ammoniumsalze, Harnstoff und Aminosäuren. Sie können
jedoch auch in Form komplizierter Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in
proteidischer Form enthalten, zugesetzt werden. Beispiele solcher komplizierterer
Substanzen sind Casein, Lactalbumin und Gluten sowie deren Hydrolysate, Sojamehl,
Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakt, Hefeextr4t, Distiller's solubles und Maisquellwasser.
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Unter den zugefügten Mineralstoffen können gewisse eine Pufferwirkung
oder eine Neutralisationswirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate
oder Calciüm- und- Magnesiumca.rbonat.
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Andere Mineralstoffe tragen zu dem für die Entwicklung des Streptomyces
662 und zur Erzeugung des Antibioticums erforderlichen Ionengleichgewicht bei, wie
beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken
gewisse in speziellerer Art als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces
662. Zu diesem gehören die Zink-, Cobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.
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Zu Beginn der Züchtung soll der p11-Wert des Fermentationsmediums
zwischen 6,0 und 7,5 liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur beträgt 26 bis
27° C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 35° C eine befriedigende
Produktion erzielt. Die Belüftung der Fermentation kann zwischen ziemdich weiten
Grenzen schwanken. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,5 bis 2 1 Luft
je Liter Brühe und Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an
Antibioticum wird nach 3 bis 5 Tagen Züchtung erhalten; wobei diese Zeit beträchtlich
von dem verwendeten Medium abhängt.
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Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß man die allgemeinen Bedingungen
der Züchtung des Streptomyces 662 zur Produktion des Antibioticums in ziemlich weitem
Maße variieren und jedem besonderen Erfordernis anpassen kann.
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Das Antibioticum 5278 R. P. kann aus den Gärmaischen nach verschiedenen
Methoden isoliert werden. Die Gärmaische kann bei einem px Wert zwischen 6 und 9
filtriert werden. In diesem Falle findet sich der Hauptteil der Aktivität in dem
Filtrat. Es ist dagegen auch möglich, die Filtration in einem pH-Intervall von 1
bis 4 durchzuführen, wobei unter diesen Bedingungen die Aktivität in dem Filterkuchen
verbleibt, aus dem sie mit einem Lösungsmittel aus der Gruppe der aliphatischen
Alkohole, z. B. '!Methanol, Äthanol, Propanolen oder Butanolen, der Gruppe der Ketone,
z. B. Aceton oder Methylisobutylketon, oder der Gruppe der Ester, wie beispielsweise
Essigsäureäthylester, extrahiert werden kann. Man kann die Aktivität auch aus dem
Filterkuchen mit Wasser unter Alkalischmachen bis zu einem pH-Wert zwischen 6 und
9 extrahieren.
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Das Rohprodukt kann aus den, wie oben beschrieben, erhaltenen wäßrig-alkalischen
Lösungen direkt isoliert werden, indem man sie durch Ansäuern mittels einer Säure,
wie beispielsweisse Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, ausfällt. Im allgemeinen
ist es vorzuziehen, von dem alkalichen Filtrat oder dem wäßrig-alkalischen Extrakt
des sauren Filterkuchens auszugehen und die Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren
Lösungsmittel zu extrahieren., wobei man im Augenblick der Extraktion auf einen
pH-Wert zwischen 1 und 4 ansäuert. Als Lösungsmittel kann man aliphatische Alkohole
mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen, z. B. Butylalkohole oder ein Gemisch von. Amylalkoholen,
Ketonen, z. B. Methylisobutylketon, Ester, z. B. Essigsäureäthyl- oder Es.sigsäureamylester,
chlorhaltige Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform oder Dichlaräthan, aromatiche
Kohl.enwasserstoffe, z. B. Benzol, oder Äther, wie beispielsweise Äthyläther oder
Isopropyläther, verwenden.
