KR101086239B1 - 박테리오신을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 육계용생균제 조성물 - Google Patents
박테리오신을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 육계용생균제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항균물질을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 육계용 생균제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 육계의 소화기관으로부터 유래되고 항균물질을 생산하는 3개의 균주, 엔테로코커스 패슘 SH 528 (Enterococcus faecium SH 528, KACC 91383P); 엔테로코커스 패슘 SH 632 (Enterococcus faecium SH 632, KACC 91382P); 페디오코커스 펜토사시우스 SH 740 (Pediococcus pentosaceus SH 740, KACC 91381P)이 분리, 동정된다. 또, 본 발명에서는 이들을 이용한 복합 생균제 조성물이 제공된다.
육계, 유산균, 박테리오신, 항균물질, 프로바이오틱스, 생균제
Description
본 발명은 병원성 유해세균을 억제하는 항균물질 생산균주 및 이를 이용한 생균제 조성물에 관한 것으로, 특히 항균물질을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 육계용 생균제 조성물에 관한 것이다.
1928년 항생제(antibiotics)가 발견된 이후로, 1950년대부터 가축의 치료 및 성장촉진을 목적으로 항생제가 광범위하게 가축사양에 사용되어 왔다. 준치료적 수준의 낮은 농도의 항생제를 양돈 및 가금류의 사양에 사용하면서, 가축의 성장촉진, 사료효율 개선 및 질병발생의 억제 등의 효과가 있다는 연구결과들이 발표되었다. 그러나 1960년 이후부터 항생제에 대한 문제점이 대두되기 시작하여, 최근에는 항생제의 오남용으로 인한 내성균주의 출현과 축산물 내 잔류 항생물질로 인한 안전성 문제가 야기되면서 항생물질의 사용이 점차 규제되고 있는 추세이다. EU에서는 2006년부터 가축의 성장촉진을 목적으로 하는 항생제의 사용을 전면 금지한 바 있으며, 우리나라에서도 2005년부터 사료에 첨가할 수 있는 항생제의 종류를 52 종에서 25종으로 감소시켰다. 이러한 축산환경의 변화 외에도 축산물의 안전성에 대한 소비자들의 관심과 무항생제 사용 축산물에 대한 요구가 높아짐에 따라 항생제 대체물질의 개발 필요성은 더욱 커지고 있다.
항생제 대체물질로는 생균제(probiotics), 산성화제(acidifer), 면역조절 및 증강 물질, 사료첨가용 복합효소제, 기능성 천연추출물 등이 있으나, 장내미생물의 균형을 개선하여 숙주동물에게 유익한 작용을 하는 생균제가 가장 각광을 받고 있다. 가축용 생균제로서 사용되고 있는 미생물로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius), 엔테로코커스 패슘(Enterococcus faecium), 페디오코커스속 미생물(Pediococcus sp.), 비피도박테리움속 미생물(Bifidobacterium sp.)과 같은 유산균과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 및 효모류가 있다. 좋은 가축용 생균제의 조건으로는, 첫째, 생균제를 적용할 가축의 장내미생물로부터 분리함으로써 안전성 및 장내 정착 등에 도움을 주어야 하며, 둘째, 내산성 및 내담즙산성을 지니고 있어서 음용시 장내에 도착하여 그 효능을 발휘할 수 있어야 하고, 셋째, 병원성미생물에 대한 항균물질(유기산, 과산화수소, 박테리오신 등)을 생산하여야 하며, 넷째, 제조과정 및 유통기간 내에 생균수로 생존할 수 있는 안정성을 보유하여야 한다. 가축용 생균제의 주요 기작은, 장내 병원성 미생물들에 대하여 유기산, 과산화수소(H2O2), 박테리오신(bacteriocin) 같은 항병성 인자의 생성과 경쟁적 배제(competitive exclusion) 등을 통하여 장내 유해세균 및 부패 관련 균주들을 감소시킴으로써 가축의 성장촉진 및 사료효율 상승 효과를 유발하는 것이다. 또한 분뇨 배설량 감소 및 악취성 유해가스 발생의 억제를 통하여 가축의 사육환경을 개선하기도 한다.
박테리오신은 세포 외로 분비되는 단백질 또는 펩타이드계 항균물질로서 생산균주와 근연관계에 있는 미생물을 죽이거나 생육을 억제하는 물질이라고 알려져 있다. 또한 소화기계의 여러 단백질 분해효소에 의해 분해되므로 인체에 무해하고 잔류성이 없는 장점이 있다. 따라서 최근에는 천연의 식품보존제로서 활용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재, 산업적으로 실용화되고 있는 유일한 박테리오신인 니신(nisin)은 약 50개국에서 가공치즈, 야채, 과일의 통조림, 발효유 제품 등에 식품보존제로서 사용되고 있다. 국내에서도 전통발효식품(김치, 젓갈)에서 유래한 유산균들이 생산하는 박테리오신의 식품부패 관련 병원성균주들에 대한 억제효과 등이 보고되고 있다(Kwon 등, 2002).
