KR20170020215A

KR20170020215A - 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이를 포함하는 동물 사료용 조성물

Info

Publication number: KR20170020215A
Application number: KR1020160070202A
Authority: KR
Inventors: 이중수; 배기덕; 이은경; 김성훈; 지석우
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2015-08-12
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2017-02-22
Also published as: PH12018500069A1; KR101873898B1; WO2017026635A1; CN107949633A; AU2016305391A1; CN107949633B; AU2016305391B2; MY188407A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 속 균주 또는 이의 사균체를 포함하는 동물 사료용 조성물 및 락토바실러스 속 균주의 사균체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이를 포함하는 동물 사료용 조성물{NOVEL LACTOBACILLUS SP. AND FEED COMPOSITION FOR ANIMAL COMPRISING THEREOF}

본 발명은 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이를 포함하는 동물 사료용 조성물에 관한 것이다.

락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.) 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산 간균으로서 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스 속 미생물은 장내 pH를 산성으로 유지시켜, 대장균(E. coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 비타민 합성, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

락토바실러스 속 미생물의 상기 특성에 기초하여 생균제 및 가축사료로 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 가축의 세균성 설사병은 증체율 감소와 폐사를 유발한다. 따라서, 이를 예방하여 가축의 생산을 높이고자 사료에 항생제를 첨가하는 것이 일반적으로 널리 행해져 왔다. 그러나, 항생물질에 대한 내성균의 출현과 축산물 내 잔류 항생물질 등의 문제 때문에 사료 내 항생물질의 사용을 규제하고 유기적인 가축 사양법이 강조되고 있는 추세이다(한국특허공개 1998-78358)(McEwen and Fedorka-Cray, Antimicrobial use and resistance in animals, Clinical infectious Diseases, Volume 34, June 2002, pages S93-S106).

대한민국 등록특허 10-0763037호(2007.10.04 공고)

이에, 본 발명자들은 락토바실러스 속 중에서도 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) CJLR1505의 사균(dead cells, 死菌)이 다음과 같은 효과를 가짐을 알아내었다. 장내 유해세균과 경쟁적 부착 저해능을 발휘하여 장내 세균총을 형성하는데 기여하고, 소장 내에서 사균체의 세포벽이 파괴되면서 용출된 세포벽 구성성분인 리포테이코산(lipoteichoic acid)이 장내 유해세균이 장점막에 정착하는 것을 방해한다. 또한, 장내 유해세균인 대장균과 살모넬라 등은 장내 환경에서 표면에 흡착하지 못하고 장 분비액과 장 연동에 의해 씻겨 내려가게 된다. 또한 락토바실러스 람노서스 CJLR1505의 사균은 중성지방 분해능이 있어, 이를 동물 사료에 사용시 동물의 증체에 효과적이며 사료 효율을 높일 수 있다. 또한 이를 섭취한 동물의 면역력을 증진시킬 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 신규한 락토바실러스 람노서스 CJLR1505와, 이의 사균체를 함유하는 동물 사료용 조성물을 제공함으로써, 이를 포함하는 사료를 섭취한 동물의 증체를 개선하고 항병력을 향상시키는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(Lactobacillus rhamnosus CJLR1505)(KCCM11721P)가 제공된다.

본 발명의 다른 실시예에서, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P), 또는 이의 사균체를 포함하는, 동물 사료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)를 배양하여 배양액을 제조하고, 상기 배양액을 열교환기를 이용하여 70℃ 내지 160℃의 온도로 간접 가열하고, 상기 간접 가열된 배양액을 10~100L/min의 속도로 10℃ 내지 60℃로 급속 냉각하고, 상기 급속 냉각된 배양액에서 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체를 분리하는 것을 포함하는, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 또는 이의 사균체, 특히 사균체는 중성지방 분해능, 내독소 흡착능, 병원성 세균 생장 억제력 및 소화 효소 활성능이 우수하여, 이를 포함하는 동물 사료를 통해 동물의 증체를 개선하고 항병력을 향상시킬 수 있다.