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Das rohe Antibioticum 5278 R. P.. kann aus dem organischen Extrakt
durch Einengen und Trocknen unter vermindertem Druck oder durch Einengen und Ausfällen
mittels eines. schlechten Lösungsmittels, wie beispielsweise Petroläther oder Cyclohexan,
erhalten werden. Zur Erzielung eines reineren Rohprodukts ist es von Vorteil, die
Wirksubstanz aus der Lösung in dem Lösungsmittel mit Wasser erneut zu extrahieren,
wobei man bis zu einem p11-Wert zwischen 6 und 9 alkalisch macht. Das Antibioticum
wird dann durch Einengen und Trocknen der wäßrigen. Lösung oder erneute Extraktion
in saurem Medium mit einem der obengenannten Lösungsmittel und Ausfällen isoliert.
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Das 5278 R. P. kann dann direkt in Form der freien Säure durch Auflösen
in einem Lösungsmittel, wie Aceton, Essigsäureäthylester, Propanol, Butanol, Chloroform,
Äthyläther oder Benzol, in. der Siedehitze unter Rückfluß und Abkühlen kristallisiert
werden, die Kristallisation läßt sich auch durch Auflösen in Wasser bei einem pA
Wert zwischen 8 und 9 und anschließendes Ansäuern bewirken.
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In den. Fällen, in welchen. das Rohprodukt für eine direkte Kristallisation
noch zu unrein ist oder aber,
falls man ein sehr reines Produkt
erhalten will, ist es von Vorteil, das Antibioticum 5278 R. P. einer Chromatographie
zu unterwerfen. Diese kann unter Verwendung einer Aluminiumoxydsäule durchgeführt
werden, durch welche man eine Lösung des Produkts in einem Lösungsmittel, wie beispielsweise
Aceton, Essigsäureäthylester oder Benzol, durchleitet.. Das Produkt wird mit dem
gleichen, Lösungsmittel oder mit bis zu einem pH Wert von 8 bis 10 alkalisch gemachtem
Wasser eluiert, worauf man die Kristallisation dann wie oben angegeben durchführt.
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Die Salze des 5278 R. P. können durch Suspendieren der freien Säure
in Wasser, Salzbildung mit Hilfe der gewählten Base, wie beispielsweise Natrium-
oder Kaliumhydroxyd, bei einem pH Wert von 8,5 und Lyophilisation der so erhaltenen
Lösung hergestellt werden. Das Natriumsalz ist aus Methanol kristaliisierbar. Das
in Wasser wenig lösliche Calciumsalz kann durch doppelte Umsetzung zwischen einer
wäßrigen Lösung des Natriumsalzes und einem löslichen Calciumsalz, wie beispielsweise
Calciumchlorid, erhalten werden.
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Es ist ersichtlich, daß die verschiedenen angeführten Methoden je
nach den Herstellungserfordernissen nacheinander in. verschiedener Reihenfolge angewandt
oder mehrere Male wiederholt werden können, um 5278 R. P. in für den gewünschten
Anwendungszweck geeigneter Form zu erhalten.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Im folgenden wird die Aktivität in reinem 5278 R. P. in Form der freien Säure ausgedrückt.
Sie wird biologisch nach der als Diffusionsmethode bezeichneten Bestimmungsmethode
unter Verwendung von B. subtilis ATCC Nr. 6633 als empfindlichem Keim bestimmt.
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Beispiel 1 In ein Fermentationsgefäß mit 1701 Inhalt bringt man folgendes
Medium ein: Maisquellwasser (50'°% Trockenextrakt) 4,800 kg Glucose .............................
2,400 kg Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,600 kg hydratisiertes
Magnesiumsulfat ...... 0,120 kg Leitungswasser ...................... 1001
Der pH-Wert wird mit 500 ccm 10n-Natronlauge auf 6,6 eingestellt. Dann setzt man
0,600 kg gefälltes Calciumcarbonat zu.
