KR19980072333A

KR19980072333A - 신규한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12균주와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)

Info

Publication number: KR19980072333A
Application number: KR1019970007088A
Authority: KR
Inventors: 오태광; 박승춘; 변재원; 이동규
Original assignee: 박원훈; 한국과학기술연구원; 이동규; 주식회사 대성미생물연구소
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 1998-11-05
Also published as: KR100206454B1

Abstract

본 발명은 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12(KCTC 0298BP)와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스로에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 종래보다 개선된 내염성, 내담즙성 및 내산성 등의 생리활성을 갖는 신규한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12균주와 이를 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)로의 이용에 관한 것이다.

Description

신규한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12균주와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)

본 발명은 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12(KCTC 0298BP)와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 종래보다 개선된 내염성, 내담즙성 및 내산성 등의 생리활성을 갖는 신규한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12균주와 이를 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)로의 이용에 관한 것이다.

락토바실러스 속 균주는 정상적으로 사람을 포함한 동물의 장관에 일정한 균총을 생성하고 면역증진작용, 유희병원균의 성장억제, 유해독소의 중화 및 합성차단, 영양분의 소화흡수의 증대 그리고 여러 유익한 생리활성을 나타내는 것으로 이미 잘 알려져 있어 사람은 물론 동물에게도 많이 투여하고 있다. 이러한 효과 때문에 유산균의 적용 범위는 더욱 확대되어 육상동물뿐만 아니라 어류에게도 적용되고 있다.

최근에는 동물 및 어류에게 예방학적 차원에서 사용하고 있는 항생제를 환경보호차원에서 그 사용을 규제하고 있고, 또한 일부 이에 대해 법적 규제를 행하고 있다. 실제 항생제를 대신하여 프로바이오틱스(Probiotics)로서 동물 및 어류에 이런 유산균을 투여했을 때, 그 효과가 우수한 것으로 보고된 바도 있다[Simirnov, V.V. et al, Microbiol. Z. 55(4) : 92(1993)].

현재, 바다양식은 대량, 고밀도 사육이 행해지고 있고, 이러한 양식어류는 많은 스트레스와 병원성 세균에 노출되고 있어 각종 생균제 제품을 사료와 혼합하여 투여하므로써 질병예방 및 증체율향상을 유도하고 있다.

프로바이오틱스(Probiotics)란 살아있는 생균제로서 사람 및 동물에 투여된 생균이 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며, 유산을 생성하여 장내의 pH를 낮추어서 유해세균이 증식하지 못하게 한다. 또한, 투여된 생균제는 박테리오신(Bacteriocin) 혹은 과산화물을 생성하여 병원균의 증식을 억제하며 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와준다. 이밖에도, 생균제는 영양소의 흡수와 이용을 돕는 물질을 생성하고, 사료요구율을 개선시키며, 병원균이 생성하는 독성물질을 중화하는 물질을 생성하기도 한다. 생균제는 대체로 동물 혹은 어류가 스트레스로 인한 소화관의 유용균 감소를 억제할 목적으로 이용되며, 항생물질을 경구투여하고 난 후 병원균보다 먼저 세균이 없는 소화관 벽에 부착하여 병원균이 정착하는 것을 방지한다.

그러나, 유산균은 종-특이성(Species-specificity)이 있어 사용하고자 하는 동물의 장세포와 어떤 친화력이 있어서 분과 함께 증식되는 데로 배설되지 않고, 장내 흡착(Adhesion)[Conway,P.L. et al, J. Dairy Sci. 70:1(1987), Fuller et al, Am.J.Clin.Nutri. 27: 1305(1974)]하는 특성이 있어야 효과적인 질병 예방 및 치료효과를 얻을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 현재 프로바이오틱스(Probiotics)로서 사용하고 있는 대부분의 유산균 속들은 사람 및 육상동물의 장내에서 쉽게 분리되는 특성이 있으며, 이를 사람 및 육상동물 뿐만 아니라 해상 및 담수에 생육하는 어류에도 적용하고 있다.

