DE1064687B - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums 6798 R. P. - Google Patents

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Antibiotikums, das im folgenden mit »6798 R.P.« bezeichnet wird und insbesondere gegen Mycobakterien und gewisse grampositive Keime und in geringerem Grade gegenüber gewissen gramnegativen Keimen wirksam ist. Dieses neue Antibiotikum besitzt eine sehr geringe Toxizität beim Tier und ist ganz besonders interessant, da es die gleiche Aktivität gegenüber Mycobakterien, die gegen andere Antibiotika, wie beispielsweise Streptomycin und Neomyein, resistent sind, wie gegenüber Mycobakterien, die gegen diese Antibiotika sensibel sind, besitzt.

Die neue antibiotische Substanz wird durch Züchtung eines im nachfolgenden vollständiger identifizierten Mikroorganismus, der dem Genus der Streptomyces angehört und mit »Streptomyces 6227« oder »Streptomyces peruviensis« bezeichnet wird, unter künstlichen Bedingungen erzeugt. Er wurde bei United States Departement of Agriculture, Agucultural Research Service, Northern Utilization Research and Derelopment Division, Prevria, III., V. St. A., unter NRRL 2757 hinterlegt.

Das neue Antibiotikum ist eine amphotere Substanz, die in Form der freien Base und in Form der Salze mit Basen, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Bariumhydroxyd, isoliert wurde. Die Base liefert komplexe kristallisierte Salze mit Alkalisalzen organischer Säuren, wie beispielsweise Salicylsäure, p-Oxybenzoesäure, Kresotinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Mandelsäure und Sulfanilsäure. Die Base sowie die verschiedenen Salze des Antibiotikums sind weiß.

Die Base ist in Wasser (etwa 1% bei 20° C), wäßrigen Alkoholen und Dimethylformamid schwach löslich. Praktisch unlöslich ist sie in Aceton, Benzol, Chloroform und Äther. Die Alkalisalze sind in Wasser leicht löslich (mehr als 20 °/o bei 20° C) und in wasserfreien Alkoholen, Aceton, Benzol und Äther unlöslich. Die Komplexsalze sind in Wasser und wäßrigem Methylalkohol schwach löslich und in organischen Lösungsmitteln unlöslich.

Die Elementaranalyse der Base zeigt, daß das Antibiotikum nur Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff enthält.

C = 55,25 bis 55,35%, O =23,05 bis 23,25%,
H= 5,9 bis 6,1%, N = 15,60 bis 15,65%.

Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums 6798 R. P.

Anmelder:
Societe des Usines Chimiques Rhöne-Poulenc, Paris

Vertreter: Dr. F. Zumstein, Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. Ε. Assmann und Dipl.-Chem. Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte, München 2, Bräuhausstr. 4

Beanspruchte Priorität: Frankreich vom 1. Juni 1957

Sylvie Pinnert, Leon Ninet und Jean Preud'homme, Paris,

sind als Erfinder genannt worden

(C42 ^hSiQi₃ N₁₀) „.

Molekulargewicht = (906) „.

Berechnet: C=55,7%, H = 5,95%, 0=22,9%, N=15,45%.

Die Zusammensetzung des Natriumsalzes entspricht der Formel

(C₄₂H₅₃O₁₃N₁₀Na)_n.

C=54,25%, H=6%,
N=14,8 Vo_j Na=2,6%;

Gefunden
berechnet

C=54,3%, H=5,7%, N=15,05%, Na=2,55%.

0=22,45%, 0=22,4 0/0,

Die Zusammensetzung des Komplexes mit Natriumsalicylat entspricht der Formel

(C₄₂H₅₄O₁₃N₁₀-C₇H₅O₃Na)_n.

Gefunden: C=55,4%, H=5,65%, 0=23,8%, N= 13,3%, Na=2,7%,

Salicylsäure= 12,8%;

Das durch Titration der Basizität mit Perchlorsäure berechnet: C=55,l °/o, in wasserfreiem Medium bestimmte Neutraläquivalent 50 der Base beträgt 880. Durch Titration der Azidität mit Kaliummethylat, ebenfalls in wasserfreiem Medium, wurde ein Wert von 813 gefunden. Die Analyse und das Neutraläquivalent stimmen für die Formel

H=5,55%, 0=24,05%,

N=13,15%, Na=2,15%, Salicylsäure= 12,95 %.

Der Schmelzpunkt der freien Base beträgt 240 bis 245° C und derjenige des Komplexes 238 bis 240° C,

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wenn diese Bestimmungen nach der Methode des Kappillarröhrchens durchgeführt werden.

Das Ultraviolettspektrum des Antibiotikums ist charakteristisch. Im folgenden sind die Konstanten der verschiedenen Formen wiedergegeben (die Bestimmungen wurden mit einer Lösung in 70%igem Methanol durchgeführt):

Absorptionsmaximum : 222 bis 223 πιμ Absorptionsminimum : 237,5 πιμ
Absorptionsmaximum: 257,5 πιμ

Natriumsalz

Absorptionsniaximum : 222 bis 223 πιμ Absorptionsminimum : 237,5 πιμ Absorptionsmaximum: 257,5 πιμ

Salicylkomplex

Absorptionsmaximum: 222 πιμ
Absorptionsminimum : 240 πιμ
Absorptionsmaximum: 257,5 πιμ

Die Infrarot-Absorptionsspektren des Antibiotikums in Form der Base, des Natriumsalzes und des Salicylkomplexes wurden bestimmt und sind in den Figuren wiedergegeben, in denen als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm^-1 (oberer Maßstab) und als Ordinaten die Transmissionen in Prozent aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden des Infrarot-Absorptionsspektrums für diese Produkte wiedergegeben.

Tabelle I

Infrarot-Absorptionsspektren

Diese Spektren wurden an festen, mit Kaliumbromid verpreßten Produkten gemessen.

*-· 1 cm	= 519
pi* lern	= 183
lern	= 235

1 cm 1%

-Ei

483 175 222

Fi*	= 516
*-> 1 cm	= 195
Fi*	= 201

Base	Natriumsalz	Salicylkomplex
3370 St	3370 st	3300 St
1660 st	1660 st	1660 st
etwa 1600 sch	1600 m
1550 st	1550 st	1545 st
1492 sch	1492 sch	1492 m
1463 m	1463 m	1468 m
1388 m	1390 m	1388 st
1345 sch	1345 sch	1340 m
1280 sch	1280	1283 m
1260 m	1260 m	1267 m
1220 m	1222 m	1222 m
1184 m	1184 m	1186 st
1127	1127	1123 m
1106 m	1106 m	1106 m
1064 m	1064 m	1062 m
1014 sch	1014 sch
1001 sch	1001 sch	1002 sch
961 sch	961 sch	961 m
929 sch
878 m	878 m	862 m
812 m	812 m	812 m
782	782	780
773 m
749 m	749 m	750
699 m	699 m

Drehvermögen der Base, des Natriumsalzes und des Salicylkomplexes sind die folgenden:

Base

[«] ff

= -21° (c = l Voin n/10 NaOH),
= -36° (C=IVoin n/10 HCl),

Natriumsalz

W ²D⁰ = -32° (c =IVo in Wasser),

[a] I? = -20° (c=l Vo in n/10 Na OH),

Salicylkomplex

[a] ²S = -18° (c = l % in n/1 ONaOH),

[a] ²O⁰ = -33° (c=l»/o in n/10 HCl),
[a] f = 0 bis -5° (c=l Vo in Pyridin).