도 1은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) CJLR1505 균주의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 락토바실러스 람노서스 CJLR1505의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 3은 락토바실러스 람노서스 CJLR1505와 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450(Lactobacillus rhamnosus KCCM 32450) 표준 균주의 장 상피세포 부착능 평가 후 부착된 사균수를 나타내는 전자현미경 사진이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

본 발명의 일 실시예는, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(Lactobacillus rhamnosus CJLR1505)(KCCM11721P)에 대한 것이다.

본 발명자들은 자돈의 소장 말단을 채취하여 멸균증류수로 세척한 다음0.001%의 브롬페니콜 퍼플(Bromphenicol purple, BCP)이 첨가된 MRS배지에 도말하여 37℃에서 혐기 배양하였다. 여기서 유산균 생성 균주 47여 종을 선별하여 계대 배양한 다음 이 균주들을 이용하여 형태학적 분리 방법으로 23종을 2차 분리하였다. 23종에 대한 항균활성 및 소화효소 활성 능력을 비교하여 11종을 3차 분리하였으며, 이 유산균 생성 균주의 내담즙성, 내산성 및 동물 장벽세포 흡착성을 측정하고, 당발효, 병원성 세균 생장 억제력, 소화효소 활성능, 중성지방 분해능이 가장 우수한 균주 1종을 분리하였다.

상기 분리한 유산균 생성 균주를 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(Lactobacillius rhamnosus CJLR1505)로 명명하고, 한국미생물보존센터에 2015년 7월 8일자로 기탁하였다(수탁번호: KCCM11721P).

상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505의 형태학적 및 생리학적 특성은 하기 표 1과 같다.

1. 형태학적 특징(MRS 고체배지에서 성장시켰을 때의 형태)
- 세포의 모양	간균
- 세포의 다형성(多形性)	없음
- 운동성	없음
- 아포 형성	없음
2. 생리학적 특징
- 그람 염색(Gram staining)	그람 양성(Gram positive)
- 카탈라아제(Catalase)	음성
- 옥시다아제(Oxidase)	음성
- 생육 온도 및 시간	37℃, 18~48시간
- 산소 요구도	통성혐기성

또한, 상기 락토바실러스 람노서스 CJLR150는 도 1에 도시된 바와 같이 막대(rod) 형태를 가지고 포자를 형성하지 않으며 사균화하였을 때 세포벽 표면의 당단백질 활성에 의해 생균과 사균의 차이가 확인된다.

상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505의 생화학적 분석을 위해 API 키트로 분석한 결과, 하기 표 2에서와 같이 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)와 유사한 당 이용성을 가지는 것으로 동정되었고 16s rRNA 분석을 마크로젠에 의뢰하여 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)와 99% 유사한 분자생물학적 특성을 가지는 것으로 도 2와 같이 동정되었다.

락토바실러스 람노서스 CJLR1505의 당 이용능 분석

No.	당종류	락토바실러스 람노서스 CJLR1505
0	Temoin	-
1	Glycerol	-
2	Erythritol	-
3	D-arabinose	+
4	L-arabinose	-
5	D-ribose	+
6	D-xylose	-
7	L-xylose	-
8	D-adonito	-
9	Methyl-αD-xylopyranozide	-
10	D-galactose	+
11	D-glucose	+
12	D-fructose	+
13	D-mannose	+
14	L-sorbose	-
15	L-ramnose	+
16	D-ulcitol	+
17	Inositol	±
18	D-mannitol	+
19	D-sorbitol	+
20	Methyl-αD-manopyranozide	-
21	Methyl-αD-glucopyranozide	-
22	N-acetylglucosamine	+
23	Amygdalin	+
24	Arbutin	+
25	Asculin	+
26	Salicin	+
27	D-celobiose	+
28	D-maltose	-
29	D-lactose	+
30	D-mellibiose	-
31	D-saccharose	+
32	D-trehalose	+
33	Inulin	-
34	D-melesitose	+
35	D-rafinose	+
36	Amidon	-
37	Glycogen	-
38	Xylitol	-
39	Genthiobiose	+
40	D-turanose	-
41	D-lyxose	-
42	D-tagatose	+
43	D-fucose	-
44	L-fucose	+
45	D-arabitol	-
46	L-arabitol	-
47	Gluconate	+
48	2-ketogluconate	-
49	5-ketogluconate	-

상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)는 내산성, 내담즙성, 항균활성, 소화 효소 분해능 및 중성 지방 분해능이 뛰어나, 이를 동물 사료에 사용시 사료의 효율 및 동물의 증체를 효과적으로 개선할 수 있는 장점이 있다.