가축에 대한 생균제의 개발은 전 세계적으로 많이 연구되어 있어 많은 제품들이 상품화되어 있으나, 어류에 대한 생균제의 제품은 그렇게 많지가 않다. 현재까지 국내에서 사용되고 있는 어류 전용 프로바이오틱스 제품은 대부분 외국에서 수입되는 균주로써 국내의 어류의 생육환경에 잘 적응하지 못하고 있는 실정이다. 또한, 해양어류에 프로바이오틱스로 사용하는 미생물의 유래가 어류에서 분리된 균주라기보다는, 대부분이 포유동물에서 분리되어 포유동물과 함께 사용하고 있어 어류에 대한 효과에 의구심을 불러일으킨다. 게다가, 원료의 수입으로 인하여, 수입에서 국내 유통간의 시간적인 차이로 인한 안정성의 결핍으로 균체의 콜로니형성도(Colony Forming Unit)도 상당한 문제점으로 제시되고 있다. 특히, 국내에서는 어류용 생균제의 개발은 단 한 건도 국내 기술에 의해 이루어진 것이 없다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 극복한 어류용 전문 생균제가 국내 및 세계적으로 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 양식어류로부터 직접 분리된 유산균주와 이 균주로부터 제조된 프로바이오틱스를 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12(KCTC 0298BP)균주의 전자현미경 사진(×8800)이다.

본 발명은 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12(KCTC 0298BP)를 그 특징으로 한다.

또한, 본발명은 상기 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12(KCTC 0298BP)을 이용한 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)에 또다른 특징이 있다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 내염성, 내담즙성 및 내산성 등 우수한 생리활성을 갖을 뿐만 아니라 종-특이성의 문제도 극복한 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)DS-12와 이 균주를 이용한 프로바이오틱스에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)DS-12의 분리 및 동정과정은 다음과 같다.

- 신규 미생물의 분리 -

남해안 지역의 양식어장으로부터 우럭과 넙치의 내장을 100여점 채취하였다. 각 시료의 장 내용물에서 장내 유산균의 분리를 위하여 3%와 5% 염분(NaCl)이 포함된 BL 배지(10^-1,-3)를 사용하였다. 유산균의 특징인 그람 양성의 간균으로서 카탈라제가 음성인 균주를 최종 선별한 3개균주를 분리하여 선정하였다.

- 신규 미생물의 동정 -

1) 형태 및 배양학적 특성

최적 생육배지에서 배양한 균주를 그람염색을 행한 결과는 그람 양성균이었다. 배양학적인 특징은 통성 혐기성(Facultative anaerobes)이며, 첨부한 도 1에 나타낸 바와 같이 단간상(Short rod) 형태를 가지고 포자를 형성하지 않았으며, 카탈라제(Catalase) 시험결과는 음성반응이고, 유산(Lactic acid) 및 유기산을 생산하는 특성을 가지고 있는 바, 전형적인 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)이 갖는 형태 및 배양학적 특성을 가지고 있다.

2) 생리학적 특성

미생물의 균체의 생리학적인 특성은 주로 당이용성으로서 조사하였다. 다음의 표 1에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 비데센스(Lactobacillus videscens)와 비슷한 생리학적 특성을 나타내었고, 정확히 일치되는 균주는 없었지만, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)에 해당됨을 확정할 수 있었다.

[표 1]