Die Base gibt folgende Farbreaktionen:
Reaktionennach Molisch, Folin-Denis positiv; Reaktionen nach Millon, Tollens, Fehling, Sakaguchi, Ehrlich mit Biuret, Ferrichlorid, Ninhydrin, Eisenalaun nach alkalischer Hydrolyse negativ.

Mit konzentrierter Salzsäure gibt das Antibiotikum eine rotbraune Färbung, die in 1 bis 2 Stunden nach Grün umschlägt.

Das Antibiotikum kann auch durch die Papierchromatographie identifiziert werden. Die mit verschiedenen Entwicklungslösungsmitteln erhaltenen Rf Werte sind in nachfolgender Tabelle II zusammengestellt (Chromatographie mit Papier Arches Nr. 302, Entwicklung bei 30° C, Nachweis auf mit Mycobacterium 607 beimpften Agarplatten).

Tabelle II Lösungsmittel R_f

Aceton 0

Dioxan 0

Butanol, mit Wasser gesättigt 0

Gemisch Äthanol—Wasser

(80 : 20 Volumina) 0,6

Gemisch n-Propanol—Wasser

(80 : 20 Volumina) 0,4

Gemisch n-Propanol—Wasser

(75 : 25 Volumina) 0,55

Gemisch n-Propanol—Wasser

(70 : 30 Volumina) 0,65

Gemisch n-Propanol—Wasser

60 :40 Volumina) 0,90

Gemisch n-Propanol—Wasser

(50 : 50 Volumina) 0,90

Wasser 0,95

Intensität der Banden: st = stark; m = mittel; sch = schwach.

Das antibiotische Wirkungsspektrum von 6798 R.P. wurde durch eine der üblicherweise für diesen Zweck verwendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. Für jeden Keim wurde die kleinste Konzentration an Substanz, die jegliche sichtbare Entwicklung verhindert, bestimmt. Die wirksamen Konzentrationen sind in γ Substanz/cm³ Versuchsmedium ausgedrückt. Die Ergebnisse dieser verschiedenen Bestimmungen sind in nachfolgender Tabelle zusammengestellt:

Tabelle III
Antibiotisches Wirkungsspektrum

Bakterienstämme

Staphylococcus aureus,
Stamm 209 P-ATCC 6538 P ...

Staphylococcus aureus,

Stamm 133 (Institut Pasteur) ...

Staphylococcus aureus, 15 gegen einen oder mehrere der folgenden Antibiotika resistente Stämme: Streptomycin, Penicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Streptothricin, Congocidin, Spiramycin, Carbomycin, Erythromycin, Novobiocin, Actinomycin, Streptogramin

Sarcina lutea — ATCC 9341

Streptococcus faecalis — ATCC 9790

Streptococcus viridans

(Institut Pasteur)

Streptococcus pyogenes haemolyticus, Stamm Dig. 7 (Institut Pasteur)

Diplococcus pneumoniae, Stamm Till (Institut Pasteur)

Neisseria catarrhalis (Faculte de Pharmacie)

Corynebacterium pseudodiphtericum (Faculte de Pharmacie)

Bacillus subtilis — ATCC 6633 ....

Bacillus cereus — ATCC 6630

Mycobacterium species — ATCC 607

Mycobacterium phlei (Institut bacteriologique in Lyon)

Mycobacterium para-smegmatis —■ A 75 (Lausanne)

Mycobacterium tuberculosis,
Stamm H 37 Rv

Mycobacterium Stamm Ravenel

Escherichia coli — ATCC 9637 ....

Salmonella paratyphi A (Lacasse — Institut Pasteur)

Proteus vulgaris (Faculte de

Pharmacie)

Klebsiella pneumoniae —

ATCC 10 031

Pseudomonas aeruginosa, Stamm
Bass (Institut Pasteur)

Pasteurella multocida — A 125
(Institut Pasteur)

Bakteriostatische Konzentration in y/cm³

Tabelle IV

Wirkung auf Mycobakterien, die gegen andere
Antibiotika resistent sind

222 370

194 bis

150 >320

320

2,9

50

320

25,6 320 31 3,1

22,2 3,1

Ibis 5 bis >320

>535 16,6 273 14,6

Bakterienstämme

Mycobacterium species ATCC 607

Mycobacterium species ATCC 607 NR

(gegen Neomycin resistent)

Mycobacterium species ATCC 607 SR

¹S (gegen Streptomycin resistent)

Mycobacterium tuberculosis, Stamm

Ravenel

Mycobacterium tuberculosis, Stamm

Ravenel

ao Mycobacterium species (gegen Streptomycin resistent)

Bakteriostatische Konzentration in 7/cm³

3,1

3,1

3,1
5 bis 10
1 bis 10

Diese verschiedenen Bestimmungen zeigen, daß die Wirksamkeit von 6798 R. P. sich hauptsächlich auf Mycobakterien einschließlich virulenter Stämme erstreckt. Außerdem wirkt 6798 R. P. auch gut sowohl auf gegen Streptomycin oder Neomycin resistente Stämme wie auf nicht resistente Stämme, wie die Tabelle IV zeigt.

Gewisse grampositive und, wenn auch in geringerem Grade, gramnegative Kokken sind ebenfalls gegenüber 6798 R. P. sensibel.

Im Verlaufe der in-vitro-Studien der Eigenschaften des neuen Antibiotikums konnte man feststellen, daß diese Substanz gegenüber Mycobakterien nicht nur bakteriostatisch, sondern auch bakterizid und sogar bakteriolytisch wirkt.

Das neue Antibiotikum zeichnet sich ganz besonders durch seine geringe Toxizität aus. Wird es Mäusen subcutan in Dosen von 5 bis 2,5 g/kg injiziert, so führt es bei keinem der Versuchstiere zum Tod. Auch bei oraler Verabreichung zeigt es sich sehr wenig toxisch. Intravenös kann man Mäusen eine Dosis von 1 g/kg, Meerschweinchen eine Dosis von 0,1 g/kg und Kaninchen eine Dosis von 0,2 g/kg verabreichen, ohne daß ein Todesfall eintritt. Hunde vertragen ohne irgendein Anzeichen von Toxizität 0,1 g/kg bei intravenöser Verabreichung oder 0,5 g/kg bei subcutaner Verabreichung.

Führt man schließlich wiederholte subcutane Injektionen bei Mäusen durch, so vertragen diese 21 Injektionen täglich von je 1,5 g/kg.

Die antibiotische Wirksamkeit in vitro von 6798 R. P. wurde in vivo an Versuchstieren, die experimentell mit Mikroorganismen, wie beispielsweise Streptococcus haemolyticus oder Tuberkelbazillen (virulenter Stamm H 37 Rv), infiziert wurden, bestätigt.

Wenn man das Antibiotikum subcutan Mäusen mit schweren experimentellen Infektionen durch den Stamm des Bacillus tuberculosis H 37 Rv verabreicht, kann man feststellen, daß vier Fünftel der Tiere in dem Augenblick noch am Leben sind, wo mehr als neun Zehntel der nicht behandelten Tiere bereits tot sind. Dieses Ergebnis wird erhalten, wenn die Behandlung sofort nach der Infektion begonnen wird.

Man kann jedoch auch dann noch eine bemerkenswerte Heilwirkung beobachten, wenn die Behandlung erst 2 Wochen nach der Infektion eingeleitet wird.

