JP5998273B2 - 新たなバチルス・サブチルス｛ｎｏｖｅｌｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ｝ - Google Patents

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Description

本発明は、新たなバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株及びそのプロバイオティクス製剤と、これを活用した家畜疾病の予防又は治療方法に関するものである。
家畜の感染症は、家畜の体重を減少させたり色々な病状を起こさせるなど、商品価値を著しく低下させる。家畜の感染症を起こさせる細菌性疾病には、腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）による下痢病、鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ、ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）による大腸菌症（Ｃｏｌｉｂａｉｌｏｓｉｓ）、敗血症、急慢性腸炎を起こさせるサルモネラ症（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）による壊疽性腸炎などがある。
また、飼料の原料である穀類に増殖するアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）によるアフラトキシン中毒症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）は、急性の場合には食欲低下、発熱、呼吸困難、下痢、痙攣などの神経症を起こさせる真菌性の疾病である。
このような疾病を治療と予防するために多くの抗生剤が開発されてきた。しかし、抗生剤の無分別な使用で耐性菌の出現頻度が増加することにより、抗生剤の使用において疾病治療の目的以外には、疾病予防と生長促進を目的とする飼料への添加は、全面禁止又は規制されている。抗生剤使用の規制によって家畜の生産性低下と斃死率増加の恐れがあり、このような問題点を補える抗生剤の代替剤の開発が非常に急を要している。
最近、このような問題を反映し抗生剤を代替することができる生菌剤の開発研究が行われている。生菌剤に関する先行技術は下記に示す。
韓国公開特許第２０１０−００７６２６３号は、子牛の下痢病を予防するための大腸菌、サルモネラ抑制に効果があるラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＢＬＡＢ１９を開示している。
韓国登録特許第１０−０８７８７９９号は、抗生剤に耐性を有する病原性微生物、又は腸内有害微生物であるエドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、大腸菌と表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の生長を抑制するバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｋ３７を開示している。
韓国公開特許第２００６−００２６３７１号には、子豚の下痢を誘発する大腸菌を抑制する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ １２−１、ＫＡＣＣ９１１３５）を開示されている。
しかし、上述の先行技術は、養鶏又は養豚において問題となっている大腸菌、サルモネラ又はクロストリジウムに対する抗菌力を有する菌株を開示するだけで、飼料の材料である穀類で増殖し、これを摂取した家畜にアフラトキシン中毒症などを誘発するアスペルギルスに対する抗真菌力を共に有する菌株に関しては報告されたことがない。
本発明は、抗菌及び抗真菌活性に優れ、複合消化酵素の生産能、耐酸性及び耐胆汁性が優秀な、バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）の提供を目的とする。
また、本発明は、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株の培養物の提供を目的とする。
また、本発明は、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株又はその培養物を含む、プロバイオティクス製剤、飼料添加剤及び飼料の提供を目的とする。
また、本発明は、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株、又はその培養物を家畜に投与することで、家畜の細菌性、又は真菌性の疾病を予防又は治療する方法の提供を目的とする。
本発明は、新たに分離したバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株及びこれを含むプロバイオティクス製剤と、これを活用した家畜疾病の予防又は治療方法に関するものである。
本発明のある実施様態において、抗菌及び抗真菌活性を有し、複合消化酵素の生産能、耐酸性及び耐胆汁性を有する、新たなバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株が提供される。
本発明のさらなる実施様態において、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株の培養物が提供される。
本発明のさらなる実施様態において、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株、又は前記菌株の培養物を含む、プロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）製剤が提供される。
本発明のさらなる実施様態において、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株、前記菌株の培養物、又は前記プロバイオティクス製剤を含む飼料添加剤が提供される。