분리된 DS-12균주와 생리적 특성이 비슷한 유산균의 비교

구분 미생물종류	DS-12	락토바실러스 브레비스	락토바실러스 퍼멘텀	락토바실러스 비리데센스
가스생산(Gas production)저온생육(Growth at 15℃)글루콘산이용	++-	+++	+++	++-
아라비노스(Arabinose)자이로스(Xylose)람노스(Rhamnose)솔보스(Sorbose)리보스(Ribose)	d----	dd--+	dd--+	----+
글루코스(Glucose)만노스(Mannose)프럭토스(Fructose)갈락토스(Galactose)	++++	+dd+	++d+	+++-
슈크로스(Sucrose)말토스(Maltose)셀로바이오스(Cellobiose)락토오스(Lactose)트레할로오스(Trehalose)멜리바이오스(Melibiose)	++++++	d+-d-d	d+d+d+	d+--d-
라피노오스(Raffinose)멜리지토오스(Melezitose)	+-	d-	d-	--
가용전분(Soluble starch)	-	-	-	-
만니톨(Mannitol)솔비톨(Sorbitol)	--	--	--	--
에스쿨린(Esculin)살리신(Salicin)아미그달린(Amygdaline)	+--	d--	--d	---
유산이성질체(Lactate isomer)	DL	DL	DL	DL
(주) + ; 90 ~ 100% 양성반응- ; 90 ~ 100% 음성반응d ; 11 ~ 89%

3) 신균주 미생물 DS-12의 동정 및 명명

형태적, 배양학적 및 생리적 특성을 분석한 결과, 본 발명에서 분리된 균주는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)에 속하는 미생물임을 버기스 매뉴얼(Bergey's Manual Systematic Bacteriology Vol 2,William Wilkins Co., 1989)에서 확인할 수 있었다. 동정결과가 정확하게 일치되는 균주는 없었지만, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)과 가장 비슷한 결과를 가지는 것으로 보아 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)의 변종으로 판단된다.

분리된 미생물을 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12로 명명하고, 1997년 1월 22일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구소 생명공학연구소내 유전자원센타에 기탁하여 수탁번호 KCTC 0298BP를 부여받았다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12의 생산

제품화를 위한 생산시험을 하기위해서 배양기(Fermentor)를 사용하여 균체생산시험을 행하였다.

5ℓ의 배양기를 이용하여 펩톤(Proteose peptone)10g, 소고기 육즙(Beef extract) 10g, 효모추출물(Yeast extract) 5g, 덱스트로스(Dextrose) 20g, 솔비탄(Sorbitan monooleate) 1g, 암모늄 사이트레이트(Ammonium citrate) 2g, 소디움 아세테이트(Sodium acetate) 5g, 마그네슘 설페이트(Magnesium sulfate) 0.1g, 망간 설페이트(Manganese sulfate) 0.05g, 다이소디움 포스페이트(Disodium phosphate) 0.05g을 1ℓ의 수돗물에 녹인 배지 3ℓ에 미리 배양된 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12의 종배양 30㎖를 접종하여 공기공급량 1vvm, 교반속도 300 rpm, 30℃의 조건에서 배양하였다.

생산결과는 표 2에 나타낸 바와 같이 균 접종후 14시간에 최대의 균수인 7.8×10⁹/㎖를 생산할 수 있었다.

[표 2]

발효시간에 따른 생산 균수

발효시간(hrs)	생존균수(CFU/㎖)	흡광도(O.D_600㎚)
0	2.2×10¹	0.012
2	2.0×10⁷	0.340
4	1.4×10⁸	0.680
6	3.0×10⁸	1.147
10	8.0×10⁸	1.788
12	2.4×10⁹	1.862
14	7.8×10⁹	1.867
48	10⁵	2.020

실시예 2 : 신균주의 산 생성능 시험

산생성능 실험은 0.2% CaCO₃을 포함하는 펩톤(Proteose peptone) 10g, 소고기 육즙(Beef extract) 10g, 효모추출물(Yeast extract) 5g, 덱스트로스(Dextrose) 20g, 솔비탄(Sorbitan monooleate) 1g, 암모늄 사이트레이트(Ammonium citrate) 2g, 소디움 아세테이트(Sodium acetate) 5g, 마그네슘 설페이트(Magnesium sulfate) 0.1g, 망간 설페이트(Manganese sulfate) 0.05g, 다이소디움 포스페이트(Disodium phosphate) 0.05g을 1ℓ의 증류수에 녹인 배지를 제조하여 사용하였다. 결과판정은 투명환의 크기를 비교하여 산 생성능을 확인하였다. 이렇게 최종 선별된 3균주를 비교한 결과 그 중 산 생성능이 가장 좋은 DS-12균주를 최종 선발하였다.

