PL87754B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego obojetnego, zawierajacego azot antybioty¬ ku okreslonego jako A-2315.Sposób wytwarzania antybiotyku A-2315 wedlug wynalazku polega na hodowli nowego organizmu Actinoplanes phllippinensis NRRL 5462 w warun¬ kach wglebnej fermentacji aerobowej, az do uzy¬ skania odpowiedniej aktywnosci antyhiotycznej.Otrzytmany antybiotyk wyosabnia sie z przesa¬ czonej brzeczki pofermentacyjnej w postaci amor¬ ficznej, korzystnie przez ekstrakcje rozpuszczalni¬ kiem organicznym i oczyszcza chromatografia ko¬ lumnowa na aktywowanym tlenku glinu lub zelu krzemionkowym. Antybiotyk A-2315 stosuje sie jako srodek antybakteryjny zwlaszcza przeciw streptokokom Gram^dodatnim.W innym aspekcie, antybiotyk A-2315 jest sku¬ teczny dla zwalczania organizmów, wywolujacych próchnice zebów i zapalenie tkanki okolozebowej.Antybiotyk A-2315 wplywa takze na wzrost ptactwa, jezeli podaje sie go w karmie.Ponadto stosuje sie go na plantacjach roslin jako srodek grzybobójczy.Antybiotyk A-23ii5 jest stala substancja amor¬ ficzna barwy 'bialej o ciezarze czasteczkowym 032 638, okreslonym przez widmo masowe. Anali¬ za elementarna wykazala zawartosc 61,61*/t wegla, 7lf/t wodoru, 8,69*/* azotu i 21,53*/* tlenu. Biorac pod uwage analize elementarna i ciezar czastecz- Juwy, okreslono dla antybiotyku nastepujacy wzór 2 empiryczny C^^NjOj. Elektrometryczne miarecz¬ kowanie antybiotyku A-2315 w 66*/« roztworze dwoimetyloformamidu w wodzie nie wykazalo obec¬ nosci grup, dajacych sie zmiareczkowac.Skrecalnosc wlasciwa antybiotyku A-t33l5 okres¬ lona w temperaturze 27°C w metanolu, w którym stezenie antybiotyku wynosilo 0,375 procent wago¬ wych na objetosc, wynosila — 132°.Krzywa absorbcji widma podczerwonego anty¬ biotyku A»2915 w chloroformie przedstawiono na rysunku.Obserwowano nastepujace pasma atosorbcyjne wid¬ ma podczerwonego w mikronach (w — slabe, m — srednie, s — mocne): 2,81 (w), 2,99 11 5,82 i(m); 6,02 (m-Hs); 6,82 (w); 6,94 7,71 (w); 8,88 (WMm); 9,11 (w—m); il!l,14 (w-nm).Ultrafioletowe widmo absorpcyjne antybiotyku A-2315 w 95Vo etanolu wykazalo maksimum ab¬ sorpcji przy 214 mfi (840,290) o zdolnosci absorp¬ cyjnej £ }*m , wynoszace 799.Antybiotyk A-2315 jest rozpuszczalny w metano- tt lu, etanolu, w wyzszych alkoholach w wiekszosci rozpuszczalników organicznych, lecz wykazuje tylko niewielka rozpuszczalnosc w wodzie. Chro¬ matografia bibulowa z zastosowaniem jako orga¬ nizmów wskazujacych Sarcina lutea okreslono war- tosci refrakcji, przedstawione w tablicy 1. 87 75487 754 3 Tablica 1 c.d. tablicy 2 | Wartosc 0,19 0,91 0,91 0,56 0,60 0,83 0,75 0,72 0,65 0,84 1 0,90 ~*—' " ' 1 Rozpuszczalnik metylo-etylo-keton (MEK):benzen: woda (1:5:1) warstwa górna butanol nasycony woda butanol nasycony woda plus 2% kwas p-toluenosultfonowy (p-TlSA) metylo-izobutylo-keton (MIBK) nasycony woda MIBiK nasycony woda plus 2% p-TSA .woda:metanol:aceton (12:3:1) ó wartosci pH=10,5 otrzymanego za pomoca NH4OH, a nastepnie zmniejszonej do wartosci 7,5 za pomoca H^P04 l«/o MLBK, 0,5°/o NH4OH w wodzie 17,4 kg fc2HP04, 30 ml etanolu na 1 litr wody 7% NaCl plus 2,5% MEK w -wodzie propanol i woda (1:9) 1 butanol:etanol:woda (13,5:15:150) 1P0 poddaniu analizie amina-kwas, antybiotyk A-i2315 wydziela wieksza ilosc alaniny; Antybiotyk A-2315 zawiera dwie grupy hydro¬ ksylowe i jest zdolny do wytwarzania pochodnych estrowych znanym sposobem ina przyklad przez acylowanie bezwodnikiem octowym w pirydynie.Otrzymane pochodne estrowe sa takze stosowane jako antybiotyki.Uwzgledniajac wlasciwosci fizyczne i badania strukturalne okreslono prawdopodobny wzór dla antybiotyku A-2315 przedstawiony na rysunku. Bu¬ dowa antybiotyku A-2315 okreslona tym wzorem nie jest pewna, lecz istnieje duze prawdopodobien¬ stwo, ze taik wlasnie ijest.Antybiotyk A-23)15 wykazuje dzialanie