상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 사균체는 장내 유해세균과 경쟁적 부착저해능을 발휘하여 장내 세균총을 형성하는데 기여를 하며, 소장 내에서 사균체의 세포벽이 파괴되면서 용출된 세포벽 구성성분인 리포테이코산(lipoteichoic acid)이 장내 유해세균이 장점막에 정착하는 것을 방해할 수 있다. 또한 상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 사균체는 생균에 비해 소수성 및 응집성이 높아 병원성 미생물 및 내독소에 부착되어 항병력을 향상시킬 수 있는 이점이 있다.

따라서, 본 발명의 다른 실시예는, 상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P), 또는 이의 사균체를 포함하는 동물 사료용 조성물에 대한 것이다.

상기 동물 사료용 조성물은 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 부형제는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 부형제를 사용할 수 있다.

부형제로서는 예컨대 당류(예: 락토오스, D-만니톨, D-소르비톨, 수크로오스), 전분류(예: 옥수수 전분, 감자 전분), 및 무기 염류(예: 인산 칼슘, 황산 칼슘, 침강 탄산 칼슘)등이 있다. 상기 동물 사료용 조성물은, 조성물 1g 당 상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P), 또는 이의 사균체가 1.0×10⁸ cfu 내지 1.0×10¹⁰ cfu로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 1.0×10⁸ cfu 내지 3.0×10⁹cfu로 포함하는 것일 수 있으며, 일 예에서 5×10⁸ cfu로 포함할 수 있다.

상기 범위로 조성물에 사균체를 포함하는 경우, 동물 사료용 조성물의 중성지방 분해능, 내독소 흡착능, 병원성 세균 생장 억제능 및 소화효소 활성능이 극대화될 수 있는 이점이 있다.

다른 실시예에서, 상기 동물 사료용 조성물을 사용하여 제조된 동물 사료가 제공된다. 상기 동물 사료는 본 발명의 일 실시예들에 따른 동물 사료용 조성물을, 통상적인 사료와 혼합하여 제조된 것일 수 있다. 통상적인 사료 구성성분은, 예를 들어, 옥수수, 대두, 대두유, 아미노산 등을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명의 다른 실시예에 따른 동물 사료에는 또 다른 동물 사료용 조성물을 더 혼합하여 제조할 수 있음을 물론이다.

상기 동물 사료는 특별히 제한되는 것은 아니며, 소, 돼지, 말 등의 가축에 급이하기 위한 것일 수 있다. 일 예에서, 돼지에게 급이하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예는, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)를 배양하여 배양액을 제조하고, 상기 배양액을 열교환기를 이용하여 70℃ 내지 160℃의 온도로 간접 가열하고, 상기 간접 가열된 배양액을 10~100L/min의 속도로 10℃ 내지 60℃로 급속 냉각하고, 상기 급속 냉각된 배양액에서 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체를 분리하는 것을 포함하는, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체의 제조 방법에 대한 것이다.

구체적으로, 상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)를 배양하여 배양액을 제조하는 단계는 MRS 한천 배지를 사용하여 이루어질 수 있다. 일 구체예에서, MRS 한천 배지에 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)를 루프로 도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 배양액을 제조할 수 있다.

그 다음, 상기 배양액을 상기 배양액을 열교환기를 이용하여 70℃ 내지 160℃의 온도로 간접 가열한다. 상기 간접 가열은 구체적으로 80℃ 내지 150℃, 보다 구체적으로 90℃ 내지 120℃의 온도범위까지 수행될 수 있다.

