KR100371503B1 - 양식어류의 사료첨가제용 미생물 제제 및 그 제조방법 - Google Patents

양식어류의 사료첨가제용 미생물 제제 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

기탁번호 제 KFCC-11189호로 기탁되어 있고, 어류의 사료 첨가제로 사용되는 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움 및 이들 배양여액 건조물을 함유한 미생물 제제 MDG100은 어류의 항병력을 증진시켜 항생제 남용을 막을 수 있고 소화기관내 유익한 균총을 형성하여 소화효율을 증진시켜 발육을 촉진시키고 면역력 증강에 의한 항병력 강화 및 질병예방 등으로 어류의 치사율을 감소시키고 사료의 이용효율을 개선시키는 경제성이 있다.

Description

양식어류의 사료첨가제용 미생물 제제 및 그 제조방법{Probiotic preparations for aquacultured fish and its production method}
[산업상 이용분야]
본 발명은 사료첨가제용 미생물 제제 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 어류의 항병력 증진 및 발육과 소화를 촉진시키고 항생제 대신 미생물 제제를 사용함으로써 항생제 내성균의 발현을 방지시키는 사료첨가제용 미생물 제제 및 상기 미생물 제제에 사용되는 분리 미생물들을 고농도 대량배양 할 수 있도록 배양공정을 확립하고 또한 상기 미생물들의 배양여액 건조물을 사료첨가제로 이용할 수 있게 하는 상기 미생물 제제의 제조방법에 관한 것이다.
[종래기술]
최근 사료첨가제에 항생제 사용 규제 강화에 의해 미생물 제제의 수요와 공급이 증가하고 있다. 그러나 양식어의 사료에 사용되는 미생물 제제는 사람이나 가축에 사용되는 최적발육온도 37℃의 미생물을 이용함으로서 15℃∼25℃에서 생육하는 양식어에는 부적절하며 특히 해수 양식어의 경우 높은 염농도에도 견딜 수 없는 실정이다.
저온·고염에서 생육 가능한 미생물 제제의 개발은 어류의 항병력 증진과 발육 및 소화를 촉진시켜 어가 소득수준 향상에 기여할 수 있고, 항생제 남용을 막을 수 있어 항생제 수입대체에 따른 외화낭비를 막을 수 있다는 점에서 그 중요성이 매우 크다. 또한, 배양여액을 배출하지 않고 건조분말로 제제화하여 사료첨가제로 이용함으로써 폐수 정화를 위한 비용이 절감되며 경제적인 생산 및 제조방법이 구축될 것이다.
본 발명의 목적은 양식어류에 대해 항생물질의 남용을 억제 및 대체 할 수 있는 미생물 제제 개발의 일환으로서 어류의 장내에 유익세균총을 형성하게 하고 성장촉진은 물론 면역력 증강과 질병의 예방 및 수질오염 억제 등의 기능을 수행하는 미생물 제제를 제공하기 위한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 제제화 방법의 흐름도
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 기탁번호 제 KFCC-11189호(한국종균협회,2000.8.12)로 기탁되어 있고, 어류의 사료첨가제로 사용되는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 엔테로코커스 훼시움(Enterococcus faecium)과 그 배양여액 건조물을 함유한 미생물 제제 MDG100을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스훼시움 을 유산균 배양용 배지에서 종균배양하고, 상기 종균배양된 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움을 발효조에 접종하여 본 배양함으로써 상기 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움을 생산하는 단계; 본 배양된 미생물 배양액을 각각 원심분리하여 미생물 농축액을 수득하고, 탈지유(skim milk) 10% 및 말토스(maltose) 1%를 첨가하여 동결건조하는 단계; 동결건조된 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움과 배양여액의 건조물을 혼합하는 단계;를 포함하는 상기 미생물 제제의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 하기와 같다.
