PL88566B1 - - Google Patents

Description

*** Twórcawynalazku:— Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company, Indianopolis, Indiana (Stany Zjednoczone Ameryki Sposób Wytwarzania ttóWegó antybiotyku A-2S7 1 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku A-287, który stanowi mie¬ szanine mikrobiologicznie czynnych, strukturalnie zblizonych skladników A i B. Mieszanina anty¬ biotyku A-287 i jego skladniki wykazuja czyn¬ nosc przeciwbalkteryjina, przeciwgrzybowa, prze- diwpasozyitnicza ona-z czynnosc pobudzania wzro¬ stu.

Antybiotyk arbitralnie oznaczony symbolem A-287 jieslt mieszanina dwóch antybiotyków pepty- dowych. Skladnika te zostaly rozdzielone i scha¬ rakteryzowane. Oznaczono je symbolami A-287 A i B.

Antybiotyk A-287 wytwarza sie na drodze pod- pawierzchiniowej hodowli nowego iszozepu Actino- planes utahensis NRRL 5914 w warunkach aero- bowych, az do osiagniecia wysokiego poziomu ak¬ tywnosci anitybiotycznej. Antybiotyk ekstrahuje sie z plynu hodowlanego za pomoca polarnego rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt odparo¬ wuje sie, otrzymujac amityMoityk w postaci oleju, który ekstrahuje sie wodnym roztworem buforo¬ wym o pH okolo 7. Z roztworu wodnego antybio¬ tyk ekstrahuje sie polarnym rozpuszczalnikiem or¬ ganicznym. Organiczny ekstrakt odparowuje sie, otrzymujac antybiotyk A-287, który nastepnie oczyszcza sie na drodze chromatografii. Poszcze¬ gólne skladniki mieszaniny rozdziela sie i wy¬ odrebnia znamymi sposobami takimi, jak rozdzial' przeciwpradowy i chromatografia cienkówar-stwó- wa.

Antybiotyk A-287, jak równiez poszczególne je¬ go skladniki, hamuja wzrost organizmów choro¬ botwórczych w stosunku do zwierzat i roslin, a ich szczególna wartosc polega na aktywnosci w sto¬ sunku do organizmów gram dodatnich, na przy¬ klad Staphylocoocus aureus i Streptooocou/s pyo-. genes. Ponadto antybiotyk A-287 i jego skladniki wykazuja czynnosc przeoiwpasozytnicza oraz czyn-- nosc pobudzania wzrostu.

Skladniki antybiotyku A-287 sa strukturalnie zblizone i wykazuja chemiczne, fizyczne 'i spek¬ tralne wlasciwosci podobne do wlasciwosci pepty- dów. Oba czynniki powstaja lacznie podczas fer¬ mentacji i otrzymywane sa w postaci mieszaniny.

Rozdziela sie je i wyodrebnia w sposób przed¬ stawiony w dalszej czesci opisu.

Antybiotyk A-287 ma postac proszku barwy bia- lej, rozpuszczalnego w wodzie i nizszych alkano- lach i prawie nierozpuszczalnego w wielu roz¬ puszczalnikach organicznych. W dalszej czesci opisu przedstawiono dotychczas (scharakteryzowa¬ ne fizyczne i spektralne wlasciwosci obu skladni¬ ków antybiotyku A^287.

Skladnik A antybiotyku A-287 jest bezposta¬ ciowym cialem stalym barwy bialej, o tempera¬ turze topnienia powyzej 220°C. Jego sklad ele-» mentarny stanowi 44,98% C, 6,15% H, 10,28% N, 26,37% O, 4,15% popiolu. 6856688566 Pozorny ciezar czasteczkowy skladnika A wy¬ nosi okolo 1500 (1475,73). Oznaczenie to wykona¬ no w metanolu metoda osmometryczna, za pomo¬ ca aparatu do oznaczania ciezaru czasteczkowego Hd'tachi-Perkin Elmer model 115.

Widmo w podczerwieni skladnika A w zawie¬ sinie w oleju mineralnym przedstawiono na fig. 1 zalaczanych rysunków. W widmie tym obserwuje sie maksima przy 3,05 (srednie), 6,05 (srednie do silnego), 6,59 (srednie), 6,84 (srednie) i 7,27 (sred¬ nie) mikronów (pasma oleju mineralnego przy 3,42 i 3,50 mikronów).

Skladnik A obserwuje w nadfioletowej czesci widma, wykazujac w roztworze wodnym maksima przy* ^20* m/i i(E r= 8500, przegiecie) i 273 m/i (E = 2700), przy czym maksima nie ulegaja prze¬ sunieciu^ w roztworach zasadowych i kwasnych.

Skladnik B antybiotyku A-287 jes.t bezposta¬ ciowym cialem stalym barwy bialej, nie wykazu¬ jacym wyraznej temperatury topnienia, zwegla¬ jacym isie w temperaturze okolo 200°C. Jego sklad elementarny .stanowi 49,96% C, 6,98% H, 9,90% N, 23,86% O, 4,66% popiolu.