本発明のさらなる実施様態において、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株、前記菌株の培養物、前記プロバイオティクス製剤、又は前記飼料添加剤を含む飼料が提供される。
本発明のさらなる実施様態において、前記プロバイオティクス製剤、飼料添加剤、及び飼料からなる群より選択される少なくとも一つを家畜に投与する段階を含む、家畜の細菌性又は真菌性の疾病を予防又は治療する方法が提供される。
本発明は、抗菌及び抗真菌活性に優れ、複合消化酵素の生産能、耐酸性及び耐胆汁性が優秀なバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株、又はその培養物を含む、プロバイオティクス、飼料添加剤及び飼料を提供する。これを家畜に投与し家畜の細菌性又は真菌性の疾病を予防又は治療する方法を提供することで、家畜の疾病管理及び消化力向上と腸内微生物に均衡維持を助け、家畜用飼料を効率を増進することにより畜産業発展に寄与する効果がある。
図１は、本発明のバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株の電子顕微鏡写真である。 図２ａは、実施例２の候補菌株３種の、腸毒性大腸菌Ｏ１２２に対する生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）抗菌活性を示すグラフである。 図２ｂは、実施例２の候補菌株３種の、腸毒性大腸菌Ｏ１４９に対する生体外抗菌活性を示すグラフである。 図３は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）の抗菌活性を示す写真である。 図４は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）のアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）に対する抗真菌活性を示す写真である。 図５は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）の複合消化酵素活性を示す写真である。 図６は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）を、人工胃液又は人工胆汁に処理したときの生存率を示すグラフである。 図７は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）の溶血性有無を示す写真である。 図８は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）の１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を示す。
下記において本発明に関してより詳しく説明する。本明細書に記載のない内容は、本発明の技術分野又は類似分野の熟練者なら十分に認識と類推できるものであり、その説明を省略する。
本発明のある実施様態において、新たに分離したバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）（以下、‘ＣＪＭＰＢ９５７’）菌株が提供される。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は、形態学的にグラム陽性桿菌に該当し（図１参照）、１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１、図８）の分析結果、バチルス・サブチルスと９８％の相同性を有する菌株である。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は２０１２年３月２２日に、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１２７１Ｐとして寄託された。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は、複合抗菌及び抗真菌活性がある。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は、抗菌又は抗真菌活性の対象菌として、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）を含み、腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ、ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）及びクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は、好ましくはアスペルギルス属、腸毒性大腸菌、鳥類病原性大腸菌、サルモネラ属及びクロストリジウム属の全てに対する抗菌又は抗真菌活性を表すことができる。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は、複合消化酵素の生産能を有する。
前記ＣＪＭＰＢ９５７の生産できる消化酵素は、プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）、セルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、アミラーゼ（Ａｍｙｌａｓｅ）、キシラナーゼ（Ｘｙｌａｎａｓｅ）、マンナナーゼ（Ｍａｎｎａｎａｓｅ）、リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ）及びフィターゼ（Ｐｈｙｔａｓｅ）からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は、より好ましくは、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、リパーゼ及びフィターゼを全て生産することができる。
前記ＣＪＭＰＢ９５７に耐熱性に非常に優れている。