Der das neue Antibiotikum erzeugende Organismus gehört zum Genus Streptomyces und wird mit dem Namen »Streptomyces 6227« oder wegen seines Ursprungs »Streptomyces peruviensis« bezeichnet.

Dieser Organismus wurde aus einer in der Nähe von Truj illo, Peru, entnommenen Erdprobe isoliert. Die Isolierungsmethode ist die folgende: Die Erdprobe wird in destilliertem sterilem Wasser suspen-

diert und die Suspension dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Ein kleines Volumen jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht, die ein Nährmedium nach Emerson oder irgendein anderes geeignetes Medium enthalten. Nach Inkubation von einigen Tagen bei 26° C werden die Kolonien des Streptomyces peruviensis auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten. In der Klassifizierung von »Bergeys manual of

Bohnenabsudmedium

Wie für das vorhergehende Medium stellt man ein gutes Wachstum und gute Sporulation des Stammes fest. DieKolonien sind weniger gefaltet als diejenigen, die man auf dem Medium nach Benett beobachtet. Sie nehmen eine Form einer regelmäßigen sphärischen Kalotte an, die an den Rändern sehr schwach gelappt oder sogar ausgefranst sind. Das vegetative Mycel

determinative Bacteriology«, Ö.Auflage (1949), für ίο ist hellbeige, seine Rückseite ist beige-hellgelb. Das

den Genus Streptomyces findet man keine Beschreibung einer Species, deren Züchtungscharakteristika und biochemische Eigenschaften mit denjenigen des Streptomyces 6227 übereinstimmen. Dieser Organismus kann daher als eine neue Species betrachtet werden, die den Namen »Streptomyces peruviensis« erhalten hat.

Im nachfolgenden sind die Eigenschaften dieser neuen Species wiedergegeben.

Mikroskopische Morphologie

Die Kulturen auf Streifen im Medium nach Benett zeigen, mikroskopisch untersucht, die Bildung von verzweigten Mycelfäden sowie Sporenketten, die für den Genus Streptomyces charakteristisch sind.

Die Mycelfäden tragen sehr zahlreiche Sporenketten in Form von Spiralen mit sehr dichten Windungen mit zwei bis zehn Drehungen. Manchmal weist die Aufrollung der Spiralen die Form eines gut regelmäßigen Zylinders, manchmal eine leichte Kegelstumpfform auf. Der größte Teil der Spiralen besitzt zwei bis fünf Windungen. Die Sporen sind oval.

Entwicklungstemperatur Luftmycel ist in 10 bis 15 Tagen gut entwickelt. Sein Aussehen ist samtartig und seine Farbe von einem weniger lebhaften Blaugrün als auf dem vorgenannten Medium. Es bildet ein blaugraues lösliches Pigment mittlerer Intensität.

Medium nach Emerson

Die Kolonien besitzen ein gut entwickeltes vegetatives Mycel, das an den Rändern braun-hellgrau und im Zentrum beige gefärbt ist. Die Ränder sind fein gezahnt, nicht ausgefranst. Die Farbe der Rückseite ist braun-hellrötlich. Im Zentrum beobachtet man einen gewölbten Teil, der an der Oberfläche unregelmäßig ist. Das Luftmycel ist wenig entwickelt und bedeckt im allgemeinen die Ränder der Kolonien nicht. Seine Farbe ist zu Beginn der Entwicklung weiß und schlägt dann immer mehr nach Blaugrün um. Es bildet ein braunrötliches Pigment mittlerer Intensität.

Maltose-Trypton-Medium

Die Entwicklung ist gut. Die Kolonien sind an den Rändern nicht ausgefranst, gezahnt, an der Oberfläche gewölbt und stark gefaltet mit einer großen zentralen Depression (Abflachung). Das vegetative Mycel ist

S. peruviensis entwickelt sich gut bei 26 bis 37° C, 35 dunkelbraun, die Unterseite der Kolonie braunschwarz. Das Luftmycel, das sich ziemlich langsam entwickelt, ist zunächst weiß und färbt sich dann blaßblau. Es bildet zu Beginn der Inkubation ein inten-

jedoch weder bei 45, 50, 55 noch 65° C
Allgemeine Eigenschaften
Auf Medien, die »synthetische« genannt werden, sives braunschwärzliches, charakteristisches Pigment.

weist S. peruviensis im allgemeinen ein ungefärbtes 40
bis gelbliches vegetatives Mycel auf und erzeugt keine
löslichen Pigmente oder sehr schwache gelbliche Pigmente. Auf Medien, die »organische« genannt werden,
bildet er ein in verschiedenen braunen Tönen gefärbtes
vegetatives Mycel und mehr oder weniger intensiv 45 genannten Medien. Die Ränder sind meist ausgefranst, braune, lösliche Pigmente, je nach Medium und Alter Die Kolonie ist im Zentrum gewölbt und bildet einige der Kultur. Auf allen diesen Medien erscheint kein Falten in Richtung der Radien. Das vegetative Mycel Luftmycel. Wenn es erzeugt wird, ist es stets zu Be- ist weißlich, die Unterseite weißgrau. Es bildet sich ginn seiner Entwicklung weiß und färbt sich dann im allgemeinen kein Luftmycel und kein lösliches blaugrün (türkis) in einem je nach Entwicklungsgrad 5° Pigment.

Asparagin-Glucose-Medium

Die Entwicklung ist auf diesem Medium auch ziemlich langsam, und die Kolonien sind in Form und Farbe den auf dem Asparagin-Glycerin-Medium entwickelten ziemlich ähnlich. Das Luftmycel entwickelt

Asparagin-Glycerin-Medium

Die Entwicklung ist ziemlich träge auf diesem Medium. Die Kolonien bleiben kleiner als auf den vor

mehr oder weniger intensiven Ton.

Form der isolierten Kolonien
(Kulturen auf Petrischalen)
Medium nach Benett

Die Monosporenkulturen in Pertrischalen zeigen runde, an den Rändern nicht ausgefranste, gelappte Kolonien. Die Kolonien sind wenig gewölbt und weisen im allgemeinen eine mehr oder weniger kenntliche zentrale Depression auf. Gewisse Kolonien sind nicht damit versehen.

Das vegetative Mycel bildet zahlreiche Falten in Richtung der Radien. Es ist chamoisfarbig, seine Rückseite ist braun-hellgrau. Das Luftmycel bildet sich jedoch besser. Es ist zunächst weiß und färbt sich dann ganz leicht bläulich. Es entsteht kein lösliches Pigment.

Medium mit Calciummalat

Die Entwicklung ist auf diesem Medium ziemlich langsam. Die Kolonien sind kreisförmig, flach, mit scharfen Rändern. Das vegetative Mycel ist weiß-

sich im allgemeinen ziemlich langsam. Es ist zunächst 65 cremefarbig, die Unterseite weißgelblich. Das Luftweiß und färbt sich dann zunehmend blaugrün. Je mycel ist sehr wenig entwickelt und weiß. Es tritt kein nach dem Entwicklungsgrad beobachtet man für das lösliches Pigment auf. Man stellt große Zonen, wo Luftmycel alle Zwischentöne zwischen Weiß und das Malat gelöst ist, um die Kolonien herum fest. Die Blaugrün. Es bildet ein braunhellgelbes lösliches Größe dieser Zonen variieren zwischen etwa 3 und Pigment. 70 10 mm.