어류의 생육환경 특성을 고려하여 저온 숙성 김치에서 분리한 미생물을 이용한 사료첨가제용 미생물 제제를 개발하였다. 사료첨가제용 균주로서는 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움이 분리·선정되었다. 미생물 제제에 이용될 분리 미생물들을 고농도 대량배양하고 배양여액을 이용할 수 있는 배양공정을 확립하였다.
저온 숙성 김치를 분리원으로 하여 브레모크레졸 퍼플을 함유한 세균수 측정용 고체 배지(plate count agar)에서 노란색 환을 형성하는 200여 개의 단일 군집(colony)를 1차 분리하였으며 1차 분리된 균주를 NaCl이 6.0% 함유된 MRS 배지를 사용하여 15℃에서 3일간 배양하여 생육한 균주를 2차 선별하였다. 2차 선별된 균주를 25℃, 48시간 동안 MRS 액체배지에서 배양 후 상등액을 사용하여 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 생육저해 활성을 비교하여 최종적으로 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움의 3종의 균주를 최종 선별하였다.
미생물 제제용으로 선정된 각 균주의 배양조건, 생리적특성을 바탕으로 미생물을 대량배양하기 위한 배양공정기술을 확립하기 위한 실험을 수행하였다.
분리된 균주의 분류적, 생리적 특성을 감안하여 선택한 배지의 조성과 배양조건은 하기 표 1과 같다.
표1
미생물 제제로 선정된 미생물(이하 기탁균주)의 항병력을 알기 위해 항균활성 조사를 원형여지를 사용하는 한천 분산법(agar diffusion)에 따라 실시하였다. 배양액의 항균활성에 대한 지시균은스타필로코코스 아우리우스(Staphylococcusaureus)ATCC6538,비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)ATCC14547,에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)ATCC29522,살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)IFO3313,슈도모나스 애류지노사(Pseudomonas aeruginosa)IFO3080를 사용하였다. 트립톤과 대두분을 함유한 고체배지(Tryptic soy agar) 10ml를 배양접시에 분주하여 고화시킨 후 그 위에 절당부이온배지(LB배지)에서 25-30℃로 24시간 배양한 지시균액을 105-106/ml의 균수가 되도록 첨가한 고체영양배지(agar 0.4% 함유) 2ml를 중층하고 다시 그 위에 기탁균주의 배양액 및 상등액 조제시료를 농도별로 묻힌 원형여지를 (직경 8mm)를 올려놓고 25℃에서 24시간 배양했을 때 지시균의 생육저지대의 폭을 측정하였으며 대조 항생물질로는 0.1% 아목시실린(amoxycillin)을 사용하여 비교하였다. 락토바실러스 브레비스의 항균활성을 측정한 결과는 대조약물과 비교할 때스타피로코코스 아우리우스(S.aureus)의 경우 배양액, 배양상등액, 상등액 중화시료 모두 대조약물 50㎕ 점적량 효과 이상의 항균활성을 보였다.비프리오 콜레라의 경우 배양액시료는 대조약물 30㎕의 점적량과 동등한 효과를 보였고에스케리치아 콜라이(E.coli)의 경우 전반적으로 대조약물이 우수하게 나타났다.살모넬라 엔테리티디스(S.enteritidis)의 경우 배양액시료 50㎕ 효과는 대조약물 10㎕의 점적량과 동등하였으며슈도모나스 애루지노사(P.aeruginosa)의 경우 배양시료 50㎕와 동등한 항균활성을 보였다.
엔테로코커스 훼시움의 항균활성을 측정한 결과 대조약물과 비교할 때스타피로코코스 아우리우스의 경우 배양액과 배양상등액 및 상등액 중화시료등 모두 대조약물 10㎕ 점적량이 나타내는 항균효과 이상의 항균활성을 보였으며비브리오 콜레라의 경우 3종의 시료 모두 대조약물 30㎕점적량 효과와 비슷하였다.살모넬라 엔테리티디스의 경우도 3종의 시료 모두 대조약물 10㎕ 점적량의 효과와 비슷하였으며슈도모나스 애루지노사의 경우 배양액 시료 50㎕는 대조약물 50㎕의 효과와 동등하였다.