より具体的に、前記ＣＪＭＰＢ９５７は、３７℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間培養した後、９５℃で１０分間熱処理した後の内生胞子の形成率が、好ましくは９５％以上、より好ましくは１００％である。
前記内生胞子は、高温条件の環境だけでなく、紫外線、低音、乾燥、及び／又は、高圧などの極限環境に抵抗性を有し、内生胞子形成率が高いほど菌株の生存率が高くなる。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は、耐酸性に非常に優れている。
より具体的に、前記ＣＪＭＰＢ９５７は、ｐＨ２．５に調整した溶液にペプシン（Ｐｅｐｓｉｎ）を１％（ｗ／ｖ）で添加して製造された人工胃液を含む培地で、３時間培養した後の生存率が、好ましくは９５％以上、より好ましくは１００％である。
前記ＣＪＭＰＢ９５７は、耐胆汁性に非常に優れている。
より具体的に、前記ＣＪＭＰＢ９５７は１％（ｗ／ｖ）のパンクレアチン（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ）が含まれた人工胆汁を含有する培地で、３時間培養した後の生存率が、好ましくは９５％以上、より好ましくは１００％である。
本発明の新たに分離した菌株ＣＪＭＰＢ９５７は、バチルス菌株の通常的な培養方法により培養することができる。前記ＣＪＭＰＢ９５７は、好ましくは２０ないし４０℃の培養温度で、１２時間ないし４日間培養して得ることができる。
本発明のさらなる実施様態において、前記ＣＪＭＰＢ９５７の培養物が提供される。
前記培養物は、前記ＣＪＭＰＢ９５７菌株を培養した培養培地又は培養液、及び前記培養培地又は培養液で培養したその結果物、を含む概念であり、前記培養物は前記ＣＪＭＰＢ９５７菌株の含有有無は適宜選択できる。
前記培養物の剤形は特に限定されず、当該技術分野において通常的に用いられる剤形であり得る。例えば、前記培養物は、液体又は固体であり、培養物の原形状態又はその濃縮形態・乾燥形態であり得る。
培養培地
本発明のＣＪＭＰＢ９５７を培養する培地は、天然培地、又は合成培地であり得る。
前記培地の炭素原は、特に限りはなく、当該技術分野において公知のものが用いられる。前記炭素原の非制限的例として、グルコース、スクロース、デキストリン、グリセロール、又はデンプンなどを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上を混合して用いることができる。
前記培地の窒素原は、特に限りはなく、当該技術分野において公知のものを用いることができる。前記窒素原の非制限的例としてペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥された酵母、大豆、アンモニウム塩、硝酸塩、及びその他の有機・無機窒素含有化合物などを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上を混合して用いることができる。
前記培地に含まれる無機塩は、特に限りはなく、当該技術分野において公知のものを用いることができる。前記無機塩の非制限的例として、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カルシウムなどを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上を混合して用いることができる。
本発明のＣＪＭＰＢ９５７の培養培地には、前記炭素原、窒素原及び無機塩成分の他に、アミノ酸、ビタミン、核酸、及び／又は、その他一般的に培養培地に含まれる成分を添加することができる。
培養液
本発明のＣＪＭＰＢ９５７菌株の培養液は、培養原液であることもできるし、前記培養原液から培養上澄液を除去した液、及び／又は、それの濃縮液であり得る。前記培養液には前記ＣＪＭＰＢ９５７菌株を含むこともできる。
前記培養液の組成は、特に限りはなく、通常的にバチルス菌株の培養において必要であると知られた成分だけでなく、バチルスの生長に上昇的に作用する成分をされに含むこともでき、それによる組成は当該技術分野において通常の知識を有する者により容易に選択できる。
前記培養液は、液状状態、又は乾燥状態であり得る。
前記培養液の乾燥方法は、特に限りはなく、当該技術分野で通常的に用いる方法が利用できる。前記乾燥方法の非制限的例として、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、又は凍結乾燥などを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上の方法を併合して用いることができる。
本発明のさらなる実施様態において、前記ＣＪＭＰＢ９５７菌株、又は前記菌株の培養物を含む、プロバイオティクス製剤が提供される。
前記プロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）は、人間や動物などの宿主の健康に有益な効果を表す微生物、又はその成分の意味であり、宿主の腸内の消化管の壁に定着し他の有害菌の定着、及び病原菌の増殖を抑制し、プロバイオティクスが生産する有益な消化酵素は栄養素の吸収と利用を容易にすることと知られている。
本発明のプロバイオティクス製剤は、前記ＣＪＭＰＢ９５７菌株、及び／又は、前記菌株の培養物を含むものであり得る。
本発明のプロバイオティクスは、好ましくは前記ＣＪＭＰＢ９５７菌株を５×１０４ないし５×１０１０ＣＦＵ／ｍｌ、より好ましくは１×１０６ないし１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ含むことができる。
前記プロバイオティクス製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができ、前記担体と共に製剤化されて提供できる。
前記薬学的に許容される担体は、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性・特性を阻害しない担体、又は希釈剤を意味する。
