ES2695149T3 - Cepas de Bacillus sensibles a antibióticos que tienen efecto antimicrobiano contra E. coli y Clostridium perfringens y que tienen alta capacidad de esporulación - Google Patents

Abstract

Cepa de Bacillus seleccionada del grupo que consiste en (a) la cepa de Bacillus mojavensis con número de registro DSM 25839; (b) las cepas de Bacillus amyloliquefaciens con número de registro DSM 25840, número de registro DSM 27032 o número de registro DSM 27033; y (c) la cepa de Bacillus subtilis con número de registro DSM 25841.

Description

DESCRIPCION

Cepas de Bacillus sensibles a antibioticos que tienen efecto antimicrobiano contra E. coli y Clostridium perfringens y que tienen alta capacidad de esporulacion

Campo de la invencion

Bacillus spp se usan para disoluciones probioticas en la industria de piensos y se conocen bien los efectos positivos de los probioticos basados en Bacillus en la produccion y la salud en animales de cna (Spiehs et al., 2008; Cutting, 2011). Su uso esta relacionado con la capacidad de Bacillus para reemplazar o reducir el uso de antibioticos, que se usan como estimuladores del crecimiento en la industria de piensos.

Sin embargo, hay una necesidad no satisfecha de cepas de Bacillus que no tengan resistencia a antibioticos contra antibioticos que se usan comunmente para seres humanos. La presente invencion proporciona cepas aisladas de Bacillus que se caracterizan por sensibilidad a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol y que tambien inhiben el crecimiento de patogenos principales tales como E. coli y Clostridium perfringens. Las cepas tienen ademas un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide en el dfa 2, lo que posibilita producir eficazmente esporas de Bacillus utiles y seguras para la produccion de piensos.

La invencion se refiere ademas al uso de las esporas de las cepas de Bacillus de la invencion para la produccion de aditivos de piensos, en particular productos para cerdos y aves, donde las cepas tienen un efecto probiotico (estimulacion del crecimiento, la utilizacion de piensos y la salud).

Antecedentes de la invencion

Los cerdos, especialmente los lechones, padecen diarrea del ganado, que puede producirse por bacterias tales como Escherichia coli (E. coli) y Clostridium perfringens tipos A y C (C. perfringens). La diarrea del ganado puede producir perdidas por fallecimiento y graves perdidas de produccion, incluyendo perdida de peso, si no se trata. E. coli es la causa principal de la diarrea en lechones y el 50-75% del antibiotico usado en granjas se usa contra diarrea en el destete, producida principalmente por E. coli. La diarrea es el mayor problema en animales en destete y en engorde (hasta 40 kg) y E. coli es el patogeno mas importante que produce diarrea (Klose et al., 2010).

Las infecciones clostridiales entericas en cerdos se producen predominantemente en el periodo antes del destete pero tambien estan asociadas con smdrome hemorragico intestinal que afecta a cerdos en el periodo de finalizacion. Aunque la inmunizacion contra C. perfringens tipo C ha reducido enormemente la mortalidad antes del destete, actualmente no se dispone de vacunas comerciales para C. perfringens tipo A. Las infecciones por C. perfringens tipo A se reconocen ahora con frecuencia creciente en cerdos antes del destete y los enfoques de diagnostico y profilaxis son tanto diferentes como mas complejos que los de las infecciones por tipo C.

Varias infecciones y enfermedades en aves estan producidas por bacterias patogenas, incluyendo E. coli y Clostridium perfringens. Las infecciones y enfermedades producidas por patogenos dan como resultado una mortalidad aumentada, rendimiento disminuido y costes de produccion aumentados. Ademas, muchos de estos patogenos pueden transmitirse a seres humanos. La colibacilosis aviar es una infeccion sistemica producida por E. coli y se produce con la mayor frecuencia en polluelos y pollos de engorde.