1

Medium mit Stärke

Die auf diesem Medium entwickelten Kolonien sind denjenigen, die auf dem Glucose-Asparagin-Medium beobachtet werden, ähnlich. Gießt man einige Tropfen Jod-Jodid-Reagenz auf die Oberfläche der Petrischalen, so stellt man fest, daß sich um die Kolonien Zonen von 2 bis 5 mm Durchmesser bilden, in denen das Medium sich nicht dunkelblauviolett färbt, während der Rest des Mediums gefärbt ist. Es findet also eine Hydrolyse der Stärke in der Nähe der Kolonien statt. Diese Reaktion tritt nur bei 10 bis 15 Tage alten Kulturen ein. Sie ist bei sehr jungen Kulturen negativ. Die Hydrolyse der Stärke erfolgt daher langsam.

Tyrosin-Medium

Auf diesem Medium ist die Entwicklung mäßig. Die Kolonien sind kreisförmig mit scharfen Rändern, flach und bilden sehr wenig Falten in Richtung der Radien. Das vegetative Mycel ist braun, die Rückseite der Kolonien braungrau. Es bildet sich kein Luftmycel. Man stellt die Erzeugung eines braunen, mittelreichlichen, löslichen Pigments fest. Es tritt keine Löslichmachung der in dem Medium suspendierten Tyrosinteilchen während der ersten 15 Inkubationstage auf. Dann treten Zonen, wo die Teilchen gelöst sind, von 1 bis 2 mm auf.

Eigenschaften der Kulturen auf Schrägagar

Biochemische Eigenschaften

Die Züchtungseigenschaften und die biochemischen Eigenschaften sind in nachfolgender Tabelle V zusammengestellt. Die verwendeten Züchtungsmedien wurden meist nach den in »The Actinomycetes «, S.A. Waksman, S. 193 bis 197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA., 1950, beschriebenen Formulierungen hergestellt. Die den verschiedenen Medien in »The Actinomycetes« gegebenen Zahlen wurden hier beibehalten. Wenn es nicht anders erwähnt ist, betreffen die Beobachtungen Kulturen auf Schrägagar, die 4 Wochen bei 26° C inkubiert wurden.

Verwendung von verschiedenen Kohlenwasserstoffelementen nach der Methode von ^ Pridham und Gottlieb

Die Kulturen wurden auf Schrägagar durchgeführt. Die Inkubation erfolgte bei 26° C. Zu den Stoffen, die ein rasches und vollständiges Wachstum mit Bildung von Luftmycel und Sporen innerhalb von 10 bis 15 Tagen hervorrufen, gehören Xylose, Rhamnose, Laevulose, Galactose, Maltose, Lactose, Raffinose, Mannit, Mesoinosit, Glucose, Mannose, Ribose, Inulin und Adonit. Die folgenden Stoffe ergeben in der gleichen Zeit ebenfalls ein gutes Wachstum, jedoch ohne Entwicklung von Luftmycel oder Sporen: Arabinose, Saccharose, Stärke, Glycerin. In 30 Tagen haben die Kulturen in Gegenwart dieser letzteren vier Verbindungen jedoch Luftmycel und Sporen wie die Kulturen der vorgenannten Reihe gebildet. Man kann daher sagen, daß alle diese Stoffe verwendbar sind.

Sorbit, Dulcit, Erythrit und Sorbose ermöglichen keine Entwicklung oder führen nur zu einer außerordentlich beschränkten Entwicklung im Verlauf von 1 Monat Inkubation. Man kann daher sagen, daß diese Stoffe nicht verwendbar sind.

Das neue Antibiotikum wird hergestellt, indem der Streptomyces peruviensis oder seine Mutanten unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise durch Immersionszüchtung nach üblicherweise für diese Art der 687

Fermentation verwendeten Arbeitsweisen, gezüchtet wird.

Das Fermentationsmedium soll eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthalten. Die Kohlenstoffquelle kann aus Kohlehydraten, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Dextrinen, Stärke, Lactose, Melasse oder anderen Kohlehydratderivaten, Substanzen, wie Zuckeralkoholen, insbesondere Mannit und Glycerin, bestehen. Man kann jedoch auch mit Vorteil tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, verwenden.

Die zur Fermentierung geeigneten Stickstoff quellen können außerordentlich verschieden sein. Sie können einfache anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, -sulfat, -nitrat, -phosphat, -acetat, -lactat, -citrat oder -tartrat, sein. Man kann auch viel komplexere Substanzen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie Fleischextrakte, Fischmehle, Sojamehle, Arachismehle, Maisquellwasser, Hefeextrakte und -autolysate oder Caseinhydrolysate, verwenden.

Unter den zugefügten mineralischen Elementen besitzen gewisse eine Pufferwirkung, wie beispielsweise Calcium- oder Magnesiumcarbonat oder die Alkalioder Erdalkaliphosphate. Andere bewirken das zur maximalen Erzeugung des Antibiotikums erforderliche Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkalichloride oder -sulfate. Schließlich wirken gewisse in spezieller Art auf die Stoffwechselreaktionen des S. peruviensis. Zu diesen gehören die Zink-, Cobalt-, Kupfer-, Mangan- und Eisensalze.

Zu Beginn der Züchtung soll der p_a-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,0 und 7,5 liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur beträgt 30° C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 25 und 35° C eine befriedigende Produktion erzielt. Die Belüftung der Züchtung stellt keinen kritischen Faktor dar, doch ist eine Belüftung von 0,5 bis 2 1 Luft je Liter Kulturflüssigkeit und Minute besonders vorteilhaft. Die maximale Ausbeute an Antibiotikum wird nach 3 bis 4 Tagen Züchtung erhalten.

Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß man das zur Erzeugung von 6798 R.P. verwendete Kulturmedium in ziemlich weitem Maße variieren kann, je nach den Bedingungen, den verfügbaren Nährsubstanzen oder aus irgendwelchen anderen Gründen.

Das Antibiotikum 6798 R. P. kann aus den Kulturmedien nach verschiedenen Methoden isoliert werden. Es kann bei einem p_H-Wert zwischen 2 und 9 in Gegenwart von Kieselgur filtriert werden, wobei die in dem Filtrat bestimmte Aktivität praktisch von dem P_a-Wert unabhängig ist, wenn die Filtration in den angegebenen Grenzen durchgeführt wird. Zur Erleichterung der weiteren Arbeitsgänge ist es jedoch im allgemeinen zu bevorzugen, das Kulturmedium in einem P_s-Bereich zwischen 2 und 4 zu filtrieren.

Das Antibiotikum kann aus dem Filtrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aus der Gruppe der aliphatischen Alkohole mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise n-Butylalkohol, oder einem Gemisch aus Amylalkoholen oder mit einem Alkohol, wie beispielsweise Benzylalkohol, extrahiert werden. Die Extraktion kann ebenfalls bei einem p_H-Wert zwischen 2 und 9 erfolgen, doch läßt sie sich wirksamer durchführen, wenn der p_H-Wert der wäßrigen Lösung zwischen 3 und 4 beträgt. Es wurde festgestellt, daß die Extraktion verbessert wird, wenn man der wäßrigen Lösung ein Salz, wie beispielsweise