가축 질병치료에 적용된 박테리오신으로는, 발효유식품에서 분리한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 의해 생산된 락티신(lacticin) 3147을 젖소의 유방염 치료에 효과적으로 사용한 예가 있으며(Ryan 등, 1998), 대장균(E. coli)에 의해 생산되는 박테리오신인 콜리신(colicin)과 마이크로신(microcin)을 가금류 또는 소에 투여하여 살모넬라(Salmonella) 및 대장균(E. coli)O157:H7의 생육을 억제한 예가 보고되어 있다(Gillor 등, 2004; Diez-Gonzalez, 2007). 그 밖에 돼지(박경준 등, 1995; Rodr등, 2003), 가금류(Halami 등, 1999; Poeta 등, 2006) 등으로부터 박테리오신을 분리 및 확인한 보고도 있다. 최근에는 육계의 장관으로부터 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)에 대하여 항균능력을 지닌 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)를 분리한 바 있다 (Pilasombut 등, 2006). 그리고 축산용 생균제로 개발하기 위하여 가축의 분변 및 내장으로부터 병원성 미생물에 대하여 항균특성을 지닌 유산균들을 분리하였다는 보고가 있으나, 대부분 박테리오신이 아닌 유기산, 과산화수소, 또는 저분자성 물질인 것으로 알려져 있다.
아직까지는 가축으로부터 박테리오신을 생산하는 유산균들을 분리하여 특성 및 작용기작을 밝히고, 박테리오신 또는 박테리오신 생산균주를 이용하여 가축용 생균제를 개발하고자 하는 연구들은 찾아보기 어렵다.
가금류에 질병을 유발하는 병원성 세균으로는 그람 음성균으로 살모넬라(Salmonella), 캄필로박터( Campylobacter ), 대장균( Escherichia coli ) 등이 있으며, 그람 양성균으로 클로스트리디움(Clostridium) 등이 있다. 특히 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)은 간균으로서 장내에 기생하는 살모넬라균에 속하는 세균이며, 어린 병아리에 백색설사를 하며 패혈증으로 폐사시키는 급성전염병을 일으키는 추백리균이다. 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)은 가금티프스, 즉 성계에서 패혈증을 주증으로 하는 소화기 전염병으로서 난계대점염을 일으킨다. 대장균(E. coli)은 장내세균과에 속하는 세균으로서 건강한 가축, 조류 및 사람의 소화관에 많이 서식하고 있으며 비병원성 대장균이 병원성 대장균보다 훨씬 많이 서식하는 것으로 알려져 있다. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 그람 음성의 운동성을 지닌 약호기성 균주로서 산란율 저하와 발육장해 및 폐사율을 증 가시키는 만성적 감염을 일으킨다. 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens) A형은 알파 톡신(toxin)을 생산하고 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens) C형은 베타톡신을 생산하여 괴사성 장염을 일으킨다. 그 밖에 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes)는 토양, 물 등 자연계에 널리 분포하고 있으며, 사람과 동물의 정상 분변에서도 분리되고 있으며, 특히 소에서는 33.8%, 돼지에서는 5.9%, 닭에서는 8% 가 발견되고 있다 (Weber 등, 1995). 또한 냉장상태에서도 발육이 가능하기 때문에 냉장 및 냉동식품에서 리스테리아병(listeriosis)을 유발하기도 한다. 상기와 같은 병원성 미생물들은 가축질병을 유발할 뿐만 아니라, 도축과정에서 식육에 오염되어 사람에게 질병을 유발하기도 한다.
본 발명은 박테리오신 생산 유산균주 및 이를 이용한 육계용 생균제 조성물에 관한 것이다.
가축용 생균제로 사용되고 있는 미생물로는 바실러스(Bacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 이스트(yeast) 등이 있으나, 생균제 선발기준인 장내부착, 정착성, 안전성 등을 고려한다면 사용하고자 하는 축종으로부터 분리한 미생물을 이용하여 생균제를 제조하는 것이 바람직한 방법이다. 가금류용 생균제를 개발하기 위하여 토종닭, 육계 또는 산란계로부터 유기산, 박테리오신 등 항균물질을 생산하는 유산균을 분리하기도 하였으나(Jin 등, 1997; 김상호, 2002; 이재연 등, 2002; Stern 등, 2006), 박테리오신 항균물질을 생산하는 미생물들을 복합적으로 혼합하여 병원성 세균에 대하여 광범위한 항균효과를 지닌 생균제를 개발한 예는 거의 없는 실정이다. 본 발명에서는 육계로부터 유용 미생물인 박테리오신 생산 유산균주를 분리하여 제공하고자 한다. 특히 본 발명에서는 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens)와 리스테리아속 미생물(Listeria sp.)에 대하여 강력한 항균능을 지닌 박테리오신 생산균주를 제공하고자 한다. 본 발명에서 제공하는 상기 박테리오신 생산 균주들은 유기산을 생산하여 그람음성균인 살모넬라속 미생물(Salmonella sp.), 대장균(E. coli) 등에도 항균효능을 지닌다.