상기 간접 가열된 배양액을 10~100L/min의 속도로 10℃ 내지 60℃, 구체적으로 20℃ 내지 50℃, 일 예에서 4℃까지 급속 냉각한다. 그 다음, 상기 급속 냉각된 배양액에서 사균체를 분리함으로써 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체를 얻을 수 있다.

상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체의 제조 방법은, 상기 분리된 사균체에 보호제를 혼합하고 이를 분무건조하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 보호제는 특별히 제한되지 아니하나, 예를 들어 효모추출물, 덱스트로즈 및 원당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 사용할 수 있다. 상기와 같이 보호제를 혼합하고 분무건조하는 단계를 거침으로써, 사균체가 외부 환경으로부터 오염되는 것을 방지하고 사균체의 유통을 보다 용이하게 할 수 있는 이점이 있다.

여기서, 분무건조는 스프레이 드라이라고도 불리며, 열기류 중에 단번에 액체를 분무하여 순간적으로 액상의 건조물을 얻는 방법으로, 회전원반에 의한 원심분무와 압력 노즐에 의한 가압분무 등이 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

더욱 구체적으로, 사균체에 보호제를 혼합하고 분무건조하는 것은, 예를 들어, 사균체에 효모추출물, 덱스트로즈 및 원당을 혼합하여 혼합물을 만든 다음 건조시켜 분말화 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 사균체에 당(예를 들어, 원당) 및/또는 전분(예를 들어, 덱스트로즈)을 혼합한 후, 물(예를 들어, 증류수)에 현탁시킨 혼합액을 분무 건조 처리하여 사균체 분말을 수득할 수 있다. 분무 건조시에는, 예를 들어, 열풍의 유입구 온도를 120∼200℃, 바람직하게는 130∼170℃로 하고, 출구 온도를 30∼150℃, 바람직하게는 50∼100℃로 하여 분무 건조할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

효모추출물, 덱스트로즈 및 원당은 혼합액의 100 중량부를 기준으로, 효모추출물의 첨가량을 0.04∼50 중량부, 더욱 구체적으로, 0.1∼10 중량부로 하는 한편, 덱스트로즈의 첨가량을 1∼100 중량부, 더욱 구체적으로, 10∼50 중량부로 하고, 원당의 첨가량을 0.2∼50 중량부, 더욱 구체적으로, 0.4∼10 중량부로 혼합할 수 있다.

나아가, 분무 건조를 통해 수득된 사균체 분말을 무기염류(예: 인산 칼슘, 황산 칼슘, 탄산 칼슘 등)와 혼합하는 단계를 거칠 수 있다. 이와 같이 무기염류와 사균체 분말을 혼합하는 경우, 무기염류(예를 들어, 탄산 칼슘)가 가지는 흡습성으로, 사균체 분말의 수분 함량을 조절할 수 있는 장점이 있다.

더욱 구체적으로, 동물 사료용 조성물 전체 중량을 기준으로, 사균체 분말 0.05 ~ 50%(w/w), 구체적으로, 0.5~30%, 더욱 구체적으로, 0.5~5%와, 무기염류, 예를 들어 탄산 칼슘 1~80%, 구체적으로, 5~50%. 더욱 구체적으로, 5~20%을 혼합할 수 있다.

상기 동물 사료용 조성물 중에는 당해 조성물 1g 당 사균체를 최소한 10⁸ cfu, 바람직하게는 10⁸∼10¹⁰cfu, 보다 바람직하게는 10⁹∼10¹⁰ cfu 함유하는 것이 좋다. 조성물중에 무기 물질을 추가로 함유할 경우에는 무기 물질의 양은 5∼99%, 바람직하게는 50∼90% 보다 바람직하게는 1∼10%이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.

여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예

실험예 1 내지 6

공지된 균주인 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450을 비교 균주로 하여, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 균주의 안전성, 내산성, 내담즙성, 항균활성, 소화 효소 활성 및 중성지방 분해 활성을 평가하였다.