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Das Medium wird durch 40minütiges Durchleiten von Dampf von 120° C
sterilisiert. Nach Abkühlen auf 27° C beträgt das Volumen des Mediums 1201 und der
pH-Wert 6,8. Das Medium wird dann mit 250 ccm einer gerührten bzw. geschüttelten
Erlenmeyerkultur des Stammes Streptomyces 662 beimpft.
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Die Kultur im Fermentationsgefäß wird mit steriler Luft mit einer
Geschwindigkeit von 5 cm/Std. belüftet und mit einer Turbine mit 350 Umdr./Min.
gerührt. Die Entwicklung des Streptomyces beginnt erst nach 40stündiger Züchtungsdauer
und weist nach 52 Stunden die zur Beimpfung der Produktionszüchtung richtige Intensität
auf.
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Diese letztere wird in einem Fermentationsgefäß von 8001 Inhalt durchgeführt,
das mit folgenden Substanzen beschickt ist.
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Sojamehl . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 12,000 kg Distillers'
solubles . . . . . . . . . . . . . 2,000 kg Natriumchlorid . . . . . . . . . . .
. . . . 2,000 kg Leitungswasser ...................... 3601 Der pH-Wert wird mit
250 ccm 10n-Natronlauge auf 7,45 eingestellt. Dann setzt man 21 Sojaöl zu.
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Das. Medium wird bei 120° C durch 40minütiges Durchleiten von Dampf
sterilisiert. Nach Abkühlen wird die Beschickung des Fermentationsgefäßes mit 101
einer sterilen Lösung, die 4,000 kg Glucose enthält, vervollständigt.
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Das Volumen des Mediums beträgt somit 4001, sein pH-Wert 6,85.
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Das Medium wird dann mit 401 der vorhergehenden Kultur aus dem Fermentationsgefäß
mit 1701 Inhalt beimpft. Es wird mittels einer Turbine mit 205 Umdr./Min. gerührt,
mit 15 cbm steriler Luft je Stunde belüftet und auf 26° C gehalten.
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Nach etwa 40 Stunden, in deren Verlauf die Entwicklung des Streptomyces
reichlich ist, steigt das p$ auf etwas alkalische Werte an, erreicht 7,2, worauf
ein schwacher Abfall des p11-Wertes auf etwa 6,8 und dann ein Wiederanstieg erfolgt.
Die maximale Aktivität ist zum Zeitpunkt des Erlangens des PH-Wertes von 7,0 nach
70stündiger Züchtung erreicht und beträgt 86 y/ccm. Die im Verlauf der Züchtung
gebildeten Schäume werden leicht mit 21 einer Swiftlösung in einem Mineralöl bekämpft.
Beispiel 2 Ein Fernientationsgefäß von, 8001 Inhalt wird mit folgenden Substanzen
beschickt: Maisquellwasser (50'% Trockenextrakt) 12,000 kg Monokaliumphosphat .
. . . . . . . . . . ..... 0,400 kg Magnesiumsulfat . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 0,400 kg Leitungswasser .................... 3601 Der pH-Wert
wird durch Zugabe von 1200ccm 10 n-Natronlauge auf 6,6 eingestellt. Dann setzt man
1,000 kg Calciumcarbonat und 2 1 Sojaöl zu.
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Das Medium wird bei 120° C durch 40minütiges Durchleiten von Dampf
sterilisiert. Nach Abkühlen wird die Beschickung des Fermentationsgefäßes mit 4,000
kg Glucose in steriler Lösung in 101 Wasser vervollständigt, wodurch ein Gesamtvolumen
des Mediums von 4001 erreicht wird.
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Das Medium wird dann beimpft und die Fermentation, wie im Beispiel
1 beschrieben, durchgeführt. Nach 90 Stunden Züchtung beträgt die Aktivität 24 y/cem.