가축의 장내에는 400여종의 다양한 미생물들이 생태계를 이루면서 상호생존 하고 있기 때문에, 동일 속의 다른 미생물 또는 다른 속의 미생물들로 이루어진 복합생균제를 사용하는 것이 단일 미생물로 이루어진 생균제보다 가축의 장내 생존에 유리하며, 성장률 및 폐사율에서 개선효과가 있었다고 보고되어 있다(Timmerman 등, 2004). 따라서 본 발명에서는 육계로부터 분리된 박테리오신 생산 유산균주 및 이들이 생산하는 여러 종류의 박테리오신을 조합하여 항생제를 대체할 수 있는 복합생균제, 특히 육계 사육에 적합한 복합생균제를 제공하고자 한다.
이를 위해 본 발명에서는, 육계의 소장 및 맹장으로부터 항균물질 특히 박테리오신을 주로 생산하는 3주의 미생물을 분리, 동정하였으며, 항균물질의 특성 및 프로바이오틱스의 요건 등을 확인하였다. 이러한 연구결과를 토대로 본 발명에서는, 육계의 소화기관으로부터 유래되고, 항균물질을 생산하는 3개의 균주, 엔테로코커스 패슘 SH 528 (Enterococcus faecium SH 528, KACC 91383P); 엔테로코커스 패슘 SH 632 (Enterococcus faecium SH 632, KACC 91382P) 및 페디오코커스 펜토사시우스 SH 740 (Pediococcus pentosaceus SH 740, KACC 91381P)를 제공한다.
단일 박테리오신을 사용하는 것 보다 여러 개의 박테리오신을 조합하여 사용하는 것이 더 폭넓은 항균범위를 나타내고, 박테리오신에 저항하는 미생물의 숫자를 줄임으로써 응용 범위도 더욱 확대할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 더욱 효과적인 육계 전용 생균제를 개발하기 위하여, 선발된 미생물 및 박테리오신으로 복합생균제를 구성하고, 최종적으로 육계사양실험을 통하여 복합 생균제의 효과를 확인한다. 이러한 실험결과를 토대로 본 발명에서는, 상기 3개의 균주 및 이들이 생 산하는 항균물질을 포함하는 생균제 조성물을 제공한다. 본 발명의 생균제 조성물은 바람직하게는 상기 균주들을 각각 1.0×106 ∼1.0×1010 cfu/g으로 포함한다.
본 발명에서는 육계의 소장 및 맹장으로부터 가금류에서 질병을 일으키는 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이진스(Listeria monocytogenes) 등에 강력한 항균효능을 지닌 새로운 박테리오신 생산균주들을 분리, 동정하여 복합생균제로 제조하였으며, 본 발명에 따른 복합생균제는 육계 사양시험을 통해 확인되는 바와 같이 병원성 세균에 대한 억제능력이 우수하여 육계를 포함한 가축사육에서 항생제 대체물질로서 큰 활용이 기대된다.
본 발명에서는 항생제 대체물질로서 가축용, 특히 육계용 생균제를 개발하기 위하여, 육계의 소장 및 맹장으로부터 장내 병원성 세균들에 대해 강력한 항균활성을 지닌 박테리오신을 생산하는 미생물들을 선발하고 동정하였다. 본 발명에서는 더욱 효과적인 생균제를 개발하기 위하여, 선발된 미생물 중에서 서로 시너지 효과를 발휘할 수 있는 미생물 및 박테리오신을 선택하여 복합 사용시 병원성 세균에 대한 억제능력을 향상시켰다. 본 발명에서 새롭게 분리, 동정된 박테리오신 생산 유산균은, 장내 병원성 유해세균을 억제하고 프로바이오틱스 특성을 지닌 엔테로코커스 패슘 SH 528 (Enterococcus faecium SH 528, KACC 91383P); 엔테로코커스 패슘 SH 632 (Enterococcus faecium SH 632, KACC 91382P) 및 페디오코커스 펜토사시 우스 SH 740 (Pediococcus pentosaceus SH 740, KACC 91381P)이며, 농업생명공학연구원의 한국농업미생물자원센터(KACC)에 2008년 5월 23일자로 기탁되었다.
또한, 본 발명에서는 상기 균주들이 생산하는 박테리오신 자체의 생화학적 특성, 선발된 미생물의 내산성, 내담즙산성 및 소화효소 활성조사 등 균주특성을 조사하였다.
그리고 이러한 결과를 토대로 복합생균제 조성물을 제조하고, 육계 사양시험을 통해 그 효과를 확인하였다. 본 발명의 생균제 조성물은 특히 육계 사육에 적합하나, 용도가 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 생균제 조성물은 오리를 포함하는 다양한 가금류에도 사용될 수 있으며, 양돈, 반추동물, 애완동물, 수산용 양식어류 등에도 사용 가능하다. 또, 나아가 본 발명의 생균제 조성물은 본 발명에서 밝혀진 항균작용에 따라 식품 등에 항생제 대체물질 또는 생균제로도 활용될 수 있다.