실험예 1: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 안전성 평가

락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 균주의 안전성을 평가하기 위하여 한국바이오벤처협회 단체표준에서 제시한 안전성 평가 시험법에 따라 용혈 현상 검사, 젤라틴 액화 반응 검사, 유해 대사산물(암모니아) 생성 확인 및 페닌알라닌 탈아민 검사를 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

균주	항목
	젤라틴 액화 반응 검사	페닐알라닌 탈아민 검사	용혈 현상 검사	암모니아 생성
락토바실러스 람노서스 CJLR1505	음성	음성	α-용혈, 안전함	음성

상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)는 젤라틴 액화 반응 검사, 페닌알라닌 탈아민 검사 및 암모니아 생성 확인 검사에서 모두 음성을 나타내었고, 용혈 검사에서도 안전한 것으로 드러났다.

실험예 2: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 내산성 평가

MRS 배지에서 사전 배양한 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 균주와 비교 균주인 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 표준 균주에 대해 pH 2, 3, 7로 각각 조정한 MRS 용액으로 10^-6 배 희석하였다. 희석한 균액을 37℃에서 배양하면서 일정한 시간대별로 MRS agar 배지에 도말하여 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후 콜로니 수를 측정하였다. 내산성 실험의 결과는 표 4에 나타내었다.

Strains	MRS broth (pH7)			MRS broth (pH2)			MRS broth (pH3)
	생균수 (CFU/mL)			생균수 (CFU/mL)			생균수 (CFU/mL)
	0 h	1 h	3 h	0 h	1 h	3 h	0 h	1 h	3 h
락토바실러스 람노서스 CJLR1505	5.8 x 10⁸	6.0 x 10⁸	6.2 x 10⁸	5.8 x 10⁸	2.3 x 10⁵	2.0 x 10⁵	5.8 x 10⁸	3.5 x 10⁸	2.0 x 10⁸
락토바실러스 람노서스 KCCM 32450	6.4 x 10⁸	6.8 x 10⁸	8.6 x 10⁸	6.4 x 10⁸	2.0 x 10²	2.0 x 10²	6.4 x 10⁸	1.0 x 10⁸	5.0 x 10⁶

상기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505는 pH 2 내지 4에서 비교 균주인 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450보다 생존 균수의 감소가 적어 내산성이 우수한 것으로 나타났다.

실험예 3: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 내담즙성 평가

MRS 배지에서 사전 배양한 락토바실러스 람노서스 CJLR1505균주와 비교 균주인 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 표준 균주를 pH 4로 각각 조정 후, 담즙산액(Oxgall)을 각각 0%, 0.3%, 1% 가 되도록 농도를 맞춘 후, MRS 용액으로 10^-6 배 희석하였다. 희석한 균액을 37℃에서 배양하면서 일정한 시간대별로 MRS agar 배지에 도말하여 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후 콜로니 수를 측정하였다. 균수를 측정한 결과는 표 5에 요약하였다.

Strains	MRS broth (pH4)			MRS broth (pH4 and Oxgall 0.3%)			MRS broth (pH4 and Oxgall 1%)
	생균수 (CFU/mL)			생균수 (CFU/mL)			생균수 (CFU/mL)
	0 h	1 h	3 h	0 h	1 h	3 h	0 h	1 h	3 h
락토바실러스 람노서스 CJLR1505	1.8 x 10⁷	4.2 x 10⁷	1.9 x 10⁸	1.8 x 10⁷	1.0 x 10⁷	6.8 x 10⁶	1.8 x 10⁷	7.2 x 10⁶	2.9 x 10⁴
락토바실러스 람노서스 KCCM 32450	1.6 x 10⁷	4.6 x 10⁷	6.8 x 10⁷	1.6 x 10⁷	6.0 x 10⁶	4.2 x 10⁴	1.6 x 10⁷	4.6 x 10⁴	2.0 x 10²

상기 표 5로부터 알 수 있듯이, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505는 pH 4, 담즙산(Oxgall)0.3% 및 1% 용액 모두에서 생존 균수의 수가 큰 감소가 없으며 표준균주에 비해 균수의 감소가 적어 동물 체내에서 담즙산이 분비되더라도 투여된 유산균이 생육할 수 있음을 확인하였다.