락토바실러스 플란타럼의 항균활성을 측정한 결과 대조약물과 비교할 때스타피로코코스 아우리우스의 경우 배양액시료는 대조약물 30㎕ 점적량과 같았으며 상등액의 경우 대조약물 10㎕ 점적량과 동일한 결과를 나타냈다.비브리오 콜레라의 경우 배양액 시료는 대조약물 30㎕의 점적량과 같았다.에스케리치아 콜라이의 경우 전반적으로 대조약물이 우수하게 나타났다.살모넬라 엔테리티디스의 경우 배양액시료 효과는 대조약물 30㎕의 점적효과와 비슷하였으며슈도모나스 애루지노사의 경우 배양액 및 상등액 시료가 대조약물 50㎕ 점적량의 효과보다 동등이상의 효과를 나타냈다.
기탁균주는 MRS배지에서비브리오 콜레라균은 NaCl이 2.5%함유된 절당부이온배지(LB배지)에서 24시간 배양 후 시험군은 NaCl이 2.5%함유된 MRS배지에 기탁균주와비브리오 콜레라균이 각각 106/ml의 균수가 되도록 혼합 접종하였으며 대조군은 NaCl이 2.5% 함유된 절당부이온배지(LB배지)에 비브리오 콜레라균만 접종하였다. 접종된 각각의 배지는 25℃에서 정치 배양하면서 6시간 간격으로 배양액을 채취하여 멸균 생리식염수로 희석한 후 NaCl이 2.5% 함유된 락토스 액체(LB) 평판배지와 브로모크레졸 퍼플 배지에 도말하여 25℃에서 48시간 배양하였다. 배양 후 락토스 액체 평판배지에 나타난 군집으로부터비브리오 콜레라균수를 측정하였으며 브로모크레졸퍼플(BCP) 배지로부터 기탁균주의 생균수를 측정하였다.
락토바실러스 브레비스 균주의비브리오 콜레라균에 대한 성장 저해능 및 살균력을 측정한 결과비브리오 콜레라단독배양의 경우에는 정상적인 성장을 하였으나 락토바실러스 브레비스와 혼합 배양의 경우 접종 후 8∼12시간 이후부터 균수가 감소하기 시작하여 30시간 이후 1×102/ml의 균수로 급감하였다. 그러나 락토바실러스 브레비스 균주는 9×108/ml의 생균수를 보였다.
엔테로코커스 훼시움 균주의비브리오 콜레라균에 대한 성장 저해능 및 살균력을 측정한 결과비브리오 콜레라단독배양의 경우에는 정상적인 성장을 하였으나 엔테로코커스 훼시움과 혼합배양의 경우 접종 후 12시간까지는 정상적으로 진행되다 12시간 이후에는 급격히 감소하여 48시간에는 80/ml의 생균수를 나타냈으나 엔테로코커스 훼시움 균은 9.5×108/ml의 생균수를 유지하였다.
락토바실러스 플란타럼 균주의비브리오 콜레라균에 대한 성장 저해능 및 살균력을 측정한 결과비브리오 콜레라단독배양의 경우에는 정상적인 성장을 하였으나 락토바실러스 플란타럼과 혼합배양의 경우 접종 후 18시간까지는 정상적으로 성장이 진행되다가 18시간 이후 균수가 급속히 감소하기 시작하여 48시간 이후부터는비브리오 콜레라균이 전혀 나타나지 않았으나, 락토바실러스 플란타럼 균은 6.3×108/ml의 생균수를 유지하였다.
기탁균주의 저온·고염의 환경에서 생육가능여부를 일반가축용 생균제로 사용중인 균종과 비교하여 상기 미생물 제제로 선정된 미생물들과 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)는 MRS배지로, 락토바실러스 스포로제네스(Lactobacillus sporogenes)는 브로모크레졸 퍼플(BCP) agar, 락토바실스 비피더스(Lactobacillus bifidus)는 BL agar, 클로스트리디움 뷰티리콤(Clostridium butyricum)은 플루이드 치오글리콜레이트 배지(Fluid Thioglycolate Medium), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 전분 배지에서 생육유무를 관찰하였다. 그 결과는 하기 표 2와 같다.