본 발명의 생균제 조성물은 바람직하게는 다음과 같이 제조된다. 먼저 상기 3종의 선발균주를 10㎖의 MRS 액체배지에서 하룻밤 동안 배양한 것을 대량생산용 종균으로 사용한다. 대량생산용 배지로는 0.5∼3% 소이펩톤 또는 동물성 단백질, 0.1∼2.0% 이스트 추출물, 0.5∼5% 포도당 또는 유당, 0.1∼0.5%의 완충용 시약, 그리고 0.001∼0.01%의 미네랄(마그네슘, 칼슘, 망간 등)을 사용하며, 배양조건으로는 30∼37℃, 혐기적인 상태에서 16∼20시간 동안 각각 배양한다. 배양이 완료된 후, 신속하게 원심분리하여 균체를 회수한 다음, 동결보호제 (0.5∼5%, 탈지분유, 말토덱스트린, 트레할로스, 유당, 만니톨, 사이클로덱스트린 등 함유)와 1:1 비중으로 혼합한 후 동결건조를 실시한다. 각각 동결건조하여 완료된 미생물동결건조 원말들을 1.0×106 ∼1.0×1010 cfu/g 수준, 더욱 바람직하게는 1.0×109 cfu/g 수준으로 혼합하여 본 발명의 생균제 조성물을 제조한다.
본 발명의 생균제 조성물은 육계 사료에 첨가되어 급이되거나 육계에 직접 급이될 수 있으며, 항생제의 사용을 대체할 수 있다.
이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.
실시예
1
미생물의 분리 및 선발
육계의 도축 생산라인에서 육계의 장관 부위를 수거하고 냉장상태로 실험실로 옮겨온 후, 즉시 박테리오신 생산균주 분리실험에 사용하였다. 소장 및 맹장 부위를 절단한 다음, 1g 정도의 내용물을 혐기성 희석액에 넣고 적당량 희석한 후, MRS 또는 BHI 한천배지에 도말하고, 37℃에서 호기적으로 48시간 배양하였다. 각 배지에서 성장한 집락들을 무작위로 1㎖의 MRS 또는 BHI 액체배지가 담긴 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 접종하고, 1∼2일간 배양한 다음, 10㎕의 배양액을 MRS 또는 BHI 고체배지에 점적하여 1시간 동안 건조하였다. 그리고 지시균이 접종된 BHI 또는 MRS soft agar(0.7%)를 첨가한 다음, 1일 정도 배양 후, 상기 배지 위에 나타난 clear zone을 확인함으로써 병원성균주 억제능을 지닌 균주를 1차 선발하였다. 이때 사용한 지시균으로는 E. coli KCTC 1467, Salmonella typhymurium KCTC 2515, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Listeria monocytogenes KCTC 3569, 그리고 Lactobacillus sake KCCM 40264를 사용하였다. 유산균이 생성하는 다양한 항균물질(유기산, 아세틸, H2O2 등) 중에서 유산(lactic acid)에 의한 항균효과를 제거하기 위하여, 1차 선발된 균주들에 대하여 약간 변형된 spot-on-lawn 방법(Mayr 등, 1972)을 실시하여 2차 선발과정을 실시하였다. 즉, 1차 선발된 균주들의 배양액을 원심분리하고, 공극 크기(pore size) 0.22㎛ 필터를 이용하여 제균한 다음, 10N NaOH를 사용하여 cell-free supernatant를 pH 6.5 정도로 중화시겼다. 상기 여액을 지시균이 1.0×107 cfu/㎖로 첨가된 soft agar 위에 떨어뜨린 후, 지시균의 배양조건(대략 37℃, 1일 배양)에서 배양한 다음, clear zone 형성여부를 관찰함으로써 박테리오신 생성균주를 최종 선발하였다.
육계의 소장 및 맹장으로부터 291주의 미생물을 분리하였으며, 5개의 지시균에 대하여 하나 이상의 저해능을 지닌 17개의 균주를 1차로 선발하였다. 유기산에 의한 미생물 억제효과를 제거하기 위하여 spot-on-lawn 방법을 실시한 결과, 항균활성을 나타내는 3균주를 2차로 선발하였다. 항균물질을 생산하는 3 균주는 각각 다른 항균범위를 나타냈다.
실시예
2
미생물의 동정
박테리오신 생산균주를 동정하기 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 Bergey's Manual of Determinative bacteriology에 따라 조사하였다(Holt 등, 1994). 그람염색, 운동성, 카탈라제 테스트, CO2 생성 유무 및 API 50 CHL kit(BioMerieux, France)를 사용한 탄수화물 발효 양상 등을 조사하였으며, 최종적인 균주 동정을 위해서 분리균의 16S rDNA 염기배열을 결정하여 알려진 균주들의 염기배열과 비교하였다.