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Tabelle V

Medium	Entwicklungs grad	Vegetatives Mycel	Luftmycel	Lösliches Pigment	Biochemische Eigenschaften
SynthetischerAgar (Medium nach Czapek) Nr. 1	gut	gelblich bis chamois, stark gefaltet, leuchtend	Spuren, weiß, im oberen Teil	sehr wenig reichlich, orange
des Rohres	gelblich
Glucose, synthetischer Agar	desgl.	desgl.	desgl.	desgl.
Nähragar (Nr. 5)	mittel	hellbraun, wenig gefaltet	keines	sehr wenig reichlich, braun
Glucose-Agar (Nr. 7)	mittel	braun, wenig gefaltet	Spuren im oberen Teil des	mittelreichlich, braun
Rohres
A era r τη t f" IpfTitTima Ια f I Ii^ c11 Xlll L v^CLl Ul Llllll 11 CiicL L	mittel	Cl CITlcIcirDig) pidlL	faenr wenig eniwit-Keii, weiß	Keinem	T r\c11 rlffiQr*ηAti ^mn f nlfMntn — J-/UolH-lIllld.CllCll VKJil V^all-tUllt
malat bis etwa 2 cm unter der Oberfläche
Agar mit Stärke (Nr. 10)	gut	cremefarbig-gelblich, srelappt O JJ	nur stellenweise entwickelt, in Form bläulicher Flecken, zwischen denen man das cremefarbig-gelbliche Mycel sieht	Spuren, gelblich
Agar mit Tyrosin	mittel	dunkelbraun, wenig gefaltet	keines	dunkelbraun, reichlich	kein Löslichmachen von
Tyrosin
Kartoffel	gut	braun-hellgrau, stark gefaltet	wenig entwickelt, weiß, bläulich, stellenweise	hellbraun
7\ Pitii1 (τ ρIiifitiρ ι Stiemen]iffrι -Ivv-lllv- V.J v. IcvLlllv- \ O L1 V.111V Lll L Ul J	mi ttel	gCllJllCllCö JTLctU h-iicu ail QX-X Grenze zwischen dem ver flüssigten Ii ti rl Hf1Tii niptit LVii umi via. 111 Illv-HL verflüssigten Teil	Keinem	rlpll f~\V O 11 CfPrM*?) 11 ti 1Π Hßfrl -irpt*— IiClX v/1 ctiigd/i dUii ill UCiil VCl flüssigten Teil	in 1 l\/Tr\na + CPrllPritTPiftYlicrp \/pt*— 111 1 iVlv/ilcll oClliCllllCU liil^c VCl flüssigung, 2 cm Tiefe
ίτΐ 11 ΡΓϊΰΡ-ίτΡί f3 ή tip f\Tt* Ql VJ Jl ULUDt vjc let LlllC I INI. ν)	. 1 mittel		Keines	benr ciuiikci rorncni)raun m dem verflüssigten Teil das Viii TVlJl IU t-' A fc— LV-AZ J. Vllj VX Cl* K2 Pigment diffundiert leicht in dem nicht verflüssigten Teil	desgl.
Magermilch	gut	dicker hellbrauner Ring mit	wenig entwickelt, weißbläu-	gegen die Oberfläche dunkel-	weder Koagulation noch
π ί1ΐΐ1ίβΠ>ϊ*ί1 TlTlPtl ΤίΊρίΊί-ρπ VlUniVVil/J ClLlilV-XX 1 Iv.CftCii	iiv-il, etil UCiil UliLiCll IVclilU UCO	bra 1111 P-PiTpn (1 pn Τλππρτί rl pc Ul ClLlJIj liCtClJ UClJ UUV.1CJ1 UCQ	Pontnnisation das τϊττ hlpiht X V-IJ LWllJ O CL· Llt/llj Vl CLiZt XT IJX V-1 IJ I
RinErOS des vegetativen Tvtvcels -C V .1 Jl, cS VJhV \J v v-W v- l- Il vv-ia JtVi1JVUlu	Rohres immer heller	unverändert auf 6,5, bei 37° C
schwache Floculation von Milch
T,nmififj* inif" „Stärki* /iMr 1 0Λ J fUO vi I Iii IlllL V j l cl1 IVV- \ J. 1 1 t XyJ		WeiRlicJlf* T^InrIiPn Tin T^pi-rlpri VV vIli/lIVIiL J I Wv-jr\.vll «(Iii IJ v/UCli	Lr p 1 ti P c KCIliCn	CPrir Cr1VnxrPPrl ΟΆΙ nl IfVlP OClll OCJJWelCii £ςCJ J Jl J CliC	Hip Tncnhf von Tndid-Tnd-T^p- UlC 'J Llg el V Ul 1 IUUlU JWvl 1\ C
des Rohres und gelblicher Ring an der Oberfläche		Färbung der Lösung	agenz verursacht das Auftreten einer braunroten Färbung (Dextrin), bei älteren Kul turen vollständige Hydrolyse
Nitrat-Nährbouillon	ziemlich gut	dünner grau-hellbrauner	keines	unter der Oberfläche dunkel	Reaktion mit Nitriten positiv
Schleier		braun, am Boden heller werdend
Synthetische Nitratlösung	sehr schwach	einige kleine Kolonien am Boden des Rohres	keines	keines	Untersuchung von Nitriten negativ oder schwache Spuren

13 14

Ammonsulfat, in Konzentrationen, die zwischen 0 und in Wasser suspendiert, durch Alkalischmachen mit 500 g/1 variieren können, zusetzt. Die für die tech- einer verdünnten Natrium- oder Kaliumhydroxydnische Durchführung des Verfahrens am besten ge- lösung bis zu einem p_H-Wert von 8 löst, die erhaltene eigneten Bedingungen bestehen darin, die mit 250 bis Lösung von der zur Bildung des Komplexes dienenden 350 g Ammoniumsulfat je Liter versetzten Filtrate 5 Säure durch Leiten durch eine Kolonne mit einem der Kulturen bei einem p_H-Wert zwischen 3 und 4 zu Ionenaustauscher, wie beispielsweise Amberlit extrahieren. Das Antibiotikum kann durch Einengen IRA 400, oder durch jedes beliebige andere Mittel des Extraktes in dem organischen Lösungsmittel befreit, den p_H-Wert der so erhaltenen Lösung durch unter vermindertem Druck in Form der rohen Base Neutralisieren oder durch Verwendung eines Ionenisoliert werden. Die im Verlauf des Einengens auf io austauscherharzes, wie beispielsweise Amberlit ICR 50, Grund ihrer schwachen Löslichkeit ausgefällte Base auf 8 einstellt und das Alkalisalz des Antibiotikums wird durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Es aus der Lösung durch Lyophilisation oder Einengen ist auch möglich, die Base aus der alkoholischen Lö- und Ausfällen mit einem mit Wasser mischbaren sung mittels Wasser zurückzuextrahieren, wobei man organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthaden p_H-Wert mit einer Base, vorzugsweise unter Zu- 15 nol, Isopropanol oder Aceton, isoliert. Auf die gleiche satz eines schlechten Lösungsmittels, wie Benzol, Di- Weise ist es möglich, Salze mit organischen Basen, chloräthan oder Äther, zwischen 7 und 9 einstellt. Das wie beispielsweise Methylamin, Äthylamin, N-Methylrohe Salz aus Antibiotikum und der verwendeten glucamin u. dgl., herzustellen.

Base kann dann aus der wäßrigen Lösung in geeigne- Die wenig löslichen Erdalkalisalze können durch

ter Weise, beispielsweise durch Eindampfen bei tiefer 20 doppelte Umsetzung aus einer konzentrierten wäß-

Temperatur, isoliert werden. Man kann die alkoho- rigen Lösung eines Alkalisalzes des Antibiotikums

lische Lösung auch mit einer wäßrigen, schwach und einer wäßrigen Lösung eines Salzes des gewählten

alkalischen Lösung eines Salzes, wie beispielsweise Erdalkalikations hergestellt werden.