실시예 3 : 어류 병원성 미생물에 대한 억제능 실험

어류 병원성 미생물 균주에 대한 억제능의 효과를 확인하기 위하여 상기 실시예 2에서 최종 선별한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12 균주를 이용하여 실험을 행하였다.

어류 질병의 원인균중, 비브리오 앙귈라리움(Vibrio anguillarium), 슈도모나스 플루오르센스(Pseudomonas fluorescens), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 슈도모나스 앙귈리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica), 파스퇴렐라 피시다(Pasteurella piscida), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 비브리오 앙귈라리움(Vibrio anguillarium) 85805에 대하여 길항작용 실험을 실시하였다. 그 결과, 본 발명의 균주인 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12는 어류의 주요 병원균인 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 파스퇴렐라 피시다(Pasteurella piscida), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 비브리오 앙귈라리움(Vibrio anguillarium) 85805에 대한 증식억제작용 혹은 살균작용을 나타내었으며, 이는 다음 표 3에 요약하였다. 즉, 이러한 결과는 이 균주가 생성하는 유산균에 의하여 기인하는 것으로 생균제로 적용시 매우 유용한 결과를 얻을 수 있다.

[표 3]

어류 병원성미생물에 대한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12의 항균력

병원성미생물	항균작용의 정도
슈도모나스 플루오르센스	-
에드워드시엘라 타르다	+
슈도모나스 엥귈리셉티카	-
파스퇴렐라 피시다	+
스트렙스코커스 속	-
에어로모나스 하이드로필라	+
비브리오 엥귈라리움	+

실시예 4 : 항생제 내성 시험

어류 및 동물의 사료 첨가 및 치료용으로 많이 사용되는 항생제의 내성을 조사하기 위하여 하룻밤 배양한 락토바실러스 속 DS-12를 10⁴CFU/㎖로 조정한 후, 100㎕를 96-웰 플레이트에 넣고, 미리 희석된 시험하고자 하는 항생제를 100㎕ 가한 다음, 37℃ 정치배양기에 넣어 48시간 후에 균의 생육을 조사하여 최소발육 억제농도를 측정하였다. 그 결과는 다음 표 4에 나타내었으며, 베타 락탐계의 항생제를 제외하고는 모든 계열의 항생제에 대하여 내성을 보유하고 있는 것으로 나타났다. 이미 기존의 유산균들과 항생제의 내성을 비교한 결과 동등하거나 보다 우수한 것으로 나타났다.

이러한 결과는 신균주를 항생제가 포함된 사료에 사용해도 프로바이오틱스로서의 효과를 가질 수 있다는 중요한 사실을 말해준다.

[표 4]

최소발육억제농도의 비교

항생제	최소발육억제농도(MIC(㎍/㎖))
항생제	락토바실러스 속 (L. sp.)DS-12	스트렙토코커스 페슘(S. faecium)	락토바실러스 염내성균(L. halotolerance)
옥시테트라사이클린	25	6.25	12.5
노르플록사신	25	100	100
아목사실린	0.39	0.19	1.56
에리쓰로마이신	100	0.39	3.13
페니실린 G	0.0153	0.0153	0.0153
티아물린	6.25	3.13	3.13
타이로신	100	3.13	6.25
엔로플록사신	25	10	25
스트렙토마이신	50	100	100
스펙티노마이신	100	25	100
테트라사이클린	50	12.5	25
플루메퀸	100	100	100

실시예 5 : 담즙산 내성 시험

상기 실시예 1에서 제시된 유산균 생산배지에 담즙으로 옥스갈(Oxgall)을 0, 0.15, 0.3, 0.5, 1%가 되도록 농도를 맞춘 후, 이미 배양시킨 락토바실러스 속 DS-12 균주를 10⁴CFU/㎖로 접종한 후, 37℃에서 24시간 배양한 다음, 균수를 측정한 결과를 다음 표 5에 요약하였다. 그 결과 옥스갈 1%에서도 균이 정상적인 생육을 보여주어, 동물체내에서 담즙산이 분비되더라도 투여된 유산균이 생육할 수 있으며, 따라서, 프로바이오틱스로서의 역할을 할 수 있는 우수한 유산균이라는 결론을 내릴 수 있었다.