2차 선발된 3주 미생물들은 그람양성, 카탈라제(catalase) 음성, 비운동성 등의 특성을 지니고 있었으며, 당발효 실험결과, 유산균으로 분류되었다. 또한 선발 미생물의 16S rDNA 염기배열을 유전자은행(GeneBank)에 등록된 여러 유산균들과의 상동성을 비교한 결과, 각각의 균주들이 97%이상의 상동성을 나타내었으며, 최종적으로 각 균주들은 엔테로코커스 패슘 SH 528(Enterococcus faecium SH 528), 엔테로코커스 패슘 SH 632(Enterococcus faecium SH 632), 그리고 페디오코커스 펜토사시우스 SH 740(Pediococcus pentosaceus SH 740)으로 동정되었다. 도 1은 선발된 균주들의 세포 모양을 현미경으로 촬영한 사진이다. 다음의 표 1 내지 2는 분리균주의 탄수화물 발효 결과이다.
실시예 3
Cell-free 상층액의 제조
선발된 박테리오신 생산균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 본 배양액을 3,000×g에서 20분간 원심분리하여 균체를 제거하고, 얻어진 상등액을 1N NaOH를 이용하여 최종 pH 6.5로 조정한 후에, 여과막(0.2pore size)으로 여과하여 박테리오신 활성을 측정하기 위한 cell-free 상층액을 조제하였다.
실시예
4
항균범위 조사
선발된 박테리오신 생산균주에 대한 항균범위를 확인하기 위하여 deferred antagonism 방법과 항균물질 중 유기산에 의한 억제효과를 제거하기 위하여 spot-on-lawn 방법을 이용하였다. deferred antagonism 방법은 배양액을 지시균이 함유된 soft agar에 떨어뜨린 후 지시균의 최적 성장온도에서 하룻밤 배양한 다음, 억제환 생성 유무를 조사하였다. spot-on-lawn 방법은 cell-free supernatant를 지시균(1.0×107 cfu/㎖)이 함유된 soft agar에 떨어뜨린 후, 지시균의 최적 성장온도에서 하룻밤 배양한 다음, 억제환 생성 유무를 조사하였다.
Deferred antagonism 방법에서는 선발균주 (SH 528, SH 632, SH 740)에서 생산되는 유기산을 포함하는 항균물질로 인하여 대부분의 음성 세균, 즉 E. coli, Salmonella sp. 및 Staphylococcus aureus 등의 생육이 억제되었다.
그리고 spot-on-lawn 방법에서는 선발된 대부분의 유산균들이 L. monocytogenes 생육에 대하여 강한 억제활성을 나타냈다. 특히, Ent . faecium SH 528의 경우, Clostridium perfringens에 대하여 억제활성을 나타내었다. Ped . pentosaceus SH 740은 유산균보다는 L. monocytogenes , Staph . aureus와 같은 식품부패 및 병원성관련 미생물들의 생육을 억제하는 특성을 나타내었다. Clostridium sp.와 Listeria sp., 그리고 그람음성 세균(대장균, Salmonella 등)들은 가금류의 장내병원성 세균으로 상존하며, 사람의 장염에도 관여되는 것으로 알려져 있다. 또한 가금류 생산에서의 낮은 생산성, 폐사율 증가 등에 주요한 원인이 되며, 도계 공정에서의 오염원으로 작용되고 있다. 따라서, 상기 결과를 종합해 보면 박테리오신을 생산하는 Ent. faecium SH 528, Ent. faecium SH 632, Ped. pentosaceus SH 740를 혼합하여 생균제로 사용한다면, Listeria, Clostridium에 대하여 항균작용을 하는 박테리오신과 그람 음성균에 억제활성을 나타내는 높은 유기산 등으로 인하여 가금류에서 발견되는 병원성 세균의 감소에 적합할 것으로 판단된다.
상기 결과를 바탕으로, 3개의 선발균주, 즉 Ent. faecium SH 528, Ent. faecium SH 632, Ped. pentosaceus SH 740에 대한 항균물질의 특성 및 생균제로서의 적용여부에 대한 실험을 진행하였다. 다음 표 3에 2차 선발균주의 병원성 세균에 대한 억제 효과를 나타내었다.
실시예
5
박테리오신의 이화학적 특성 조사
박테리오신의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여, cell-free supernatant를 10N NaOH와 10N HCl로 pH 2.0에서 10.0까지 조정한 후 상온에서 1시간 방치한 다음, 박테리오신의 활성을 spot-on-lawn 방법으로 측정하였다. 열안정성은 상기 액을 60℃에서 30분, 95℃에서 30분, 그리고 121℃에서 15분 동안 각각 처리한 후, 박테리오신 활성을 측정하였다. 효소처리에 따른 박테리오신의 활성변화를 측정하기 위하여 각각의 효소를 최종농도가 1 mg/㎖이 되도록 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 80℃에서 10분간 열처리하여 효소활성을 중지시킨 다음 박테리오신 활성을 측정하였다. 효소로는 프로테이나제 K(proteinase K), 프로테아제(protease), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), α-아밀라제(α-amylase), β-아밀라제(β-amylase), 그리고 카탈라제 등을 사용하였다. 유기용매 처리가 박테리오신 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, cell-free supernatant와 유기용매를 동량 혼합한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 박테리오신 활성을 측정하였다. 이때 사용한 유기용매의 종류는 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 아세톤, 아세토니트릴, 헥산(hexane), 에틸 아세테이트, 아세테이트 등이었다.
