DE2402956C2

DE2402956C2 - Antibioticum A-287 und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2402956C2
Application number: DE2402956A
Authority: DE
Inventors: Robert L. New Ross Ind. Hamill; William Max Indianapolis Ind. Stark
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1973-01-22
Filing date: 1974-01-22
Publication date: 1985-06-13
Also published as: NL175072C; DD111404A5; CH590335A5; CS190419B2; DK132590B; AT328082B; NO138854C; NL175072B; SU509246A3; FI52355B; ATA52874A; IL43937A0; IL43937A; ES422433A1; BG24958A3; JPS49108293A; IE38708B1; HU166397B; IE38708L; FR2214469A1

Description

Organismus

MiH-Werte	^g/ml)
Faktor A	Faktor B
6,25	12,5
6,25	6,25
12,5	3,13
100,0	12,5
50,0	50,0
100,0	25,0
100,0	12,5
50,0	25,0
100,0	100,0
100,0	100,0

Die Erfindung bezieht sich auf das in den Ansprüchen angegebene Antibiotika-Gemisch A-287 und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Die Stämme Bacillus subutils ATCC 6633, Sarcina lutea ATCC 9341 (=Micrococcus luteus ATCC 9341) und Staphylococcus aureus ATCC 6538 sind auch Im Catalogue of Stralus I, 1982, der ATCC als hinterlegte Stämme aufgeführt. Dieses Gemisch besteht aus zwei einzelnen Antibiotika, die als die Faktoren A und B bezeichnet werden. Es läßt sich unter Anwendung an sich bekannter Methoden, beispielsweise durch Gegenstromverteilung oder Dünnschichtchromatographie, ohne weiteres in seine beiden Komponenten A und B auftrennen.

Das Antibiotika-Gemisch A-287 und seine Einzelfaktoren A und B hemmen das Wachsen von Organismen, die als Krankheitserreger für Tier und Pflanze gelten. So werden durch ein solches Antibiotikum beispielsweise grampositive Mikroorganismen gehemmt, wie Staphylococcus aureus und Streptococcus pyogenes. Weiter wirken das Anttblotlka-Gemlsch A-287 und seine Faktoren auch gegen Parasiten und sind wachstumsfördernd.

Die Faktoren A und B, aus denen das erfindungsgemäße Antibiotika-Gemisch A-287 besteht, sind strukturell verwandt. Sie weisen chemische, physikalische und Spektraleigenschaften auf, die denjenigen der Peptide ähneln. Dieses Antibiotika-Gemisch A-287 ist ein weißes Pulver, das sich In Wasser und niederen Alkoholen löst, in vielen organischen Lösungsmitteln, z. B. Diäthyläther, jedoch praktisch unlöslich ist. Die weiteren Eigenschaften der beiden Einzelfaktoren dieses Gemisches, nämlich von Antibiotikum A-287 Faktor A und von Antibiotikum A-287 Faktor B, gehen aus dem Patentanspruch 1 hervor.

In dem aus Flg. 1 der Zeichnung hervorgehenden Infrarotspektrum für den Faktor A In Mineralölmull lassen sich folgende Absorptionsmaxima (Mineralölband"", bei 3,42 und 3,50 Mikron) feststellen: 3,05 (mittel), 6,05 (mittelstark), 6,59 (mittel), 6,84 (mittel) und 7,27 (mittel) Mikron. Der Faktor A absorbiert im Ultravlolettberelch des Spektrums und weist die Im Anspruch 1 angegebenen Absorptionsmaxima In Wasser auf. Es gibt keine Verschiebung in einer Base oder einer Säure.

In dem aus Flg. 2 der Zeichnung hervorgehenden Infrarotspektrum für den Faktor B In Mineralölmull lassen sich folgende Absorptionsmaxima (Mineralölbande bei 3,45 und 3,52 Mikron) feststellen: 3,06 (mittel), 6,09 (stark), 6,60 (mittel), 6,89 (mittel) und 7,30 (mittel) Mikron. Der Faktor B absorbiert im Ultraviolettbereich des Spektrums und weist die im Anspruch 1 angegebenen Absorptionsmaxima In Wasser auf. Es gibt keine Verschiebung In Säure oder Base.

Eine elektrometrische Titration der Faktoren A und B des Antibiotika-Gemisches A-287 zeigt einen konstanten Verbrauch von Base, was auf cyclische Peptide hinweist.

Das Antibiotika-Gemisch A-287 und seine Faktoren A und B sind allgemein löslich In niederen Alkoholen, wie Butanol oder Methanol, und In V/asser. Sie sind allgemein unlöslich In vielen organischen Lösungsmitteln, wie Diethylether

Das erfindung.!gemäße Antibiotika-Gemisch A-287 und seine Einzelfaktoren A und B hemmen - wie bereits angegeben - unter anderem das Wachstum pathogener grampositiver Mikroorganismen. Die nach dem sogenannten Standard-Agar-Verdünnungsversuch für die Faktoren A und B bei mehreren typischen Organismen erhaltenen minimalen Hemmwerte gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.

Tabelle I

Staphylococcus aureus Staphylococcus albus Bacillus subtilis Mycobacterium avium Proteus vulgaris Shigella paradysenteriae Bruceila bronchiseptica

Vibrio metschnikovii 50,0 25,0

Erwinia amylovora Agrobacterium tumefaciens

Fortsetzung

Organismus

MiH-Werte (jig/ml) Faktor A Faktor B

Xanthomonas malvacearum Xanthomonas phaseoli Pseudomonas solanacearum Pseudomonas syringae Corynebacterium insidiosum Alternaria oleracea CcratGstorneHa firnbriaia Glomerella singulata PuiSularia sp. Verticillium albo-atrum

Der Faktor B 1st Im erfindungsgemäßen AntiblotiKa-Gemisch A-287 In geringerer Menge vorhanden. Nachdem die In vliro-Aktivltätsmuster der Faktoren A und B den In Tabelle I enthaltenen Daten zufolge jedoch ziemlich ähnlich sind, ist eine Auftrennung des Gemisches in seine Faktoren daher Im allgemeinen nicht notwendig. Die folgenden Untersuchungen beruhen daher durchweg auf einem Antibiotika-Gemisch A-287, das aus etwa 95 bis 98% Faktor A und etwa 2 bis 5% Faktor B besteht.

Die akute Toxizltät eines solchen Gemisches beträgt 1370 mg/kg, und zwar bestimmt durch Intraperitoneale Verarbreichung an Mäuse und ausgedrückt als LDjo-Wert. Bei einer oralen Verabreichung an Mäuse In einer Dosis von 1250 mg/kg werden keine Tiere getötet.

Die In vivo antimlkroblelle Wirkung wird ermittelt. Indem man das Antibiotika-Gemisch A-287 entweder parenteral oder oral an Mäuse verabfolgt. Die ED₅o-Werte (effektive Dosis, bei der 50% der Versuchstiere geschützt werden, wenn man 2 Dosen verwendet) für typische Infektionen sind wie folgt:

50,0	50,0
25,0	25,0
50,0	6,25
100,0	100,0
100,0	100,0
25,0	12,5
50,0	50,0
100,0	100,0
25,0	12,0
100,0	100,0

Subcutan Oral

Staphylococcus aureus 50 mg/kg

Streptococcus pyogenes 1 mg/kg 400 mg/kg

Diplococcus pneumoniae 25 mg/kg

Eine weitere nützliche Eigenschaft des Antibiotika-Gemisches A-287 ist seine Fähigkeit, das Wachsen von Tieren zu fördern. Setzt man ein solches Gemisch dem Futter wachsender Hühnchen in einer Menge von 45,4 g pro Tonne zu, dann beträgt die mittlere Gewichtszunahme nach 10 Tagen 159,9 g. Für eine Vergleichsgruppe liegt die mittlere Gewichtszunahme demgegenüber bei nur 146,1 g. Der Futterumwandlungswert (Futter/Gewichtszunahme) für mit einem solchen Gemisch gefütterte Hühnchen beträgt 1,43. Der Futterumwandlungswert für die Vergleichsgruppe liegt demgegenüber bei 1,52.

Die Fähigkeit zu einer Stimulation von Gewichtszunahmen macht dieses Gemisch besonders geeignet zur Verbesserung der Viehproduktion. Bei Verwendung als wachstumsförderndes Mittel mischt man das Antibiotikum am besten In geeigneter Konzentration, beispielsweise In Mengen von 10 bis 1000 g pro Tonne, In die normale Futterration der Tiere ein.

Das erfindungsgemäße Antibiotika-Gemisch A-287 zeichnet sich auch durch eine parasiticide Wirkung aus, und es kann daher auch zur Behandlung von Rückfallfieber verwendet werden, das durch die Spirochäte Borre-Ha novyl hervorgerufen wird. Zum Schutz gegen Parasiten, wie Borrelia, wird dieses Gemisch beispielsweise parenteral an Tiere In einer Dosis von 10 und 500 mg/kg verabreicht.

Der zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antibiotika-Gemisches A-287 einzusetzende Mikroorganismus ist der Stamm Actinoplanes utahensls NRRL 5614, der von der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Division, U.S. Dept. of Agriculture, Peoria, Illinois 61 604, V.St.A. frei zu beziehen ist. Das Ergebnis taxonomischer Untersuchungen dieses Mikroorganismus geht aus den folgenden Ausführungen hervor.

Morphologie Vegetatives Mycelium

Die Hyphen auf synthetischem und semisynthetischem Agarmedlum sind lang, verzweigt, septiert und haben einen Durchmesser von 0,2 bis 1,2 μπι. Auf der Oberfläche des Agars bildet das Mycelium einen kompakten, leicht erhobenen und etwas lederartigen Bewuchs. Auf keinem Medium werden Lufthyphen gebildet. Dicht unter der Oberfläche des Agars sind reichlich vertikale Hyphen vorhanden. Jede dieser Hyphen entspringt einer horizontalen Trägerhyphe, die tiefer im Agar in reichlichem Maße vorhanden 1st, und endet an der Oberfläche des Agars unter Bildung eines Sporanglums.

Anio-Henssen-Agar

Leidliches Wachsen. Ein Punktlnoculum bildet In 4 Wochen eine Kolonie von etwa 0,5 cm Durchmesser. Keine Luflnyphen feststellbar. Die Kolonie 1st geblrgsartig, und sie hat einen scharfen Peak In der Mitte mit scharfen Rändern, die sich bis zum Rand der Kolonie erstrecken. Die Kolonie ist hellorange bis gelborange gefärbt. Im älteren Teil der Kolonie werden In großer Zahl Sporangien gebildet, jedoch nicht In dem Ausmaß, In dem sie auf Czapek-Lösung-Agar entstehen.

Zellwandchemie

Actinoplanes utahensis NRRL 5614 besitzt eine Zellwandchemie, die den Stämmen von Actlnoplanes utahensis sehr ähneln. Automatische Aminosäure- und Aminozuckeranalysen der Zellwandrückstände, die nach 18stündiger Hydrolyse mit 1 ml 6 η-Salzsäure bei 100° C zurückbleiben, zeigen, daß Glucosamin, Muramlnsäure, Glycin, Alanin und 2,6-Diamlno-3-hydroxyplmellnsäure (HDAP) In den Wänden in hohen Konzentrationen vorhanden sind. 2,6-Dlaminopimelinsäure (DAP) läßt sich nur In geringer Konzentration feststellen.

Ein Vergleich der Aminosäuremolverhältnisse der Zellwand (die Glutaminsäure wird als Einheit betrachtet) von Actinoplanes utahensis NRRL 5614 und A. utahensis (Szanlszlo and Gooder) geht aus Tabelle II hervor.

Tabelle II

Organismus Aminosäuren

Glutaminsäure Glycin Alanin HDAP DAP

Actinoplanes 1,00 1,14 0,74 0,61 0,15

utahensis

NRRL 5614

Actinoplanes 1,00 1,18 0,93 0,53 0,11

utahensis

(Szaniszlo und Gooder)

Papierchromatographische Analysen von Rückständen, die nach 2stündiger Hydrolyse mit 2 ml 2 n-Schwefelsäure bei 100° C zurückbleiben, zeigen, daß die Monosaccharide Glucose, Galactose, Mannose, Arablnose, Xylose und Rhamnose in feststellbaren Mengen in den Zellwänden vorhanden sind. Diese Zucker werden allgemein in den Zellwänden von Stämmen von A. utahensis gefunden.

Sporanglen jj'

Auf einem Agar aus Czapek-Lösung werden reichlich Sporanglen gebildet. Sie erscheinen nach etwa 7täglger Inkubation bei 22 bis 25° C. Mit alternder Kolonie bedeckt sich die ganze Oberfläche der Kolonie mit einer dich- ^

ten Sporanglenmatte. Die Sporangien werden einzeln an sehr kurzen Spöranglophoren (Endteil vertikaler 5 i

Hyphen über der Agaroberfläche) geboren. Gelegentlich verzweigt sich ein Sporanlophor unter Bildung eines |

zweiten und selten auch eines dritten Sporanglums. Die Sporangien sind In typischer Welse sphärisch oder subsphärisch und können 8 bis 10 μίτι groß sein. Die Sporanglen enthalten etwa 35 bis 50 subsphärische Sporan- |

glosporen, die In einer oder mehreren herausragenden Spiralen Im Sporangium angeordnet sind. Die Sporangiosporen haben bei Ihrer Reife einen Durchmesser von etwa 1,0 μπι. Durch die fast totale Zersetzung der Sporangialwand scheint eine Sporanglaldehlscenz vorzuliegen. 10 oder 15 Minuten nach Einlegen der Sporanglen in Wasser beginnt normalerweise das Verfahren einer Sporenliberation. Die Sporen sind normalerweise nicht sofort motll, sie werden jedoch Innerhalb von 5 Minuten aktiv motll durch ein Büschel polarer Flagella.

Aussehen auf Medien

Agar aus Czapek-Lösung

Gutes Wachsen. Ein Punktlnoculum bildet In 4 Wochen eine Kolonie von etwa 1 cm Durchmesser. Keine Lufthyphen feststellbar. Die Kolonie Ist Im allgemeinen abgeflacht mit einem leichten Hügel in der Mitte. Die Farbe der Kolonie Ist zuerst hellorange, und sie ändert sich in mattorange, wenn sich Sporanglen bilden und die Mycelien bedecken.

Agar aus Pepton-Czapek-Lösung

Leidliches Wachsen. Ein Punktinoculum bildet in 4 Wochen eine Kolonie von etwa 0,5 cm Durchmesser. Keine Lufthyphen feststellbar. Die Kolonie Ist im allgemeinen flach, diffus und leicht mucold. Die Farbe der Kolonie 1st matt bräunlichorange. Es werden keine Sporanglen gebildet.

Kulturcharakteristiken auf verschiedenen Agar-Medien
(Inkubationstemperatur 30 ⁰C)

	Medium	Menge an vegetativem	Aerialmorphologie oder Sporulation	Umkehrfarbe
5		Mycelium		M & P Code ')
				ICNB Name *)
	Glucose-Asparagin	4+	Sporangien; keine Luftmycelien	10C7
10			beobachtet	mäßig gelblich pink
	Emerson	4+	keine Sporangien; keine	11B12
			Luftmycelien beobachtet	stark orange
	Benett	3+	Sporangien; keine Luftmyceliei	12C7
			beobachtet	hellbraun
15	Toiiiateiipaste-Iiafcimeh!	1 +	*liquit oi/i/iaiigiwi, niuiv*	keine Farbzuordnung
			Luftmycelien beobachtet
	Czapek	3-4+	Sporangien; keine Luftmycelien	13D7
			beobachtet	hellbraun
20	Nährmedium	2+	keine Sporangien; keine	11B2
			Luftmycelien beobachtet	schwach gelb
	Tyrosin	2+	keine Sporangien; keine	13B7
			Luftmycelien beobachtet	helbraun
25	Hafermehl	3+	Sporangien; leichter Flaum	12C3
				gräulich gelb
	Glycerin-Glycin	4+	keine Sporangien; leichter Flaum	12B9
				bräunlichorange
30	Hefeextrakt	4+	Sporangien; leichter Flaum	12B9
				bräunlichorange
	anorganische Salze-Stärke	3-4+	reich an Sporangien;	12A9
			leichter Flaum	bräunlichorange
35	Glycerin-Asparagin	4+	reich an Sporangien;	9C8
			leichter Flaum	mittelorange
	Calciummalat	4+	kleine Sporangien;	9C8
			leichter Flaum	mittelorange
	Hefeextrakt-Malzextrakt		SDoraneien: leichter Flaum

') Bezogen auf A. Maerz and M. Rea Paul, »A Dictionary of Color«, »McGraw-Hill«, New York, N. Y.

²) The ISCC-NBS Method ofDesignating Colors and a Dictionary of Color Names, National Bureau ofStandards Circular 533, U. S. Government Printing Office

Aufgrund der vorstehenden taxonomlschen Beschreibung des A-287 produzierenden Stammes wurde der Mikroorganismus als ein neuer Stamm von Actlnoplanes utahensls Couch klassifiziert. Der A-287 bildende Organismus Ist leicht verschieden von Actlnoplanes utahensls Couch, wie von Couch In J. Elisha Mitchell Sei. Soc. 79, 53-66 (1963) beschrieben. Auf Czapek-Lösung-Agar produziert der neue Stamm reichlich Sporangien und ist hellorange bis matt bräunlichorange gefärbt. Der publizierte Organismus bildet demgegenüber keine bis wenig Sporangien und ist leuchtend aprlcoorange gefärbt. Dieser Farbunterschied läßt sich auch auf Pepton-Czapek-Agar .feststellen. Ein Farbunterschied von heilbraun (neuer Stamm) gegenüber orange (publizierte Beschreibung) kann auch auf Tyrosln-Agar beobachtet werden. Diese Unterschiede stellen jedoch nur Stammunterschiede dar. In allen anderen Beziehungen stimmen die Charakteristiken mit der publizierten Beschreibung dieser Species überein.

Wie bereits erwähnt, kann Actinoplanes utahensls NRRL 5614 in einem Kultumedlum unter Bildung des erfindungsgemäßen Antibiotikum-Gemisches A-287 gezüchtet werden. Als Kulturmedium läßt sich irgendein Medium verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Herstellung, einer maximalen Ausbeute und einer leichten Isolierbarkeit des Gemisches A-287 werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Melasse stellt daher eine der bevorzugten Kohlehydratquellen dar, und Sojabohnenmehl ist eine der bevorzugten Stickstoffquellen.

Dem Kulturmedium sollten anorganische Nährsalze zugegeben werden, und hierunter fallen die üblichen Salze, die Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat, Acetat oder Carbonat ergeben. Mit Vorteil können ferner Quellen von Wachstumsfaktoren, wie getrocknete Schlempe und Hefeextrakte, zugegen sein. In dem zum Wachsen des erfindungsgemäß verwendeten Stammes eingesetzten Kulturmedium sollten ferner essentielle Spurenelemente vorhanden sein, wie dies auch für das Wachsen und die Entwicklung anderer Mikroorganismen gilt. Solche Spurenelemente werden normalerweise als Verunreinigungen gleichzeitig mit der Zugabe anderer Bestandteile des Mediums geliefert.

Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums läßt sich variieren. Vor der Beimpfung mit dem Organismus sollte man den pH-Wert des Kulturmediums zweckmäßigerweise jedoch auf pH 6,8 bis 7,5 einstellen, und zwar je nach dem besonderen verwendeten Medium. Der End-pH-Wert wird zumindest teilweise bestimmt durch den Ausgangs-pH-Wert des Mediums, die Im Medium vorhandenen Puffer sowie die Zeltspanne, während der man den Organismus wachsen läßt.

Zur Bildung wesentlicher Mengen des Antibiotikum-Gemisches A-287 bedient man sich vorzugsweise einer submersen aeroben Fermentation in Tanks. Geringe Mengen an Antibiotikum erhält man durch Kultivierung in einer Schüttelflascbe. Wegen der durch die Beimpfung großer Tanks verbundenen Zeltverzögerung In der Produktion von Antibiotikum mit der Sporenform des Organismus verwendet man vorzugsweise ein vegetatives Inokulum. Das vegetative Inokulum wird hergestellt, indem man ein kleines Volumen Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelfragmenten des Organismus beimpft, wodurch man eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Das vegetative Inokulum überträgt man dann In einen größeren Tank. Das zum Wachsen des vegetativen Inokulums verwendete Medium kann das gleiche sein wie dasjenige, das man für größere Fermentationen einsetzt, man kann hierfür jedoch auch andere Medien verwenden.

Den A-287 produzierenden Organismus kann man bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 35° C wachsen lassen, Zu einer optimalen Produktion an A-287 scheint es bei einer Temperatur von etwa 3O⁰C zu kommen.

Wie bei üblichen aeroben Submerskulturverfahren, so wird auch Im vorliegenden Fall Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein ausreichendes Wachsen des Organismus und eine entsprechende Produktion an A-287 Antlblotlca sollte das in den Tank zur Bildung der A-287 Antlbiotlca eingebrachte Luftvolumen Vorzugsweise über 0,1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturmedium betragen. Ein optimales Wachsen erfolgt dann, wenn das Volumen an eingesetzter Luft zwischen 0,6 und 1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturmedium beträgt.

Die Bildung an Antibiotika läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Brühe bezüglich ihrer antlblotlschen Aktivität gegen Organismen untersucht, deren Empfindlichkeit gegen Antlblotlca man kennt. Ein zur Prüfung der erfindungsgemäßen Antiblotlca geeigneter Versuchsorganismus Ist Sarclna lutea ATCC 9341. Der Bioversuch wird zweckmäßigerweise nach dem Papier-Scheiben-Verfahren auf Agarplatten durchgeführt.

Im allgemeinen kommt es Innerhalb von 2 bis 6 Tagen entweder bei einer Großtankfermentation oder einer Schüttelflaschenfermentatlon zu maximaler Antibiotikabildung. Eine maximale Produktion an antiblotischer 3C Aktivität vollzieht sich normalerweise innerhalb von 20 bis 96 Stunden.

Nach seiner Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen läßt sich das Antibiotika-Gemisch A-287 aus der Fermentationsbrühe durch In der Fermentationstechnik übliche Verfahren Isolieren (vgl. Patentanspruch 2). Die während der Fermentation des A-287 produzierenden Organismus entstandene antibiotlsche Aktivität tritt in der antibiotischen Brühe auf. Die zur Herstellung der A-287 Antibiotika verwendeten Isoliertechnlken müssen demzufolge so ausgelegt sein, daß sich eine maximale Menge der Antibiotika aus der Brühe gewinnen läßt. Mycelien und ungelöste Feststoffe werden daher beispielsweise aus der Fermentationsbrühe in üblicher Welse, wie durch Filtrieren, entfernt, und die A-287 Antibiotika werden aus der filtrierten Brühe durch Techniken wie Extraktion oder Absorption gewonnen.

Bei Anwendung der erwähnten Bedingungen bildet der oben beschriebene und als NRRL 5614 bezeichnete Stamm von Actlnoplanes das Antibioticum Faktor A als den überwiegenden Faktor. Der Faktor A macht im allgemeinen etwa 95 bis 98% der gesamten gewonnenen antibiotischen Aktivität aus. Der Faktor B bildet praktisch den Rest der antibiotischen Aktivität.

Zur Extraktion der filtrierten Brühe eignen sich niedere Alkohole wie Butanol oder Pentanol. Eine weitere Reinigung der A-287 Antibiotika erfolgt durch zusätzliche Extraktions- und Absorptionsverfahren. Mit Vorteil lassen sich Absorptionsmittel wie Sephadex G-25 oder G-50 oder Tonerde verwenden.

Die antibiotischen Faktoren A und B können durch bekannte Verfahren, wie Gegenstromverteilung, präparative Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie, voneinander getrennt und als Elnzelverblndungen Isoliert werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
A. Fermentation von A-287 in der Schüttelflasche

Eine Kultur von Actlnoplanes utahensis NRRL 5614 wird hergestellt und auf Schrägagar folgender Zusammensetzung gehalten:

Bestandteile Menge

—

Hafermehl (vorgekocht) 65 g

Agar 20 g

Deionisiertes Wasser q. s. 1 Liter

Der Schrägagar wird mit Actlnoplanes utahensis NRRL 5614 beimpft und 10 bis 14 Tage bei 30° C inkubiert. <·> Im Mycelium wird ein Pigment gebildet, das von orange zu orangebraun schwankt. Die Kultur sporullert auf diesem Medium normalerweise nicht, und man muß die Mycelmatte daher mit einer abgeflachten scharfen Inokuliernadel macerieren, um so die Anzahl möglicher Wachstumszentren zu erhöhen. Die macerierte reife

20

Kultur wird mit sterilem Wasser bedeckt und sorgfältig mit einem sterilen Stab abgekratzt, wodurch man eine Mycelsuspension erhält. Diese Suspension wird durch Lyophilisleren konservierL Ein Sechstel der so hergestellten Schrägagarkultuv wird zur Beimpfung von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile

Menge

Hafermehl (vorgekocht)	20,0 g
Trypton	5,0 g
Getrocknete Hefe	2,5 g
Deionisiertes Wasser	q. s. 1 Liter

Der Anfangs-pH-Wert des vegetativen Mediums beträgt etwa 7,2. Nach 72 Stunden liegt der pH-Wert bei etwa 6,6 bis 7,0. Das vegetative Medium, wird inoculiert und in einem 250 ml-Kolben 72 Stunden bei 3O⁰C auf einem Rotationsschüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubieri. Die am Ende erhaltenen Feststoffe (die das Wachstum wiedergeben) machen 20 b!s 309b aus.

B. Tankfermentation von A-287

Das wie oben beschrieben hergestellte vegetative Medium (1,25 1) wird zur Inokulierung von 25 1 sterilem Prodiiktionsmedlum folgender Zusammensetzung verwendet:

30 35

Bestandteile	Menge
Saccharose	10,0 g
Sojabohnenmehl	10,0 g
Melasse	30,0 g
Enzymatlsches Hydrolysat von Casein	4,0 g
K₂HPO₄	1,0 g
MgSO₄	1,0 g
Antischaummittel	0,2 g
Czapek-Mlneralgemlsch')	5,0 ml
Leitungswasser	Cj. s. 25 Liter

') Czapek-Mineralgemisch hat die folgende Zusammensetzung:

40

Bestandteile

Menge

MgSO₄7H₂O
FeSOJH₂O
Deionisiertes Wasser

100 g 100 g

2 g (gelöst in 2 ml konz. HCI)

1 Liter

50 55 611

Der pH-Wert des Mediums beträgt nach Sterilisation durch Behandeln Im Autoklaven bei 120⁰C während 30 Minuten bei 6,8 bis 9,07 kg Druck 7,2. Das Inokulierte Produktionsmedium läßt man 5 Tage bei einer Temperatur von 3O⁰C In einem 30 Liter Kermentatlonstank fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft In einer Geschwindigkeit von 1 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute belüftet und mit üblichen Rührern bei 400 Umdrehungen pro Minute gerührt.

Beispiel 2

Nach dem Verfahren von Beispiel 1 stellt man A-287 Antlbiotlca her, wöbe! .^jnsn jedoch abweichend davon ein Schrägagarmedium folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile	Menge
Halermehl (vorgekocht)	60,0 g
Hefe	2,5 g
Agar	20,0 g
K₂HPO₄	1,0 g
Czapek Mineralgemisch	5,0 ml
Lösliche Fermeniationsbestandteile	5,0 g
aus einer Butanolfermentatlon

Beispiel 3
Isolierung der A-287 Antibiotikumfaktoren

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Fermentationsbrühe (etwa 25 Liter) wird mit einer Filterhilfe filtriert. Das Brühenflltrat wird mit verdünnter Salzsäure auf etwa pH 6,5 eingestellt und dann zweimal mit 1-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Öl löst man In Natriumphosphatpuffer (0,1 m, pH 7,0), und die Pufferlösung wird dreimal mit 1-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst, und zum Ausfällen des anüblotlschen Gemisches wird Äther zugesetzt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und über Vakuum zu einem lohfarbenen Pulver (etwa 50 bis 655b Ausbeute aus dem ursprünglichen Flltrat) getrocknet. Dieser Rückstand wird weiter gereinigt und gefärbt durch Chromatographie über Sephadex G-25 In Wasser. Nach chromatographischer Reinigung fällt man das aktive Material erneut aus Methanol aus, und zwar unter Verwendung von Ether, worauf man wie oben erwähnt abtrennt und so 3 g A-287 Antibiotikagemisch erhält.

Faktoren A und B des Antibiotika-Gemisches A-287 können durch Gegenstromverteilung getrennt werden, und zwar unter Verwendung von fünfzehn 500 ml Scheidetrichtern mit 250 ml einer jeden Phase und Bewegen der unteren Phase. Die obere Phase besteht aus Methyllsobutylketon: 1-Butanol (3 :2), und die untere Phase 1st 0,1 m-Natriumphosphatpuffer vom pH 6,8. Der Faktor A bewegt sich mit der unteren Phase. Der Faktor B bleibt in der oberen Phase des ersten Trichters. Eindampfen unter Vakuum ergibt 0,1 g Faktor B. Der Faktor A wird aus der Pufferphase durch Extraktion mit 1-Butanol gewonnen. Der Butanolextrakt /wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Den so erhaltenen Rückstand löst man In Ethanol, wobei man wiederum Ether verwendet, um so 2,9 g Faktor A auszufällen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Antibiotika-Gemisch A-287 aus

(A.) Antibiotikum A-287 Faktor A, der

a) eine weiße amorphe Verbindung ist,

b) nicht unter etwa 220° C schmilzt,

c) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 44,9896 Kohlenstoff, 6,15« Wasserstoff, 10,2S% Stickstoff, 26,37% Sauerstoff und 4,15% Asche hat,

ίο d) ein scheinbares Molekulargewicht im Bereich von 1500 (1475,73) besitzt, und zwar bestimmt In

Methanol nach dem osmometrischen Verfahren unter Verwendung der Molekulargewichtsbestimmungsapparatur von Hitachl-Pcrkln-Elmer, Modell 115,

e) in Mineralölmull ein Infrarotabsorptionsspektrum besitzt, wie es aus F i g. 1 der Zeichnung hervorgeht,

0 in Wasser Im Ultraviolettbereich des Spektrums bei folgenden Maxima absorbiert:

A_m„, 220 ΐημ (ε 9500; Schulter)
/„„, 273 ΐημ (ε 2700\

g) löslich 1st in niederen Alkoholen und in Wasser,
h) unlöslich 1st In Diäthyläther,
i) ein ungefähres Aminosäureverhältnis wie folgt hat: Serin (1), Glutaminsäure (1), Glycin (2), Alanin (1), Valin (2), Cystein (1), Isoleucin (1), Leucin (2), Tryptophan (1) und Unbekannte (2),
j) in den unten angegebenen paplerchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtllls ATCC 6633, Sarclna lutea ATCC 9341 oder Staphylococcus aureus ATCC 6538 als Detektionsorganlsmen folgende Rf-Werte hat:

Rf-Werte Lösungsmlltelsystem

0,17
0,70
0,39
0,72

0,68

mit Wasser gesättigtes Butanol

mit Wasser gesättigtes Butanol plus 296 p-Toluolsulfonsäure (p-TSA)
mit Wasser gesättigtes Butanol plus 2% p-TSA und 296 Piperidin
80% Äthanol mit 1,596 NaCl, wobei das Papier mit einer Lösung aus
0,95 m Na₂SO₄ und 0,05 m NaHSO₄ · H₂O imprägniert ist
Methanol: 0,1 nHCl (3 : 1),

(B) Antibiotikum A-287 Faktor B, der

a) eine weiße amorphe Verbindung ist,

b) bei etwa 200° C verkohlt,

c) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 49,9696 Kohlenstoff, 6,9896 Wasserstoff, 9,9096 Stickstoff, 23,86% Sauerstorf und 4,66% Asche hat,

d) ein scheinbares Molekulargewicht Im Bereich von 2800 (2781,28) besitzt, und zwar bestimmt in Methanol durch das osmometrlsche Verfahren unter Verwendung einer Molekulargewichtsbestimmungsapparatur von Hitachi-Perkin-Elmer, Modell 115,

e) In Mineralölmull ein Infrarotabsorptionsspektrum wie in Fig. 2 der anliegenden Zeichnung gezeigt besitzt,

f) In Wasser Im Ultraviolettbereich des Spektrums bei folgenden Maxima absorbiert:
A„_n 220 πιμ (ε 9200; Schulter)

A_m„ 273 ηιμ ( 3200),

g) In niederen Alkoholen und In Wasser löslich ist,
h) In Diäthyläther unlöslich 1st,

1) ein ungefähres Aminosäureverhältnis wie folgt besitzt: Serin (1), Glutaminsäure (1), Glycin (2), Alanin (1), Valin (2), Cystein (1), Isoleucin (1). Leucin (2), Tryptophan (1) und Unbekannte (2),

j) In den unten angegebenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtllis ATCC 6633, Sarcina lutea ATCC 9341 oder Staphylococcus aureus ATCC 6538 als Detectionsorganlsmen folgende Rf-Werte hat:

Rf-Werte

Lösungsmittelsystem

0,88 mit Wasser gesättigtes Butanol

0,88 mit Wasser gesättigtes Butanol plus 2% p-Toluolsulfonsäure (p-TSA)

0,90 mit Wasser gesättigtes Butanol plus 2% p-TSA und 2% Piperidin

0,86 80% Äthanol mit 1,5% NaCl, wobei das Papier mit einer Lösung aus

0,95 [TiNa₂SO₄ und 0,05 m NaHSO₄ · H₂O Imprägniert ist
0.89 Methanol : 0,1 nHCl (3 : 1),

wobei die Fig. 1 und 2 Bestandteil dieses Anspruchs sind.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotika-Gemisches A-287 gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeich-

net, daß man Actlnoplanes utahensls NRRL 5614 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis dieser Organismus in dem Kulturmedium eine wesentliche antlblotlsche Aktivität gebildet hat, und das A-287-AntlbIotika-Gemlsch aus der Fermentationsbrühe mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert, das Lösungsmittel einengt, das so erhaltene Öl mit einem wäßrigen Puffer, der einen pH-Wert von 7 hat, extrahiert, das Antibiotika-Gemisch A-287 hieraus mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahier?., den organischen Extrakt eindampft und säulenchromatographlsch weiter reinigt.