hamujace wzrost pewnych mikroorganizmów.Poziom hamowania wzrostu organizmów przez antybiotyk A-2315, okreslono za pomoca róznych badan.Badanie za pomoca plyitek-dysków.Plytki z agarem szczepiono badanym organiz¬ mem, stosujac 6 mm dysk (pojemnosc 0,02 ml) na¬ pelniany .2 rozcienczeniami roztworu antybiotyku.Dysk zawieral 1/50 stezenia stosowanego roztworu, np. dysk zawiera 30 ug substancji, otrzymanej z roztworu o stezeniu 1500 ug/ml.Wyniki, otrzymane z wyzej wymienionych badan dla antybiotyku A-2315, przedstawiono w tablicy 2.Tablica 2 Aktywnosc antybiotyku A-2315 Badany mikroorganizm Staphylococcus aureus 3055* Staphylococcus aureus 3130*** Staphylococcus aureus 1 3074** Mycobacterinni avium | Streptococcus pyógenes Minimalne stezenie I hamujace rozwój — MIC (kg/dysk) ' 0.025 0.2 0.4 3.13 0.012 40 45 50 55 Aktywnosc antybiotyku A-2315 | Badany mikroorganizm Bacillus subtilis Sarcina lutea Proteus sp.Escherichia coli Salmonella typhimurium Salmonella typhosa Sjhigella flexneri Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Candida albicans Saccharomyces pastorianus Trichophyton mentagrophytes Fusarium moniliforme 1 ^Teurospora sp.Minimalne stezenie 1 hamujace rozwój —* MIC (kg/dysk) 50. 0.008 100. - 12.5 12.5 12.5 1.56 12.5 50.0 100.0 100.0 1Ó0.0 100.0 1 100.0 | A wrazliwe na benzylopenicyline ** odporne na dzialanie benzylopenicyliny *** odporne na dzialanie benzylopenicyliny i meticyliny W tablicy 3 przedstawiono wyniki hamowania infekcji zakazonych doswiadczalnie myszy za po¬ moca antybiotyku A-2315. Badanie wrazliwosci an¬ tybiotyku A-2315 przeciw chorobotwórczym orga¬ nizmom Gram-dodatriim.Tablica 3 Badanie wrazliwosci rozcienczonej brzeczki, zawierajacej antybiotyk A-2315 Badany organizm Staphylococcus aureus 3055* Streptococcus pyógenes C203* Diplococcus pneumoniae Park I MIC (lig/ml) 3.13 0.4 .0 * wrazliwe na benzylopenicyline Antybiotyk A-2315, wstrzykniety myszom, wy¬ kazuje in vivo dzialanie antybakteryjne przeciw doswiadczalnie -wywolanym przez bakterie infek¬ cjom. W tablicy 4 przedstawiono wartosc EDM (efektywna dawka dla zabezpieczenia 50°/o bada¬ nych zwierzat wedlug1 Warren Wick'a i innych, J. Bacteriol, 81, 233-235/1961/), obliczona za pomoca dwóch dawek antybiotyku A-2315, podawanych za- kaizonym myszom.Tablica 4 Organizm," wywolujacy infekcje Staphylococcus aureus 3055 Streptococcus pyógenes Diplococcus pneumoniae (ParkI) iWartosc ED50 90 mg/kg 83 mg/kg 166 mg/kg ,y Ostra toksycznosc antybiotyku A-2315, podawa¬ nego doustnie lub podskórnie myszom, okreslona jako LD0, wymesi wiecej niz 500 mg/fcg. Ostra tok¬ sycznosc antybiotyku A-2315, podawanego myszom87 754 dootrzewnowo, okreslona jako LD50, wynosi wiecej na 400 nig/kg.Inne wlasciwosci antybiotyku A-2315 wykorzy¬ stuje sie do zwalczania Mycoplasma gallisepticum, organizmu, wywolujacego choroby drobiu. Szcze¬ gólnie interesujaca jest aktywnosc antybiotyku A-2315 przeciw takim szczepom tego organizmu, który jest odporny na dzialanie tylozyny.Minimalne stezenie hamujace (MIC) okreslono in vitro za pomoca badan rozcienczonej brzeczki.Wyniki przedstawiono w tablicy 5.T a b 1 i c a 5 Wrazliwosc Mycoplasma Gallisepticum CMG) na antybiotyk A-2315 Szczep MG 34 159 (odporny na tylozyne) 41313 (odporny na tylozyne) 42 854 (odporny na tylozyne) 43 480 (odporny na tylozyne) i 318 502 (wrazliwy na 1 tylozyne) MIC ([Ag/ml) 0,195 0,78 0,195 <0,097 <0,097 Ponadto antybiotyk A-2315, podany kurczetom zakazonym Mycoplasma gallisepticum, wplywa na zwiekszenie wagi i zmniejszenie uszkodzen pocho- robowych u kurczat, które przezyly chorobe. Kur¬ czetom wstrzykuje sie w szyje dootrzewnowo roz¬ twór antybiotyku w glikolu polietylenowym 200.Nie obserwowano toksycznosci, lecz u niektórych kurczat, które padly, obserwuje sie maly krwotok na powierzchni szyi. Otrzymane wyniki przed¬ stawiono w tablicy 6. mg/kg