선발된 3 균주로부터 생산된 항균물질에 대해 여러 효소 처리, 열처리, pH 및 유기용매 처리를 하여 이에 대한 박테리오신의 안정성을 조사한 결과를 다음 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타난 바와 같이, Ent. faecium SH 528(A), Ent . faecium SH 632(B), 그리고 Ped . pentosaceus SH 740(C)의 경우, 단백질 분해효소 처리에 따라 cell-free supernatants에 있는 항균특성이 불활성화되어 역가를 상실하였는데, 이것은 항균물질이 단백질 또는 펩타이드(peptides)로 이루어진 박테리오신임을 증명한 것이다. 각각의 균주에서 생산되는 대부분의 박테리오신의 활성은 pH 2∼10 범위에서 안정하였으나, 유기용매 처리에 대해서는 균주별 또는 유기용매 종류별로 활성의 차이를 보였다. 또한 3균주에서 생산되는 박테리오신은 95℃에서 30분간 처리하였을 때에도 높은 항균활성을 유지하고 있었다.
실시예 6
박테리오신의 구조유전자 확인실험
선발된 3 균주로부터 생산된 박테리오신의 종류를 분석하기 위하여 기존에 알려진 enterocin과 pediocin 유전자에 대한 primer를 제작하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하였다. Total DNA는 Anderson과 McKay (1983)의 방법에 따라 분리하였으며, 분리된 total DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. Enterocin과 pediocin에 대한 primer는 표 5에 표시하였다. PCR 반응은 thermal cycler (Amplitron Ⅱ, Barnstead / Thermolyne, Montreal, QC, Canada)를 사용하였으며 PCR Kit (SolGent, Daejeon, Korea)의 매뉴얼에 의거하여 진행하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성후, 95℃에서 1분 동안 변성, 56℃에서 1분간 붙임, 그리고 72℃에서 1분 동안 연장을 하여 총 35회 running하였다. PCR 생성물은 0.5㎍/㎖의 ethidium bromide로 염색된 2% agarose gel을 이용하여 100V에서 전기영동하여 생성된 band를 관찰하였으며, 결과는 도 2와 같다 (SH 528 균주(lane 2-6), SH 632 균주(lane 7-11), 그리고 SH 740 균주(lane 12)).
육계로부터 분리한 Ent . faecium SH 528 균주는 enterocin A와 B의 specific primers에 반응하여 각각 130bp와 160bp의 생성물이 나타났으며, 이것은 SH 528 균주가 enterocin A와 B의 유전자를 지니고 있음을 증명해 준다. 상기와 같은 방법으로 실험을 실시한 결과, Ent . faecium SH 632는 enterocin P와 L50 유전자를 지니고 있는 것으로 확인되었으며, Ped . pentosaceus SH 740 균주는 pediocin 유전자에 반응하였다. 도 2에서 Lanes 1 : 100bp ladder, 2 & 7 : enterocin A primers에 대한 PCR 생성물, 3 & 8 : enterocin B primers에 대한 PCR 생성물, 4 & 9:enterocin P primers에 대한 PCR 생성물, 5 & 10 : enterocin L50 primers에 대한 PCR 생성물, 6 & 11 : enterocin Q primers에 대한 PCR 생성물, 12 : pediocin PA-1 primers에 대한 PCR 생성물이다.
실시예
6
내산성
및
내담즙산성
분리된 균주를 MRS 액체배지에 일정량 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 0.05M 소듐 인산염 완충액(sodium phosphate buffer)을 HCl로 보정하여 만든 pH 7.0, 3.0, 2.5, 2.3, 2.0 완충용액에 각각 1.0×107 cfu/㎖ 정도의 초기 접종농도로 접종하였다. 위 용액을 37℃에서 2시간 동안 정치배양한 후, 각 농도별로 1㎖ 희석액을 MRS 또는 BHI 한천배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그리고 배양 후에 나타난 집락수를 계수함으로써 각각의 산성 pH에 대한 내성을 측정하였다. 내산성 실험결과를 도 3에 나타내었다.
분리된 균주를 MRS 또는 BHI 액체배지에 일정량 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음 멸균 생리식염수로 희석한 후, Gilliland 등(1977)의 방법을 변형하여 담즙산(oxgall, Difco)이 각각 0%, 0.05%, 0.1%, 0.3%, 0.5%씩 함유된 MRS 한천배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그리고 배양 후에 나타난 집락수를 계수함으로써 담즙산 농도에 따른 내담즙산성을 측정하였다. 내담즙산성 실험결과를 도 4에 나타내었다.