前記担体において、液状溶液として製剤化されるプロバイオティクス製剤に利用できる担体として、滅菌と生体に適合するものは、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、又はグリセロールなどを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上を混合して用いることもできるし、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、及び／又は、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することもできる。
また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び／又は、潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤に製剤化することができる。
本発明のプロバイオティクス製剤を有効成分として含む経口投与用の剤形は、特に限りはなく、当該技術分野で知られている剤形を用いることができる。前記経口投与用剤形の非制限的例として、錠剤、トローチ、ローゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性又は油性懸濁液、調剤粉末、又は顆粒、エマルション、ハード又はソフトカプセル、シロップ、又はエリキシル剤などを挙げることができる。
前記錠剤又はカプセルなどの剤形として製剤化するため、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロース、又はゼラチンなどの結合剤、ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉、又はサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ナトリウムステアリルフマラート、又はポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油などを含むことができ、カプセル剤形の場合は上述した物質以外にも脂肪油などの液体担体をさらに含むことができる。
本発明のさらなる実施様態において、前記プロバイオティクス製剤を含む飼料添加剤が提供される。
本発明のＣＪＭＰＢ９５７菌株、及び／又は、その培養物が含まれたプロバイオティクス製剤は、飼料添加剤の形態で別途に製造して家畜飼料に混合すること、又は飼料製造のとき前記プロバイオティクス製剤を直接添加する方法で混合することができる。
前記飼料添加剤の形態は、特に限りはなく、好ましくは液状、又は乾燥状態であり、より好ましくは乾燥粉末形態であり得る。
前記乾燥粉末形のプロバイオティクス製剤の乾燥方法は、特に限りはなく、当該技術分野での公知方法を利用することができる。前記乾燥方法の非制限的例として、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、又は凍結乾燥などを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上の方法を合わせて利用することができる。
前記飼料添加剤は、本発明のＣＪＭＰＢ９５７、及び／又は、その培養物を含む、プロバイオティクス製剤の他に飼料の保存性を高められる他の添加剤をさらに含むことができる。
本発明の飼料添加剤にさらに含められる添加剤は、特に限りはなく、当該技術分野で知られたもとを利用することができる。前記添加剤の非制限的例として、飼料添加剤の品質低下を防止する決着剤、乳化剤、保存剤など；効用を増大させるアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、オリゴ糖などがあり、その他にも飼料混合剤などをさらに含むことができる。これらは一つ、又は二つ以上を混合して用いることができる。
本発明のプロバイオティクス製剤、又は飼料添加剤は、動物に単独で投与されることもできるし、食用担体の中に他の飼料添加剤を組み合わせて投与されることもできる。また、トップ・ドレス、家畜飼料への直接混合、飼料とは別に経口剤形での投与、又は他成分と組合わせて投与することもできる。
本発明のさらなる実施様態において、前記飼料添加剤を含む飼料が提供される。
本発明の前記飼料は、前記飼料添加剤を、好ましくは飼料１００重量部に対して０．０５ないし１０重量部、より好ましくは０．１ないし１重量部で含むことができる。前記の範囲内で家畜の消化力を効果的に増進させ飼料の効率を高めることができる。
本発明の前記飼料の成分は、特に限りはなく、当該技術分野で知られたものであり得る。前記飼料成分の非制限的例として、植物性として、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、油脂類、澱粉類、フクベ類、穀物副産物類など；動物性として、タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、魚粉などを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上を混合して用いることができる。
本発明のプロバイオティクス製剤、飼料添加剤、又は前記飼料添加剤が含まれた飼料が使用できる家畜は、例えば、食用牛、乳牛、子牛、豚、子豚、羊、ヤギ、馬、ウサギ、犬、猫などの家畜、及びひよこ、卵鶏、家庭用ニワトリ、雄鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ウズラなどの家禽類が含まれるが、これらに限らない。
本発明のさらなる実施様態において、
本発明のＣＪＭＰＢ９５７菌株、及び／又は、前記菌株の培養物を含むプロバイオティクス製剤、前記プロバイオティクス製剤を含む飼料添加剤、及び前記飼料添加剤を含む飼料からなる群より選ばれる少なくとも一つを家畜に投与する段階を含む、家畜の細菌性、又は真菌性の疾病を予防と治療する方法が提供される。
前記“予防”は、前記ＣＪＭＰＢ９５７菌株、及び／又は、前記菌株の培養物を対象動物に薬学的に製剤形態で、又は飼料添加剤などの摂食できる形態で提供し、当該疾病を抑制させたり発病を遅延させる全ての行為をを意味する。
前記、“治療”は、前記ＣＪＭＰＢ９５７菌株、及び／又は、前記菌株の培養物を対象動物に薬学的に製剤形態で、又は飼料添加剤などの摂食できる形態で提供し、既に感染された当該疾病の病的状態を改善する全ての行為を意味する。
前記細菌性疾病は、例えば、腸毒性大腸菌による下痢病、鳥類病原性大腸菌による大腸菌症（Ｃｏｌｉｂａｉｌｏｓｉｓ）、敗血症、急慢性腸炎を起こさせるサルモネラ症（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）による壊疽性腸炎などがあるが、これらに限らない。
前記真菌性の疾病は、例えば、アスペルギルス属による食欲低下、発熱、呼吸困難、下痢、痙攣などを起こさせるアフラトキシン中毒症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）があるが、これらに限らない。
前記プロバイオティクス製剤は、薬学的製剤の形態で動物に投与するか、家畜の飼料、又は飲み水に混合され摂食させる方法により投与することができ、より好ましくは飼料添加剤に形態で飼料に混合されて投与することができる。
前記プロバイオティクス製剤の投与経路は、目的組織まで達することができる限り特に限定されず、経口・非経口の多様な経路を通じて投与することができ、具体的に、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻側内、吸入などの通常的方法により投与することができる。
下記で、実施例を記述することにより、本発明をより詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明の一つの例示に過ぎなく、本発明の内容がこれらに限定して解釈されることではない。
実施例１
バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ９５７菌株の分離
（１）試料の用意と菌株の分離
伝統発酵食品であるメジュと各種醤類の試料を用意し、前記試料を段階的に希釈して３％塩化ナトリウムが添加されたＢＨＩ固体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に塗抹した後、３７℃の条件で２４時間培養した。
前記各試料から分離された菌株はコロニー観察によりグループ化し、菌株を分離した。選別されたコロニーは３回にわたって新しい培地に移し培養する方法により純粋分離し、純粋培養された菌を２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）が添加された培地に入れ、−７０℃以下で保存した。
（２）複合抗菌活性の優秀な菌株を選抜
養鶏と養豚において問題となる代表的病原性細菌である大腸菌とサルモネラに対する抗菌活性がある菌株を１次選抜するために分離された醤類由来菌に対し、腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ）、鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ）、サルモネラ・ティフィムリウム（ＳＴ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の３種に対する抗菌評価を行った。前記抗菌評価は病原性菌に対する生育阻害環（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）分析により評価した。
ＹＭ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）固体培地製造のとき、前記病原性細菌３種の振盪培養液を各々０．４％混合し、抗菌評価培地を製造した。製造された前記評価培地上に醤類由来菌の培養液１．５μｌを滴下し３７℃で１８時間培養したあと、選抜菌株の周囲に形成される生育阻害環の有無をを観察した。醤類由来菌の中で前記病原性細菌３種に対して抗菌性を表す菌株１３種を１次的に選抜した。
複合抗菌活性が優秀な、１次選抜された１３種の菌株に対し、腸毒性大腸菌３種とクロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に対する抗菌活性を評価した。腸毒性大腸菌は、Ｋ８８吸着繊毛（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｐｉｌｉ）を生産するＥＴＥＣＯ１４９、Ｋ８８と９８７ｐを生産するＥＴＥＣＯ１２２、Ｋ９９を生産するＥＴＥＣ２６１７を用いた。クロストリジウム・パーフリンゲンスを評価するときに選抜菌株の培養上澄液を使用し、３７℃、嫌気条件で培養したことを除いて、上記の方法と同様に行った。
その結果、表１に示したとおり、複合抗菌活性の優秀な菌株３種（７３９、８２３、９５７）を候補菌株として選抜した。
実施例２
腸毒性大腸菌に対する生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）抗菌活性の評価
前記複合抗菌活性の優秀な三つの候補菌株を用いて、腸毒性大腸菌２種に対する活性抑制効果を生体外で測定した。
ＢＨＩ液体培地に、前記候補菌株３種とＥＴＥＣＯ１２２、ＥＴＥＣＯ１４９を各々０．１％ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１５時間培養した。１／２ＢＨＩ液体培地に候補菌株の一種とＥＴＥＣ一種を各々約１×１０５ＣＦＵ／ｍｌになるよう同時接種し、３７℃、２００ｒｐｍで培養した。各時間帯別に培養液をＢＨＩ固体培地とマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ、Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）固体培地に塗抹して候補菌株とＥＴＥＣの菌数を測定した。
前記結果は、下表２と図２ａ、２ｂに示し、２４時間以上培養したとき、９５７菌株がＥＴＥＣ Ｏ１２２とＥＴＥＣ Ｏ１４９に対し生長抑制効果がより優秀であることを確認した。よって、抗菌活性の優秀な菌株として９５７最終選抜し、これをＣＪＭＰＢ９５７と命名した。
最終選抜されたＣＪＭＰＢ９５７は、腸毒性大腸菌、鳥類病原性大腸菌、サルモネラ・ティフィムリウム、クロストリジウム・パーフリンゲンスに対して抗菌活性が優秀であり、前記抗菌活性結果は図３示した。
実施例３
ＣＪＭＰＢ９５７菌株の形態学的、生化学的特性の調査と同定
（１）形態学的、生化学的特性の調査
複合消化酵素活性の優秀な菌株として最終選抜されたＣＪＭＰＢ９５７菌株を同定するため、１次的に形態学的、生化学的調査を行った。形態的な特徴はグラム陽性桿菌であることを確認し（図１）、生化学的特性を分析するためＡＰＩ５０ＣＨＢシステム（ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いてＣＪＭＰＢ９５７菌株の糖発酵パターンを分析した。
下表３は、ＣＪＭＰＢ９５７菌株の糖発酵パターンを分析した結果を示す。
上記表３において、’＋’は陽性、’−’は陰性を表し、対照区は基質のない試験群である。
（２）ＣＪＭＰＢ９５７菌株の同定
ＣＪＭＰＢ９５７菌株のより正確な同定のため、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的方法を行った。
塩基配列分析はＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（バイオニア、韓国）とユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’：配列番号２）、及び１４９２Ｒ（５’ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３’： 配列番号３）を用いて、１６ｓ ｒＤＮＡの遺伝子を増幅した。遺伝子増幅の際、総反応液は２０μｌに合わせて、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返し、増幅されたＤＮＡ塩基配列を分析した。ＣＪＭＰＢ９５７菌株の分析された１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は配列番号１（図８）に示した。
前記の分析結果、バチルス・サブチルスと９８％の相同性を有する微生物として同定された。
上述した方法により同定された本発明の新たな微生物であるバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ９５７は、２０１２年３月２２日に、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１２７１Ｐとして寄託された。
実施例４
ＣＪＭＰＢ９５７菌株の抗真菌活性
ＣＪＭＰＢ９５７の抗真菌活性を調べるため飼料において問題となっているアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）に対する抗真菌活性を評価した。
アスペルギルスをＰＤＡ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）固体培地で、３０℃、７２時間静置培養して使用した。固体培地で培養されたアスペルギルスを５ｍｍ×５ｍｍ（横幅）のサイズで切断して、新しいＰＤＡ固体培地の中央に接種し２４時間培養した。
活性化されたＣＪＭＰＢ９５７をアスペルギルスの培養されている固体培地に１０μｌ分株し、３０℃で４８時間培養して形成されるアスペルギルスの生育阻害環の形成有無を観察した。
図４に示したとおり、バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７がアスペルギルスの生育を阻害することを確認し、前記菌株が抗真菌活性を有することを確認した。
実施例５
ＣＪＭＰＢ９５７菌株の消化酵素活性
前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７の消化酵素生産能を調べるため、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、リパーゼ、及び、フィターゼに対して、消化酵素活性評価を行った。
前記酵素活性評価は、各酵素に対する基質が入っている培地を用いて、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
１）助酵素液の採取
ＣＪＭＰＢ９５７菌株をＢＨＩ液体培地で、２４時間、４８時間、培養した培養上澄液を採取し、４℃、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、最終上層液を酵素活性分析用の助酵素液として、下記の通り、各酵素別各々の基質が含まれている培地を用いて、基質分解の程度を判定した。
２）プロテアーゼ活性
脱脂粉乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を２％添加したＹＭ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ／ｌ、Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ／ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ５ｇ／ｌ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ １０ｇ／ｌ、Ａｇａｒ ２０ｇ／ｌ； Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ、以下、‘ＹＭ培地’）培地を製造した。上記で採取した助酵素液を１．５μｌずつ基質培地に分株した後、３０℃で１５時間反応した後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
３）セルラーゼ活性
１％ＣＭＣ（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を１．５μｌずつ基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した後、０．２％のコンゴーレッド（Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ）水溶液で３０分間染色し、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液で脱色した。助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環の形成程度により酵素の活性能力を測定した。
４）アミラーゼ活性
１％の可溶性デンプン（ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を１．５μｌずつ基質培地に分株した後、３７℃で１５時間反応した。Ｉ２とＫＩが各々０．１％、２％添加された水溶液で染色した後、助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環の形成程度により酵素の活性能力を測定した。
５）キシラナーゼ活性
１％キシラン（ｘｙｌａｎ）が添加されたＹＭ培地を製造した。上記助酵素液１．５μｌを基質培地に分株して、３７℃で１５時間反応した後、０．２％コンゴーレッド水溶液で３０分染色し、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液で脱色した。その後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
６）マンナナーゼ活性
１％マンナン（ｌｏｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ、ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）が添加された基質培地（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ／ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／ｌ、Ａｇａｒ ２０ｇ／ｌ 、ｐＨ５）を製造した。上記助酵素液１．５μｌを基質培地に分株した後、３７℃で２４時間反応した後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
７）リパーゼ活性
１％トリカプリリン（ｔｒｉｃａｐｒｙｌｉｎ）が添加されたＹＭ培地を製造した。上記助酵素液１．５μｌを基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
８）フィターゼ活性
１％フィチン酸（Ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ、ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）が添加された基質培地（グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ） １５ｇ／ｌ、ＮＨ４ＮＯ３ ５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／ｌ 、ＫＣｌ ０．５ ｇ／ｌ 、ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４４Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／ｌ 、Ａｇａｒ ２０μｌ、ｐＨ５．５）を製造した。上記助酵素液１．５μｌを基質培地に分株して、３７℃で２４時間反応した後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
前記ＣＪＭＰＢ９５７の消化酵素活性は、下表４、及び図５に示した。
上記表４、及び図５に示したとおり、バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７は、抗菌、及び抗真菌活性だけでなく、複合消化酵素活性も優秀であることを確認した。
実施例６
ＣＪＭＰＢ９５７菌株の内生胞子形成能
バチルスは、必須栄養源の中で一つ以上の栄養源が枯渇するなどのストレスを受けると生存のため内生胞子を形成する。内生胞子は、紫外線、高温、低温、乾燥、及び高圧などの極限環境に抵抗性を有するため、内生胞子の形成はバチルスの生存率を維持することにおいて非常に重要である。このようなことで、バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７を長時間培養し、内生胞子の形成能を確認した。
ＢＨＩ液体培地に菌を０．１％接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間、４８時間培養した。各時間帯別に培養液をＢＨＩ寒天培地に塗抹して総菌数を測定し、９５℃で１０分間熱処理した培養液をＢＨＩアガー（Ａｇａｒ）培地に塗抹して、内生胞子の数を測定した。
下表５は、前記内生胞子数の測定結果を示す。
上記表５に示した通り、ＣＪＭＰＢ９５７を２４時間以上培養したとき、１００％が内生胞子を形成した。
従って、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７ ２４時間以上培養したとき、高い内生胞子形成能を有し、プロバイオティクスとして利用したら動物の消化器官内で高い生存率の維持が可能であると判断される。
実施例７
ＣＪＭＰＢ９５７菌株の耐酸性と耐胆汁性
プロバイオティクス菌株は、口腔から摂取され最終目的部位である腸まで生きたまま到達するためには強酸性の胃液と胆汁液に対する抵抗性が必要である。よって、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７がプロバイオティクス菌株としての応用できるかを確認するため、耐酸性及び耐胆汁性を確認した。
（１）耐酸性及び人工胃液に対する抵抗性
人工胃液は、ＨＣｌを用いてｐＨ２．５に調整した０．０５Ｍのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液にペプシン（Ｐｅｐｓｉｎ；Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）１％（ｗ／ｖ）を添加して製造した。
ＣＪＭＰＢ９５７菌株をＢＨＩ液体培地に、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した後、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し上澄液は捨てて菌体を回収し、人工胃液を上澄液の同量に添加し、３７℃で３時間培養した。培養後、ＢＨＩ培地に塗抹して菌数を測定し、耐酸性、及び人工胃液に対する抵抗性を確認した。
（２）人工胆汁に対する抵抗性
人工胆汁は０．０５Ｍリン酸ナトリウム溶液に１％（ｗ／ｖ）のパンクレアチン（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加し滅菌した後、滅菌１０％（ｗ／ｖ）ｏｘａｇａｌｌ（Ｄｉｆｃｏ Ｃｏ．）溶液を培地の１％（ｖ／ｖ）になるように添加し、ｐＨを６．８に調整して製造した。
前記（１）の人工胃液で３時間培養したＣＪＭＰＢ９５７菌株を、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上澄液は捨てて菌体を回収し前記人工胆汁を上澄液と同量に添加し、３７℃で２４時間培養した。培養後、ＢＨＩ培地に塗抹して菌数を測定し耐酸性、及び人工胆汁に対する抵抗性を確認した。
前記耐酸性、及び人工胃液と人工胆汁に対する抵抗性測定の結果は、図６に示した。
図６に示したとおり、ＣＪＭＰＢ９５７をｐＨ２．５の人工胃液で２時間処理したとき、１００％の生存率を表し、人工胃液処理後に人工胆汁を２４時間処理したときにも同様に１００％が生存率が維持された。
したがって、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７は人工胃液と人工胆汁の連続処理後においても、高い生存率を表し、プロバイオティクス菌株として有用に利用できることが確認された。
実施例８
ＣＪＭＰＢ９５７菌株の安全性
ＣＪＭＰＢ９５７の安全性調べるため溶血性（β−ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）を調査した。β−溶血は、有害菌の中でリン脂質酵素を生産し赤血球により供給されるリン脂質を加水分解して赤血球を溶血させる作用である。
バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７の溶血性を調べるため５％の羊血液（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ、ギサンバイオテック、韓国）が含まれているＴＳＡ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）を製造した。製造された前記血液寒天培地に画線接種（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）した後、３７℃で２４時間培養し結果、図７に示したとおり、溶血性を表さないことを確認した。

Claims (8)

  1. 抗菌及び抗真菌の活性を有し、複合消化酵素の生産能、耐酸性及び耐胆汁性を有する、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ９５７（ＫＣＣＭ１１２７１Ｐ）菌株。
  2. 第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７菌株の培養物。
  3. 第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７菌株、又は第２項に記載の前記菌株の培養物を含む、プロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）製剤。
  4. 第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７菌株、第２項に記載の前記菌株の培養物、又は第３項に記載のプロバイオティクス製剤を含む、飼料添加剤。
  5. 第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７菌株、第２項に記載の前記菌株の培養物、第３項に記載のプロバイオティクス製剤、又は第４項に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
  6. 第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ９５７菌株、又は第２項に記載の前記菌株の培養物が含まれた組成物を、家畜に投与する段階を含む、家畜の細菌性又は真菌性の疾病を予防又は治療する、方法。
  7. 前記組成物は、プロバイオティクス製剤、飼料添加剤及び飼料からなる群より選ばれる少なくとも一つである、家畜の細菌性又は真菌性の疾病を予防又は治療する、第６項に記載の家畜の細菌性又は真菌性の疾病を予防又は治療する、方法。
  8. 前記細菌性又は真菌性の疾病は、下痢病、大腸菌症（Ｃｏｌｉｂａｉｌｏｓｉｓ）、サルモネラ症（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、壊疽性腸炎（Ｇａｎｇｒｅｎｏｕｓ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）及びアフラトキシン中毒症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、家畜の細菌性又は真菌性の疾病を予防又は治療する、第６項に記載の家畜の細菌性又は真菌性の疾病を予防又は治療する、方法。
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