실험예 4: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 항균활성 평가

TSB(Tryptic soy broth) 배지(BD, USA)에 24시간 액체 배양된 3종의 병원균(E. coli K88, E. coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium KCCM 25922, Salmonella cholerasuis KCCM 10709)을 멸균된 면봉으로 균일하게 10^5~6 cfu로 도말하였다.

도말 후 직경 4mm의 paper disc에 락토바실러스 람노서스 CJLR1505와 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 를 각각 PBS 버퍼에 10⁹ cfu/mL로 희석 후 50㎕씩 분주하였다. 희석액이 paper disc 속으로 충분히 스며들 때까지 실온에 방치 다음 37℃에서 18시간 동안 호기 배양하였다. 여기서 상기 희석액은 배양 후 상층액에 대해 원심분리(3,000 × g, 10분) 후 PBS 버퍼를 이용해 3회 세척 후 사용한 균체만을 사용한 것이다. 저해환의 크기는 전체 투명환의 직경과 agar 홈의 직경의 차로 측정하였다. 그 결과는 표 6에 나타냈다.

Strains	E. coli K88	E. coli ATCC 25922	Salmonella typhimurium KCCM 25922	Salmonella cholerasuis KCCM 10709
락토바실러스 람노서스 CJLR1505	++	+++	+++	++
락토바실러스 람노서스 KCCM 32450	++	++	++	++

10~15 mm: +, 15~20 mm: ++, 21~25 mm: +++

상기 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 균주 및 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 표준 균주 모두 병원성 미생물에 대한 증식억제 작용을 나타내었지만, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 균주가 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 표준 균주에 비해 항균활성이 높은 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 균주가 생성하는 대사산물에 의한 효과가 아닌 균체 자체에 의한 효과이기 때문에, 이를 가축에게 적용 시 유해 미생물 증식을 억제할 수 있음을 증명한다.

실험예 5: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 소화 효소 분해 활성 평가

소화 효소 분해 활성 실험은 탄수화물, 단백질, 인을 분해할 수 있는 효소를 가지고 있는 유산균인지 여부를 확인하기 위해 수행되었다.

프로테아제(protease)활성이 있는지 여부를 알기 위해서 MRS 한천 배지에 스킴 밀크(skim milk) 0.5%를 첨가하였고, 셀룰라아제(cellulase) 활성이 있는지의 여부를 알기 위해서 MRS 한천배지에 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)를 0.2% 첨가하였으며, α-아밀라아제(α-amylase)활성이 있는지의 여부를 알기 위해서 MRS 한천배지에 옥수수 전분(corn starch) 0.2%(w/v)를 넣었으며, 파이타제(phytase) 활성을 알기 위해 파이테이트 칼슘염(Ca-phytate)을 0.5% 첨가한 배지를 각각 제조하였다. 상기에서 제조된 각각의 배지에 분리된 균주들을 도말(streaking)한 다음, 24시간 배양한 후 관찰하였다.

α-아밀라아제와 셀룰라아제 활성은 24시간 배양한 배지에 2% 콩고 레드(congo red, Sigma, USA) 시약을 처리한 후, 1M 염화나트륨(Nacl)을 이용하여 세척(washing)한 다음, 색깔 여부에 의해 분해효소여부를 확인하였다. 또한, 프로테아제와 파이타제 활성 여부 판정은 투명환의 여부에 의해 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 기재하였다.

Strains	Protease activity	Phytase activity	Lipase activity	Cellulose activity	Amlyase activity
락토바실러스 람노서스 CJLR1505	+++	+++	++++	++++	++++
락토바실러스 람노서스 KCCM 32450	++	++	+++	+++	+++

1~10 mm: +, 11~20 mm: ++, 21~30 mm: +++, 31~35 mm: ++++

상기 표 7로부터 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 균주가 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 표준 균주에 비해 소화효소 분해 활성이 높은 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 락토바실러스 람노서스 CJLR1505를 가축에게 적용 시 사료의 효율을 개선시킬 수 있다는 것을 입증한다.