육계로부터 분리한 3개의 선발균주에 대한 내산성실험을 실시한 결과, Ent . faecium SH 528 균주가 다른 2균주보다 높은 생존율을 보였으며(도 3), pH 3.0 조건하에서 Ent . faecium SH 528과 SH 632는 1.0×106 cfu/㎖ 이상 생존하였다. 그러나 pH 2.3에서는 2시간 동안 방치후에는 보통의 균주에서 보여주는 것과 같이 1.0×102 cfu/㎖ 이하로 감소하였다. 담즙산(oxgall)을 각각 0.05%, 0.1%, 0.3%, 0.5%(w/v)씩 첨가한 MRS 또는 BHI 한천배지에서 내담즙산성 실험을 실시한 결과, 선발균주 모두 0.5% 담즙산 농도까지 아무런 억제현상 없이 정상적으로 집락을 형성하는 것으로 나타났다(도 4). 가금류의 소화기관은 사람이나 단위동물에 비해 상대적으로 짧으며, 음식물이 전체 소화관을 통과하는데 소요되는 시간은 2.5시간 이내이기 때문에(Duke 1977), 가금류에서의 생균제에 대한 내산성은 음식물 통과시간이 긴 다른 가축에 비하여 그 중요성이 낮다고 알려져 있다. 따라서 pH 3.0에서 생존율이 좋은 상기 선발균주도 생균제로서 문제가 없을 것으로 판단된다.
실시예
7
효소활성 조사
선발균주를 MRS 또는 BHI broth에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양 후, 배양액을 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 0.22㎛ syringe filter로 여과하여 시험에 사용하였다.
아밀라아제(amylase)와 셀룰라아제(cellulase)의 활성 측정은 Miller(1959)의 DNS(dinitrosalicyclic acid) 방법을 변형하여 사용하였다(Khasin 등, 1993). 상기 배양액 50㎕를 각각 950㎕의 0.5% 기질(starch, carboxymethylcellulose)을 포함하는 0.1M Tris-HCl 효소반응액(pH 7.0)과 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 1㎖의 DNS를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이를 다시 끓는 물에서 5∼7분간 방치하여 발색시키고 즉시 냉각시킨 후, 8㎖의 증류수를 첨가하여 UV 스펙트로포토메터(UV spectrophotometer, Unico, USA)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 아밀라아제와 셀룰라아제 활성도 1유닛(unit)은 37℃에서 1분 동안 1에 상응하는 환원당(glucose)을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 리파아제(lipase)의 활성은 Lesuisse 등(1993)의 방법을 변형하여 사용하였다. 배양액 0.5㎖와 0.5㎖의 기질 용액(1% 4-nitrophenyl butyrate in 50mM Tris-HCl, pH 7.0)을 섞은 다음 37℃에서 10분간 반응시킨 후, UV 스펙트로포토메터를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 리파아제의 1유닛은 37℃에서 1분 동안 1에 상응하는 생성물(4-nitrophenol)을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 프로테아제(Protease)의 활성은 Yanagida 등(1986)의 방법을 변형하여 조사하였다. 0.7% 카제인(casein)( from bovine milk, Sigma) 용액 2.5㎖와 배양액 0.5㎖를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 10% TCA(trichloroacetic acid) 용액 2.5㎖를 가하여 반응을 정지시켰다. 이를 4℃에서 3,500rpm으로 10분간 원심분리를 하고, 상등액을 취하여 UV 스펙트로포토메터로 275㎚에서 흡광도를 측정하였다. 프로테아제 활성은 37℃에서 1분 동안 1몰의 티로신(tyrosine)을 유리시키는 것을 1유닛으로 정의하였다. 효소활성 조사 결과를 다음 표 6에 나타내었다.
육계 소장 및 맹장유래 유산균 3종 대한 분비효소 활성을 조사한 결과, 대조군으로 사용한 대장균과 Bacilus subtilis에 비해 아밀라아제 활성과 셀룰라아제 효소 활성이 높게 분석되었다. 특히 Ent. faecium SH 528 균주는 상대적으로 높은 아밀라아제 활성과 셀룰라아제 효소 활성을 지니고 있었다.
가축용 생균제는 인체용 생균제와는 달리 가축의 생산성 및 경제성에 더 중요한 관점을 두기 때문에 사료효율 및 증체율 증가가 매우 중요하다. Alam 등(2003)은 육계 사료에 인위적으로 소화효소를 첨가하였을 때, 육계의 성장률, 사료효율, 생산량 등이 증가되었음을 발견하였으며, Jin 등(1999)은 락토바실러스(Lactobacillus)가 첨가된 사료를 급여한 육계의 소장 내 아밀라아제 활성이 매우 높게 증가한 반면 단백질 및 지방관련 효소활성은 영향을 받지 않았다고 보고하였다. 육계로부터 항균물질 생산균주로 선발된 3 균주에 대한 소화효소 활성을 측정한 결과, 3균주 모두 매우 높은 아밀라아제 활성을 나타냈으며, 이것은 진(Jin) 등(1999)의 결과와 유사하였다. 일반적으로 가금류에 급여되는 사료가 주로 곡물사료(전분)에 식물성 단백질과 소량의 동물성 단백질로 이루어져 있음을 고려할 때 높은 아밀라아제 활성을 지닌 미생물의 선발 및 사용은 가축용 생균제에 있어서 주요한 선발 요건이 될 수 있다.