Natriumsalicylat, extrahieren und den Komplex Das Antibiotikum kann in Form der reinen freien

durch Einengen dieser Lösung direkt zur Kristalli- 25 Base leicht isoliert werden, indem man aus einem

sation bringen. Alkalisalz des Antibiotikums eine konzentrierte Lö-

Man kann das Antibiotikum auch aus dem Kultur- sung in Wasser herstellt und diese auf einen p_H-Wert

filtrat durch Fixieren an einem Adsorptionsmittel, wie von 5 bis 5,5 ansäuert, was zur Ausfällung der schwach

beispielsweise Aktivkohle, Adsorptionserden, wie bei- löslichen Base führt.

spielsweise einem ausgefällten, unter dem Namen 30 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, »Magnesol« bekannten Magnesiumsilicat, oder einem ohne sie zu beschränken. Im folgenden soll unter Ionenaustauscherharz, wie beispielsweise Amberlit »Einheit« die Minimalmenge des Produkts verstanden IRC 50, das vorher durch Waschen mit verdünnter werden, die, gelöst in 1 cm³ eines geeigneten Kultur-Säure regeneriert wurde, isolieren. Das aktive Pro- mediums, die Entwicklung von Mycobacterium dukt wird dann mit einem Lösungsmittel, wie bei- 35 sp. ATCC 607 hemmt,
spielsweise Methylalkohol oder Äthylalkohol, mit 10 Beisill
bis 30°/» Wasser und einem Gehalt an Salzsäure oder ⁶¹ ^^le

Ammoniak eluiert, wobei man zur Elution auch eine In ein Fermentationsgefäß mit 170 1 Inhalt bringt organische Base, wie mit Wasser versetztes Pyridin, man folgendes Medium ein:
verwenden kann. Das Antibiotikum wird dann aus der 40 Maisquellwasser (50«/«» Trockenerhaltenen Losung durch jede geeignete Arbeitsweise extrakt) 2 400 k^CT
isoliert. Saccharose 3 600 kg
Die Reinigung kann durch Chromatographie an Neutrales Ammoniumsülfat'.' 0^240 kg

Aktivkohle oder verschiedene andere Adsorptions- Calciumcarbonat 0,840 kg

mittel oder durch Extraktion mit einem Lösungsmittel 45 Soiaöl 0 0601

durchgeführt werden. Es wurde jedoch gefunden, daß Leitungswasser'........... ad lOo'l

eine besonders wirksame Methode darin besteht, einen

aus der Base und Alkalisalzen gewisser organischer Der p_H-Wert beträgt 6,2.

Säuren, beispielsweise der Salicylsäure, p-Oxybenzoe- Das Medium wird durch 40minütiges Durchleiten säure, Kresotinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Mandel- 50 von Dampf von 120° C sterilisiert. Nach Abkühlen säure oder Sulfanilsäure, gebildeten Komplex zur auf 30° C beträgt das Volumen 120 1 und der p_H-Wert Kristallisation zu bringen. Der Komplex wird durch 6,9. Das Medium wird dann mit 250 cm³ einer gerührAuflösen der rohen Base in einer wäßrigen Lösung ten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur des Stamms mit einem Gehalt von 10 bis 40 Gewichtsprozent des Streptomyces Nr. 6227 beimpft.

Salzes der verwendeten Säure erhalten. Es hat sich 55 Die Kultur im Fermentationsgefäß wird mit 5 m^s gezeigt, daß eine Konzentration von 25% besonders steriler Luft je Stunde belüftet und 24 Stunden gegünstig für die Durchführung des Verfahrens ist. Die rührt bzw. geschüttelt. Sie dient zur Beimpfung der Base wird in der wäßrigen Lösung suspendiert und Produktionskultur.

die Auflösung durch Alkalischmachen bis zu einem Diese wird in einem Fermentationsgefäß von 800 1 P₃-Wert zwischen 7 und 9 mit der Base, die zur Salz- 60 Inhalt durchgeführt, das mit folgendem Medium bebildung der verwendeten organischen Säure diente, schickt ist:

erzielt. Nach Auflösung wird die Lösung durch Zu- Maisquellwasser (50 % Trockengäbe von beispielsweise Essigsäure bis zu einem extrakt) 8 kg
PH-Wert zwischen 4,5 und 5,5 angesäuert. Die Kri- Saccharose12 kanalisation des Komplexes kann zwischen 0 und 50° C 65 Neutrales Ammoniumsülf at'.'.'.' 0,800 kg

durchgeführt werden doch wurde gefunden, daß sie Calciumcarbonat 2,800 kg

besonders rasch und vollständig erfolgt, wenn die Soi aöl 16001

Temperatur zwischen 35 und 40° C gehalten wird. Leitungswasser'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.' 'ad 3701

Die reinen Alkalisalze können aus dem kristallisierten Komplex hergestellt werden, indem man diesen 70 Der p_H-Wert beträgt 6,2.

15 16

Das Medium wird bei 120° C durch 40minütiges regelmäßig und erreicht in 30 Stunden 6,0. Dann

Durchleiten von Dampf sterilisiert. Nach Abkühlen steigt er langsamer bis zu einem Wert von 7, der nach

beträgt das Volumen 400 1 und der p_H-Wert 6,9. 90 Stunden Züchtung erreicht wird. Die Endaktivität

Das Medium wird dann durch Einbringen von 40 1 beträgt 375 Einheiten/cm³,

der Impfkultur aus dem Fermentationsgefäß von 1701 5 „ . .

Inhalt beimpft und dann mittels einer Turbine mit Beispiel

260 Umdr./Min. gerührt, mit 15 m^a steriler Luft je 440 1 Gärmaische werden mit Oxalsäure bis zu

Stunde belüftet und auf 30° C gehalten. einem p_H-Wert von 2,5 angesäuert und dann mit 20 kg

Die Entwicklung des Mycels erfolgt reichlich und Kieselgur versetzt. Die Suspension wird 30 Minuten

rasch. Zu Beginn des Arbeitsgangs fällt der p_H-Wert ία gerührt und dann auf einer Filterpresse filtriert. Der

regelmäßig und erreicht nach 30 Stunden 6,3. Er steigt Filterkuchen wird mit 1001 Wasser gewaschen. Fil-

hierauf wieder auf 7,2 und bleibt bis zu 70 Stunden trat und Waschflüssigkeiten machen vereinigt 460 1

auf diesem Wert. Die Endaktivität gegenüber Myco- Lösung aus, die eine Aktivität von 230 Einheiten/cm*

bacterium sp. ATCC 607 beträgt 205 Einheiten/cm³. besitzen. Das Filtrat wird nacheinander unter Rühren

. 15 mit 160 1 n-Butylalkohol, 138 kg Ammoniumsulfat

Beispiel 2 _un(j _zur Einstellung des p_H-Wertes auf 3,5 mit einer

Ein Fermentationsbehälter von 8001 Inhalt wird verdünnten Natriumhydroxydlösung versetzt. Nach

mit folgendem Medium beschickt: 30minütigem Rühren läßt man absetzen und trennt

Brennerei-Hefeautolvsat . 10 400 kg ^{die Butanol}P^{hase ab}- ^{Darm führt man eine zweite}

Natriumchlorid 4-ks ²⁰ Extraktion mit 701 Butylalkohol durch. Die beiden

Magnesiumsulfat0 400k°- Butylalkoholextraktewerden vereinigt und mit 251

Monokaliumphosphat ".'.'.Y.'.'.'.'. oisOO k| ^^asser S^ewasc^ⁿ- Man erhält so 230 1 Butylalkohol-

