DE1467883A1 - Neues Antibiotikum,Verfahren zu dessen Herstellung und dreses Antibiotikum enthaltendes Tierfutter - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums und dieses Antibiotikum enthaltendes Tierfutter

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotisohe Substanz, welche hier ale A 3823 bezeichnet wird, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Das neue, erfindungsgeraasu hergestellte Antibiotikum A 3323 ist ein neisser, kristalliner, fester Stoff, der bei etwa 103 bis 106-⁰C schallet, in niedermolekularen Alkoholen, niedermolekularen Estern, Ketonen, Chloroform, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxyd löslich und in Wasser unlöalich ist. Die Substanz hat eine titrierbare Gruppe vom

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pK'_a = 6,55 in 66£igom, wiaarigem Dlmethylformaldehyd. Die optisohe Drehung ^α/ρ der 1#igen Lösung in Methanol beträgt +47,7°» Die Eleraeht,aianal./se ergibt nach zwei Stunden Trocknen im Vakuum Über Phosph<>rpentoxyd bei etwa 60 ⁰C eine annähernde Zusammensetzung ron 62,78 # Kohlenstoff, 9,43 $> Wasserstoff und 26,61 # Sauerstoff und nach dem Trocknen in einer Biockschmelzpunktsvorrichtung eine annähernde Zusammensetzung von 64,66 $> Kohlenstoff, 9,58 i» Wasserstoff und 25,41 $> Sauerstoff. Dao Molekulargewicht beträgt etwa 677, berechnet aus Titrotionowcrten. Die Lösung des Antibiotikums , in Chloroform ^e Igt die folgenden untersoheidbaren Banden deu Ultrarotabsorptionespi ektrums: 2,73, 2,96 (Schulter), 3,05, 3,30, 3,47, 5,86,*6.23, 6,83, 7,02, 7,26, 7,56, 7,66, 7,76, 8,04, 9,02, 9,17, 9-47, 9,78, 9,91, 10,06, 10,25, 10,58, 10,82, 10,98, 11,21, 11,4', 11,64, 11,82 und 11,97 Mikron. Die Substanz zeigt keine tier küche Absorption im Ultraviolettbereich.

Gegenstand der Erfindung jst ein Verfahren zur Herstellung dee Antibiotikums A 3823, daß daduroh gekennzeichnet ist, dass man Streptomyces cinramonensio ATCC 15413 in einem Kulturmedium unter eubmerten, aeroben Bedingungen zUohtet, welches assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorßaniüohen Salzen enthält, bis eine wesentliche Menge

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der Substanz A 3823 durch diesen Pilz in diesem Kulturmedium hergestellt worden ist.

Die Erfindung stellt eusaerdem ein Tierfutter zur Verfügung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es das Antibiotikum A 3823 enthält, aowie ein Verfahren zur Herstellung derarti ge*>~Tierf utter.

Das Antibiotikum Λ 3^23 unterliegt einer raeohen Verärderung in saurer Lösung unter Alctivitäteverluat. In basischer Lösung dagegen ist das Antibiotikum merklich beständig. So unterliegt beispielsweise eine Prob3 des Antibiotikums, das man bei einem pH-Wert von 11 60 Stunde ι unter Rückfluss erhitzt, keiner nichtbaren Änderung, abgisehen von tier Bildung des Salzes . der Säure. Wenn man das \ntibiotikum als trockenes, kristallines Material lagert, 8 3 bleibt A 3823 lange Zeit beständig.

Dag kernmagnetisch He son inzspektrum deutet darauf hin, dass elas MolekUl eine Carboxy jruppe, 3 bis 4 Hydroxygruppen und cine /therbindung aufweist. Der Rest des Moleküls scheint aus Methylen- und Methyl-Gruppierungen zu bestehen. Dae Ultrarotubsoiptionespektrum dna Antibiotikums A 3823 in Chloroformlöaung bei 0,1 mm Schichtdicke zeigt die anliegend beigefügte Figur 1.

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Ein Rüntgenpulverdiagramm dee Antibiotikums unter Verwendung einer Gr-Strahlung mit einem Vanadiumfilter zur Berechnung der Schichtlinienabetände ergibt folgende Werte:

13,01	a.	0^05
11,08		0,10
9,70		ο,βο
9,39		0,90
8,68		0,50
8,20		0,20
7,93		0,20
7,50		0,20
7,21		0,80
7,01		1,00
6,39		0,90
5,47		0,90
5,56		0,05
5,19		0,70
4,95		0,60
4,65		0,50
4,47		0,10
4,26		0,60
5,97		0,10
3,77		0,05
3,58		0,05
3,53		0,05
3,44		0,05
3,32		0,05
3,17		0,05
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Die berechnete empirische Formel von A 3823 let ^·κξ^(Ρ^2' Jßdoch lässt das Verhalten der Verbindung unter scharfen Trocknungebedingungen vermuten» dass dao Antibiotikum mit einem Mol Kristallwasaer kristallisiert und die empiriaohe Formel tiou Antibiotikums ^gHg^Oj j lautet.