Beispiel 3 4201 Gärmaische (Gehalt 86 y/cem gemäß Beispiel 1) werden in ein mit
einer Rührvorrichtung versehenes Gefäß eingebracht. Der PH-Wert wird durch Zugabe
von verdünnter Natronlauge auf 9 eingestellt. Dann rührt man die Suspension 30 Minuten,
setzt 30 kg Filterhilfe zu, filtriert auf einer Filterpresse und wäscht den Filterkuchen
mit 1501 auf px 9 alkalisch gemachtem Wasser. Das Volumen des Filtrats und vereinigten.
Waschwassers beträgt 4451, und die Lösung weist eine Aktivität von 59 y/ccm auf.
Man säuert die Lösung mit verdünnter Salzsäure auf pff 2 an und extrahiert kontinuierlich
im Gegenstrom in zwei Stufen mit 30 Volumprozent Essigsäureäthylester, wobei man
eine Gruppe von zwei Zentrifugen verwendet.
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Den. Essigsäureäthylesterextrakt wäscht man mit 10 Volumprozent Wasser
und klärt. Man erhält so 135 1 Lösung, die man unter vermindertem Druck auf 191
unter Verwendung einer kontinuierlich arbeitenden Apparatur einengt, die ermöglicht,
ständig bei einer 35° C nicht überschreitenden Temperatur zu arbeiten. Die eingeengte
Lösung extrahiert man mit
8,5 1 Wasser, wobei man mit verdünnter
Natronlauge auf pH. 9 alkalisch macht. Nach Abtrennen der wäßrigen Phase wird die
Extraktion unter Verwendung von 2 1 Wasser und Einstellen des p$ Wertes auf 9 erneut
durchgeführt. Man erhält so 111 wäßrige Lösung, die man erneut auf PH 2 ansäuert
und nach= einander mit 31 und mit 11 Essigsäureäthylester extrahiert. Die vereinigten,
Extrakte engt man unter vermindertem Druck auf 21 ein, und gießt das Konzentrat
in 201 Petroläther unter Rühren ein. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert,
mit Petroläther gewaschen und getrocknet.
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Man erhält so 64 g rohes Antibioticum 5278 R. P. mit einer Aktivität
von 341y/mg.
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50 g rohes 5278 R. P. werden, in 700 ccm Aceton suspendiert und unter
Rückfiuß erhitzt. Nach 15 Minuten filtriert man die Lösung, kühlt dann auf
30' C ab und engt unter vermindertem Druck auf 200 ccm ein. Während des Einengens
setzt die Kristallisation ein. Die eingeengte Lösung wird 20 Stunden auf -I-5° C
abgekühlt. Die Kristalle werde. filtriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
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Man erhält so 18,5 g kristallisiertes Antibioticum 5278 R. P. in Form
der freien Säure mit einer Aktivität von 780 7/mg. Beispiel 4 10 g des aus dem Rohprodukt,
wie im Beispiel 3 beschrieben, direkt kristallisierten Antibioticums 5278 R. P.
werden in 3 1 Essigsäureäthylester gelöst. Man chromatographiert die Lösung an einer
Aluminiumoxydsäule mit einem Durchmesser von 40 mm und einer Höhe von 760 mm mit
einer Geschwindigkeit von 0,51/Std., entwickelt das Chromatogramm und eluiert mittels
mit Wasser gesättigten. Essigsäureäthylesters, wobei man die gleiche Geschwindigkeit
beibehält. Man gewinnt so die folgenden Fraktionen:
| Volumen Titer |
| I 1 |
| y/ccm |
| Fraktion I ............... 4 50 |
| Fraktion II . . . . . . . . . . . . . . 1,4 980 |
| Fraktion III . . . . . . . . . . . . . . 9,3 580 |
| Fraktion IV .............. 2 170 |
Die vereinigten Fraktionen II und III engt man unter vermindertem Druck auf 0,3
1 ein und kühlt die erhaltene Suspension der Kristalle 2 Stunden auf +5o C. Das
kristallisierte Produkt wird abgesaugt, mit Essigsäureäthylester gewaschen und im
Vakuum getrocknet.