실험예 6: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 중성지방 분해 활성 평가

락토바실러스 람노서스 CJLR1505의 Bile salt hydrolase(이하 BSH) 활성을 조사한 결과, 2mM의 taurodeoxycholate hydrate(이하 TDCA, Sigma, USA)를 첨가한 MRS 고체배지에서 흰색침전을 생성하여 효소활성이 있음이 확인되었으며, TDCA 양성대조군 균주인 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 표준 균주의 침전과 비슷한 침전 양상을 보였다. 그러나 2mM 의 Sodium glycodeoxycholate(이하 GDCA, Sigma, USA)를 첨가한 배지에서는 침전을 보이지 않았으며, 균이 잘 자라지 못하였다. 그 결과를 하기 표 8에 기재하였다.

복합 담즙산/균주명	락토바실러스 람노서스 CJLR1505	락토바실러스 람노서스 KCCM 32450
TDCA	+	+
GDCA	+	-

+: 성장, -: 성장 못함

상기 표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505는 높은 답즙내성을 가지며 BSH 의 생산으로 중성지방을 분해할 수 있는 형태로 전환하여, 이를 동물에 적용 시 증체에 영향을 줄 수 있는 기능성 균주임이 확인되었다.

실험예 7 내지 9

락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 및 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450표준 균주를 각각 MRS 한천 배지에 루프로 도말하고 37℃에서 48시간 배양하여 배양액을 제조하였다.

그 다음, 상기 배양액을 상기 배양액을 열교환기를 이용하여 100℃의 온도로 간접 가열하고, 이를 30~100L/min의 속도로 10℃까지 급속 냉각하였다. 급속 냉각된 배양액에서 사균체를 분리함으로써, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체 및 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 사균체를 제조하였다.

상기 제조된 사균체들에 대해, 장 상피세포 부착능을 실험하였으며, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505의 생균과 사균의 소수성 및 응집성을 비교하였고, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 사균체를 포함하는 기초사료와 이를 포함하지 않는 기초사료의 증체량 및 사료요구율을 비교하였다.

실험예 7: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)의 장 상피세포 부착능 평가

장 상피세포 부착능 시험을 위한 동물세포로서 HT-29를 한국 세포주은행 (KCLB)에서 분양 받아 사용하였으며, 실험 방법은 김 등 (Kim et. al., Probiotic properties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from porcine gastrointestinal tract, Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 74, April 2007, pages 1103-1111)과 Hirano 등(Hirano et. al., The effect of Lactobacillus rhamnosus on enterohemorrhagic Escherichia coli infection of human intestinal cells in vitro, Microbiology and Immunology, Volume 47, 2003, pages 405-109)의 방법을 사용하였다. 장 상피세포 부착능 실험은 Monolayer를 형성한 HT-29 세포를 PBS buffer를 이용하여 3회 세척하고 항생제가 첨가되지 않은 RPMI1640 배지 0.5mL를 첨가하였다.

상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 사균체 및 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 사균체를 약 10⁹ cells/mL의 농도로 RPMI에 현탁한 다음 well plate에 접종하고 37°C에서 2시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 부착이 되지 않은 유산균 사균체의 제거와 세척에 따른 부착능력을 확인하기 위하여 PBS buffer를 사용하여 3회 세척한 다음, 그람 염색을 실시하여 현미경에서 사균수를 계수하여 부착 정도를 평가하였다. 실험 결과는 도 3에 나타내었다.

실험 결과, 2시간 후 락토바실러스 람노서스 CJLR1505는 5.4 ×10⁸ cells/mL의 사균수로 확인되어, 3.2 × 10⁶ cells/mL의 사균수를 나타낸 락토바실러스 람노서스 KCCM 32450 표준 균주에 비해 높은 장 상피세포 부착력을 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 8: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 생균과 사균의 소수성 및 응집성 평가

락토바실러스 람노서스 CJLR1505생균과 사균의 소수성과 응집성 차이를 확인하기 위해, 자가응집반응과 동시응집반응을 평가하였다.

자가응집반응은 락토바실러스 람노서스 CJLR1505생균과 사균에 대해 OD₆₀₀이 0.5가 되도록 희석한 유산균 3mL에 1mL의 톨루엔을 첨가하여 90초 동안 vortex 하였다. 이후 37℃ water bath에서 1시간 방치한 뒤 톨루엔을 제거 후 수용액 층의 OD₆₀₀을 측정하였다.