Los probioticos se usan en aplicaciones de salud animal con el fin de mantener una microflora intestinal sana, incluyendo una reduccion en las bacterias perjudiciales tales como Clostridia y E. coli y un aumento en las bacterias beneficiosas tales como Lactobacillus spp. y Bifidobacterium. Los probioticos son muy adecuados para mantener un equilibrio sano entre bacterias patogenas y beneficiosas, porque a diferencia de los antibioticos, no destruyen las bacterias indiscriminadamente ni conducen a cepas de bacterias patogenas resistentes a antibioticos. Hay muchos mecanismos mediante los cuales se cree que los probioticos mantienen una microflora intestinal sana: exclusion competitiva de bacterias patogenas, reduccion de bacterias patogenas a traves de produccion de sustancias antimicrobianas, potenciacion del crecimiento y viabilidad de la microflora intestinal beneficiosa, y estimulando una respuesta inmunitaria sistemica en el animal.

En vista de lo anterior, sena deseable tener una o mas cepas de Bacillus para tratar o prevenir enfermedades debido a infecciones con E. coli y/o Clostridium en cerdos y aves.

Guo et al., 2006, describen el examen de cepas de Bacillus como probioticos potenciales y una prueba de Bacillus subtilis MA139 en cerdos. Se recogieron 124 muestras de pollos de engorde, cerdos, suelos, alimentos fermentados y hierbas chinas. Se aislaron 750 cepas aerobias formadoras de esporas de estas muestras. Se sometio a prueba la actividad inhibidora contra E. coli K88 y K99, Salmonella y Staphilococcus aureus usando un ensayo de difusion en placa. Se sometieron a prueba 6 bacilos con mejor actividad para determinar su supervivencia dentro de las condiciones de GIT simulado (pH 2 y 0,3% de sales biliares). B. subtilis MA139 fue el mejor candidato y se sometio a prueba in vivo en lechones en un ensayo de alimentacion de 28 dfas con 90 lechones. Se mejoro la ADG y la utilizacion de pienso. Se aumentaron las bacterias del acido lactico, se disminuyo E. coli en las heces. Sin embargo, no se sometio a prueba la actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y la sensibilidad a antibioticos. Barbosa et al., 2005 describen el aislamiento de 237 Bacillus de heces de polios de engorde criados ecologicamente (en contacto con el suelo). Se caracterizaron 31 aislados. B. subtilis y B. licheniformis estaban entre ellos. Varias cepas de B. subtilis mostraron inhibicion a C. perfringens y S. aureus. B. licheniformis tambien mostro efecto contra C. perfringens. Sin embargo, ninguno de los aislados de Bacillus seleccionados mostro actividad antimicrobiana contra E. coli tal como se define en la presente solicitud. Un aislado de Bacillus mostro reduccion en la intensidad de crecimiento, pero ausencia de inhibicion completa contra la cepa de E. coli, O78:K80 y ningun efecto contra la otra cepa de E coli sometida a prueba (vease la tabla 5). No se proporcionan datos sobre el porcentaje de esporulacion despues de 2 dfas de incubacion ni sobre la sensibilidad a vancomicina, kanamicina, estreptomicina y clindamicina. Chaiyawan et al., 2010, dan a conocer una cepa de Bacillus sp. T3-1, que es sensible a antibioticos usados ampliamente en el tratamiento medico y que muestra actividad antimicrobiana contra C. perfringens ATCC 15191. La cepa no tiene actividad antimicrobiana contra E. coli O157. No se proporcionan datos sobre el porcentaje de esporulacion despues de 2 dfas de incubacion.

Benitez et al., 2011 han descrito recientemente que la presencia de E. coli intacto o inactivado potencio la smtesis de peptidos antimicrobianos por la cepa de Bacillus amyloliquefaciens, LBM 5006.

El documento US 7.754.469 se refiere a microorganismos y metodos para tratar aves y el documento US 8.021.654 se refiere a metodos de tratamiento de cerdos con cepas de Bacillus.

Sin embargo, en ninguno de estos artfculos o patentes hay alguna descripcion o sugerencia para seleccionar cepas de Bacillus que son sensibles a antibioticos que se usan comunmente para seres humanos, inhiben el crecimiento tanto de Clostridium perfringens como de E. coli y tienen un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide despues de 2 dfas de incubacion con el fin de hacer que la cepa sea util para esporulacion eficaz y por tanto para la produccion probiotica de Bacillus.

Ninguno de los documentos de la tecnica anterior, por ejemplo Barbosa et al., 2005, Chaiyawan et al., 2010, y Guo et al., 2006 da a conocer cepas que tienen sensibilidad a antibioticos que se usan comunmente para seres humanos, inhiben el crecimiento tanto de Clostridium perfringens como de E. coli, y tienen un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide despues de 2 dfas de incubacion.