기탁균주를 6ℓ발효조(NBS)에서 최적생산배지를 사용하여 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 탈지유(skim milk)10%와 말토스1%로 이루어진 동결건조 보호제와 혼합하여 균질화 한 후 -40℃로 동결시킨 다음 동결건조기(IL Shin Lab)에서 건조하였다. 건조된 균체는 분쇄하여 분말화 시킨 다음 멸균 생리식염수에 단계 희석하여 브로모크레졸 퍼플배지에 도말한 후 25℃에서 48시간 배양한 다음 생균수를 측정하여 동결건조 후의 생존율을 측정한 결과 동결전의 생균수를 100%로 간주하였을 때 동결건조 후의 생존율이 60%이상으로 측정되었다.
인공위액은 고바야시(Kobayashi) 등의 방법에 따라 HCl을 사용하여 pH2.5로 조정한 MRS 액체배지에 펩신 1%를 첨가하여 사용하였다. 동결건조 균체분말 0.1g을 인공위액 10ml에 넣고 25℃에서 1시간 방치하였다. 인공위액에서 처리된 균체분말을 멸균 생리식염수에 단계 희석하여 브로모크레졸 퍼플배지에 도말한 다음 25℃에서 48시간 배양 후 생성된 군집(colony)수를 계측하여 인공위액 처리전의 생균수와 비교한 결과 인공위액 처리전의 생존율을 100%로 간주하였을 때 60%이상의 생존율을 보였다.
본 발명에 따른 제제화 방법을 도 1에 나타내었다.
[실시예]
본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 나타내는 본 발명의 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 미생물 제제를 넙치에 투여하는 실험을 수행하였고 어체의증체율 및 치사율을 조사하였다. 양식 실험은 해수 양식장에서 넙치를 대상으로 실시하였다. 넙치 316마리를 수온 15℃∼25℃에서 50일간 사육하였다.
본 실시예에서는 미생물 제제를 사료 1kg당 1g씩 섞어 매일 공급하였다.
상기 실시예에서 상기 미생물 제제를 공급하지 않는 것을 제외하고는 실질적으로 동일하게 실시하였다.
상기 실시예 및 비교예에서 시일경과에 따른 넙치의 체중 증가를 조사하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
상기 표에서와 같이 50일 동안 비교예에서는 평균 17.9%의 체중 증가가 관찰된 반면 실시예에서는 27.0% 증가를 보여 실시예에서 증체율이 50% 증가한 것으로 관찰되었다. 즉, 비교예의 어체의 체중 증가량보다 실시예의 어체의 체중 증가량이 1.5배에 달한다. 이는 투여한 미생물 및 배양건조물이 장의 기능을 강화시켜 소화율 등을 증가시키기 때문으로 사료된다.
상기 실시예 및 비교예에서 시일 경과에 따른 넙치의 치사율을 조사하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
상기 표에서 보는 바와 같이 비교예에서 5%의 치사율을 보인 반면 실시예에서는 0%의 치사율을 보여 실시예에서 생존율이 우수한 것으로 관찰되었다. 이는 투여한 미생물이 어류의 병을 일으키는 균에 대한 항균성이 뛰어나고 항병력이 증진되어 어류가 병을 일으키지 않았기 때문으로 사료된다.
본 발명의 미생물 제제는 어류의 항병력을 증진시키고 소화효율의 개선에 의한 발육촉진 및 항생제 대체용으로 경제성이 있다.

Claims (4)

  1. 양식어류의 사료첨가용 미생물제제에 있어서,
    저온 및 고염의 조건에서 생육이 가능하고, 어류의 항변력과 소화효율을 개선하는 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움을 함유하는 혼합미생물 KFCC 11189를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 양식어류의 사료첨가제용 미생물제제
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  3. 삭제
  4. 삭제
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