동시응집반응은 락토바실러스 람노서스 CJLR1505생균과 사균에 대해 병원성 미생물(E. coli K88, Salmonella typhimurium KCCM 25922, Salmonella cholerasuis KCCM 10709)과 동량으로 혼합(병원성 미생물 : 생균 또는 사균 = 1:1(각1.5ml))한 3mL에 각각 1mL의 톨루엔을 첨가하여 90초 동안 vortex 하였다. 이후 37℃ water bath에서 1시간 방치한 뒤 톨루엔을 제거 후 수용액 층의 OD₆₀₀을 측정하였다.

소수성(%)은 100 x (초기 OD₆₀₀ - 1시간 OD₆₀₀)/초기 OD₆₀₀으로 계산하였다.

생균과 사균의 자가응집반응과 동시응집반응 결과는 하기 표 9에 기재하였다.

항목/병원성 균주		락토바실러스 람노서스 CJLR1505
항목/병원성 균주		생균	사균화 균체
자가응집반응		11%	35%
동시응집반응	E. coli K88	45%	87%
	Salmonella typhimurium KCCM 25922	30%	65%
	Salmonella cholerasuis KCCM 10709	15%	45%

상기 표 9로부터 알 수 있듯이, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 사균의 자가응집반응과 동시응집반응 모두 생균보다 2~3배 이상 높은 것으로 나타났다. 미생물의 세포 외 소수성 및 응집성은 세포 표면 단백질의 특성이나 표면 구조에 영향을 받고, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 사균체는 도 1과 같이 표면 단백질 구조가 생균과 달라 소수성과 응집성이 증가한다. 내독소에 부착하여 항병력에 영향을 주는 기능성 균주로의 이용 가능성이 기대된다.

실험예 9: 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 사균체를 포함하는 사료와 일반 기초사료의 비교

이유 자돈의 기초사료에 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 사균체 0.2%(w/w)를 투여한 사료와 이를 투여하지 않은 기초사료(대조군)에 대해, 통상의 사료 급이와 같이 28일간 급이하고 개시 체중(kg), 종료체중(kg), 일당 증체량(g), 일당 사료 섭취량(g) 및 사료 요구율을 각각 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

구분	락토바실러스 람노서스 CJLR1505 사균체 투여군	대조군
시험두수	24	24
개시 체중(kg)	6.98	7.00
종료 체중(kg)	18.86	17.76
일당 증체량(g)	425	383
일당 사료 섭취량(g)	528	526
사료 요구율	1.25	1.38

상기 표 10에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 CJLR1505 사균체 투여군은 이를 투여하지 않은 대조군에 비하여 증체량 및 사료 요구율 모두 월등한 효과를 나타내었다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11721P

수탁일자 : 20150708

Claims

락토바실러스 람노서스 CJLR1505(Lactobacillus rhamnosus CJLR1505)(KCCM11721P).
락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P), 또는 이의 사균체를 포함하는, 동물 사료용 조성물.
제2항에 있어서, 부형제를 추가로 포함하는, 동물 사료용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 동물 사료용 조성물 1g 당 상기 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P), 또는 이의 사균체가 1.0×10⁸ cfu 내지 1.0×10¹⁰ cfu로 포함되는, 동물 사료용 조성물.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 동물 사료.
락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P)를 배양하여 배양액을 제조하고,
상기 배양액을 열교환기를 이용하여 70℃ 내지 160℃의 온도로 간접 가열하고,
상기 간접 가열된 배양액을 10 내지 100 L/min의 속도로 10℃ 내지 60℃로 급속 냉각하고,
상기 급속 냉각된 배양액에서 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체를 분리하는 것을 포함하는, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 분리된 사균체에 보호제를 혼합하고 이를 분무건조하는 것을 추가로 포함하는, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체의 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 보호제가 효모추출물, 덱스트로즈 및 원당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질인, 락토바실러스 람노서스 CJLR1505(KCCM11721P) 사균체의 제조 방법.