Leitungswasser ad 3101 ^lofⁿ&; ^die unter vermindertem Druck ohne Uber-

^σ schreitung einer lemperatur von 35 C bis zu einem Der pij-Wert wird mit Natronlauge auf 6,7 einge- 25 Volumen von 101 eingeengt werden. Nach 15stünstellt. Dann werden 2 kg Calciumcarbonat und 1,600 1 digem Abkühlen des Konzentrats auf +4° C wird das Sojaöl zugesetzt. in Form der amorphen Base ausgefallene Antibiotikum Das Medium wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, abgesaugt, mit Butylalkohol gewaschen und unter versterilisiert, wobei nach Abkühlen ein Bouillonvolumen mindertem Druck getrocknet.

von 3501 erhalten wird. Dem so hergestellten Medium 30 Man erhält so 165 g rohe Base mit einer Aktivität

setzt man dann 50 1 einer sterilisierten Glucoselösung von 260 Einheiten/mg.

mit einem Gehalt von 20 kg Glucose zu. Der p_H-Wert 128 g der rohen Base werden in den Salicylkomplex

beträgt 6.75. übergeführt, indem man sie in 0,55 1 einer 25%igen

Das Medium wird dann durch Einbringen von 40 1 wäßrigen Natriumsalicylatlösung suspendiert, durch

der Impfkultur beimpft, anschließend mit einer Tür- 35 Einstellen des p_H-Wertes mit 30 cm³ 3 n-Natronlauge

bine mit 260 Umdr./Min. gerührt, mit 15 m³ steriler auf p_H 7 löst, die Lösung filtriert und den p_H-Wert

Luft je Stunde belüftet und auf 30° C gehalten. durch Zugabe von 30 cm³ 50°/oiger Essigsäure auf 4,8

Die Pilzentwicklung erfolgt sehr reichlich und einstellt. Es beginnen sich langsam Kristalle zu bil-

rasch. Zu Beginn des Arbeitsgangs fällt der p_H-Wert den. Die Lösung wird 20 Stunden auf 40° C gehalten

rasch, erreicht in 30 Stunden 5,2 und steigt dann wie- 40 und der Komplex dann abgesaugt, nacheinander mit

der auf 7.0, einen Wert, den er nach 65 Stunden der 100 cm³ 25%iger Natriumsalicylatlösung und 200 cm³

Züchtung erreicht. Die Endaktivität beträgt 330 Ein- Wasser gewaschen und schließlich getrocknet.

heiten/cm³. Man erhält so 65 g des Komplexes mit einer Akti-

Beispiel 3 ^v'^{tat von} Einheiten/mg.

45 10 g des Komplexes werden unter den gleichen Be-Ein Fermentationsgefäß von 800 1 Inhalt wird mit dingungen umkristallisiert, wobei man als Lösungsfolgendem Medium beschickt: mittel 70 cm³ Natriumsalicylatlösung verwendet. Man

Ammoniumchlorid 2,250kg ^{erhält s}^⁷'¹ f ^{des in} ζ^οπη, ^weißf ¹^^{deln 1}^^istalli"

Stärke 500 kg sierten Komplexes mit den folgenden Kennzahlen:

Natriumchlorid 6,750 kg ⁵⁰ Aktivität: 560 Einheiten/mg;

Magnesiumsulfat 0,450 kg F. (Kapillare): 238 bis 240° C;

Monokaliumphosphat 0,450 kg [a] f = -18° (c = 1% in n/10 Na OH),

Calciumcarbonat 4,500 kg [a] ²S = -33° (c = 1 % in n/10 H Cl) ;

Zinksulfat 0,013 kg C = 55,4 %, H = 5,65 %, O = 23,8 %, N = 13,3 %,

Cobaltchlorid 0,00013 kg ⁵⁵ Na = 2,7%, Salicylsäure = 12,8%.

Leitungswasser'.'.'.'.".'.'.'.'.'.'.'.' 'ad 4201°° ¹ , ^Das, Ultraviolettspektrum weist zwei Maxima, die

40%ige Natronlauge 0,1901 ^den Wellenlangen 222 und 257,5 ηιμ entsprechen, und

ein Minimum bei 240 πιμ auf.
Der p_H-Wert beträgt 6,6. 60 50 g des kristallisierten Komplexes werden in 1,5 1 Das Medium wird durch 40minütiges Durchleiten destilliertem Wasser suspendiert, der p_H-Wert wird von Dampf von 122° C sterilisiert. Nach Abkühlen mit 44 cm³ 10%iger Natronlauge auf 8,7 eingestellt auf 30° C beträgt das Volumen 450 1 und der und die so erhaltene Lösung durch eine Kolonne mit P₁₁-Wert 7,4. 100 cm³ Amberlit IRA 400, der zuvor durch Waschen Das Medium wird dann, wie im vorstehenden be- 65 mit n-Natronlauge und dann mit destilliertem Wasser schrieben, beimpft, mit einer Turbine mit 205 Umdr./ regeneriert wurde, geleitet. Nach Durchleiten der Min. gerührt und mit 15 m³ steriler Luft je Stunde Lösung wäscht man den Ionenaustauscher mit belüftet. 200 cm³ Wasser und fügt das Waschwasser zu der Die Pilzentwicklung erfolgt reichlich und sehr Lösung. Die Lösung des Natriumsalzes des Antirasch. Zu Beginn des Arbeitsgangs fällt der p_H-Wert 70 biotikums wird teilweise mit Amberlit IRC 50, der

durch Waschen mit η-Salzsäure und darm mit Wasser regeneriert wurde, bis zu p_H 8 neutralisiert. Die so erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck auf 0,5 1 eingeengt und dann der Lyophilisation unterworfen.

Man erhält so 47 g Natriumsalz, das die folgenden Kennzahlen aufweist:

Aktivität: 600 Einheiten/mg;
[a] %o ₌ _20° (c= in n/10 JSTaO H),
[a] ²S = -32° (c = 1 % in Wasser); C = 54,25 %, N = 6 o/o, O = 22,45Vo, N = 14,8 %, Na = 2,6%.

Das Ultraviolettspektrum weist zwei Maxima, die den Wellenlängen 222 bis 223 und 257,5 πιμ entsprechen, und ein Minimum bei 237,5 ηιμ auf.

IOg des Natriumsalzes werden in IlOcm³ destilliertem Wasser gelöst, und der p_H-Wert wird durch Zugabe von n/10 Salzsäure unter Rühren auf 5,2 herabgesetzt. Nach 3stündiger Abkühlung der so erhaltenen Suspension auf + 5° C saugt man die ausgefallene Base ab, wäscht sie mit Wasser und trocknet.

Man erhält so 5 g der Base, die folgende Kennzahlen aufweist:

Aktivität: 615 Einheiten/mg;

F. (Kapillare): 240 bis 245° C;

[_a] * = -18° (c= 1% in n/10 NaOH),

[a] f = -33° (c = 1 % in n/10 H Cl);

C = 55,25 bis 55,35 %, H = 5,9 bis 6,1 %,

O = 23,05 bis 23,25 Vo, N = 15,6 bis 15,65 %; Asche (Schwefelsäure-Methode): weniger als 0,1%.

Das Ultraviolettspektrum weist zwei Maxima, die den Wellenlängen 222 bis 223 πιμ und 257,5 πιμ entsprechen, und ein Minimum bei 237,5 ιημ auf.

