DE939397C - Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines Produktes mit antiviraler Aktivitaet - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines Produktes mit antiviraler Aktivität Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines Produktes, aus welchem man eine neue antivirale Substanz gewinnen kann, durch Vergärung geeigneter Nährmedien mit einer neuen Species von Nocardia, welche als Nocardia formica bezeichnet wird sowie auf das dabei entstehende Fermentationsprodukt.
• Wenn auch der Mikroorganismus Nocardia formica zur Gattung Nocardia gehört, entspricht er keiner der bisher bekannten Species dieser Gattung, die in der 6. Auflage von Bergeys Manual beschrieben ist. Die neue Species kann indessen durch ihre Kultur- und morphologischen Eigenschaften wie folgt beschrieben werden: Kultureigenschaften und Morphologie von Nocardia formica dorphologie vegetativ . . .. Ausgedehnte Mycelentwicklung, kein Abbrechen der Hyphen; bildet kaum sichtbare Fäden und cytoplasmische Kondensationen. submers .. .. Gerade und gekrümmte Stäbchen; Y- und V-Formen; Stäbchen o,g bis I, I X I, 3 bis 6 Mikron; gram positiv, nicht säurefest. aktivem Material aus diesem Produkt wurde nun gefunden, daß zwar die antibiotische Aktivität keine besondere Bedeutung hat, daß man aber aus diesem Produkt eine neue antivirale Substanz gewinnen kann, die gegen bestimmte Pflanzenviren, wie das Tabakmosaikvirus, aktiv ist.
• Nährmedien zur Herstellung des neuen Produktes sollen eine oder mehrere folgender komplexer stickstofilialtiger Substanzen enthalten: Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Sojabohnenmehl, Maisquellwasserkonzentrat und lösliche Schlempebestandteile, ferner einen Zucker, - wieMaltose oder Dextrose, und schließlich geeignete Mineralien, welche getrennt oder zum Teil im Fleischextrakt oder den anderen komplexen stickstoffhaltigen Nährstoffen zugesetzt werden können. Im allgemeinen ergibt ein Nährmedium, welches etwa 10/0 Zucker, I bis 201o stickstoffhaltiges Material und bis zu etwa o, 5 °/0 Mineralsalze einschließlich Na Cl enthält, eine zufriedenstellende Fermentation; sehr gute Ergebnisse werden mit Medien erzielt, welche Dextrose, ein Caseinhydrolysat und Fleischextrakt als Nährstoff enthalten. Natürlich ergeben nicht alle Stämme des zur Bildung eines Produktes mit antiviraler Aktivität befähigten Organismus mit dem gleichen Nährmedium maximale Ausbeuten, so daß die Zusammensetzung des Nährmediums dem jeweils verwendeten Stamm angepaßt werden muß.
• Aus diesem Grunde empfiehlt es sich, als Impfstoff jeweils eine solche Kultur zu verwenden, welche in einem Medium von der gleichen Zusammensetzung gezüchtet ist, wie sie das Fermentationsmedium besitzt.
• Zur Durchführung der Fermentation kann ein sterilisiertes Medium mit einem 40stündigen vegetativen Wachstum des Organismus beimpft und dann submers unter Rühren und starker Belüftung bei etwa 20 bis 37°, vorzugsweise 27 bis 28° bebrütet werden.
• Die Bebrütungszeit kann je nach dem betreffenden Medium und verwendeten Stamm etwa 48 bis 96 Stunden betragen, im allgemeinen aber ergibt eine etwa 72stündige Bebrütung zufriedenstellende Ausbeuten.
• Das pH des Ausgangsmediums wird auf etwa 7 bis 7,2 eingestellt, kann aber nach der Sterilisierung und Beimpfung auf etwa 5,8 fallen und dann nach einer etwa 72stündigen Bebrütung gleichmäßig auf etwa 8,6 ansteigen. Wenn das p, nach dem anfänglichen Absinken nicht wieder ansteigt, ist die Ausbeute an antiviraler Substanz aus dem Fermentationsprodukt unvergleichlich viel geringer als gewöhnlich. Der Zusatz von Alkali zum Medium während der Bebrütungsperiode erhöht indessen die antivirale Aktivität nicht merklich.
• Nach Beendigung der Fermentation wird die Nährlösung filtriert, um. Zellinaterial und andere Feststoffe zu entfernen. Das Filtrat stellt das Produkt dar, aus dem die antivirale Substanz gewonnen werden kann.
• Eines der Verfahren zur Gewinnung der antiviralen Substanz besteht in der Behandlung des Produktes mit Aktivkohle, an welcher die antivirale Aktivität adsorbiert wird. Die Kohle wird dann mit angesäuertem wäßrigem Alkohol eluiert und das saure Eluat neutralisiert und zur Trockne verdampft. Dieses Rohkonzentrat enthält die Hauptmenge der antiviralen Substanz. Man kann das Rohkonzentrat mit Gelatinestabilität .. Nach - 4 Tagen; Verflüssignng; grauweiße submerse Kolonien; kein lösliches Pigment.
• Agarnährmedium... Gutes Wachstum, kein Luftmycel.
• Nährbrühe .. . Flockenartiges Wachstum.
• Stärke-Agar .. . Hydrolysiert, kein lösliches Pigment.
• GIucose-Asparagin.. Gutes Wachstum, Luftmycel grauweiß. -Glycerin-Nähragar.. Sehr schlechtes Wachstum.
• Lackmusmilch .. . Peptisiert, neutral.
• Nitrat-Agar .. . Nitritbildung.
• Rohrzuckerlösung nach Czapek. . Spärliches Wachstum.
• Rohrzuckeragar nach Czapek.. . Sehr schlechtes Wachstum.
• Kartoffelkeil.. .. Sehr schlechtes Wachstum.
• Casein. .. Hydrolysiert.
• Ei-Medium nach Do r set . .. Ausgezeichnetes Wachstum, gelbbraun gefärbt, zusammengerollt, feucht; keine Verflüssigung, Medium nicht verfärbt.
• Blutserum nach Löffler.. . Ausgezeichnetes Wachstum, gelbbraun gefärbt,. zusammengerollt, Medium 50 °/Overflüssigt ; Medium und Exsudat braun.
• Paraffin.. . Zur Verwertung von Paraffin nicht befähigt.
• Phenol.. .. Zur Verwertung von Phenol nicht befähigt.
• Reaktion anorganischer Medien, die Kohlehydrate enthalten. . . 0,5 % Glucose sauer, 0,5 % Glycerin sauer, 0,5% Lactose sauer, 0,5 Olo Maltose sauer, 0,5 % Rohrzucker keine Veränderung.
• Andere Eigenschaften.... .. Aerob, optimale Temperatur 28", optimales p 7 bis 7,5.
• Der Mikroorganismus Nocardia formica wurde bei der Suche nach neuen Organismen entdeckt, die sich zur Erzeugung wertvoller Antibiotica eignen. Die Züchtung dieses Organismus in Nährmedien, die komplexe stickstoffhaltige Nährstoffe, Mineralien und Zucker enthalten, ergibt ein Produkt, welches eine erhebliche antibiotische Aktivität besitzt. Bei der weiteren Untersuchung über die Gewinnung von Lösungsmitteln behandeln und auf diese Weise eine Lösung von hoher antiviraler Aktivität von dem ausgefällten Anteil niedriger antiviraler Aktivität trennen.
• Durch Trocknen der Lösung und chromatographische Behandlung einer wäßrigen Lösung des getrockneten Materials mit Aktivkohle erhält man Eluatfraktionen von noch höherer Konzentration an antiviraler Substanz, welche bei Einengung zur Trockne ohne weitere Reinigung zur Behandlung bestimmter Pflanzenviren, z. B. des Tabakmosaikvirus, verwendet werden kann. Beispielsweise ergibt das Besprühen von Tabak mit einer etwa o,10/0igen wäßrigen Lösung dieses Materials keine sichtbare Beschädigung des Blattgewebes, während die Virenmenge in den Pflanzen um etwa 70 bis go % gesenkt wird.
• Das nachfolgende Beispiel erläutert die Herstellung des Fermentationsproduktes, ohne die Erfindung erschöpfend zu kennzeichnen.
• Beispiel Es wird ein Nährmedium von folgender Zusammensetzung hergestellt: Dextrose .................. 1,0 0Io Caseinhydrolysat .................. I, O/, Fleichextrakt ...................... 0,3 % NaCl................................ 0,5% Wasser.............................. 97,2% 7570 1 dieses Mediums von einem p, von etwa 7 werden durch I5minutiges Erhitzen auf 1200 sterilisiert.
• Das Impfmaterial wird wie folgt hergestellt: Der Mikroorganismus Nocardia formica wird gewöhnlich in einem Rohr mit Erde oder unter Mineralöl auf einem Agarboden gelagert. Eine mit dem oben angegebenen Fleischmedium beschickte Schüttelflasche von 250 cm3 Inhalt wird mit dem Organismus angeimpft und bei 28° so lange geschüttelt, bis ein gutes Wachstum entstanden ist (24 bis 48 Stunden). Diese Flasche dient nun dazu, eine 2-l-Flasche zu beimpfen, die etwa 750 cm3 Fleischmedium enthält und 35 bis 48 Stunden bei 28° geschüttelt wird. Diese Brühe wird nun zur Beimpfung eines Tanks von 11361 Fassungsvermögen verwendet, welcher das gleiche Fleischmedium enthält und 40 Stunden bei 28° der Fermentation unterworfen wird. Dieser II36-1-Ansatz wird dann als Impfstoff für den 7570-1-Ansatz verwendet. Das beimpfte Medium wird submers unter Rühren und starker Belüftung 72 Stunden bei 28° fermentiert. Der Verbrauch an Dextrose und das pH des Mediums ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