Pozorny ciezar czasteczlsawy skladnika B wy¬ nosi okolo 2800 (2781,28). Oznaczenie to wykonano w metanolu metoda osmometryczna, za pomoca atparsftu <4q Qzmcz&nia ciezaru <^^steczkcrw^gQ Hi- tachd-Perkin Elmer model 115.

Widmo w podczerwieni skladnika B w zawie¬ sinie w oleju mineralnym przedstawiano na fig. 2 zalaczonych rysunków. W widmie tym obserwuje sie maksima przy 3,06 (srednie), 6,09 (silne), 6,60 (srednie), 6,89 (srednie) i 7,30 (pasma olejiu mineralnego przy 3,45 i 3,52 mikro¬ nów).

Sfcla4|LiH E absorbuje w nadfioletowej czesci widma, wykazujac w roztworze wodnym maksi¬ ma przy 220 rau (E = 9200) \ 273 m/j (E ^ 3200), przy czym maksima me ulegaja przesunieciu W roz^tworaifch zasadowych i kwasnych.

Ekiktroniieferyczne miareczkowanie skladników antybiotyku A-287 wykazuje stala konsumpcje za¬ sady, co jest cecha charakterystyczna peptydów cyklicznych.

Skladniki antybiotyku A-287 i ich mieszaniny sa dobrze rozpuszczalne w wodzie i nizszych al¬ koholach,, takich, jak butanol i metanol, a nie¬ rozpuszczalne w wielu rozpuszczalnikach organicz¬ nych takich, jak na przyklad eter dwuetylowy.

Skladniki A i B antybiotyku A-287 niaja w chro¬ matografii bibulowej podane w tablicy 1 wartosci Rf. Jako organizmy testowe stosowano Bacillus subtilis ATCC 6633, Sacrina lutea ATCC 9341 lub Staiphylococcus aureus ATCC 6538.

Sklad aminokwasowy skladników A i B anty¬ biotyku A-287 jest bardzo podobny. W sklad ich czasteczek wchodza aminokwasy (w nawiasach przyblizona wartosc stosunku molowego) takie, jak seryna (1), kwas glutaminowy (1), glicyna. (2), ala¬ nina (1), walina (2), cysteina (1)* izoleucyna (1), leucyna (2), tryptofan (1), nieznane (2).

Antybiotyk A^287 i poszczególne jego skladniki hamuja wzrost mikroorganizmów chorobotwór¬ czych w stosunku do zwierzat i roslin, a ponadto Tabela 1 40t 45 50 55 W.artosc Rf Sklad¬ nik A 0,17 0,70 0,39 0,72 0,68 Sklad¬ nik B 0,88 0,88 0,90 0,86 0,89 Uklad (rozpuszczalników butanol wysyoony woda (butanol wysycony woda +2% ikwasu p-toluenosulfonowego (p-TSA) butanol wysycany woda +2% p-TSA + 2% piperydyny 80% etanol z 1,5% NaCl, bibula impregnowana roz¬ tworem wodnym 0,95 m Na2S04 i 0,05 m NaHS04 metanol: 0,1 n liCa <3 :1) wykazuja czynnosc przeciwpasozytnicza i czyn¬ nosc pobudzania wzrostu.

Antybiotyk A-287 i jego skladniki sa poszcze¬ gólnie aktywne w istosunku do chorioboitwórczych bakterii gram dodatnich, zarówno in vitro, jak i in vivo, i mo^a byc stasowane do leczenia cho¬ rób, wywolywanych przez te organizmy.

W tabeli 2 przedstawiono minimalne stezenia hamujace (MIC) skladników A i B antybiotyku A-287 w stosunku do kilkunastu przykladowych mikroorganizmów, oznaczone standardowym spo¬ sobem rozcienezen na agarze.

Tabela. 2 Organizm $taphylQCoocus. auapeus Staphylococcus albus Biacillus subtilis Mycobaotermm avium Proteus vulgaris Shigella paradyisenteriae Br-ueella bronchiseptica Viibrio metschndkoviii Erwinia amylovora Agrobaoterium tumefaciens Xanth'Omonas malvacearuim Xanth'omonas phaseóiU Pseudomonas solanaeearum Pseudomonas syringae Corynebaoteriuni insddiosum Ailternaria oleracea Ceratostomella fimbriata Glom.erella singuiata Pullularia sp.

YeirticiUium albo atrum MIC {^g/ml) Sklad¬ nia A 6,25 6,25 12,5 100,0 50,0 100 © \ 50 100 100 50. 50 100 100 50 100 100 Sklad¬ nik B 12,5 6,25 3,13 12,5 ; 50,0 12,5 ,0 100 100 . 50 . 6,2.5 100 100 12,5 50 100 12,5 100 | Ilosciowy udzial skladnika B antybiotyku A-287 jest niewielki. Jak wynika z tablicy 1, aktywna sci in vitro skladników A i B isa zblizone, tak 65 wiec rozdzielanie ich w celu zwalczania bakterii5 88566 6 chorobotwórczych lub pobudzania wzrostu nie jest celowe.

W ponizej przedstawionych badaniach antybio¬ tyk A-287 oznacza mieszanine, skladajaca sie w 95—98% ze skladnika A i w 2—5% ze sklad¬ nika B.

Ostra toksycznosc .antybiotyku A-287, oznaczo¬ na na myszach droga wprowadzania dootrzewno¬ wego i wyrazona jako LD5q, wynosi 1370 mg/kg.

Antybiotyk A- 287 w doustnych dawkach 1250 mg/ /kg nie powodowal smierci myszy.

Antybiotyk A-287 wykazywal czynnosc prze- ciwbakteryjna przy podawaniu myszom badz to pozajelitowo, badz tez doustnie. Ponizej w tabeli 3 przedstawiono wartosci ED50 (dawki efektywne, zabezpieczajace 50% zwierzat testowych przy dwóch dawkach) w przykladowych zakazeniach.

Tabela 3 Staphylococcus autreus Streptococcus pyogenes Diplococcus pneumoniae Podskór¬ nie 50 mg/kg 1 mg/kg mg/kg Doust¬ nie 4 mg/kg Dalsza cenna wlasciwoscia antybiotyku A-287 jest czynnosc przyspieszania wzrostu zwierzat.

Dodany do pozywienia w ilosci 45,4 g na tone an¬ tybiotyk A-287 powodowal przecietny przyrost wagi kurczat w ciagu 10 dni 159,9 g, podczas gdy w grupie kontrolnej przyrost wagi wynosil w tym czasie tylko 146,1 g. Sprawnosc konwersji pozy¬ wienia (-stosunek wagi pozywienia do przyrostu wagi ciala) wynosila 1,43 w przypadku zwierzat, karmionych pasza z dodatkiem antybiotyku A-287 a w grupie kontrolnej 1,52.

Wlasciwosc pobudzania przyrostu wagi czyni an¬ tybiotyk A-287 szczególnie cennym w hodowli zwierzat. W przypadku stosowania jako czynnika poBudzajacego wzrost, korzystnie antybiotyk mie¬ sza sie z pokarmem. Efektywnosc pobudzania wzrostu wystepuje podczas stosowania w daw¬ kach 10—1000 g na tone paszy. , Antybiotyk A-287 wykazuje równiez wlasciwo¬ sci pasozytobójeze. Jest efektywny w zwalczaniu goraczki powrotnej powodowanej przez kretki Borrelia novyi. W próbie opisanej w artykule M.

C. Cowen, M. E. Callender, J. F. Lawlis, Jr. i M.

C. Brandt, Amer, J. Trop. Med. Hyg. 2, 212—218 (1953) zakaza Sie myszy kretkami goraczlki po¬ wrotnej, a po uplywie 6 godzin podaje im bada¬ ny zwiazek. Nastepnie po uplywie 24 i 48 godzin pobiera sie myszom krew i bada ja na obecnosc kretków. Efektywna dawka antybiotyku A-287 w istosunku do Borrelia wynosi, przy wprowadza¬ niu dootrzewnowym 10 mg/kg.

Typowa dawka ochronna antybiotyku A-287 przeciw/ko pasozytom takim, jak Borrelia, przy wprowadzaniu pozajelitowym wynosi 10—500 mg/ /'kg.

Jak wynika z powyzej opisanych wlasciwosci, amtyibiotyk A-287 jest uzyteczny w hamowaniu wzrostu organizmów chorobotwórczych. Oprócz wyzej opisanych zastosowan antybiotyk A-287 stasuje sie równiez jako powierzchniowy srodek dezynfekcyjny. Jako skuteczne srodki dezynfek¬ cyjne stosuje sie 2°/o roztwory antybiotyku. Ko¬ rzystnie stosuje sie roztwory, zawierajace równiez detergent lub inny srodek czyszczacy. Roztwory te mozna stosowac do dezynfekcji iszikla, narzedzi dentystycznych i chirurgicznych, i powierzchni ta¬ kich, jak sciany, podlogi i stoly w pomieszcze¬ niach, w których wazne jest zachowanie warun¬ ków sterylnych, na przyklad w szpitalach i w kuchniach.

Nowy antybiotyk sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie w drodze podpowierzchniowej, ae- robowej hodowli wytwarzajacego antybiotyk A-287 szczepu Actinoplanes, na odpowiedniej pozywce.

Wyodrebnianie i oczyszczanie antybiotyku prze¬ prowadza sie sposobami ogólnie stosowanymii Mikroorganizmem nadajacym sie do wytwarza¬ nia antybiotyku A-287 jest szczep rodzaju Actino¬ planes z rodziny Actinoplanaceae. Rodiziina Acti^ noplanaceae nalezy do rzedu Aatinomycetales i zo¬ stala opisana po raz pierwszy przez Coudha [J. EMsha Mithell Sci. Soc, 65, 315—318 (194&); 66, 87—92 (1950); Trans. New York Acad. Sci., 16, 315—318 (1954); J. Elisha Mitchell Sci. Soc., 71, 148—155 i 269 (1955); „Berigey'is Manual of Deter- miinative Bacteriology" 7th Edition, 825—829 (1957); J. Elisha Mitchell Sci. SoC, 79, 53—70 (1963)].

Kultura Actionoplahes (stosowana do wytwarza¬ nia antybiotyku A-287 zostala. zdeponowana bez ograniczen w Northern UtilizaitJion Research and Development Division, U. S. Dept. of Agriculture, Peoria Illinois 61604^ gdzie Jeisft ogólnie dostepna pod numerem NRRL 5614.

Dr Paul J. Szainiszló isklasyfilkowal taksono¬ micznie powyzsza kultu*$ jako nowy szOzep Acti¬ noplanes utahensis. W badaniach taksonomicz¬ nych posluzyl sie metodamij podobnymi do zale¬ canych przez Interniational Streptomyces Project oraz dodatkowymi próbami zwykle -stosowanymi w taksonomii [E. B. Shifling i D. Gotitlieb: „Me^ thods for Oharacterizaition of Streptomyces Spe- cies", Iintennational Buli. Systemie BaoteHol., 16, 313—340 (1966)].

Póinizej przedstawiano morfologie szczepu Acti¬ noplanes uJtahenisiis.

Grzybnia wegetatywna. Strzepki ria isynitetycznyim i pólsyntetycznyim agarze sa dlugie, rozgaleziome, popirizegradzanc, srednicy 0,2—1,2 iuni. Na po¬ wierzchni agatfu grzybnia tworzy zwarta, diiecó uniesiona warstwe, przypomiinajac^ skóre. W zad¬ nej pozywce nie powstaja strzepki powietrzne.

Obfitosc pionowych strzepków" bezposrednio pod powierzchnia agaru. Wszystkie pionowe strzepki wyrastaja ze strzepków poziomychj które obficie wystepuja glebiej w agarze d nia powierzchni aga¬ ru koncza sie zarodinia.

Zaródnie. Zarodnie powstaja w obfitosci na aga¬ rze Czapska (Dfifco Laboratories, Óetiroit, ftlicni- gam). Pojawiaja sie po okolo sle^miMimowej in¬ kubacji w temperaturze 22—Z5°C; W miare; sta¬ rzenia isic. kolonii, Cala jej rió^ietfzefi/hia t^kryW& 40 45 50 55 6088566 7 8 sie gesta mata zaródni. Zarodnie umiejscowione sa pojedynczo na bardzo krótkich sporangiofo- rach (koncowe partie pionowych strzepków ponad powierzchnia agaru).

Niekitóre sporangiofory rizgaleziaja sie dwu- lub czasem trzykrotnie, a na ko*ncu kazdego rozgale¬ zienia wyrastaja zarodnie. Typowe zarodnie maja ksztalt kulisty lub zblizony do kulistego, a ich srednica wynosi 8—10 jam. Zarodnie zawieraja —50 zarodników o ksztalcie zblizonym do kuli¬ stego, ulozonych we wnetrzu zarodnii w jednym lub kilku pierscieniach. Pekniecie zarodni prze¬ jawia sie jako prawie calkowita dezintegracja scianyv Proces uwalniania zarodników rozpoczyna sie zwykle w 10—15 minut po umieszczeniu za¬ rodni w wodzie. Zarodniki nie sa zwykle od razu ruchliwe, lecz dopiero po Uplywie okolo 5 minut.

Ruchliwosc nadaja im peczki biegunowych rozlo¬ gów.

'Ponizej przedstawiono wyglad mikroorganizmu na pozywce. Agar Czapeka. Wzrost dobry, przy czym z inokulum punktowego w ciagu 4 tygodni wyrasta kolonia o srednicy okolo 1 cm. Nie ob¬ serwuje sie strzepków powietrznych. Kolonia jest zwykle splaszczona, z lekkim centralnym wybrzu¬ szeniem. Kolonia jest poczatkowo barwy jasno- pomaranozowej, matowiejacej w miare powstawa¬ nia zarodni i pokrywania nimi grzybni.

Agar Czapeka z peptonem. Wzrost dostateczny, przy czym z inokulum punktowego w ciagu 4 ty¬ godni wyrasta kolonia o srednicy okolo 0,5 cm.

.Nie obserwuje sie. strzepków powietrznych. Kolo¬ nia zwykle. plaska, rozproszona i lekko sluzowata, barwy brazowopomaranczawej — matowa. Zarod¬ nie powstaja.

Agar Anio-Henssena. Wzrost dostateczny, przy czym z inokulum punktowego w ciagu 4 tygodni wyrasta kolonia o srednicy okolo 0,5 cm. Nie ob¬ serwuje sie strzepków powietrznych. Kolonia jest „pagórkowata", z ostrym szczytem w srodku, z ostrymi grzebieniami, rozchodzacymi sie do kra¬ wedzi kolonii. Kolonia jest barwy jasnopomaran- czowej do zóltopomaranczowej. Liczne zarodnie powstaja w starszej czesci kolonii, lecz nie w ta¬ kiej ilosci, jak na agarze Czapeka. Ponizej przed¬ stawiono tsklad chemiczny scianki komórkowej Ac¬ tinoplanes utachensis.

Aotinoplanes utachensis NRRL 5614 ma .sklad chemiczny scianki komórkowej, podobny do wy¬ kazywanej przez szczepy Actinoplanes utahensis (Szaniszlo i Gooder, 1967). Automatyczne analizy aminokwasów i aminocukrów wykazuja obecnosc w hydrolizacie sciany komórkowej po 18 godzi¬ nach, w 6 n HOl, w temperaturze 100°C, gluko- zaminy, kwasu muramowego, glicyny, alaniny i kwasu 2,6-dwuamino-3-hydroksypimelinowego (HDAP) w duzych stezeniach. W mniejszych ste¬ zeniach wystepuje kwas 2,6-dwuaminopimelino- wy (DAP). W tabeli 4 przedstawiono molowy sklad aminokwasowy scian komórkowych Actino¬ planes utachensis NRRL 5614 i A. utahensis (Sza¬ niszlo i Gooder). Za jednosc przyjeto stezenie kwasu glutaminowego wyrazone w molach.

Chromatografia bibulowa sciany komórkowej w ciagu 2 godzin, w 2 n H2SO4, w temperaturze Tabela 4 1 Organizm Actinopla¬ nes uta- hiensiis NRRL 5614 Aotino¬ planes utahensis (Szaniszlo | i Gooder) Aminokwasy kwas glutami¬ nowy 1,00 1,00 1,14 1,18 13 0,74 0,93 HDAP 0,61 0,53 DAP 0,15 0,11 100°C wykazala obecnosc jiednocukrów takich, jak glukoza, galaktoza, marinoza, arabinoza, ksyloza i raminoza. Cukry te zwykle znajduje sie w scia¬ nach komórkowych szczepów A. utahensis.

Na podstawie powyzszego opisu taksonomiczne¬ go, mikroorganizm, produkujacy antybiotyk A-287, sklasyfikowano jako nowy szczep Aotinoplanes utahensis, nieco rózniacy sie od Atcinoplanes uta¬ hensis Couch, opisanego przez Coucha w J. Eli- scha Mitchell Sci. Soc, 79, 53—66 (1963). Nowy szczep wytwarza na agarze Czapeka liczne zarod¬ nie i jest barwy jasnopomaranczowej do matowej brazowawopomaranezowej, podczas gdy znany or¬ ganizm wytwarza „zadne lub nieliczne" zarodnie i jest barwy brzoskwiniowopomaranczowej. Róz¬ nice zabarwienia obserwuje sie równiez na aga¬ rze Czapeka z peptonem i na agarze z (tyrozyna (nowy szczep barwy jaisnobrazowej, znany szczep barwy pomaranczowej). Powyzsze róznice sa jed¬ nakze jedynie róznicami szczepów, a pod wszyst¬ kimi innymi wzgledami charakterystyka nowego szczepu jest zgodna z charakteryistyka opisana dla tego 'gatunku.

. Jak uprzednio wspomniano, antybiotyk A-287 wytwarza sie na drodze hodowli Actinoplanes utahensis NRRL 5614. Hodowle mozna prowadzic na róznych pozywkach, jadnak z uwagi na eko¬ nomie, wydajnosc i latwosc wyodrebniania anty¬ biotyku, niektóre z mich sa korzystniejsze od in¬ nych. Tak wiec korzystnym zródlem weglowoda¬ nów jest melasa, a korzystnym zródlem azotu ma¬ ka sojowa.

Ponadto pozywka powinna zawierac nieorga¬ niczne sole odzywcze, istanowiace zródlo sodu, po¬ tasu, amonu, wapnia, jonów fosforanowych, chlor¬ kowych, siarczanowych, octanowych i weglano¬ wych. Dobre wyniki daje dodatek czynników wzrostowych takich, jak pozostalosc po destylacji zacieru i ekstrakt drozdzowy.

Podobnie, -jak w przypadkach innych mikroor¬ ganizmów, hodowla Actinoplanes sp., stosowanego w niniejszym wynalazku, wymaga obecnosci pier¬ wiastków sladowych. Pierwiastki te -zwykle sta¬ nowia zanieczyszczenia innych (skladników po¬ zywki.

Poczatkowa wartosc pH pozywki moze byc róz- 40 45 50 55 6088566 9 10 Tabela 5 Charakterystyka kultur na róznych pozywkach agarowych (temperatura inkubacji 30°C) Pozywka Glukoza z asparagina Agar Emersonsa Agar Bennetta Maka owsiana z pasta pomidorowa Agar Czapeka Agaf odzywczy Tyrozyna Maka owsiana Gliceryna z glicyna Ekstrakt z drozdzy Skrobia z solami nieor¬ ganicznymi Gliceryna z asparagina Jablczan wapnia Ekstrakt z drozdzy + + ekstrakt slodowy | Grzybnia wegeta¬ tywna Jlosc 4+ 4+ 3 + 1 + 3^+ 2+ 2+ 3+ 4 + 4+ 3/4+ '4+ 4+ Morfologia powietrzna ilub sporulacja zaródnie; brak grzybni powietrznej brak zarodni; brak grzybni powietrznej zarodnie; brak grzybni powietrznej brak zarodni; brak grzybni powietrznej zarodnie; brak grzybni powietrznej brak zarodni; brak grzybni powietrznej brak zarodni; 'brak grzybni powietrznej zarodnie; nieznaczny „wykwit" brak zarodni; nieznaczny „wykwit" zarodnie; nieznaczny „wykwit" liczne zarodnie; nieznaczny „wykwit" liczne zarodnie; nieznaczny „wykwit" brak zarodni; nieznaczny „wykwit" zarodnie; nieznaczny „wykwit" Barwa odwrotu Kod M&P* Nazwa INCB** 10C7 umiarkowanie zóltawonrózowa 1.1B.12 intensywnie pomaranczowa 12C7 jasnobrazowa barwa nie okreslona T 13D7 jasnobrazowa 11B2 - jasnozólta 13B7 ' jasnobrazowa 12C3 iszarawozólta 12B9 brazowopomaranczowa 12B9 brazowawopomaranczowa 12A9 brazowawopomairanczowa 9C8 " / ,. I sredmiopomaranczowa 9C8 sredniopomaranczowa _l *) A. Maerz, M. Rea Paul „A Dictionary of Colar", McGraw-Hill New **) Sposób oznaczania barw ISCC-NBS i „A Dictioinary of Color Names Oircular 553, Z. S. Government Póntiing Office York, N. Y.

National Bureau of Staridarts na, pozadane jest jednak, by przed imokulaeja mi¬ kroorganizmem doprowadzic je do wartosci pH = = 6,8—7,5, w zaleznosci od rodzaju stosowanej pozywki. Koncowa wartosc pH jiest okreslona, przynajmniej w pewnym stopniu, poczatkowa wartoscia pH pozywki, buforami obecnymi w po¬ zywce i czasem wzrostu organizmu.

Korzystne warunki produkcji antybiotyku A-287 stwarza podpowierzchniiowa fermentacja aerobowa w tankach. Male ilosci antybiotyku mozna otrzy¬ mywac w hodowli, prowadzonej w kolbach na trzasawce. Z uwagi na opóznienie wytwarzania antybiotyku, zwyikle zwiazane z inokulacja duzych tanków zarodnikowa postacia mikroorganizmu, korzystnie stosuje isie linokulum wegetatywne.

Swieze aktywne inokulum wegetatywne otrzymu¬ je sie, indkulujac mala objetosc pozywki hodo¬ wlanej zarodnikami lub grzybnia mikroorganizmu.

Inokulum wegetatywne przenosi sie do wiekszego tanku. Do hodowli .inokulum wegetatywnego moz¬ na stosowac te isama ipozywke, co w fermenta¬ cjach na wiejksza skale, lub inna. 53 65 Mikroorganizm, wytwarzajacy antybiotyk A-287, mozna hodowac w temperaturze 20^35°C. Opty¬ malna temperatura wytwarizania antybiotyku A-287 wynosi okolo 30^C.

Zazwyczaj w aerobowej hodowli podpowierzdh- niowej, pozywke przedmuchuje sie sterylnym po¬ wietrzem. Dobry wzrost mikroorganizmu i wyso¬ ka wydajnosc antybiotyku A-287 uzyskuje pie, przedmuchujac powietrze z .szybkoscia powyzej 0,1 objetosci na jednostke objetosci pozywki na minute. Wartoscia optymalna jest 0,6—1 objetosci powietrza na jednostke objetosci pozywki na mi¬ nute.

Wytwarzanie antybiotyku w czasie fermentacji kontroluje sie, badajac próbki brzeczki na aktyw¬ nosc w stosunku do organizmów, wrazliwych na antybiotyk. Jednym z odpowiednich organizmów poddanych badaniu jest Sacrina lutea ATOC 9341.

Próby biologiczne przeprowadza sie za pomoca krazków bibuly, wysyconych brzeczka i naklada¬ nych na plyty z agarem. zarówno w hodowli w tankach, jak i w kol--S8566 li bach, maksymalne stezenie antybiotyku wystepu¬ je'zwykle po uplywie 2—6 dni ód inokulacji.

, Wyzej opisany antybiotyk A-287 mozna wyod¬ rebniac z hodowli * znanymi sposobami. Antybio¬ tyk wytwarzany w czasie fermentacji gromadzi sie w plynie hodowlanym i jego wyodrebnianie prowadzi sie dostosowanymi do takich przypad¬ ków sposobami. Tak wiec, na przyklad konwen¬ cjonalnymi sposobami, na przyklad ma drodze sa¬ czenia usuwa sie grzybnie i nie rozpuszczone cia¬ la stale, a z przesaczu wyodrebnia sie antybiotyk A-287 na drodze ekstrakcji ]ub absorpcji.

W wyzej opisanych warunkach szczep Actino- myces NRRL 5614 wytwarza glówinie skladnik A antybiotyku A-287. Skladnik ten stanowi 95—98% mieszaniny, a pozostalosc stanowi skladnik B.

Jako odpowiednie rozpuszczalniki do ekstrakcji przesaczonej brzeczki stosuje sie 'nizsze alkohole, na przyklad butanol lub pentanol. Dalszego oczy¬ szczania antybiotyku A-287 dokonuje sie na dro¬ dze dodatkowej 'ekstrakcji i'chromatografii na ma¬ terialach takich, jak Sephadex G-25 lub G-50 i tlenek glinu.

Rozdzielenia skladników A i B i ich wyodreb¬ nienia dokonuje sie dobrze znanymi sposobami takimi, jak rozdzial przeciwpradowy i prepara- tywna chromatografia cienkowarstwowa lub ko- lulmnowa. Przykladowo (rozdzielenia skladników A i B mozna dokonac na drodze preparatywnej chromatografii na zelu krzemionkowym w ukla¬ dzie butanoli: kwas octowy : woda (4:1:1), stosu¬ jac elucje metanolem. Na wieksza skale korzyst¬ nie stosuje sie chromatografie kolumnowa.

Chromatografie kolumnowa mozna przeprowa¬ dzac na tlenku glinu, eluujac skladnik - B meta¬ nolem, a skladnik A 2J°/o roztwcrem amoniaku w metanolu, na celulozie DEAE stosujac elucje bu¬ forem octanu sodu o pH = 5,6, o gradiencie ste¬ zenia, wzrastajacym od 0,001 m do 0,2 m, na zy¬ wicy ikatioMitowej (XE-64 w cyklu wodorowym), stosujac elucje 0,05 ni buforem cytrynianowym o pH wznastajacym od 5,2 do 5,8. Korzystnym sposobem rozdzialu jest rozdzial przeciwpradowy.

Dobre wyniki uzyskuje sie, gdy jedna faza jest polarny rozpuszczaltnik niemieszajacy sie z woda lub mieszanina takich rozpuszczalników, a dru¬ ga faza buforowy roztwór o pH = 5,0—8,5. Naj¬ lepsze wyniki otrzymuje sie, gdy jedna z faz jest uklad rozpuszczalników taki, jak keton metylo- izdbutylowy : butanol lub octan etylu : etanol, a druga faza roztwór buforowy o pH = 6,8—7,0.

Ponizsze przyklady ilustruja przedmiot wyna¬ lazku.

Przyklad I. Fermentacja antybiotyku A-287.

A. Fermentacja w kolbach. Skos agarowy, skla¬ dajacy sie z 65 g maki owsianej (gotowanej), 20 g agaru i wody zdemineralizowanej, stanowiacej uzupelnienie do objetosci 1 litra iinokuluje sie szczepem Actinoplanes utahensis NRRL 5614 i prowadzi hodowle w ciagu 10—14 "dni w tempe¬ raturze 30°C.

Grzybnia wytwarza pigment barwy •pomaran¬ czowej do pomaranczowobrazowej. Na tej pozyw¬ ce kultura zwykle nie zarodnikuje, dlatego ko¬ nieczne jest zmacerowanie grzybni splaszczona, za-~ 12 ostrzona igla do inokulacji, w celu zwiekszenia liczby potencjalnych centrów wzrostu. Zmacero- wana dojrzala kulture zalewa sie sterylna woda i dokladnie rozciera sterylna paleczka w celu otrzymania zawiesiny grzybni. Zawiesine przecho¬ wuje sie w stanie zliofilizowanym. Jedna szósta tak przygotowanej kultury inokuluje sie 50 ml pozywki wegeritatywnej, zawierajacej 20,0 g maki owsianej, 5,0 g tryptonu, 2,5 g suszonych drozdzy oraz wode zdemiineralizowana, stanowiaca uzupel¬ nienie do 1 litra.

Poczatkowa wartosc pH pozywki wegetatywnej wynosi okolo 7,2 a po uplywie 72 ogdzin 6,6—7,0.

Wegetatywna pozywke iinokuluje sie i imkubuje w kolbach o pojemnosci 250 ml, w temperaturze °C, w ciagu 72 godzin, na wstrzasarce obroto¬ wej, obracanej z szybkoscia 250 obrotów na mi¬ nute. Po zakonczeniu fermentacji ciala stale (re¬ prezentujace wzrost) stanowia 20—30%.

B. Fermentacja w tanku. Pozywka wegetatyw¬ na, otrzymana w sposób wyzej opisany, uzyta w objetosci 1,25 litra, inokuluje sie 25 litrów ste¬ rylnej pozywki produkcyjnej, zawierajacej 10,0 g sacharozy, 10,0 g maki sojowej, 30,0. g melasy, 4,0 g enzymatycznego hydrolizatu kazeiny. 1,0 g K2HP04, 1,0 g MgS04, 0,2 g srodka przeciwpien- nego. Dow Corminig oraz 5 ml roztworu soli mi¬ neralnych Czapeka (KC1 100 g, MgS04 • 7H20 100 g, FeS04 • 7H20 rozpuszczone w 2 ml stezo- negio HC1 — 2 g, woda zdemiineralizowana uzu¬ pelnienie do 1 litra) i wode wodociagowa, stano¬ wiaca uzupelnienie do 25 litrów.

Po sterylizacji w ciagu 30 minut, w autoklawie w temperaturze 120°C, pod cisnieniem 7—r9 atmo- sfer, pH pozywki ma wartosc 7,2. Iniokulowana pozywke produkcyjna fermentuje sie w tanku o pojemnosci 30 litrów w temperaturze 3iO°C, W ciagu 5 dmi. Przez pozywke przedmuchuje sie ste¬ rylne powietrze z szybkoscia, stanowiaca jednost- 40 ke objetosci powietrza na jednostke objetosci po¬ zywki na minute i miesza ja konwencjonalnym mieszadlem z szybkoscia 400 obrotów na minuta Przyklad II. Antybiotyk A-287 wytwarza sie sposobem, opisanym w przykladzie I, z ta rózni- 45 ca, ze stosuje sie skos agarowy, zawierajacy 60,0 g maki owsianej (gotowanej), 2,5 g drozdzy, 20,0 g agaru, 1,0 g K2HP04, 5 ml roztworu soli mine¬ ralnych Czapeka i 5,0 g ekstraktu z fermentacji butanolu BY500 produkcji Commercial Solvents 50 Corp., Terre Haute, Indiana.

Przyklad III. Wyodrebnianie skladników antybiotyku A-287. Brzeczke fermentacyjna w ilo¬ sci okolo 25 litrów, otrzymana sposobem, opisa¬ nym w przykladzie I, przesacza sie z dodatkiem 55 pomocniczego materialu filtracyjnego (Hyflo Su¬ per-cel, ziemia okrzemkowa produkcji Johns- Manyille Products Corp.). Przesacz doprowadza sie rozcienczonym HC1 do pH 6,5, a nastepnie dwu¬ krotnie ekstrahuje 1-butanolem. Ekstrakt butano- 60 Iowy zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac oleista pozostalosc, która rozpuszcza sie w buforze fosforanu sodu (0,1 m, pH = 7,0), a roztwór trzykrotnie ekstrahuje 1-butanolem.

Ekstrakt butanolowy odparowuje sie pod aminiej- 65 szonym cisnieniem do sucha, a pozostalosc roi-13 88566 14 puszoza w metanolu i eterem wytraca z roztworu ainltybiotyk. Osad odwirowuje sie i suszy pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac proszek bar¬ wy brazowej {wydajnosc odzysku z brzeczki 50— 65%). Poszek oczyszcza sie, a nastepnie odbarwia na drodze chromatografii na zelu Sephadex G-25, prowadzac elucje woda. Po oczyszczaniu chroma¬ tograficznym, aktywna substancje ponownie wy¬ traca sie eterem z metanolu i oddziela, otrzymu¬ jac 3 g antybiotyku A-287.

Skladniki A i B antybiotyku A-287 rozdziela sie na drodze przeciwpradowego rozdzialu, stosu¬ jac 15 rozdzielaczy o pojemnosci 500 ml, po 250 ml w kazdej z faz. Jako faze górna stosuje sie mieszanine keton izobutylowy : 1-butanol (3 : 2), a jako faze dolna (ruchoma) 0,1 m bufor fosfora¬ nu sodu o pH = 6,8. Skladnik A przechodzi do fazy ruchomej, a skladnik B pozostaje w górnej fazie pierwszego rozdzielacza. Odparowanie pod zmniejszanym cisnieniem daje 1 g produktu.

Skladnik A odzyskuje sie z buforu na drodze eks¬ trakcji 1-butanolem, odparowania ekstraktu do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, rozpuszczenia pozostalosci w metanolu i wytracenia eterem. Wy¬ dajnosc skladnika A wynosi 2,9 g.

Claims (1)

Zastrzezenie patentowe ¦

1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku A-287 znamienny tym, ze w pozywce zawiera¬ jacej przyswajalne zródlo weglowodanów, azotu i nieorganicznych soli prowadzi sie podpowierzch- niowa hodowle szczepu Actiinoplanes utahensis NRRL 5614, w warunkach aerobawych, do wy¬ tworzenia przez ten mikroorganizm w wymienio¬ nej pozywce wysokiego stezenia antybiotyku, a na¬ stepnie z brzeczki pofermentacyjnej wyodrebnia sie otrzymany antybiotyk A-287 oraz ewentualnie rozdziela na skladniki A i B. io , 1588566 00 OJ i < El88566 00 00 CD