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Man erhält so 6,8 g kristallisiertes Antibioticum 5278 R. P. in Form
der freien Säure mit einer Aktivität von 945 y/mg und einem Schmelzpunkt- von 300
bis 304' C (Block Maquenne).
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5 g dieses Produkts löst man in 750 ccm Aceton in der Siedehitze,
filtriert die Lösung, kühlt, setzt 2,25 1 Isopropyläther zu und läßt dann zur Kristallisation
20 Stunden bei +5o C stehen. Die gebildeten Kristalle werden abgesaugt, mit Isoprop:yläther
gewaschen und zuerst 10 Stunden bei 30' C unter einem Druck von 5 mm Hg und
dann 2 Stunden bei 100' C unter einem Druck von 1 mm Hg getrocknet.
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Man erhält so 3,8 g kristallisiertes 5278 R. P. als braune Nadeln
in Form der freien Säure mit folgen: den Kennzahlen: F.=301 bis 303° C (Block Maquenne),
C=59,2 bis 59,6'%, H= 4,8 bis 5,2"/o, O=25,0 bis 25,2%, N=10,8 bis 11,10/0. Das
Ultraviolettspektrum weist zwei Absorptionsmaxima bei Wellenlängen, von 382 und
247 m g, auf.
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3,5 g Antibioticum 5278 R. P. in Form der freien Säure werden in 70
ccm Wasser suspendiert, und der pH-Wert wird durch Zugabe verdünnter Natronlauge
auf 8,7 eingestellt. Die Lösung des Natriumsalzes wird filtriert und lyophilisiert.
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Man erhält 3,3 g Natriumsadz mit einer Aktivität von 856 y/mg. 3 g
amorphes Natriumsalz werden in 15 ccm Methanol gelöst, und die Lösung wird rasch
filtriert und 16 Stunden bei -[-5o C zur Kristallisation stehengelassen. Man erhält
so 1,6- g kristallisiertes Natriumsalz mit einer Aktivität von 930 y/mg. Beispiel
5 415 1 Gärmaische mit einer Aktivität von 8 y/ccm werden mit verdünnter Salzsäure
auf pH 2 angesäuert und 30 Minuten mit 21 kg Kieselgur verrührt. Man filtriert die
Suspension auf einer Filterpresse und wäscht den Filterkuchen, mit 801 Wasser. Dann
suspendiert man den Filterkuchen in 2101 Wasser, rührt das Gemisch stark und stellt
den pH-Wert mit Natronlauge auf 8 ein. Nach 30minütigem Rühren wird die Suspension
auf einer Filterpresse filtriert und der Inhalt des Filters mit 1201 Wasser gewaschen.
Man vereinigt das Filtrat und die Waschwässer, wobei man 3101 wäßrige Lösung mit
einer Aktivität von 8,6 y%ccm erhält. Die wäßrige Lösung wird auf pH 2 angesäuert
und zweimal mit je 57 1 n-Butylalkoho:l extrahiert. Die vereinigten Butylalkoholextrakte
werden unter vermindertem Druck bei einer 35' C nicht überschreitenden Temperatur
bis zu einem Volumen von 2,5 1 eingeengt. Man filtriert die Butylalkohollösung und
extrahiert dreimal mit je 1,25l Wasser, wobei man mit Natronlauge bis zu pii 9 alkalisch
macht. Die vereinigten wäßrigen Lösungen werden auf pH 2 angesäuert und zweimal
mit je 3,91 Essigsäureäthylester extrahiert. Die vereinigten Essigsäureäthylesterextrakte
engt man unter vermindertem Druck auf 0,251 ein. Dann gießt man die Lösung unter
Rühren, in 2,51 Petro.läther ein, saugt anschließend den Niederschlag ab,
wäscht mit Petroläther und trocknet. Man erhält so. 16 g rohes Antibioticum 5278
R. P. mit einer Aktivität von 138 y/mg.
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Das Rohprodukt löst man in 11 Essigsäureäthylester und chromatographiert
die Lösung an einer Aluminiumoxydsäule mit einem Durchmesser von 50 mm und einer
Höhe von 500 mm. Nach Entwicklung mit 21 Essigsäureäthylester, der mit Wasser gesättigt
ist, beobachtet man in der Kolonnenfüllung einen. rotbraunen Ring von 100 mm Höhe,
über dem sich eine dunkelbraune Zone befindet. Man läßt die Kolonne teilweise trocknen,
entleert dann anteilweise unter Isolierung der Zone des rotbraunen Ringes. Die dieser
Bande entsprechende Aluminiumoxydfraktion wird unter Rühren mit 0,35 1 Wasser, das
bis zu pH 9 alkalisch gemacht ist, eluiert. Man wiederholt diese Arbeitsweise, bis
das Aluminiumoxyd praktisch entfärbt ist, wozu 5 Extraktionen erforderlich sind,
die 1,71 wäßrige Lösung liefern. Diese Lösung säuert man auf px 2 an und extrahiert
zunächst mit 0,61 und dann ein zweites und drittes Mal mit je 0,3 1 Butanol. Die
Butanolexträkte werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 100 ccm eingeengt,
wobei man die Kristallisation, die spontan, einsetzt, durch 4stündiges Abkühlen
auf -I- 51 C vervollständig. Das kristallisierte Produkt wird abgesaugt,
mit Äther gewaschen und zunächst 10 Stunden bei 30' C unter einem Druck von
5 mm Hg und dann 2 Stunden
bei 100° C unter einem Druck von 1 mm
Hg getrocknet.
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Man erhält so 1,3 g kristallisiertes 5278 R. P. in Form der freien
Säure mit einer Aktivität von 731 y/mg.
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Beispiel 6 2201, wie im Beispie12 beschrieben, filtrierte Kulturmaische
liefern 2551 Lösung mit einer Aktivität von 26 y/ecm. Die Lösung wird auf pH 2 angesäuert,
mit 2 kg Kieselgur verrührt und die erhaltene Suspension filtriert. Den Filterkuchen
verrührt man mit 501 auf pH 9 alkalisch gemachtem Wasser 1 Stunde und filtriert
die Suspension erneut. Der so erhaltene Filterkuchen wird mit 201 Wasser gewaschen.
Durch Vereinigen des Filtrats und der Waschflüssigkeit erhält man 65 1. Dann extrahiert
man die auf pg 2 angesäuerte wäßrige Lösung zweimal mit je 121 Butanol. Die vereinigten
Butanolextrakte werden geklärt und unter vermindertem Druck auf 11 eingeengt. Man.
gießt das Konzentrat unter Rühren in 5 1 Petroläther ein, saugt den gebildeten Niederschlag
ab, wäscht mit Petroläther und trocknet.
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Man erhält so 12,5 g rohes Antibioticum 52-78 R. P. mit einer Aktivität
von 210 1/mg. Beispiel 7 2001, wie im Beispiel 1 beschrieben, erhaltenes Kulturfiltrat
mit einer Aktivität von 59 y/ccm werden mit Essigsäureäthylester und dann mit Wasser
wie dort beschrieben extrahiert. Die aufeinanderfolgenden Behandlungen liefern 61
wäßrige Lösung mit einer Aktivität von 1510 y/ccm. Man säuert die Lösung mit Phosphorsäure
auf p$ 2 an und extrahiert dann zweimal mit je 31 Dichloräthan. Die geklärten Extrakte
werden, unter vermindertem Druck auf 0,21 eingeengt. Das Konzentrat gießt man. unter
Rühren in 1,21 Petroläther ein, saugt den gebildeten Niederschlag ab . und wäscht
mit Petroläther.
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Man erhält so 23 g rohes Antibioticum 5278 R. P. mit einer Aktivität
von 300 y/mg.