  Zeit Dextrose
  pH
  (Stunden) (mg/cm3)
  0 6,6 9,9
  12 6,8 3,9
  24 7,4 I,I
  36 7,8 0,1
  48 8,2
  60 8,5
  72 8,5

  Nach Abfiltrieren des Mycels kann das Fermentationsprodukt als solches verwendet werden; man kann es aber auch zunächst konzentrieren und dann aus ihm die antivirale Substanz gewinnen.

Claims (6)

1. PATENTANSPRÜCHE: I. Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines Produktes von antiviraler Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium submers unter Belüftung mit dem Mikroorganismus Nocardia formica vergärt und gegebenenfalls aus der vergorenen Nährlösung die antivirale Substanz gewinnt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährmedium ein solches verwendet, welches ein komplexes stickstoffhaltiges Nährmittel, einen Zucker sowie anorganische Salze enthält.
3. 3. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die in der vergorenen Nährlösung enthaltenen Feststoffe abtrennt und entfernt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das PH des Nährmediums vor der Sterilisation auf etwa 7 bis 7,2 einstellt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die stickstoffhaltige Komponente des Nährmediums aus der Gruppe Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Sojabohnenmehl, Maisquellwasserkonzentrat, lösliche Schlempebestandteile und Gemische derselben und den Zucker aus der Gruppe Maltose und Dextrose auswählt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium verwendet, welches etwa 10/0 Zucker, I bis 20/0 stickstoffhaltiges Material und etwa 0,5 % anorganische Salze, vorzugsweise etwa IO/o Dextrose, IO/o Caseinhydrolysat, 0,50/0 Fleischextrakt und 0,5 0/o NaCl enthält.