Beispiel 5

305 1 Gärmaische werden mit verdünnter Schwefelsäure auf einen p_H-Wert von 2,9 angesäuert und mit 15 kg Filterhilfe versetzt. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt, dann filtriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Man erhält so 340 1 Lösung mit einer Aktivität von 172 Einheiten/cm³. Dieser Lösung setzt man 25 kg Natriumsulfat zu, stellt den p_H-Wert mit verdünnter Natronlauge auf 3,7 ein und extrahiert zweimal nacheinander mit 120 und 50 1 n-Butylalkohol. Die vereinigten Butylalkoholextrakte werden mit 20 1 Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck auf 101 eingeengt. Nach 15stündigem Aufbewahren des Konzentrats bei +4° C wird die rohe Base abfiltriert, gewaschen und getrocknet.

Man erhält so 68 g der Base mit einer Aktivität von 275 Einheiten/mg.

B e i s ρ i e 1 6

400 1 Gärmaische werden durch Zugabe von Oxalsäure auf einen p_H-Wert von 2,4 angesäuert, und die Kulturbrühe wird nach Zugabe von 18 kg Filterhilfe auf einer Filterpresse filtriert. Nach Waschen des Filterkuchens mit Wasser erhält man 410 1 klare Lösung mit einer Aktivität von 250 Einheiten/cm³. Der p_H-Wert der Lösung wird mit verdünnter Natronlauge auf 3 eingestellt. Die Extraktion führt man direkt kontinuierlich und nach dem Gegenstromprinzip mit Hilfe einer 2-Stufen-Zentrifuge unter Verwendung eines Butylalkoholvolumens, das, bezogen auf die wäßrige Lösung, 35^e/o beträgt, durch. Der Butylalkoholextrakt wird nacheinander mit 15 1 einer wäßrigen 25%igen Ammoniumsulfatlösung und dann mit

101 Wasser gewaschen. Die, wie im Beispiel 4 beschrieben, behandelte Butylalkohollösung liefert 110 g rohe Base mit einer Aktivität von 265 Einheiten/mg.

10 g der Base werden in 40 cm³ einer wäßrigen 25%igen Lösung von kresotinsaurem Natrium, die auf 0° C abgekühlt wurde, gelöst. Nach Filtrieren der Lösung läßt man sie 20 Stunden bei 40° C stehen. Die Kristalle werden abgesaugt, mit 5 cm³ 25%iger Lösung von Natriumkresotinat und dann mit 10 cm³ Wasser gewaschen und schließlich getrocknet.

Man erhält so 1,6 g des Komplexes mit einer Aktivität von 410 Einheiten/mg.

Beispiel 7

860 1 Gärmaische werden filtriert und nach Zugabe von Ammoniumsulfat, wie im Beispiel 4 beschrieben, mit Butylalkohol extrahiert. Man erhält so 410 1 Butylalkohollösung, die erneut nacheinander mit viermal je 20 1 einer wäßrigen Natriumsalicylatlösung mit 10 g/1 extrahiert werden. Bei jeder Extraktion wird der p_H-Wert der wäßrigen Phase mit verdünnter Natronlauge auf 8 eingestellt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden unter vermindertem Druck auf 2 1 eingeengt (die Konzentrierung wird bei einer Temperatur unterhalb 35° C durchgeführt).

Die wäßrige Lösung wird mit 30 cm³ 50%iger Essigsäure auf einen p_H-Wert von 4,8 angesäuert und 20 Stunden auf 40° C gehalten. Der kristallisierte Komplex wird filtriert, gewaschen und getrocknet.

Man erhält so 138 g des Komplexes mit einer Aktivität von 435 Einheiten/mg.

100 g des Komplexes werden in 3,3 1 Wasser suspendiert. Das Antibiotikum wird durch Zugabe verdünnter Natronlauge bis zu einem p_H-Wert von 8 gelöst, die Salicylsäure durch Fixieren an Amberlit IRA 400 entfernt und die Lösung unter vermindertem Druck, ohne eine Temperatur von 35° C zu überschreiten, bis auf ein Volumen von 0,5 1 eingeengt. Das Natriumsalz wird durch Eingießen der Lösung in 6 1 IsopropylaIkohol ausgefällt. Die Suspension wird über Nacht auf + 4° C abgekühlt und das Natriumsalz filtriert, gewaschen und getrocknet.

Man erhält so 53 g Natriumsalz mit einer Aktivität von 535 Einheiten/mg.

Beispiel 8

375 1 Gärmaische vom p_H 7,1 werden mit Kieselgur versetzt und filtriert. Man erhält so 3201 wäßrige Lösung mit einer Aktivität von 120 Einheiten/cm³. Die Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf einen P_a-Wert von 3 angesäuert, mit 100 kg Ammoniumsulfat versetzt und dreimal mit je 80 1 und zweimal mit je 401 Butylalkohol extrahiert. Man erhält so 170 1 Extrakt, den man zweimal mit je 25 1 Wasser von p_H 3 wäscht. Die Butylalkohollösung versetzt man mit 170 1 Dichloräthan und extrahiert viermal mit je 10 1 Wasser, wobei man jedesmal den p_H-Wert durch verdünnte Natronlauge auf 5 einstellt. Man vereinigt die wäßrigen Extrakte, stellt den p_a-Wert auf 6,5 ein und engt unter vermindertem Druck auf 30 1 ein. Das Konzentrat wird durch eine Kolonne mit 101 eines Austauschharzes, z. B. Amberlit IRC 50, das mit η-Salzsäure behandelt und dann mit Wasser gewaschen wurde, mit einer Geschwindigkeit von 2 1/Std. filtriert. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und mit η-Ammoniak eluiert. Die angereicherte Elutionsfraktion wird unter vermindertem Druck auf 1 1 eingeengt. Dann verdünnt man die wäßrige Lösung mit 1 1 Äthanol und fällt die rohe Base durch einen Überschuß an Aceton aus.

909 610/373

Claims (1)

1. Man erhält so 98 g rohe Base mit einer Aktivität von 210 Einheiten/mg.

   Beispiel 9

   3181 KuIturfiltrat vom p_H 2,9 und einer Aktivität von 215 Einheiten/cm³ werden durch eine Kolonne geleitet, die 19 1 zuvor mit verdünnter Salzsäure behandelten und mit Wasser gewaschenen Amberlit IRC 50 enthält. Das Filtrat läuft mit einer Geschwindigkeit von 15 1/Std. durch den Austauscher. Die Kolonne wird mit 50 1 Wasser und dann mit 201 Methylalkohol gewaschen. Dann wird das Harz mit Methylalkohol, der Salzsäure in einer Konzentration von etwa Normalität enthält, mit der Geschwindigkeit von

   3 1/Std. eluiert. Man gewinnt so 30 1 Eluat, die man unter Verwendung von Amberlit IR 4B teilweise bis zu einem p_H-Wert von 5 neutralisiert. Nach Einengen des Eluats unter vermindertem Druck auf 0,5 1 wird die rohe Base mit 6 Volumina Äther ausgefällt.

   Man erhält so 96 g rohe Base mit einer Aktivität von 120 Einheiten/mg.

   Patent a .vspruch:

   ίο Die Verwendung von Pilzstämmen aus der

   Gruppe der Streptomyces, insbesondere von Streptomyces 6227, zur Herstellung eines neuen Antibiotikums 6798 R. P. auf biologischem Wege, vorzugsweise im bekannten Submersverfahren.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen