KR101047948B1 - 박테리오신을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 생균제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균물질을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 생균제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 오리의 소화기관으로부터 유래되고 항균물질을 생산하는 4개의 균주, 락토바실러스 살리바리우스 JWS 58 (Lactobacillus salivarius JWS 58, KACC91357P); 락토바실러스 플란타륨 JWS 1354 (Lactobacillus plantarum JWS 1354, KACC91358P); 엔테로코커스 패슘 JWS 833 (Enterococcus faecium JWS 833, KACC91359P) 및 페디오코커스 펜토사시우스 JWS 939 (Pediococcus pentosaceus JWS 939, KACC91360P)가 분리, 동정된다. 또, 본 발명에서는 이들을 이용한 복합 생균제 조성물이 제공된다.

오리, 유산균, 박테리오신, 항균물질, 프로바이오틱스, 생균제, 복합 생균제

Description

박테리오신을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 생균제 조성물 {Novel bacteriocin-producing lactic acid bacteria and mixed microbial composition using it}

본 발명은 병원성 유해세균을 억제하는 항균물질 생산균주 및 이를 이용한 생균제 조성물에 관한 것으로, 특히 항균물질을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 생균제 조성물에 관한 것이다.

가축의 사육 및 생산에서 환축의 치료, 질병 예방, 가축의 생산성 등을 향상시키기 위하여 광범위하게 항생제가 사용되고 있으나, 최근에는 항생물질의 오남용으로 인한 내성균주의 출현과 축산물 내 잔류 항생물질로 인한 안전성 문제의 야기로 점차 규제되고 있는 추세이다. 또한 축산물의 안전성에 대한 소비자들의 인식이 높아지고, 무항생제 사용 축산물에 대한 요구가 높아짐에 따라 항생제 대체물질의 개발은 중요한 관심의 대상이 되고 있다.

항생제 대체물질로는 생균제(probiotics), 산성화제(acidifer), 면역조절 및 증강 물질, 사료첨가용 복합효소제, 기능성 천연추출물 등이 있으나, 장내미생물의 균형을 개선하여 숙주동물에게 유익한 작용을 하는 생균제가 가장 각광을 받고 있다(Fuller, 1992). 가축용 생균제의 주요 기작은 장내 병원성 미생물들에 대하여 유기산, 과산화수소(H₂O₂), 박테리오신(bacteriocin) 같은 항병성 인자의 생성과 경쟁적 배제(competitive exclusion) 등을 통하여, 장내 유해세균 및 부패 관련 균주들을 감소시킴으로써 가축의 성장촉진 및 사료효율 상승 효과를 유발하는 것이다. 또한 분뇨 배설량 감소 및 악취성 유해가스 발생의 억제를 통하여 가축의 사육환경을 개선하기도 한다.

박테리오신은 세포 외로 분비되는 단백질 또는 펩타이드계 항균물질로서 생산균주와 근연관계에 있는 미생물을 죽이거나 생육을 억제하는 물질이라고 알려져 있다. 또한 소화기계의 여러 단백질 분해효소에 의해 분해되므로 인체에 무해하고 잔류성이 없는 장점이 있기 때문에, 최근에는 천연의 식품보존제로서 활용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재, 산업적으로 실용화되고 있는 유일한 박테리오신인 니신(nisin)은 약 50개국에서 가공치즈, 야채, 과일의 통조림, 발효유 제품 등에 식품보존제로서 사용되고 있다. 국내에서도 전통발효식품(김치, 젓갈)에서 유래한 유산균이 생산하는 박테리오신들의 식품부패 관련 병원성균주들에 대한 억제효과 등이 보고 되고 있다(Kwon 등, 2002).

가축 질병치료에 적용된 박테리오신으로는, 발효유식품에서 분리한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 의해 생산된 락티신(lacticin) 3147을 젖소의 유방염 치료에 효과적으로 사용한 예가 있으며(Ryan 등, 1998), 대장균(E. coli)에 의해 생산되는 박테리오신인 콜리신(colicin)과 마이크로신(microcin)을 가금류 또는 소에 투여하여 살모넬라(Salmonella) 및 대장균(E. coli)O157:H7의 생육을 억제한 보고가 있다(Gillor 등, 2004; Diez-Gonzalez, 2007). 그 밖에 돼지(박경준 등, 1995; Rodr등, 2003), 가금류(Halami 등, 1999; Poeta 등, 2006) 등으로부터 박테리오신을 분리 및 확인한 보고도 있다. 그리고 축산용 생균제로 개발하기 위하여 가축의 분변 및 내장으로부터 병원성 미생물에 대하여 항균특성을 지닌 유산균들을 분리하였다는 보고가 있으나, 대부분 박테리오신이 아닌 유기산, 과산화수소, 또는 저분자성 물질인 것으로 알려져 있다.

아직까지 가축으로부터 박테리오신을 생산하는 유산균들을 분리하여 특성 및 작용기작을 밝히고, 이렇게 분리된 박테리오신 또는 박테리오신 생산균주를 이용하여 해당 축종의 생균제로 개발한 선행연구들은 찾아보기 어렵다.

또, 건강식품에 대한 소비자의 요구가 증가함에 따라, 국민 1인당 오리고기의 소비량이 1994년 0.35㎏에서 2002년 1.75㎏으로 3배 이상 증가하고 있으나, 오리에 대한 전문적인 연구는 거의 이루어지지 않고 있다.

본 발명은 박테리오신 생산 유산균주 및 이를 이용한 생균제 조성물에 관한 것이다.

가축용 생균제로 사용되고 있는 미생물로는 바실러스(Bacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 이스트(yeast) 등이 있으나, 생균제 선발기준인 장내부착, 정착성, 안전성 등을 고려한다면 사용하고자 하는 축종으로부터 분리한 미생물을 이용하여 생균제를 제조하는 것이 바람직한 방법이다. 가금류용 생균제를 개발하기 위하여 토종닭, 육계 또는 산란계로부터 유기산, 박테리오신 등 항균물질을 생산하는 유산균을 분리하기도 하였으나(Jin 등, 1997; 김상호, 2002; 이재연 등, 2002; Stern 등, 2006), 오리로부터 유용 미생물을 분리하여 생균제를 개발하고자하는 연구결과는 거의 없는 실정이다. 본 발명에서는 오리로부터 유용 미생물인 박테리오신 생산 유산균주를 분리하여 이를 이용한 오리용 생균제를 제공하고자 한다.

가축의 장내에는 400여종의 다양한 미생물들이 생태계를 이루면서 상호생존하고 있기 때문에, 동일 속의 다른 미생물 또는 다른 속의 미생물들로 이루어진 복합생균제를 사용하는 것이 단일 미생물로 이루어진 생균제보다 가축의 장내 생존에 유리하며, 성장률 및 폐사율에서 개선효과가 있었다고 보고되어 있다(Timmerman 등, 2004). 따라서 본 발명에서는 오리로부터 분리된 박테리오신 생산 유산균주 및 이들이 생산하는 여러 종류의 박테리오신을 조합하여 항생제를 대체할 수 있는 복합생균제, 특히 오리 사육에 적합한 복합생균제를 개발하고자 한다.

이를 위해 본 발명에서는, 오리의 소장 및 맹장으로부터 항균물질 특히 박테리오신을 주로 생산하는 4주의 미생물을 분리, 동정하였으며, 항균물질의 특성 및 프로바이오틱스의 요건 등을 확인하였다. 이러한 연구결과를 토대로 본 발명에서는, 오리의 소화기관으로부터 유래되고, 박테리오신을 생산하는 4개의 균주, 락토바실러스 살리바리우스 JWS 58 (Lactobacillus salivarius JWS 58, KACC91357P); 락토바실러스 플란타륨 JWS 1354 (Lactobacillus plantarum JWS 1354, KACC91358P); 엔테로코커스 패슘 JWS 833 (Enterococcus faecium JWS 833, KACC91359P) 및 페디오코커스 펜토사시우스 JWS 939 (Pediococcus pentosaceus JWS 939, KACC91360P)가 제공된다.

단일 박테리오신을 사용하는 것 보다 여러 개의 박테리오신을 조합하여 사용하는 것이 더 폭넓은 항균범위를 나타내고, 박테리오신에 저항하는 미생물의 숫자를 줄임으로써 응용 범위도 더욱 확대할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 더욱 효과적인 오리 전용 생균제를 개발하기 위하여, 선발된 미생물 및 박테리오신으로 복합생균제를 구성하고, 최종적으로 오리사양실험을 통하여 복합 생균제의 효과를 확인하였다. 이러한 실험결과를 토대로 본 발명에서는, 상기 4개의 균주 및 이들이 생산하는 박테리오신을 포함하는 생균제 조성물이 제공된다. 본 발명의 생균제 조성물은 바람직하게는 상기 균주들을 각각 1.0×10⁶ cfu/g∼1.0×10¹⁰ cfu/g으로 포함한다.

본 발명에서는 오리의 소장 및 맹장으로부터 새로운 박테리오신 생산균주들을 분리, 동정하여 복합생균제로 제조하였으며, 본 발명에 따른 복합생균제는 오리 사양시험을 통해 확인되는 바와 같이 병원성 세균에 대한 억제능력이 우수하여 오리를 포함한 가축사육에서 항생제 대체물질로서 큰 활용이 기대된다.

본 발명에서는 항생제 대체물질로서 가축용, 특히 오리용 생균제를 개발하기 위하여, 오리의 소장 및 맹장으로부터 장내 병원성 세균들에 대한 강력한 항균활성을 지닌 박테리오신을 생산하는 미생물들을 선발하고 동정하였다. 본 발명에서는 더욱 효과적인 생균제를 개발하기 위하여, 선발된 미생물중에서 서로 시너지 효과를 발휘할 수 있는 미생물 및 박테리오신을 선택하여 복합 사용시 병원성 세균에 대한 억제능력을 향상시켰다. 본 발명에서 새롭게 분리, 동정된 박테리오신 생산 유산균은, 장내 병원성 유해세균을 억제하고 프로바이오틱스 특성을 지닌 락토바실러스 살리바리우스 JWS 58 (Lactobacillus salivarius JWS 58, KACC91357P); 락토바실러스 플란타륨 JWS 1354 (Lactobacillus plantarum JWS 1354, KACC91358P); 엔테로코커스 패슘 JWS 833 (Enterococcus faecium JWS 833, KACC91359P) 및 페디오코커스 펜토사시우스 JWS 939 (Pediococcus pentosaceus JWS 939, KACC91360P)이며, 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터(KACC)에 2008년 3월 13일자로 기탁되었다.

또한, 본 발명에서는 상기 균주들이 생산하는 박테리오신 자체의 생화학적 특성, 선발된 미생물의 내산성, 내담즙산성 및 소화효소 활성조사 등 균주특성을 조사하였다.

그리고 이러한 결과를 토대로 복합생균제 조성물을 제조하고, 오리 사양시험을 통해 그 효과를 확인하였다. 본 발명의 생균제 조성물은 특히 오리 사육에 적합하나, 용도가 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 생균제 조성물은 육계를 포함하는 다양한 가금류에도 사용될 수 있으며, 양돈, 반추동물, 애완동물, 수산용 양식어류 등에도 사용 가능성이 있다. 또, 나아가 본 발명의 생균제 조성물은 밝혀진 항균작용에 따라 식품 등에 항생제 대체물질 또는 생균제로도 활용될 수 있다.

본 발명의 생균제 조성물은 바람직하게는 다음과 같이 제조된다. 먼저 상기 4종의 선발균주를 10㎖의 MRS 액체배지에서 하룻밤 동안 배양한 것을 대량생산용 종균으로 사용한다. 대량생산용 배지로는 0.5∼3% 소이펩톤 또는 동물성 단백질, 0.1∼2.0% 이스트 추출물, 0.5∼5% 포도당 또는 유당, 0.1∼0.5%의 완충용 시약, 그리고 0.001∼0.01%의 미네랄(마그네슘, 칼슘, 망간 등)을 사용하며, 배양조건으로는 30∼37℃에서 혐기적인 상태에서 16∼20시간 동안 각각 배양한다. 배양이 완료된 후, 신속하게 원심분리하여 균체를 회수한 다음, 동결보호제 (0.5∼5%, 탈지분유, 말토덱스트린, 트레할로스, 유당, 만니톨, 사이클로덱스트린 등 함유)와 1:1 비중으로 혼합한 후 동결건조를 실시한다. 각각 동결건조하여 완료된 미생물동결건 조 원말들을 1.0×10⁶ cfu/g∼1.0×10¹⁰ cfu/g 수준, 더욱 바람직하게는 1.0×10⁹ cfu/g 수준으로 혼합하여 본 발명의 생균제 조성물을 제조한다.

본 발명의 오리용 생균제 조성물은 오리 사료에 첨가되어 급이되거나 오리에 직접 급이될 수 있으며, 항생제의 사용을 대체할 수 있다.

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

실시예 1

미생물의 분리 및 선발

㈜주원산오리의 도축 생산라인에서 오리의 내장부위를 수거하고 냉장상태로 실험실로 옮겨온 후, 즉시 박테리오신 생산균주 분리실험에 사용하였다. 소장 및 맹장 부위를 절단한 다음, 1g 정도의 내용물을 혐기성 희석액에 넣고 적당량 희석한 후, MRS 또는 BHI 한천배지에 도말하고, 37℃에서 호기적으로 48시간 배양하였다. 각 배지에서 성장한 집락들을 무작위로 1㎖의 MRS 또는 BHI 액체배지가 담긴 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 접종하고, 1∼2일 간 배양한 다음, 10㎕의 배양액을 MRS 또는 BHI 고체배지에 점적하여 1시간 동안 건조하였다. 그리고 지시균 이 접종된 BHI 또는 MRS soft agar(0.7%)를 첨가한 다음, 1일 정도 배양 후, 상기 배지 위에 나타난 clear zone을 확인함으로써 병원성균주 억제능을 지닌 균주를 1차 선발하였다. 이때 사용한 지시균으로는 E. coli KCTC 1467, Salmonella typhymurium KCTC 2515, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Listeria monocytogenes KCTC 3569, 그리고 Lactobacillus sake KCCM 40264를 사용하였다. 유산균이 생성하는 다양한 항균물질(유기산, 아세틸, H₂O₂ 등) 중에서 유산(lactic acid)에 의한 항균효과를 제거하기 위하여, 1차 선발된 균주들에 대하여 약간 변형된 spot-on-lawn 방법(Mayr 등, 1972)을 실시하여 2차 선발과정을 실시하였다. 즉, 1차 선발된 균주들의 배양액을 원심분리하고, 0.45필터을 이용하여 제균한 다음, 10N NaOH를 사용하여 cell-free supernatant를 pH 6.5 정도로 중화시겼다. 상기 여액을 지시균이 1.0×10⁷ cfu/㎖로 첨가된 soft agar 위에 떨어뜨린 후, 지시균의 배양조건(대략 37℃, 1일 배양)에서 배양한 다음, clear zone 형성여부를 관찰함으로써 박테리오신 생성균주를 최종 선발하였다.

오리의 소장 및 맹장으로부터 416주의 미생물을 분리하였으며, 5개의 지시균에 대하여 저해능을 지닌 76개의 균주를 1차로 선발하였다. 유기산에 의한 미생물 억제효과를 제거하기 위하여 spot-on-lawn 방법을 실시한 결과, 항균활성을 나타내는 4균주를 2차로 선발하였다. 항균물질을 생산하는 4 균주는 각각 다른 항균범위를 나타냈다.

실시예 2

미생물의 동정

박테리오신 생산균주를 동정하기 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 Bergey's Manual of Determinative bacteriology에 따라 조사하였다(Holt 등, 1994). 그람염색, 운동성, 카탈라제 테스트, CO₂ 생성 유무 및 API 50 CHL kit(BioMerieux, France)를 사용한 탄수화물 발효 양상 등을 조사하였으며, 최종적인 균주 동정을 위해서 분리균의 16S rDNA 염기배열을 결정하여 알려진 균주들의 염기배열과 비교하였다.

2차 선발된 4주 미생물들은 그람양성, 카탈라제(catalase) 음성, 비운동성 등의 특성을 지니고 있었으며, 당발효 실험결과, 유산균으로 분류되었다. 또한 선발 미생물의 16S rDNA 염기배열을 유전자은행(GeneBank)에 등록된 여러 유산균들과의 상동성을 비교한 결과, 각각의 균주들이 97% 이상의 상동성을 나타내었으며, 최종적으로 각 균주들은 락토바실러스 살리바리우스 JWS 58(Lactobacillus salivarius JWS 58), 락토바실러스 플란타륨 JWS 1354(Lactobacillus plantarum JWS 1354), 페디오코커스 펜토사시우스 JWS 939(Pediococcus pentosaceus JWS 939), 그리고 엔테로코커스 패슘 JWS 833(Enterococcus faecium JWS 833)으로 동정되었다. 다음의 표 1은 분리균주의 탄수화물 발효 결과이다.

실시예 3

Cell-free 상층액의 제조

선발된 박테리오신 생산균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 본 배양액을 3,000×g에서 20분간 원심분리하여 균체를 제거하고, 얻어진 상등액을 1N NaOH를 이용하여 최종 pH 6.5로 조정한 후에, 여과막(0.2㎛ pore size)으로 여과하여 박테리오신 활성을 측정하기 위한 cell-free 상층액을 조제하였다.

실시예 4

항균범위 조사

선발된 박테리오신 생산균주에 대한 항균범위를 확인하기 위하여 deferred antagonism 방법과 항균물질 중 유기산에 의한 억제효과를 제거하기 위하여 spot-on-lawn 방법을 이용하였다. 전기 방법은 배양액을 지시균이 함유된 soft agar에 떨어뜨린 후 지시균의 최적 성장온도에서 하룻밤 배양한 다음, 억제환 생성 유무를 조사하였다. 후기 방법은 cell-free supernatant를 지시균(1.0×10⁷ cfu/㎖)이 함유된 soft agar에 떨어뜨린 후, 지시균의 최적 성장온도에서 하룻밤 배양한 다음, 억제환 생성 유무를 조사하였다.

Deferred antagonism 방법에서는 선발균주에서 생산되는 유기산을 포함하는 항균물질로 인하여 많은 지시균들의 생육이 억제되었다.

그리고 spot-on-lawn 방법에서는 선발된 대부분의 유산균들이 L. monocytogenes 생육에 대하여 강한 억제활성을 나타냈다. Lact. salivarius JWS 58은 주로 lactobacilli 계통의 균주를 억제하면서 enterococci와 Leuconostoc mesenteroides 균주 등도 억제하였다. Ent . faecium JWS 833의 경우도 여러 종의 미생물에 대하여 광범위한 억제활성을 나타내었다. Ped. pentosaceus JWS 939는 유산균보다는 L. monocytogenes, Staph. aureus와 같은 식품부패 및 병원성관련 미생물들의 생육을 억제하는 특성을 나타내었다.

상기 결과를 바탕으로, 4개의 선발균주, 즉 Lact. salivarius JWS 58, Ent. faecium 833, Ped. pentosaceus 939, Lact. plantarum 1354에 대한 항균물질의 특성 및 생균제로서의 적용여부에 대한 실험을 진행하였다. 다음 표 2에 2차 선발균주의 병원성 세균에 대한 억제 효과를 나타내었다.

실시예 5

박테리오신의 이화학적 특성 조사

박테리오신의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여, cell-free supernatant를 10N NaOH와 10N HCl로 pH 2.0에서 10.0까지 조정한 후 상온에서 1시간 방치한 다음, 박테리오신의 활성을 spot-on-lawn 방법으로 측정하였다. 열안정성은 상기 액을 60℃에서 30분, 95℃에서 30분, 그리고 121℃에서 15분 동안 각각 처리한 후, 박테리오신 활성을 측정하였다. 효소처리에 따른 박테리오신의 활성변화를 측정하기 위하여 각각의 효소를 최종농도가 1 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 80℃에서 10분간 열처리하여 효소활성을 중지시킨 다음 박테리오신 활성을 측정하였다. 효소로는 프로테이나제 K(proteinase K), 프로테아제(protease), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), α-아밀라제(α-amylase), β-아밀라제(β-amylase), 그리고 카탈라제 등을 사용하였다. 유기용매 처리가 박테리오신 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, cell-free supernatant와 유기용매를 동량 혼합한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 박테리오신 활성을 측정하였다. 이때 사용한 유기용매의 종류는 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 아세톤, 아세토니트릴, 헥산(hexane), 에틸 아세테이트, 아세테이트 등이었다.

선발된 4 균주로부터 생산된 항균물질에 대한 여러 효소 처리, 열처리, pH 및 유기용매 처리에 대한 박테리오신의 안정성을 조사한 결과를 다음 표 3에 나타내었다. 도 1은 Lact. salivarius JWS 58(A)과 Ent. faecium JWS 833(B)에 의한 Listeria monocytogenes 병원균의 억제 결과로, 사진 중 1은 cell-free supernatant(CFS); 2는 catalase-treated CFS; 3은 proteinase K-treated CFS 이다. Lact. salivarius JWS 58, Ent. faecium 833, 그리고 Ped. pentosaceus 939의 경우 proteinase K 처리에 따라 cell-free supernatants에 있는 항균특성이 불활성화되어 역가를 상실하였는데 (표 3), 이것은 항균물질이 단백질 또는 펩타이드(peptides)로 이루어진 박테리오신임을 증명한 것이다. 그러나 Lact. plantarum 1354의 항균물질은 단백질분해효소에 의해 어떠한 영향도 받지 않는 것으로 보아, 박테리오신 이외의 유기산 또는 작은 분자량의 물질로 추정되었다. 각기 균주에서 생산되는 대부분의 박테리오신 활성은 pH 2∼10 범위에서 안정하였으나, 유기용매 처리에 대해서는 균주별 또는 유기용매 종류별로 활성의 차이를 보였다. 다음 표 3은 효소, 유기산, pH, 및 열처리에 대한 항균물질의 활력의 비교한 것이다.

실시예 6

내산성 및 내담즙산성

분리된 균주를 MRS 액체배지에 일정량 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 0.05M 소듐 인산염 완충액(sodium phosphate buffer)을 HCl로 보정하여 만든 pH 7.0, 3.0, 2.5, 2.3, 2.0 완충용액에 각각 1.0×10⁷ cfu/㎖ 정도의 초기 접종농도로 접종하였다. 위 용액을 37℃에서 2시간 동안 정치배양한 후, 각 농도별로 1㎖ 희석액을 MRS 또는 BHI 한천배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그리고 배양 후에 나타난 집락수를 계수함으로써 각각의 산성 pH에 대한 내성을 측정하였다. 내산성 실험결과를 도 2에 나타내었다.

분리된 균주를 MRS 또는 BHI 액체배지에 일정량 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음 멸균 생리식염수로 희석한 후, Gilliland 등(1977)의 방법을 변형하여 담즙산(oxgall, Difco)이 각각 0%, 0.05%, 0.1%, 0.3%, 0.5%씩 함유된 MRS 한천배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그리고 배양 후에 나타난 집락수를 계수함으로써 담즙산 농도에 따른 내담즙산성을 측정하였다. 내담즙산성 실험결과를 도 3에 나타내었다.

Lact. salivarius JWS 58은 pH 2.5에서 2시간이 지난 후에도 초기 접종농도의 50% 이상의 높은 생존율을 유지하였으나, 나머지 선발균주들은 pH 2.5이하에서 급격하게 사멸하기 시작하여 pH 2.0에서는 거의 생존하지 않는 것으로 나타났다(도 2). 또, 담즙산(oxgall)을 각각 0.05%, 0.1%, 0.3%, 0.5%(w/v)씩 첨가한 MRS 또는 BHI 한천배지에서 내담즙산성 실험을 실시한 결과, 선발균주 모두 0.5% 담즙산 농도까지 아무런 억제현상 없이 정상적으로 집락을 형성하는 것으로 나타났다(도 3).

가축의 장내에서 생균제로서 작용하기 위해서는 낮은 pH를 갖는 위를 통과하고 십이지장으로 분비되는 담즙산에 대한 내성을 지녀야한다. 선발균주에 대한 내산성실험 결과, Lact. salivarius JWS 58만 상대적으로 높은 내산성을 지녔으며, 그 밖의 균주는 일반적인 미생물들의 내산성를 나타냈으나, 내담즙산성은 매우 높게 나타났다. 이것은 장내에서 유래하지 않은 균주들이 0.3% 이상의 담즙을 함유한 배지에서 성장하지 못한다(Khattab와 Abou-Donia, 1987)는 논문의 관점에서 볼 때, 선발균주 모두 가축의 장내 조건에서 충분히 증식할 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 7

효소활성 조사

선발균주를 MRS 또는 BHI broth에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양 후, 배양액을 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 0.22㎛ syringe filter로 여과하여 시험에 사용하였다.

아밀라아제(amylase)와 셀룰라아제(cellulase)의 활성 측정은 Miller(1959)의 DNS(dinitrosalicyclic acid) 방법을 변형하여 사용하였다(Khasin 등, 1993). 상기 배양액 50㎕를 각각 950㎕의 0.5% 기질(starch, carboxymethylcellulose)을 포함하는 0.1M Tris-HCl 효소반응액(pH 7.0)과 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 1㎖의 DNS를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이를 다시 끓는 물에서 5∼7분간 방치하여 발색시키고 즉시 냉각시킨 후, 8㎖의 증류수를 첨가하여 UV 스펙트로포토메터(UV spectrophotometer, Unico, USA)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 아밀라아제와 셀룰라아제 활성도 1유닛(unit)은 37℃에서 1분 동안 1에 상응하는 환원당(glucose)을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 리파아제(lipase)의 활성은 Lesuisse 등(1993)의 방법을 변형하여 사용하였다. 배양액 0.5㎖와 0.5㎖의 기질 용액(1% 4-nitrophenyl butyrate in 50mM Tris-HCl, pH 7.0)을 섞은 다음 37℃에서 10분간 반응시킨 후, UV 스펙트로포토메터를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 리파아제의 1유닛은 37℃에서 1분 동안 1에 상응하는 생성물(4-nitrophenol)을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 프로테아제(Protease)의 활성은 Yanagida 등(1986)의 방법을 변형하여 조사하였다. 0.7% 카제인(casein)( from bovine milk, Sigma) 용액 2.5㎖와 배양액 0.5㎖를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 10% TCA(trichloroacetic acid) 용액 2.5㎖를 가하여 반응을 정지시켰다. 이를 4℃에서 3,500rpm으로 10분간 원심분리를 하고, 상등액을 취하여 UV 스펙트로포토메터로 275㎚에서 흡광도를 측정하였다. 프로테아제 활성은 37℃에서 1분 동안 1몰의 티로신(tyrosine)을 유리시키는 것을 1유닛으로 정의하였다. 효소활성 조사 결과를 다음 표 4에 나타내었다.

오리 소장 및 맹장유래 유산균 4종 대한 분비효소 활성을 조사한 결과, 아밀라아제 활성이 다른 효소활성보다 높게 나타난 반면에 프로테아제 효소 활성은 비교적 낮게 분석되었다. 특히 Ped . pentosaceus JWS 939와 Lact . plantarum JWS 1354는 상대적으로 높은 아밀라아제 활성과 셀룰라아제 효소 활성을 지니고 있었다.

가축용 생균제는 인체용 생균제와는 달리 가축의 생산성 및 경제성에 더 중요한 관점을 두기 때문에 사료효율 및 증체율 증가가 매우 중요하다. Alam 등(2003)은 육계 사료에 인위적으로 소화효소를 첨가하였을 때, 육계의 성장률, 사료효율, 생산량 등이 증가되었음을 발견하였으며, Jin 등(1999)은 락토바실러스(Lactobacillus)가 첨가된 사료를 급여한 육계의 소장 내 아밀라아제 활성이 매우 높게 증가한 반면 단백질 및 지방관련 효소활성은 영향을 받지 않았다고 보고하였다. 오리로부터 항균물질 생산균주로 선발된 4 균주에 대한 소화효소 활성을 측정한 결과, Ped. pentosaceus JWS 939와 Lact. plantarum 1354 균주는 매우 높은 아밀라아제 활성을 나타냈으며, 이것은 진(Jin) 등(1999)의 결과와 유사하였다. 일반적으로 가금류에 급여되는 사료가 주로 곡물사료(전분)에 식물성 단백질과 소량의 동물성 단백질로 이루어져 있음을 고려할 때 높은 아밀라아제 활성을 지닌 미생물의 선발 및 사용은 가축용 생균제에 있어서 주요한 선발 요건이 될 수 있다.

실시예 8

생균제 제조

상기 4종의 선발균주를 10㎖의 MRS 액체배지에서 하룻밤 동안 배양한 것을 대량생산용 종균으로 사용하였다. 대량생산용 배지 조성은 다음 표 5와 같으며, 37℃에서 혐기적인 상태에서 16시간 동안 각각 배양하였다. 배양이 완료된 후, 신속하게 원심분리하여 균체를 획수한 다음, 동결보호제와 1:1 비중으로 혼합한 후 동결건조를 실시하였다. 사용된 동결보호제의 조성은 다음 표 6과 같다. 각각 동결건조하여 완료된 미생물동결건조 원말들을 1.0×10⁹ cfu/g 수준으로 혼합하여 오리 사양시험용 생균제를 제조하였다.

실시예 9

사양시험

본 발명의 박테리오신 함유 복합생균제의 효능을 검증하기 위하여, 1일령 육용 오리를 대상으로 사양실험을 실시하였다. 사양실험은 구당 10마리, 3반복으로 나누어 45일령까지 실시하였다. 대조구는 일반 배합사료만 급여하였으며, 처리구는 실시예 8에서 제조된 박테리오신 함유 복합생균제를 0.1 중량% 수준으로 첨가하여 실시하였다. 사양시험 결과를 대조구와 비교하여 다음 표 7에 나타내었다.

대조구에서는 1마리가 자연폐사하였으나, 본 발명의 박테리오신 함유 복합생균제를 투여한 처리구에서는 100% 육성율을 나태내었다. 생산성 비교에서는 무처리구에 비하여 처리구에서 증체량 및 사료효율의 개선효과가 현저하게 높게 나타났다.

본 발명에 따른 박테리오신 함유 복합생균제는 병원성 세균에 대한 억제능력이 우수하고, 오리의 소화기관으로부터 분리되어 오리에의 적용시 장내 부착성, 정착성, 안전성 또한 우수할 것으로 기대된다. 따라서 본 발명의 복합생균제 조성물은 오리 사육에서 항생제 대체제로서 산업적으로 크게 활용될 것으로 기대되며, 나아가 우수한 항균작용으로 다른 가금류나 가축에서의 활용 또한 기대된다.

도 1은 락토바실러스 살리바리우스 JWS 58(A)과 엔테로코커스 패슘 JWS 833(B)에 의한 Listeria monocytogenes 병원균의 억제 결과이다.

도 2는 내산성 실험결과이다.

도 3은 내담즙산성 실험결과이다.

Claims (6)

1. 락토바실러스 살리바리우스 JWS 58 (Lactobacillus salivarius JWS 58, KACC91357P); 락토바실러스 플란타륨 JWS 1354 (Lactobacillus plantarum JWS 1354, KACC91358P); 엔테로코커스 패슘 JWS 833 (Enterococcus faecium JWS 833, KACC91359P); 페디오코커스 펜토사시우스 JWS 939 (Pediococcus pentosaceus JWS 939, KACC91360P) 및 이들이 생산하는 박테리오신을 포함하는 오리용 생균제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 균주들을 각각 1.0×10⁶ cfu/g∼1.0×10¹⁰ cfu/g으로 포함하는 오리용 생균제 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제

Images