Qualitative Versuche mit der Verbindung A 3823 lassen vermuten, dass keine reduzierten oder Aminozucker vorhanden sind. Die Steroid- und QluconsHureteate sind ebenfalls negativ.

Dan erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum zeigt eine Viel falt von interessanten und wertvollen Eigenschaften. So zeigt beispielsweise das Antibiotikum A 3823 eine Hemmwirkung des Wuuhstums von Bakterien und Pilzen, welche pathogen gegenüber dem tierischen und pflanzlichen Leben sind. Die Hemmkonzentrationen für eine Anzahl von Organismen, bestimmt durch die Agar KeihenverdUnnungsnethode, sind in dar nachfolgenden Tabelle I gezeigt.

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T a b e lie

Test Organismus	90 3 8	24	i	Stunden	Mindesthemmkonzentration	72 Stunden	25
			<0,78	48 Stunden		13
Staphylococcus aureue		1,56	<0,78		5
Bacillus eubtilis		~	1,56
Myeobacterium avium	t	3,13	< 0,78
Streptococcus faeoalis	I	<0,78	12,5
Laotobaclllus easel		<0,78	< 0,78		5
Leuconostoo oitrovorua		50	3,13		56
Proteus ep. No. 1		50	7-100		13
Vibrio metsöhnikovii			50	6,
Alternaria aolani				3,
Botrytie oinerea				12,
Colletotriohum pisi				100
Olomerella oingulate				50
Helmintboeporium eativum				25
Polyporue ostreatus				12,
Penicillium expaneum				1,
Pullularia ep.				3,
Sclerotinla fructicola				100
Vertioillium albo-atrum	51/ - 6			too
Hpicaria divaricate		1870

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Bine andere wichtige Eigenschaft von A 3823 ist seine Fähigkeit, die Entwicklung der Coocidiose bei Geflügel zu verhindern. So verhindert beispielsweise A 3823, das im Futter von jungen Hühnern vorhanden ist, in Mengen von nur 0,02 i» sehr wirksam die Mortalität und vermindert bei Hühnern die Zahl der Schäden, welche durch verschiedene Arten von Coccidien hervorgerufen werden. Die Ergebnisse, die bei vier Speciee beobachtet worden sind, werden in der Tabelle II gezeigt.

Tabelle

II

Antibiotische Aktivität des Antibiotikums gegenüber vier Cocoidlenarten	Antibiotikum gehalt im but ter ^w.£7	Anzahl der Hühner	Mortali tät C+J	A 3823
Infizierender Organismus	0,02	19	0	Gewichts zunahme CbJ
Eimeria tenella	Kontrolle	50	36	1778
	0,02	30	0	133
Eimeria neoatrlx	Kontrolle	50	48	4128
	0,02	50	0	-98
Eimeria maxima	Kontrolle	50	0	8500
	0,02	20	0	7100
Eimeria Brunetti	Kontrolle	20	0	1498
	935

M y ι

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Die akute Toxizität des Artibiotikums A 3823- bei Mäusen, ausgedrückt als LD₅Qt beträgi etwa 43,8 ± 5,2 mg/kg Körpergewicht, wenn man das Antibiotikum oral gibt. Intraperitoneal beträgt die LD^₀ etwa 16,6 ± 1,7 mg/kg Körpergewicht. Bas Antibiotikum scheint bei Geflügel sehr viel weniger toxisch £U sein, da die akute orale Toxiaität bei Oeflügel, wiederum ausgedrückt als LB^₀, etwt 284,45 ± 47,22 mgAg Körpergewicht beträgt.

Das neue Antibiotikum wire hergestellt, indem man einen neu aufgefundenen Stamm eines Actinomyceten-Organisnius unter aeroben Bedingungen in eirem geeigneten Kulturmedium suchtet, bis das Kulturmedium merklich antibiotisohe Aktivität aufweist. Man kann dann das antibiotikum durch Anwenden verschiedener bekannter Artec der Isolierung und Reinigung gewinnen. Biese Verfahren ktnnen verwendet werden, um das Antibiotikum in relativ reinez Form su erhalten. Es genügt «in geringerer Grad der Reinigung,.wenn das Antibiotikum In Tierfutter eingearbeitet werden soll. In dieses fall· braucht das Antibiotikum nicht ale fester Stoff gewonnen «α «erden, sondern kann, falls gewlinecht, auf das futter oder einen Träger als konzentrierte Lösung aufgesprüht werden.

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IU; r sur erflndungsgemftese ι Herstellung des neuen Antibiotikums verwendete Pilzataam wurd ι hinterlegt bei der American Type Culture Collection in Washington, D.O., und hat die Kulturf.ti.nmer A^fJ?CC 15413 erhalte i.

Wegen der Unsicherheit de: KlassifizierungsunterstJOhungen bei i'f.reptomyiiee-Qr^aniemen bestehen etete Zweifel bei der Klassifizierung eines neu aufgewundenen Organismus. Jedoch scheint der Organismus» «elcher d.is Antibiotikum A 3823 bildet, in seinen wichtigsten Eigenschaften am meisten dem Streptomyces cinnamonenais Okaai (MKRIi B 1588) au ähneln. Er wird als neuer Stamm dieses Streptomyces angesehen. Es bestehen ausreichende Unterschiede zwischen dem neu aufgefundenen Stamm von ü. cinnamonensia und (em bekannten Stamm, so dass es notwendig ist, den in dieser Anneidung beschriebenen Organismus als neuen Stamm zu bezeichnen Die zwei Stämme ähneln einander in der Sporennette und in de]- Sporenmorphologie, in der Färbung des hergestellten Luft- und vegetativen Jtyoels und im Vorhandensein eines löslicher Pigmente. Jedoch unterscheiden sich die Stämme in der Terwerti ng von neun Kohlenstoffquellen} in der Herstellung von SchweJelwasserstoff duroh S. oinnamonensis (NRHL B 1588), dagegen feilen der Herstellung von Schwefelwasserstoff durch den neu aufgefundenen Stamm. Insbesondere unterscheiden sich die zwei Stämme aber stark in ihren Tem-

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peraturerfordernissen. So erfolgen beispielsweise bei S. einnamonensis (NHRL B 15H8) maximales Wachstum und maximale Sporenbildung bei 26 ⁰C. Bei 30 ⁰C erfolgt nur eine mittelmässige Sporenbildung. E:.n Wachstum erfolgt, jedoch ohne Sporenbildung, bei 37 ⁰O. während bei 43 ⁰C das Wachstum vollständig unterdrückt wird. Im Gegensatz hierzu wächst der neu aufgefundene Stamm von 3; cinnamonensis ATCO 15413 bei 30 bis 37 ⁰C maximal unter maximaler Sporenbildung. Bei 43 ⁰C tritt noch mittelmaasiges Wachstum, obgleich mit epärlicher Sporenbildung, auf, das ist bei einer Temperatur, bei welcher der bekannte Stanrm Überhaupt nicht mehr wächst.

Der Organismus, welcher cas Antibiotikum A 3823 produziert, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem man Proben des Bodens in sterilem, destillierten Wasser suspendierte und die Suspension auf Nähragar auftrug. Die beimpften Agarplatten wurden bei 25 bis 35 ⁰C tebrütet, bis man sichtbare Kolonien beobachtete. Hach der Inkubationszeit wurden Kolonien der Antibiotika erzeugenden Organ!säen mit einer sterilen Platinöee auf Schrägagar übertragen. Die Schrägagar-Ana&tse wurden dann bebrütet, um geeignete Mengen an Impfmaterial für die Herstellung von A 3823 zu gewinnen.

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Die für die KlaesifizierungeunterBuchungen dee A 3823 produzierenden Stammes von S. cinnaraonenaia ATCC 15413 verwendeten Methoden eind diejenigen, welohe man üblicherweise sur KlaBoifizierung von Aotinoayceten verwendet. Sie Kohlen-«' atoffverwertungsteste wurden ausgeführt in Übereinstimmung mit der Methode von Pridhaa und Gottlieb (J. Bact, 56 (1946), Seite 107). In den nachfolgenden Absttteen eind die Ergebnisse der Klaeeifizierungeuntersichungen zusammengefasst. Die in Klammer gesetzten Ziffern beziehen sich auf Farbgruppen in Oicllonary of Color von Maorz und Paul (1950). Alle Kulturen wurden bei 30 ⁰C gealichtet. Morphologische und Kulturcharakteiiatiken wurden nach 14 "age Inkubationszeit bestirnt. Zum Studium der Morphologie de:.' Kulturen wurden Tomatenpaaten-Hafe mehl-Agar und Czapek-iigar verwendet. Hitratreduktion und Gelatineverflüeeigung wurden nach 7 und 14 Tagen beetlMrt, nährend Beobachtungen über dl« Schwefelwasserstoffbildung nach 24 und 48 Stunden erfolgten. WIt üblich wurde die Kohlenstoff verwertung nach 10 tage Inkubationsseit bestlait·

mkrcskoplsohe Morphologie

Morphologie der Sporenkette. Bporophoren and Sporenketten sind gerade bis gekrtfents Spiralen und Haken «lud nicht vorhanden. Die Sporen eind oval bis kurae Zjlinder »it Abmessungen von 0,7 Me 11,1 MJi SU 1,4 bis 2,2 »μ. elektronenmikroskop! sehe Aufnahmen von mit Platin kontrastier-

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ten Kohl entrücken der sporen Eeif.en eine verhaltniemfiBsig glatte Sporenoberilache, \/elche mit einem Netzwerk von in 'einander ν ei ac Ii lunge η en, ."einfasrigen Windeln bedeckt let.

Ku_-IIu: 'eigenschaften

Tt Brntenpasten- Hafermehl- A/;ar. Dao Wachstum ist reichlioh mit einem otarken, blaouroten (3-D7) Luftmyoel, die RUokseite iet rotbraun (a.H'5). Ee ißt ein löoliches, rotbraunee

Pigment vorhandene

Nähr agar. Dae V/ocheturc ie^J. gering ohne Luftravoel. Die BUckeeite iet gelb (10-P3). Lösliches Pigment iet nioht vorhanden ο

. Dan Wachstum ist massig mit einem massigen, hell-

rosafarbenen (2-B1) Luftmycel. Die Eückseite ist hellgelbbraun (11-P5)° Man beobachtet eine geringe Menge eines braunen, löslichen Pigmente.

QluooBe-Asparagin-Agar. Des Wachstum ist spärlich öhnö Luftmjael. Die EUckeeite ist hellgelb-grün (19-B1).

Stärke-Agar mit anorganischen Bälgen, Das faohstum iet reichlich nit einem reichlichen, massig blaeeroten Luftmyoel;

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die Eüokeeite let Kätsitf braun (U-AiO). Se iat tint !»ring· Menge einee braunen, löslichen Pigeente Vorhand·η.

Hefe eac tr air Vm^₁ Oat tathatm lat ftleei« Mit tint« »Äeeigen Luf teyqeX, ttlohta «tiaa itt »ii tint» bräunlich-bXeeeroten Rand. Bit BtteketiU iat eia dunklee> greuetiohigea Braun (15-A2),· «anil braune β, löalichaa Plptent.

BepnattfAffa,y_f Pa· Waobaiu« iat »iaale Alt ein·· adtaiftn, grauetiohigan, gelb-blaetrottn (#<-t7) Lufteyoel. DJa Hüok-Witt tat aäaal* braue (14-110)_t etn4f braunaa, Xöaiiohta Pigaent. ;

Baa Waohiti* iat «Haalgf jedoch ohna IuXt-Die gUokeeit* UX «Äaai« o?anfefaxben (10-17) lieht» Pigment nioJit

^Dee WachetuÄ iat aäaaig Kit eine» geXb-blaeeroten (3-D7) LoftmjrceX. PU HUokeeite ist f*aubraun; wenig bzaunea_v löeliehea fig»tet.

-AMar. Bat Waohat β* i et «ftf «SitelMeeig ohne laft-

mycel. Die Hückeeite iat ein graaatiehieae QtXb (1?-B2). Löellchea Pigaent wurde rieht feetgeeteXXt.

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BlCTDBChaften Magenallch. Koagulation uad Peptonieierung wurde beobachtet.

. We3heelnd.

Iltratreduktion. legativ.

Teyperaturbed ingumten* Maxiaalte Wache tu« und Sporenbildung werden swieahen JO und 37 ⁰C beobiohttt. Bei 43 ⁰O finden mittelnäfitlges Wichitua und »itteleäieige Sporenbildung atatt. Bei 50 ⁹O beobachtet «an kein Wachetue.

Di« Brgebnieae der Teete 3ei Kohlenatoffrerwertung, die alt dt« A 3823 produzierenden Stasa von 8· einnaeonaneia AYCC 15413 durchgeführt wurden, aind in dar nachfolgenden Tabelle engegeben. Sie Bedeutung der in der tabelle verwendeten Symbole sur Kent zeichnung de? Wachet uiaantwort eind wie folgt j

+ » Verwertung

(+) * Verwertung wahrscheinlich
(-) ■ Verwertung fraglich

* * keine Verwertung

lohlenetoff«Quelle Beaktion

L(+)-Hiboe·

L(+)-Hhaanoe«

»ext roe« +

Fr uc to ae 4-

Suoroae (.)

909

J.ulilenrtolf-Quelle	Reoktion
w. . ...-^i, ,Mini ii-i --^.Jm..- 1 «I »1 lllllll———^» Lactone	(-)
r ;-· )-Raffin3£ie	+
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M-Ho se	+
3alicin	+
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I)-I iboss	+
Df <■'.' C rehai ose
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})α>· '.Λ!τ HercLel] !Π(ζ des An Libiotikuma A 3823 durch S. <^%i»:m.tfoi!ent;iB ATCC 15413 V(!rwendete Kulturmedium kann jedee ο 1 i( bif;; Medium einer Anzahl von Medien sein« da_f wie aus !en vnrc L.'Jiend nrgegebenen VerwertungeprUfungen hervorgeht,. -ei ι'·-·ί~ λ j Libiotikunj eraeu<;ende Organieinue die Energie einer viel!alt von Quellen verwejten kann. Jedoch sind aue Gründen <ier Wirtochnftlichkeit in cer Heretelluns, der besten Auebeute v.iiö der Leichtigkeit der Isolierung dee Antibiotikuae beetimnte Kulturmedien bevorzugt. So ist eine der bevoreugten Carbohydrat-Quellc-rr für die Gänng Melasee, obgleich auch Gluooae, Fru2tof>e, Maltose, Starke, Inosit und dergleichen verwendet wurden können. Bevorzugte Stick stoffquellen sind FeptQ&e, :]oiabohnenmshl,' Mischungen von Aminosäuren und dergleichen. Unter den anorganischen Nährsalzen, welche den Kulturmedien

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eiijverlsibt werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kaliuin~_t Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Üarbonat- und dergleichen Ionen liefern können.

Spurenelemente, welch!· j. Ir das Wachstum und die Entwicklung deö Organismus, welcher für die Herateilung von A 3825 verwendet wird, notwendig Bind, sollen auch im Kulturmedium vorhanden aein. Solche Upuranelemente kommen üblicherweise ale Verunreinigungen in den anderen Beatandteilen dee Mediums in Mengeη vor, die ausreichend sind, um den Wachetumebedingungen des Organiobus zu entsprechen.

Der zur Herstellung von Λ 3823 verwendete Organ!emuβ kann beträchtlichen Änderungen „η den Wachetumsbedingungen unterworfen werden. So wächst der Organismus beispielsweise in einer Vielfalt von Medien, in welchen der anfängliche pH-Wert cehr atari: schwankt. Vor der Beimpfung des Mediums mit dem Organismus ist es jedoch erwünscht, den pH-Wert dee Hährmediums auf einen Wert zwischen etwa 6,5 und etwa 7,5 einzustellen, was von dem im £1neeUfa11 verwendeten Medium abhängt. Ebenso wie bei anderen Actinomyceten wird mit Fortgang dee Permentationeverfahrena cae Medium allmählich alkaliacher usd kann einen pH-Wert zwischen etwa 7 und etwa 8 oder höher während der Wachstumsperiode dee Organismus erreichen, wahrend

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-ins Antibiotikum erzeugt wird. Der Bnd-pH-Yert wird wenige te na teilweise bestimmt durch den anfänglichen ρH-Wert des Mediums, die im Medium vorhandene! Pufferstoffe und die Zeitdauer, während welcher nan den Organismus wachsen läset.

Ebenoo wie für die Herstellung anderer Antibiotika werden für die Herstellung von wesentlichen Mengen des Antibiotikums Λ 3823 vorzugsweise aero se Submerskulturen in gxossen Tanks verwendet. Heine Mengen des Antibiotikums erhält man aweokmäseig in Sehuttelkolben und durch Oberflächenkulturen in Flaschen. Dme Fermentatiunsmedlum im sterilen Tank kann sux Einleitung der Peimentatr.on ait finer Suspension, die Sporen gebildet hat, beimpft wenden. Da jedoch die Erfahrung gemacht wurde, dass pel Verwendung einer Suspension,die Sporen gebildet hat, als Impfmaterial eine Waohstumsverzögerung eintritt, verwendet man bevorsugt die vegetative Form der Kultur. Durch Vermeidung der Wachβtumsverzögerung in dieser Weise realisiert man ein« wirksamere Ausnutzung der fermentationevorriohtung. Ss int daher erwünscht, zunächst ein vegetatives Impfmaterial des Organismus daduroh herausteilen, dass man eine verhältnisiiäselg kleine Menge eines Kulturmediums mit einer Sporenform des Organismus beimpft und, wenn man ein junges, aktives, vegetatives Impfmaterial hergestellt hat j dieses aseptisch in einen grossen Gärtank su

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Übertragen. Das Medium, in welchen das vegetative Impfmaterial hergestellt wird, kann entweder dasselbe oder ein anderes Medium alß dasjenige sein, das man für die grosatechnisohe Herstellung von A 3823 verwendet.

Der Organismus, welcher A 3823 produziert, wächst innerhalb eines weiten Temperatürbareichs «wischen etwa 25 und etwa 45 ⁰C. Maximales Waohsttta und maximale Sporenbildung treten jedoch zwischen etwa 27 and etwa 37 ⁰C ein. Bevorzugt wird die fermentation bei einer Temperatur «wischen etwa 27 und 30 ⁰O durchgeführt.

Wie bei aeroben, eubmereon Züohtungevejfahren üblich, wird sterile Luft durch das Kulturmedium während der Fermentation geblasen. FUr ein wirksanes Wachstum dta Organismus und entsprechend gute Erzeugung von A 3823 in der Tankherstellung des Antibiotikums betrag'*; das verwendete Luftvolumen vorzugsweise wenigstens etwei 0,1 Raumteile Luft/Minute/Raumteil Kulturmedium. Das beste V'achstum und die besten Ausbeuten an A 3823 erhält man, wein das verwendete Luftvolumen wenigstens 0,5 Raumteile I* f t/Minute/Rauateil Kulturmedium, voraogsweise wesentlich βehr, beträgt.

Pie Konzentration des Antibiotkums im Kulturmedium kann man während der Fermentation leicht verfolgen, indem man Proben

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Λα α KultiTffiiidiums auf ihre Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum ν ine η OrgGtiiomue prüft, von welchem bekannt 1st, dass sein Wnchntuto in Gegenwart diesse Antibiotikums gehemmt iet. PUr ijcacn Zv.eck olnd die Organismen Mj-cobaoterium avium und Bncillu: Bubtilin geeignet. Die Prüfung der Proben kenn man in bekannter Weise turbidimetrisch oder mit der Zylinder* H atter.me thode durchfUhren.

im ulißen.elnen erfolgt die Höchetproduktion an A 3823 innerhalb etwa 2 bis b Tagen nach Beimpfung dee Hährmediums, wenn \ua\ '. ine aerobe ßubmerskultur oder SohUttelkolbenkultur ver-.ende x, und innerlialb etwa 5 bis 10 Tagen, wenn man eine Ober fläche nl;ul tür verwendet.

ν? ih jv ud der fermentation von A 3823 er Beugte Antibiotikum kann r<ich entweder in der Fähr brühe oder im Ky eel oder an beir'en Orten Vildenc Demaufolfe aind die Ieolierungaverfahren» t?ie vuii der Her Stellung \or A 3823 verwendet Herden» so gewählt, c*as8 eine Höchstgewinnung des Antibiotikums entweder von einer oder von beiden Quellen ermöglicht wird. So kann man beispielsweise die erhaltene Kährbrühe filtern und das Filtrat mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahieren, um das nicht im Myoelkuchen zurückgehaltene Antibiotikum «a ge· winnen. Zusätzlich gewinnt man das im Myce!kuchen vorhandene

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Antibiotikum durch gründliche Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel. In beiden Fällen kann das Antibiotikum aus dem Extraktionslöeungsmittel duroh Übliche, in der Technik allgemein verwendete Methoden gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Obgleioh die vorliegende Beschreibung sich besonders auf den neu aufgefundenen Organismus S. cinnamonensis ATCC 15413 bezieht, liegt auch die Herstellung von A 3823 durch Züchtung anderer A 3823 herstellender Stämme von S. cinnamoneneis oder von Mutanten von A 3823 herstellenden Stämmen von 3. cinnamoneneis einschlieeelich von Mutanten von ATCC 15413 im Bereich der Erfindung. Solche Stämme oder Mutanten kann man nach bekannten Verfahren herstellen, beispielsweise indem man einen Stamm von S. cinnamonensis einer Röntgen- oder Ultraviolettstrahlung oder der Einwirkung von chemischen Mitteln, wie Stickstofflost-Verbindungen, unterwirft.

Beispiel 1

Die Herstellung des Antibiotikums A 3823 in Schüttelkolbenkulturen wird durch das iolgende Verfahren erläutert:

Man beimpft einen Nahr-Schrägagar, welcher aus 5 g Casamin-

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säure, 5 g Glycerin, 5 g Dextrin, 10 g Sndmelasse des Zuokerrohre (»Blaok-etrap-MeIasee"), 5 g Hefe 2019, 1 β K₂HPO₄, 5 ml einer MlneralsalzltSsung, 20 g Agar und Leitungswasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 1 besteht, mit Sporen von Streptomyoes oinnamonenaie, Staon AICC 15413· (Die Mineralealzlöeung enthält 100 g KCl, 100 g MgSO₄.7H₂O, 2 g FeSO₄ und 2 ml konzentrierter Salzsäure je Liter Lösung). Der pH-Wert des Sporen-Impfmediume «ixd auf einen pH-Wert von 7,6 bis 7,8 eingestellt· Der beimpfte Sohrägagar wird etwa 5 Tage bei etwa 30 ⁰C bebrtltet, dann mit einer geringen Menge sterilem Wasser bedeckt und leicht abgesohabt, um die Organismen abzulösen und eine wässrigen Suspension der Organismen zu gewinnen.

1 ml der so erhaltenen Suspension verwendet man sum Beimpfen von 100 ml eines Mediums für vegetatives Wachstum, welches

die folgende Zusammensetzung hatt

Cereloae	15	β
Sojabohnenmehl	15	β
Maiequellwasser-Pest- stof fs	5	β
latriumohloiid	5	β
Caleiumoarbonat	2	β
Wasser auf	1	ι

Sa« Medium dieter Suaammeneetsung wird bei etwa 120 ⁰O und etwa 1,06 at etwa 30 Minute» sterilisiert, bevor es geimpft «ird. Das geimpfte Hediiui für vegetative β Wachstum wird etna 48 Stunden bei etwa 30 ⁰O auf einer AmplitudensohUttelmasohine alt einer Amplitude von etwa $,1 ob und 108 Bewegungen je Minute gesohlittelt.

5-al-Anteile des eo erhaltenen Mediums mit vegetativem Wachstum verwendet man zur Beimpf ung von IOOhbI-A-teilen eines sterilen Produktionsmediums, welches in 5OO~ml i^enmeytrkolben enthalten 1st. See verwendete Produktiv ^medium hat die folgende Zueammensetsung je Liters

Oerelose 10 g

Brer-Babbit-Melasse 20 g

Pepton 5 g

Caioiumcarbonat 2 g

faeeer auf 1 1

BIe beimpfte Produktionekultur schüttelt man etwa 5 Tage bei etwa 26 bis 30 ⁰C auf einer wie oben beschriebenen Amplitudenschüttelmaechlne. Danach gibt man den Inhalt einer Ansah! von Schüttelkolbeη susammen, filtriert die Brühe durch eine BUohner-Nutsche mit Hilfe einer handelsüblichen Filterhilfe. Die filtrierte Brühe stellt man auf einen pH-Wert von etwa 3 mit 5n Salzsäure ein und extrahiert dann zweimal

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mit Chloroform. Han engt die vereinigten Chlorofoxaextrakte zur Trockne ein, löet den Rückstand in Chloroform and filtriert die Lösung. Man leitet das Filtrat durch eine Kolonne ait dan Abmessungen 2cm χ 48om aus 0₉42x1,68-mm-Aktivkohle der Hände leeorte Pittsburgh CaI carbon (Vertrieb durch Pittsburgh Coke and Chemical Co., HeYiUe Island, Pa.), welche vorher Bit Chloroform gewaschen «orden ist. lach dem Antibiotikumfiltrat leitet man 1 1 Chloroform duroh die Kolonne. Die aus dar Kolonne ablaufenden Traktionen, die in der Prüfung antibiotieohe Aktivität zeigen, vereinigt man und verdampft eur Trockne. Man löst den Rückatand in einem LOaungageaiaoh, welches 10 feile Methanol au-' 1 Teil Wasser enthält. Sie erhaltene, das Antibiotikum enthal nde Lösung wird erwärmt und dann in einem Kühlraum beiseite gestellt. Die Kristallisation das Antibiotikums erfolg langsam, wenn etwa von dea Methanol verdampft. Man trenn* die Kristalle in einer Zentrifuge ab, wttaoht sie alt kaitea Wasser und trocknet sie in einem Vakuumofen. Das so erhaltene Antibiotikum wird aus Xther/Petroläther umkrietallieiert und im Vakuum getrocknet.

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lerstellung des Antibiotikums A 3823 in halbteohniaohei t^.e v.rrd arch dee folgende Verfahren erläutert«

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lie 2-1-Kolben ait 800 ml eine· ltodiume für vegetativ«· fache tun, das 1 + Mai θ stärke, 0,5 * latrlumohlorld _# 0,5 + Pep ton, 0,5 5* Rindfleischextrakt und 0,25 t Hefeextrakt in destilliertem Waesex enthält, wird geimpft mit einer Suspension, die man aus einer lähx-Sehrlgagarkultuz, wie In Bei-■piel 1 beschrieben, erhalten hat. Das geimpfte medium für vegetatives Waohatum wird 29 Stunden bei etwa 28° auf einer Botatlohasohttttelmaschlne mit 6«4 ort Ausschlag bei 250 Ue-Ürehungen/Minute bebrütet. 50 ml der so erhaltenen vegetativen Kultur verwendet man turn !»impfen eines 44-1-Impfkulturbehälters, welcher ein medium enthält, da· 30 Minuten bei 120 ⁰C sterilisiert worden iet, und 1 ft löslioh· Btäfcke, 0,5 * Hsfeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 * latriumohlorid und 0,5 Ϊ fiindfleisohextrakt in Wasser entnält. Man hält den Zapfkulturbehälter naoh der Impfung 24 Stunden bei 28 ⁰O. Dar Btw^n beginnt nach Έ stunden mit einet fcaehwindigkelt voll. 370 ümdrehungen/Kln. In den ersten β Stunden belüftet man 0,0113 t? Luft/Min, und erhöht dann auf eine Senge von 0,0396 *?/äin. Man verwendet die Impftankkultur «um Beimpfen eines 946-1-Fermenters, welcher ein sterilisiertee wässrige· flrmentationemedium enthält, das aus 1 £ Cerelose, 1 i° Zuckerrohrmelaese, 0,5 i» Sojabohnenschrot, 0,2 Jl OaIo 1 urne ar bonat und 0,02 + eines Antisohaummittele besteht. Die Temperatur des Fermentationstanke hält man bei etwa 30 ⁰C während der gansen Fer-

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Mutation. »1· Belüftung wafer·**, d«r !»rmentatlon fettig* 0,482 w?/WX»· Man beginnt dam Wfftn nach 6 Stunden alt 175 Umdrantmgen/feln· und flfart dMit fttr dl· Dauer der *·*- mentation fort. SI· Ι·οΧ1·χ*β§ df· Antibiotikum· wird wie in Beiapiel 3 btaohjtiben durohgefWurt.

Di· Oeninnoog «in·· gereinifton Κοη*·ηtrete, vtloh·· d·· Antibiotikum A 3823 enthält, «α« ·ΐη·* fermentetionebrtth· wird durch da· folgend· YerfaJuren «Tlttutertt

Man gibt ία 829 λ der duroh d·· in Bile^iel 2 beeobrieben« Tttrfahren exhalten«n Oeieat^iUb* 21 kg einer hand«leUbliohen PilterhUf·. Km mieoht die Brtth« gründlioh mit d·» FUt«r-Hilf· uad filtriert dann dwroh «in 61-cm-Flatten- and Bmhmen« filter, mmn weeoht den filterkuohen auf dem Wlter mit iImi auerelohenden Meng« deatilllvrtem W«*eer, um da· Wltratvolumen auf 825 1 ·« bring·»· J*n rilt«rku<ihen hebt man für UU weitere Tetarbeitttng iur Gewinnung von au»»taliohem Antibiotikum auf.

Man fUgt ludii Mit rat etwa 950 1 Chloroform und aenkt d«n pH-Wert de· Qemiaoheii duroh tugab· Ton 5n Salaattur· auf etwa 3. Man mieoht die wäaerige und dl· organlaoh· Phaae grUndlioh

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etwa 50 Minuten und trennt dann duroh Zentrifugieren· Die verbrauchte BxUhenphaee wird verworfen. Sie Ohlorofoxmphase komentriert man im Vakuum auf «in Volumen von etwa 9450 ml. Dann leitet man daa Onloroformkonsentrat duroh eine Olaskolonne eine· Durchmesser* von 10,2 cm, welche bia au einer Buhe τοη 168 cm beeohlckt let mit 1,68x0,42-mm-Aktivkohle der Bandeleeorte Pittsburgh OaI oarbon, die in der Kolonne vorgewaschen worden ist, indem man 50 1 Chloroform duroh die Kolonne mit einer Menge von 500 ml/Min, durchgeleitet hat. Men leitet daa Chloroformkonaentrat, welches da· Antibiotikum enthält, duroh die Kolonne In einer Menge von etwa 200 ml/Min, die Ton. der Kolonne abflleesenden ertttn Tier Liter, welche _t dae in der Kolonne festgehaltene flUMlgkeitavolumttn dar« •teilen, werden verworfen. lach dem Chloroformkonsentrat leitet man Chloroform als Waschflüssigkeit durch die Kolonne. Man gewinnt etwa 50 Liter Kolonneneluat, das Antibiotikum enthält, und konzentriert dieses Eluat im Vakuum auf ein Volumen von etwa 370 ml.

auaätzlichea Antibiotikum erhält man aus dem Filterkuchen, . indem man zweimal 70 1 Methanol durch die Filterpresse leitet. Ben verbrauchten Filterkuchen verwirft man* Die vereinigten Methanoleluate konzentriert man im Vakuum auf ein Volumen von etwa 13 Liter. Man gibt etwa 8,7 1 Chloroform

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su dem Konsentrat» erniedrigt den pH-Wert duroh Ingate τοη 5n SalssKure auf et«· pH 3 t mleoht die swel Phasen grOodlloh etwa 30 Minuten und trennt dann durch Zentrifugieren. Die verbrauchte laeserphaee wird rerworfen. DIa Ohloroformphase _ konsentrlert man 1« Yakut» auf ein Volumen τοη etna 420 Ml· Man fUgt das so erhaltene Konsentrat ta de« Konsentrat, das man aus des Plltrat der Brühe erhalten bat, und verwendet die Terelnlgten Konsentrate sur Herstellung τοη kristallinen A 3823 dar oh ein Kr letallieationsTer fahren» we lohe β tOinlleh ist demjenigen, das In Beispiel 1 beschrieben 1st·

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Claims (2)

; H67883 520 ty? 2β# 110P*0111** 1965 fit »nt in ι Dr Ho hi

1. Terfahren sur Herstellung dea Antibiotikums A 3823t daduroh gekennzeichnet, dass man Streptoojces oinnamonenaia ATCC 15413 in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Quellen ▼on Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salaen enthält, unter aubmereen, aeroben Bedingungen kultiviert, bis

■■♦·,.■■

durch dieaen Organismus in diesem tfährmedium eine wesentliche Menge von A 3823 erzeugt worden ist.

2. Terfahren nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, daea man A 3823 aus dem Kulturmedium gewinnt·

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3· Tierfutter, gekenneeichnet durch einen Gehalt an de« Antibiotikum A 3823, welches eweokmäaaig hergestellt werden kann naoh dem Verfahren der Ansprüche 1 oder 2, wobei dieses Antibiotikum ein weisser, kristalliner, fester Stoff ist, der bei etwa 103 bis 106 ⁰C schmilzt, in niedermolekularen Alkoholen, niedermolekularen Estern, Ketonen, Chloroform, Dimethylformamid und Dimethyleulfoxyd löslich und in Wasser unlöslich ist, eine titrierbare Gruppe mit einem pK*_a ■ 6,65 in 66#igem wässrigem Dimethylformamid, eine optische Drehung £x7?? von +47,7° ale 1*ige Löaung in

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Methanol, naoh 2 Stunden Trocknen la Vakuum Über Phosphor- pentoxyd bei etwa 60 ⁰C eine annähernde Zuaaaaenaetsnng von • 62,78 jfc Kohlenstoff, c,43 # Wasserstoff und 26,61 £ Sauerstoff, naoh dem Trocknen in einer Block-Schmelepunktavorrichtung eine annähernde Zusaaaenaetaung von 64,66 £ Kohlenstoff, 9,58 i» Wasaerstoff und 25,41 °l· Saut rat off, «in Molekulargewicht, berechnet aua Titrationewerten, von etwa 677

aufweist und als Lösung in uhlorofora la Ultrarotabeorptioneepektrun untersoheidbare Banden bei 2,73, 2,98 (Schulter), 3,05, 3,38, 3,47, 5,86_# 6,23, 6,83, 7,02, 7,26, 7,56, 7,66,, 7,76, 8,04, 9,02, 9,17, 9,47, 9,78, 9,91, 10,06, 10,25, 10,58, 10,82, 10,98, 11,21, 11,44, 11,64, 11,82 und 11,97 Mikron und keine merkliche Absorption la Ultraviolettbereich besitet;'

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ORIGINAL INSPECTED

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