wagi ciala zwierzecia. Przy stosowaniu pro¬ filaktycznym lub tarapeutycznym, zapobiegajacym tej chorobie ukladu oddechowego, antybiotyk A-2315 o odpowiednim stezeniu wprowadza sie do karmy zwierzat.W innym aspekcie antybiotyk A-2315, wytwo¬ rzony sposobem wedlug wynalazku, ma wlasciwosci hamowania rozwoju mikroorganizmów, powoduja¬ cych rozwój chorób okolozejbowych. Badania roz- cienczen brzeczki antybiotyku A-2315 wykazaly, ze hamuja one rozwój kariogennych organizmów Streptococcus mutans przy stezeniu 1—2 ug/ml i hamuja wzrost karioigeninych bakterii nitkowatych w stezeniu mniejszym od 0,1 ug/ml.Hamowanie rozwoju kariogennych organizmów za pomoca .antybiotyku A-2315 ilustruje opisany ponizej test.Probówke z brzeczka azotowa, zawierajaca 5#/o sacharozy, szczepi sie ikarioigennymi mikroorganiz¬ mami. Bakterie nitkowate wprowadza sie na po¬ wierzchnie brzeczki, znajdujacej sie w probówce.Po inkubowaniu w temjperaturze 37°C w ciagu nocy tworzy sie warstwa w postaci plytki (zwlaszcza z komórek i dekstran) na powierzchni (bakterii.Nastepnie bakterie wprowadza sie do roztworów, zawierajacych antybiotyk i kontaktuje w ciagu 5, 10 i 15 minut. Po uplywie tego czasu, bakterie wy¬ plukuje sie przez zanurzenie w wyjalowionej, de-, jonizowanej wo'dzie, a nastepnie inkubuje w ciagu nocy w temperaturze 37°C w 'jednolitym srodo¬ wisku, zawierajacym sacharoze i niebieski bromo- tymol. Wzrost bakterii obserwuje sie na podstawie zmiany zabarwienia niebieskiego bromotymolu od zielonego do zóltego odpowiednio do ilosci kwasu,, wytworzonego przez organizmy rozwijajace sie w srodowisku, zawierajacym sacharoze. Brak wzro¬ stu wskazuje, ze antybiotyk jest zniszczony przez organizm. , Tablica 6 Wplyw antybiotyku A-2315 na embriony kurczat, zakazonych Mycoplasma gallisepticum Grupy poddane badaniu Zakazona grupa kontrolna normalna grupa kontrolna grupa, której Ipodano antybiotyk A-2315 w 1 ilosci 3 mg/kurczaka kurczeta martwe liczba martwych ogólnej liczby w grupie 13/20 0/20 12/20 uszkodzenia pochorobowe 11/13° 9/9^ kurczeta zywea | 'sredni ciezar 1,00 g !214' g 133 g uszkodzenia pochorobowe 7/7 0/20 0/8 przeciwciala MG 7/7 ; 0/20 8/8 a dane otrzymane po 14 dniach b 2/13 nie poddano badaniil c 3/9 nie poddano badaniu Uwzgledniajac powyzsze, antybiotyk, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, stosuje sie jako sro¬ dek uodporniajacy kurczeta na zakazenia wywola¬ ne Mycoplasma. Odpornosc przeciw Mycoplasmia uzyskuje sie, podajac zwierzetom doustnie lub pod- 60 W badaniu tym stosowano roztwór antybiotyku, A-2315 o stezeniu 0,1% jest to roztwór, skutecznie zwalczajacy kariogenny Streptococcus sp. podczas kontaktowania z bakteriami w krótkim czasie takim, jak piec minut. skórnie antybiotyk A-2315 w ilosci okolo 50—500 65 Poniewaz aktywnosc tego typu roztworu prze-7 87 754 8 ciw keriogennym organizmom, wplywajacym na choroby ofcolozebowe, jest odpowiednia do zwal¬ czania tych chorób, antybiotyk A-2315 o odpowied¬ nim stezeniu wprowadza sie do preparatów, sto¬ sowanych do higieny jamy ustnej takich, jak pasta, proszek lub zel do mycia zebów, lub plyny do plu¬ kania lamy ustnej itp.O jaszcz* innych korzystnych zastosowaniach antybiotyku A-1315 stanowia wlasciwosci, wply¬ wajace na wzrost zwierzat Jezeli do karmy kur¬ czat dodaje sie antybiotyk A-2315 w ilosci 48J g/tone, sredni przyrost wagi ciala po 10 dniach wynosi 159, podczas gdy u kurczat grupy kontrol¬ nej, którym nie podawano antybiotyku, sredni przy¬ rost na wadze wynosi 14B g. Wspólczynnik prze* ksztalcania karmy na przyrost dla kurczat, którym podawano antybiotyk wynosi 1,44 (karma/wzrost wagi), a dla grupy kontrolnej 1*53.Wlasciwosci antybiotyku A**2315 do pobudzania wzrostu wagi zwierzat ga szczególnie uzyteczne.Podczas stosowania jako czynnika pobudzajacego wzrost antybiotyku o odpowiednim stezeniu wpro¬ wadza sie do zwyklych racji zywnosciowych dla zwierzat, Antybiotyk A-4315 szczególnie efektyw¬ nie wplywa na wzrost, jezeli podaje sie go w ilos¬ ci okolo 10—50 g/tone karmy.Ponadto antybiotyk A-23JS moze byc stosowany jako srodek grzybobójczy na plantacjach roslin.Antybiotyk A-3315 o stezeniu 400 ppm zabezpiecza plantacje fasoli zakazone rdza fasolowa (Uromyces phaSeoli var. typica) i daje odpowiednie zabezpie¬ czenie ogórkom zakazonym Colletotrichum lage- nartuap, Prsy czym obserwuje sie tylko niewielka fitotoksycznosc.Dla zabezpieczenia plantacji przed zakazeniami efektywna ilosc antybiotyku A-2315 jako srodka grzybobójczego, stosuje sie w postaci cieczy do roz¬ pylania, proszków do opalania, uzywajac odpowied¬ nich rozpuszczalników, nosników, emulsyfikatorów, srodków zwilzajacych, srodków powierzchniowo- -czynnych.W zaleznosci od indywidualnych warunków do zwalczania grzybów na plantacjach antybiotyk A-2915 stosuje sie w ilosci okolo 200—500 ppm.Biorac pod uwage wyzej wymienione wlasciwos¬ ci, antybiotyk A-2315 stosuje sie do zwalczania pa- togennych organizmów. Ponadto roztwór, zawiera¬ jacy maja ilosc antybiotyku taka, jak dwa procent, stosuje sie do dezynfekcji wyrobów szklanych, den¬ tystycznych, operacyjnych, a takze powierzchni scian, podlóg, stolów i otoczenia dla zapewnienia sterylnych warunków, które sa bardzo wazne w szpitalach i pomieszczeniach, w których produkuje sie zywnosc itp.'Nowy antybiotyk wytwarza sie sposobem wedlug wynalazku na drodze hodowania produkujacego A-2315 szczepu Actinoplanes we wglebnych wa¬ runkach aerobowych w odpowiedniej kulturze, az do otrzymania kultury, zawierajacej antybiotyk o odpowiedniej aktywnosci.Antybiotyk wydziela sie przez róznorodne wy¬ odrebnianie i oczyszczanie ogólnie stosowane w tego typu sposobach.Mikroorganizm stosowany do wytwarzania anty¬ biotyku A-2315 jest tokJsonomieznie scharakteryzo¬ wany jako nowy szczep Actinoplanes pbiHppitteBsia * Couch. Rodzaj Actinoplanes jest czlonkiem Actino- plactaceae, rodziny mikroorganizmów rzedu Actsao- mycetales. s Rodzine Actinoplanaceae opisal po raz pierwszy Couch /J. Elisha Mitchell Sci. Soc., 65, 315—3lO/lS4sV i 66, *7—*2 /1950/; Frans. New York Acad. Sfti^ 16, 315—318 /1V54/; J. Elisha Mitchell Sci. Sec., 71, 148-155 i 269 /1«K/; „Bergey'* Manual of minative Bacteriology,^ Seventh EdRion, 815—ajf /1957/; J. Elisha Mitchell Sci., Soc., 79, 53—70 /1963/A Sposoby stosowane w badaniach taksonomicznych szczepu Actinoplanes produkujacego A^2315 sa po¬ dobne do zalecanych dla Miedzynarodowych Strep- tomyces. ' W taksonomii moga byc stosowane inne znane testy /E. B. Shirlinga i D. Gotttieba; „Sposoby charakteryzacji gatunku Streptomyces" /Interna¬ tional Buli. Systemie Bacteriol., 16, 313—340/1968//.Ponizej podano ocene morfologiczna organizmu,' stosowanego w sposobie wedlug wynalazku.Wegetacyjna grzybnia.Strzepki grzyba na syntetycznym i pólsy&tetycz- nym agarze sa najpierw krótko, slabo rozgalezione, podzielone d maja srednice 0,2—1,2 um. Po okolo 2 tygodniach kolonie moga zawierac dobrze widocz¬ na mase pionowych strzepków, wyrastajacych po¬ jedynczo z ekstensywnych wyjsciowych strzepków, pochowanych bardzo gleboko w agarze, lub alter¬ natywnie moga zawierac lekko sluzowata mase krotkach strzepków, które sa majo widocznymi pio¬ nowymi strzepkami.W koloniach z dobrze widoczna masa pionowych strzepków, grzybnia tworzy scisla, powolna rosna¬ ca narosl. W koloniach z krótszymi strzepkami grzybnia tworzy najczesciej narosle w .postaci ko¬ puly.W zadnym srodowisku nie wytwarzaja sie na¬ powietrzne strzepki. Zarodniki wytwarzane sa w wiekszej ilosci na powierzchni kolonii w postaci kopuly, Zarodnie wytwarzaja sie bardzo obficie na pól- syntetycznym agarze Anio-Hausse^a. Wystepuja one po okolo 2—4 tygodniach inkubowania w tem¬ peraturze 17—19°C. Zarodnie wytwarzaja sie poje¬ dynczo na bardzo krótkim sporangioforze (konco¬ wej czesci strzepka nad powierzchnia agaru). Za¬ rodnie wystepuja w ksztalcie soczewkowatym, ku¬ listym lub lekko wachlarzowaty, sa odpowiednio male o Srednicy 4—'10 um. Zarodnie zawieraja —40 soczewikowatych zarodników* które umiesz¬ czone sa w co.-najmniej jednym splocie. Zarodniki dojrzale maja srednice wynoszaca okolo 1,0 um.Wysypywanie zarodników nastepuje przez calko¬ wite lub czesciowe rozpadanie zarodni. iW-dziesiec lub pietnascie minut po umieszczeniu w wodzie zarodnie zaczynaja irfiec tylpowy ksztalt kulisty, a nastepnie uwalniaja zarodniki na skutek rozpadu scianek. Zarodniki nie sa bardzo ruchli¬ we, lecz staja sie bardziej ruchliwe przez* poddanie dzialaniu polarnych rzesek w ciagu okolo 5 minut.Na agarze z roztworu Czapek*a wykazuja dobry wzrost; punktowe zaszczepienie wytwarza w ciagu 4 tygodni kolonie o srednicy 0,75 cm. Nie obserwuje 45 » 55 6087 754 sie napowietrznych strzepków. Kolonie sa ogólnie splaszczone z malym centralnym wferzCholkfefB.Ketonie mafia kotar umiarkowanie pomaranczowy.Zaradnie sa rzadko obserwowane.Na agarze z roztworu Czapek a, zawierajacym bialko wykazuja dobry wzrost; punktowe zaszcze- lt koloniach inkubowanych w wyzszej temperaturze wytwarza sie mniejsza liczbe zarodni.W tablicy 7 przedstawiono charakterystyke A-2315 w róznym srodowisku. Okreslenie IOP (pozywka) oznacza International Streptomyces Pro¬ ject — Shiriinga i Gottlieb'a.T Charakterystyki (Po4ywka £merson'a I Glicerol (glicyna 1 glufcoza i asparagina 1 Nieorganiczne I sole-skrobia- 1 -agar ICP4 I Glicerola&par- gina-agar ICP6 Jahlczan wapniowy Bennetfa Ag«r z maczki owsianej ICP3 Ekstrakt z drozdzy i ekstrakt z brzeczki-agar ICP2 Skladniki odzywcze Gzapk»a Ekstrakt z brzeczki Tyrozyna TFO pozywkach Ilosc wegetatyw- \ nej grzybni 0+ ,4+ 34- 3+ 9 4+ Z+ fc+ 24 3+ 1—24- 3f 3 i 1-H 2—34- a b 1 i c a 7 hodowli A-<2315 na róznych w temperaturze 30°C MD* IC NB ** 13K6; silny zóltobrazowy 9L8; silny pomaranczowy 10P7; umiarkowany pomaranczowy 12A8; umiarkowa- nie-pomaranczowy 12A9; jpomaranczo- wo-brazowy 44B1; czerwono- -zielony 12C7; jasno brazowy 44B1; czerwono- -zielony 12D7; jasno- -brazowy 12E6; jasno zólto-brazowy 11C9; umiarkowa¬ nie pomaranczowy 13H7; zólto bezowy nie oznaczono ze wzgledu na slaby wynik 12E7; jasno brazowy Barwnik rozpuszczalny f brazowy ' jasnobrazowy | brak jasnobrazowy brak ; lekko purpurowa lekko brazowy. . brak brak ] brak brak brak I brak brazowy 1 dotyczy A. Maerz i M. Rea PauTa „ADlotioflary o£ Color", Mc Cfraw-HUl, New York, N.Y.„ISCC-NBS metody oznaczania kolorów i nazewnictwa kolorów" National Bureau of Standards Cfrctriar 953, U.S. Govermeat Prlnting O&toe. pienie wytwarza w ciagu 4 tygodni kolonie o sred¬ nicy okolo 1 cm. I^e obserwuje sie napowietrznych strzepków. Kolonie rosna powoli i czasem zwijaja sie lub zderzaja. Kolor kolonii od czerwono-brazo- wega do pomaranczowo-brazowego. Nie otrzymuje sie zarodni Na agarze Anio-Haussen'a rosna dosc dobrze punktowe zaszczepienie w ciagu 4 tygodni wytwa¬ rza kolonie o srednicy 0,5 cm. Nie obserwuje sie napowietrznych strzepków. Kolonie maja ksztalt okragly, krzyza lub gwiazdy z centralnymi wgle¬ bieniami lub peknieciami. Kolonie maja kolor od intensywnie zielonego do bialo zielonego.W koloniach inkubowanych w temperaturze 17—19°C wytwarza sie wieksza ilosc zarodni; a w Actinoplanes phihppmeoa* NRRL Sttfc mala che¬ miczna budowe scianek komórki najbardziej po¬ dobna* do Actinoplanes philippineasis' Gooder, 1997). Automatyczne analizy Jamina*kwas 55 i amina-cukier resztek scianek komórki po 18 go¬ dzinach hydrolizy W kwasem solnym w tempe¬ raturze 100°C wykazaly, ze scianki zawieraja glu- kozoamine, kwas muraminowy, glicyne, alanine i kwas 2,6-dwuaminopimelioowy (DAP) w duzym 60 stezeniu. Kwas 2,6-dwuamino-3-hydr<4»ypimeiino- wy (HDAP) o duzym znaczeniu Jest nieobecny. Pb- równanie zawartosci kwasów aminowych w scian¬ kach komórek Actinoplanes philippineasis NBRL 5402 z A. philippinensis (Szanfcalo) przedstawiono u w tablicy 8.87 754 11 12 Tablica 8 Stosunki molowe* glównych Kwasów aminowych J zawartych w sciankach komórek ] Organizm A. philippinensis NUR 5622 A. philippinensis (Szaniszlo 1 -i"Gooder) glutami¬ nowy 1,00 1,00 glicyna 1,14 1,08 alanina 0,59 0,57 HDAP — DAIW 1,10 a kwas glutaminowy przyjeto za jednostke Chromatograficzna analiza bibulowa resztek, po- 15 zostalych po 2 godzinnej hydrolizie 2 ml 2N kwasu siarkowego w temperaturze r0O°C, wykazala obec¬ nosc w sciankach komórkowych monocukrów glu¬ kozy, galaktozy, majnnozy, ahaiDinozy, jcsylozy i ra- mnozy w ilosciach,! zdolnych do wykrycia. Cukry 20 te znaleziono równiez w sciankach komórek A. phi- lippinensis (Szaniszlo i Gobder).Biorac pod uwage, wyzej wymienione opisy tak¬ sonomiczne organizmu, pródukujacyj antybiotyk A-2315 sklasyfikowano jako nowy szczep Actino- 25 planes philitppimeiSfiis' Couch. Opisana ipowyzej fcul- tura rózni sie od opublikowanych* opisów tego ga¬ tunku tym, ze nie; wytwarza zarodni na agarze, zawierajacym glukoze i aspargine, ponadto na trzech pozywkach obserwuje sie niewielka róznice 30 koloru. Te róznice wskazuja na rózny szczep, lecz nie stwierdzaja róznicy gatunku.Kulture actinoplaWs stosuje sie do; wytwarzania antybiotyku A-2315, szczep ten zostal zlozony i stanowi czesc kolekcji Agriculture Research Ser- vice, Northen Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Dept of Agriculture, IPeoria, Illinois 61604 i zostal opublikowany pod numerem NRRL 5462. I Jak wyzej wspomniano, Actinojplanesi philippi¬ nensis NRRL 5462 moze rosnac w srodowisku od¬ powiednim do wydarzania a^yWotyku A-2315.Jako odpowiednie srodowisko stosuje sie róznego nodzaju media, jednakze ze wzgledów ekonomicz¬ nych i w celu dobrego wydzielenia antybiotyku preferuje sie pewnego rodzaju pozywki. Na przy¬ klad glukoza stanowi korzystne zródlo weglowo¬ dorów, a maczka sojowa korzystne zródlo azotu.Nieorganiczne sole odzywcze wprowadzane do pozywki obejmuja róznego rodzaju sole spozywcze i stanowia solfc sodu; fcotasu, amonu, wapnia, fosfo¬ ru, chlorki; siarczany, octany, weglany itp.Dodatkowym zródlem wzrostu sa wyjalowione . rozpuszczalniki i wyciagi z drozdzy.Elementy sladowe wplywajace na wzrost i roz- 55 woj innych "mikroorganizmów stanowia równiez od¬ powiednie srodowisko dla wzrostu Actinoplanes sposobem wedlug wynalazku. Te elementy sladowe stanowia zazwyczaj dodatek do innych skladników znanejpozywki. 60 Wartosc pH srodowiska stosowana dla rozwoju organizmów sposobem wedlug wynalazku miesci sie w 'bardzo szerokim zakresie. Pierwotne zaszczepie¬ nie organizmenr wymaga srodowiska o wartosci pH=6,5—7,3. Koncowa wartosc pH jest okreslona & 40 45 50 w co najmniej czesci przez wartosc pH obecnych skladników,-buforów i czasem w;którym wzrastal organizmów. i Korzystne dla otrzymania odpowiedniej ilosci an¬ tybiotyku stosuje sie wglejbna fermentacje aero- bowa, prowadzona w zbiornikach;: Mala ilosc an¬ tybiotyku otrzymuje sie w hodowli prosówkowej.Poniewaz opóznienie przy wytwarzaniu antybio¬ tyku ^alezy od zaszczepianej wielkosci zbiornika z wytworzeniem zarodników, korzystnie stosuje sie wegetatywny zaszczep.Zaszczep wegetatywny wytwarza sie przez za¬ szczepienie malej ilosci pozywki zarodnikami lub czesciami grzybni mitoooitganizmów z otrzymaniem swiezej, aktywnej pozywki, zawierajacej ten or¬ ganizm. Wegetatywny zaszczep wprowadza sie do zbiornika o wiekszej objetosci.Pozywka stosowana dla rozwoju wegetatywnego zaszczepu moze byc stosowana do fermentacji wiekszych ilosci, chociaz najczesciej stosuje sie inne pozywki.Organizm, wytwarzajacy antybiotyk A-2315, moze rozwijac sie w temperaturze okolo 20—40°C. Opty¬ malne wytwarzanie antybiotyku nachodzi w tem¬ peraturze okolo 30°C.W aerdbowej wglebnej hodowli poprzez pozywke z hodowla przepuszcza sie powietrze. Dla wydajne¬ go Wzrpstu organizmu i wytworzenia antybiotyku A-2315, do zbiornika, w którym produkuje sie an¬ tybiotyk A-2315, wprowadza sie korzystnie po¬ wietrze w ilosci 0,1 objetosci powietrza na jedna objetosc pozywki na minute. Optymalny wzrost uzyskuje sie, stosujac 0,2—0,8 objetosci powietrza na objetosc pozywki na minute.Wytwarzanie antybiotyku imozna prowadzic na drodze fermentacji przez badanie próbek brzeczki na aktywnosc antybiotyku przeciw organizmom, znanym z wrazliwosci ha dzialanie antybiotyku.Jednym z organizmów stosowanych w badaniach antybiotyku, wytworzonego sposobem wedlug wy¬ nalazku, jest Sarcina Lutea. Tego rodzaju próby biologiczne prowadzi sie z papierowym dyskiem z plytka agarowa.Ogólnie maksynialne wyprodukowanie antybioty¬ ku ma miejsce w duzym zbiorniku lub probówce w ciagu szesciu dni. Zazwyczaj maksymum aktyw¬ nosci antybiotyku otrzymuje sie w ciagu 20—96 godzin.Antybiotyk A-2315 wydziela sie z pozywki kul-, turowej i oddziela od innych substancji, które moga byc obecne jako zanieczyszczenia na skutek ek-87 754 13 14 strajscji i adsorpcji. Korzystnie dla wydzielenia an¬ tybiotyku A-i2315 stosuje sie ekstrakcje. Z prze¬ saczu zawierajacego brzeczke pofermentacyjna wy- ;dziela sie antybiotyk za pomoca odpowiedniego . rozpuszczalnika, takiego jak chloroform. Dla dal- 5 szego oczyszczania antybiotyku A^2315 stosuje sie adsorpcje i eluowanie z zastosowaniem materialów takich, jak wegiel, zywica .poliamidowa, zel krze¬ mionkowy, Sephadex LH-20, polimerowy absorbent Amberlit XADitp. 10 Ponizsze przyklady ilustruja przedmiot wyna¬ lazku, nie ograniczajac jego zakresu.(Przyklad I. A. Wytwarzanie antybiotyku A-2315 w kolbach fermentacyjnych, odpowiednich dowstrzasania. 15 Hodowle Actinoplanes philippmensis NRRL 5462 wytwarza sie i utrzymuje na agarze'zawierajacym 60,0 g wczesniej ogrzanej i osuszonej. maki owsia-# nej, 2,5 g oslabionych, suchych drozdzy browarni¬ czych, 1,0 g, K^HP04, 1,0 g skladnik mineralny po- 2o zywki Czapek'a*, 25 g agaru i 1100,0 ml demonizo¬ wanej wody.Skladnik mineralny pozywki Czapek'a zawiera 2,0 g FeS04 • 7H20' (rozpuszczony w 2 ml stezonego HC1), 100,0 g KC1, 100 g MgS04 • 7H^O i wode de- 25 jonizowana do objetosci 1 litra.Wartosc pH srodowiska doprowadza sie za po¬ moca roztworu wodorotlenku sodu do 6,2—7,3. Po sterylizacji w autoklawie w temperaturze 120°C w ciagu okolo 30 minut pod cisnieniem (15—20 30 funtów) 8—10 kG wartosc pH srodowiska wyno¬ sila 6,7.Skos agarowy szczepiono Actinoplanes philippi- nensis NRiRJL 5462 i inkubowano w temperaturze °C w ciagu 10—14 dni. Kultura w tym srodo¬ wisku zazwyczaj nie przetrwalnikuje i dlatego ewentualnie maceruje sie macierzysta grzybnie wygladzania, scinania, szczepienia igla w celu zwiekszenia potencjalnie rosnacych centr.Macerowana macierzysta kultura bulionowym serum, które zbiera sie za pomoca sterylnej pa¬ leczki, otrzymujac zawiesine grzybni. Zawiesine wprowadza sie do szesciu probówek i lofilizuje.Jedna z liofilizowanych porcji stosuje sie do szcze¬ pienia 50 ml wegetatywnej pozywki zawierajacej ,0 g glukozy, 30,0 g skrobii ziemniaczanej, 20^0 g maczki sojowej, 20,0 g odtluszczonej maki z nasion bawelny, 2,0 Ca003 i 1,1 litra wodociagowej wody. iZaszczepiona wegetatywna pozywke w 250 ml kolbie inkubuje sie w temperaturze 30°C w ciagu 75 godzin w urzadzaniu wstrzasajacym o 250 rpm.Dziesiec mililitrów zaszczepione wegetatywnej pozywki stosuje sie w drugim etapie do zaszczepie¬ nia wzrostowej pozjiMki wegetatywnej, postepujac w sposdb opisany powyzej. W drugim etapie jed- 55 no-litrowa kolbe, zawierajaca zaszczepiona pozyw¬ ke, inkubuje sie w temperaturze 30°C z zastoso¬ waniem obrotowej -vrstrzasarki o 250 rpm.B. Wytwarzanie -antybiotyku A-2315 w tanku fermentacyjnym. eo Otrzymana w drugim etapie wegetatywna po¬ zywke stosuje sie do zaszczepienia 25 litrów ste¬ rylnej pozywki, skladajacej sie z 1% glukozy, 4% skrobii ziemniaczanaj, 0,5% melasy, 4% rozpusz- czalnejgoi bialka miesajiego, 0,4% shydrolizowanej en- 65 40 45 50 zymatycznie kazeiny, 1,0% maczki sojowej, 0,3% MgS04, 0,2% CaC03, 0,02 srodka prze^iwpienieniu (Dow Corning) oraz do 25 litrów wody wodociago¬ wej.Po sterylizacji w autoklawie w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut.pod cisnieniem (15—20 fun¬ tów)*okolo 8—10 kG wartosc pH pozywki wynosila 6,4. W zbiorniku o pojemnosci 40 litrów zaszcze¬ piony produkt fermentuje sie w ciagu 4 dni w tem¬ peraturze 30°C. Fermentujacy produkt napowietrza sie, stosujac na minute pól objetosci sterylnego powietrza na 1 objetosc pozywki. Fermentujaca po¬ zywke miesza sie w znany sposób mieszadlem o obrotach 400 rpm.C. Wydzielanie antybiotyku A-2315.Cala brzeczke pofermentacyjna z tanku o pojem¬ nosci 25 litrów, saczy sie za pomoca filtru po¬ wietrznego. Przesacz alkalizuje sie za pomoca 2N wodorotlenku sodu do wartosci pH=8,5 i otrzy¬ many roztwór ekstrahuje sie 2/3 objetosci chloro¬ formu. Ekstrakt chloroformu zateza sie pod cis¬ nieniem, do otrzymania malej objetosci i dodaje powoli z mieszaniem do 20 objetosci eteru nafto¬ wego (Skellysolve F.). Wytracony osad oddziela sie przez saczenie i suszy pod zmniejszonym cis¬ nieniem uzyskujac 3,13 g surowego antyifciotyku.Surowy antybiotyk rozpuszcza sie w octanie ety¬ lu (100 ml) i podaje na kolumne o wymiarach 2X100 cm," zawierajaca zasadowy tlenek glinu (M. Woelm, Eschwege, Germany). Nastepnie ko¬ lumne przemywa sie 300 ml octanu etylu, eluuje octanem etylu i etanolem (10:1) otrzymujac frak¬ cje, zawierajace aktywny antybiotyk A-2315. Frak¬ cje te laczy sie i odparowuje do sucha pod cisnie¬ niem. Pozostalosc rozpuszcza sie w malej ilosci chloroformu i dodaje do 20 czesci objetosciowych eteru naftowego (Skellysolve F), wytracajac aktyw¬ na substancje. Osad oddziela sie przez saczenie, suszy pod cisnieniem, uzyskujac 1,63 g antybiotyku A-2315.Aktywnosc eluatu okreslono za pomoca próby dyskbibulowy, plytka-agaro/wa.z.zastosowaniem or¬ ganizmu Sarcina lutea i chromatografii cienkowar¬ stwowej na zelu krzemionkowym z zastosowaniem octanu etylu i etanolu <94) oraz Sarcina lutea jako wskaznika, przy czym .do oznaczania- stosowano pary jodu lub rozpylony kwas siarkowy.Przyklad II. Oczyszczanie antybiotyku A-2315 za pomoca zelu krzemionkowego.Postepujac w sposób, analogiczny do opisanego w przykladzie I C, wydziela sie antybiotyk przez wytracenie eterem naftowym, uzyskujac 5 g suro¬ wego produktu. Produkt ten rozpuszcza sie w oc¬ tanie etylu (okolo 10 ml) i dodaje metanol do o- trzymania przejrzystego roztworu. Otrzymany roz¬ twór wprowadza sie na kolumne o wymiarach 5X90 cm, zawierajaca 300 g zelu krzemionkowego (Merck).W celu oddzielenia zanieczyszczen kolumne prze¬ mywa sie 2,5 1 octanu etylu. Aktywny antybiotyk eluuje sie za pomoca octanu etylu i etanolu (95:5).Frakcje aktywne laczy sie i zaiteza do sucha pod cisnieniem, uzyskujac ,2,0 g antybiotyku A-2315 w postaci proszku.Dalsze eluowanie tym rozpuszczalnikiem daje do-87 754 datkowo*0,8 g antybiotyku A-2315 w postaci prosz¬ ku barwy jasno zóltej. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku A-2315, znamienny tym, ze w srodowisku, zawierajacym 16 zdolne do asymilacji zródlo wegla, azotu i sole nieorganiczne, hoduje sie Actinoplanes philippi- nensiss NtRRL 5462 w warunkach wglebilo aerobo- wych, az do otrzymania odpowiedniej ilosci wyzej 5 wymienionego antybiotyku w srodowisku i ewen¬ tualnie ze srodowiska hodowlanego wydziela sie antybiotyk A-2315. fcM-4 A 2315 boomoodoo epo ipo loooypo ajo ap t-o t^_ 13 14- 15 Bltk 2277/77 r. 105 egz. A4 Cena 10 zl PL