실시예 8
생균제 제조
상기 3종의 선발균주를 10㎖의 MRS 액체배지에서 하룻밤 동안 배양한 것을 대량생산용 종균으로 사용하였다. 대량생산용 배지 조성은 다음 표 7과 같으며, 37℃에서 혐기적인 상태에서 16시간 동안 각각 배양하였다. 배양이 완료된 후, 신속하게 원심분리하여 균체를 획수한 다음, 동결보호제와 1:1 비중으로 혼합한 후 동결건조를 실시하였다. 동결건조 미생물원말의 생균수를 측정한 결과, Ent. faecium SH 528은 4.0×1012 cfu/g, Ent . faecium SH 632은 1.3×1012 cfu/g 그리고 Ped. pentosaceus SH 740은 1.1×1012 cfu/g 이었다. 사용된 동결보호제의 조성은 다음 표 8과 같다. 각각 동결건조하여 완료된 미생물동결건조 원말들을 1.0×109 cfu/g 수준으로 혼합하여 육계 사양시험용 생균제를 제조하였다.
실시예
9
육계사양시험
본 발명의 박테리오신 함유 복합생균제의 효능을 검증하기 위하여, 일반 육계 농가(2동 보유)에서 육계 무감별 초생추 3만1천수를 대상으로 대조군와 처리군으로 나누어 각 동에 15,500수씩 배치하였다. 처리군에는 육계로부터 선발한 박테리오신 생성 복합생균제를 육계 사료에 g당 1.0×106∼1.0×107 cfu/g 수준으로 첨가하여 5주간 사양실험을 실시하였다. 또한 사양실험 종료후, 대조군과 처리군에서 각각 10수씩 희생시킨 후, 회장 및 맹장에서 내용물 1g을 무균적으로 수거한 다음 아래 표 9에 나타낸 조건에 따라 장내미생물의 변화를 측정하였다.
또, 처리군 사양시험 결과를 대조구와 비교하여 다음 표 10에 나타내었다.
대조군에서는 육성율이 96.9%이었으나, 본 발명의 박테리오신 함유 복합생균제를 투여한 처리군에서는 98.1% 육성율을 나타내었다. 생산성 비교에서는 무처리 대조군에 비하여 처리군에서 사료섭취량이 약간 늘었으나, 평균 체중 및 사료효율의 개선효과는 현저하게 높게 나타났다.
육계사양시험 결과, 대조군과 처리군간의 장내미생물변화는 다음의 표 11에 나타내었다.
일반적으로 맹장내의 장내미생물이 회장보다 더 많이 존재하고 있었으며, 대조군에 비해 박테리오신 생성균주 함유 생균제 처리군에서 유산균인 Lactobacillus와 Enterococcus의 생균수는 증가하였으며, 병원성 세균인 Salmonella와 E. coli 수가 대폭 감소하였다.
본 발명에 따른 박테리오신 함유 복합생균제는 병원성 세균에 대한 억제능력이 우수하고, 육계의 소화기관으로부터 분리되어 육계에의 적용시 장내 부착성, 정착성, 안전성 또한 우수할 것으로 기대된다. 따라서 본 발명의 복합생균제 조성물은 육계 사육에서 항생제 대체제로서 산업적으로 크게 활용될 것으로 기대되며, 나아가 우수한 항균작용으로 다른 가금류나 가축에서의 활용 또한 기대된다.
도 1은 엔테로코커스 패슘 SH 528(A), 엔테로코커스 패슘 SH 632(B), 그리고 페디오코커스 펜토사시우스 SH 740(C)의 현미경사진이다.
도 2는 SH 528 균주(lane 2-6), SH 632 균주(lane 7-11), 그리고 SH 740 균주(lane 12)에서 enterocin과 pediocin의 구조유전자를 탐색하기 위한 PCR 결과이다.
도 3은 내산성 실험결과이다.
도 4는 내담즙산성 실험결과이다.
Claims (5)
- 육계로부터 분리된, 엔테로코커스 패슘 SH 528 (Enterococcus faecium SH 528, KACC 91383P); 엔테로코커스 패슘 SH 632 (Enterococcus faecium SH 632, KACC 91382P); 및 페디오코커스 펜토사시우스 SH 740 (Pediococcus pentosaceus SH 740, KACC 91381P)을 포함하며, 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens)와 리스테리아속 미생물(Listeria sp.)에 대하여 항균력을 지닌 생균제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 균주들을 각각 1.0×106 ∼1.0×1010 cfu/g으로 포함하는 생균제 조성물.
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