[표 5]

담즙산에 대한 내성 실험

옥스갈[Oxgall(Bile)]	락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12
0%	2.3×10⁹
0.15%	2.4×10⁹
0.3%	2.4×10⁹
0.5%	2.3×10⁹
1%	2.2×10⁹

실시예 6 : 광어를 이용한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12의 장내 효능시험

체중이 평균 200 ~ 300g의 광어를 이용하여 상기 실시예 1에서 생산된 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12를 광어사료에 1%수준(10⁸개의 유산균g사료)으로 처리한 사료와 균주를 첨가하지 않은 사료를 광어에 급여하면서 15일 사양한 후, 임의로 광어를 각각 5마리씩 채취하여 장내미생물의 수를 조사한 결과 표 6에 나타내었다.

[표 6]

광어를 이용한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)DS-12의 장내효능시험(발생빈도)

분류	간균	구균	효모	코리네품	클로스티룸
분류	처리	무처리	처리	무처리	처리	무처리	처리	무처리	처리	무처리
그람양성(G+)	17	9	15	20	1	7	12	3	1	0
그람음성(G-)	3	5	18	15	-	-	-	-	-	-
용혈균	ND	8	6	11	-	-	-	-	-	-
무코이드콜로니	ND	2	ND	ND	-	-	-	-	-	-
(주) ND: 검출불가, 용혈균: 광어피를 용혈하는 병원성균

처리구에서 그람 양성의 간균의 숫자가 늘어나는 것은 사료에 첨가한 유산균인 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12의 숫자가 장내에서 증가함을 나타낸다. 따라서, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12가 물고기 장내에 정착함을 알 수 있고, 병원성 미생물인 용혈균 및 무코이드 형(Mucoid colony)이 처리구에서 급격히 감소되는 것은 어류장내에 정착한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12가 유해성 및 병원성 미생물에 대하여 길항작용을 가지고 있음을 알 수 있다. 이는 본 발명의 신균주가 해양어류의 프로바이오틱스로 유용함을 입증한다.

실시예 7 : 신균주 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12가 광어생육에 미치는 영향

상기 실시예 6과 동일한 조건으로 광어를 1달간 사육한 후, 광어의 증체율 및 사료효율 등을 조사하였다. 그 결과는 표 7에 요약하였다.

[표 7]

락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12의 증체량 및 사료효율

구분	개체 무게증가량(g)	사료효율(%)
처리(1%처리)	86.8	1.41
무처리	78.0	2.20

이 결과 신 균주는 광어의 증체율을 증가시키고 사료효율을 증가시킴을 알 수 있어서 수산농가에서 사용할 때, 수익성을 높일 수 있음을 알았다.

본 발명의 신균주 락토바실러스속(Lactobacillus sp.) DS-12(KCTC 0298BP)은 개선된 내염성, 내담즙성 및 내산성 등의 생리활성을 갖고 있고, 이를 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)로 이용할 경우 어류의 증체율 및 사료의 효율을 개선시키는 효과가 있다.

Claims

락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12(KCTC 0298BP).
제 1 항에 있어서, 상기의 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) DS-12(KCTC 0298BP)는 pH 3의 조건에서 120분동안 생육할 수 있는 내산성, 옥스갈(Oxgall) 1%(w/v)의 조건에서 생육할 수 있는 내담즙성 및 염분(NaCl) 12%(w/v)의 조건에서 생육할 수 있는 내염성이 개선된 것을 특징으로 하는 것임.
락토바실러스 속 DS-12가 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 어류용 프로바이오틱스.