En resumen, la tecnica anterior en relacion con el examen de cepas de Bacillus no proporciona las tres caractensticas distintivas de la presente invencion, es decir, sensibilidad a antibioticos que se usan comunmente para seres humanos, inhibicion del crecimiento de E. coli y Clostridium perfringens y un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide despues de 2 dfas de incubacion. La tecnica anterior tampoco proporciona cepas de Bacillus que cumplan estos tres criterios.

Sumario de la invencion

El problema que va a resolverse por la presente invencion es proporcionar una cepa de Bacillus, que se caracteriza por sensibilidad a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol; inhibicion del crecimiento de E. coli y Clostridium perfringens; y un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide en el dfa 2.

La solucion se basa en un metodo de seleccion desarrollado por los presentes inventores para la identificacion de cepas de Bacillus mejoradas que tienen estas propiedades mejoradas.

Una primera etapa esencial del metodo de seleccion es examinar espedficamente las cepas de Bacillus que son sensibles a los antibioticos que se usan comunmente para seres humanos. Mas espedficamente, las cepas se examinan para determinar la sensibilidad a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol.

Ademas, las cepas se examinan para determinar la actividad antimicrobiana contra E. coli y Clostridium perfringens y para tener un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide en el dfa 2.

De los 261 aislados de fuentes de suelo y heces y alimentos investigados por los presentes inventores, 161 aislados eran resistentes a antibioticos en la prueba de pre-examen descrita en los ejemplos. De los 100 aislados que eran sensibles a antibioticos, 56 teman efecto antimicrobiano contra Clostridium perfringens y solo 22 teman efecto tanto contra E. coli como contra Clostridium perfringens. De ellos, 12 aislados eran de la especie B. amyloliquefaciens. Otras cepas representativas eran de las especies B. subtilis y B. mojavensis. Las tablas 2 y 3 resumen los resultados de cepas propiedad de Chr. Hansen (22 de las 32 cepas seleccionadas para el examen secundario). El procedimiento de seleccion se centro en (i) seguridad, (ii) efecto y (iii) alta esporulacion en medios adecuados para la produccion. El aspecto de la seguridad se basa principalmente en la ausencia de resistencia a antibioticos, lo que es importante debido a los casos aumentados de bacterias resistentes en seres humanos. Estas bacterias han dado como resultado enfermedades bien conocidas que ya no pueden tratarse con antibioticos ya que las bacterias patogenas se han vuelto resistentes.

Se sabe bien que Bacillus puede producir sustancias que pueden tener actividad antimicrobiana, es decir, bacteriocinas, enzimas bacterioltticas o surfactinas. El segundo criterio de seleccion, el efecto contra E. coli y Clostridium perfringens, es importante ya que ambos patogenos son causas principales para diarrea en cerdos y aves. El efecto se somete a prueba contra tres cepas de E. coli y contra Clostridium perfringens tipo A, pero se contempla que los resultados sean indicativos de un efecto general contra E. coli y de un efecto tambien contra otros tipos de clostridios tales como Clostridium perfringens tipo C.

El tercer criterio de seleccion es importante para la produccion del probiotico. El procedimiento de produccion tiene lugar en fermentadores donde crecen los Bacillus y al final del procedimiento es necesaria una alta tasa de esporulacion para una alta eficacia de produccion. El proceso de esporulacion de Bacillus se ha investigado durante muchos anos pero todavfa hay muchas incognitas. Por tanto, se conoce bien entre los expertos en la tecnica que trabajan con el desarrollo de produccion y procedimiento de Bacillus que algunas cepas de Bacillus tienen una tasa de esporulacion muy baja. Se ha sugerido que Bacillus se diferencia para dar subpoblaciones de celulas especializadas como comunidades que esporulan, comunidades que producen enzimas para la degradacion de nutrientes complejos y comunidades que mueren (Lopez y Kolter, 2010). Esta diferenciacion parece estar regulada por senales extracelulares, la mayona de ellas producidas por el propio Bacillus. Por tanto, se ha lanzado la hipotesis de que una alta produccion de enzimas o sustancias antimicrobianas pueda dar como resultado una baja eficacia de esporulacion. Por tanto, para el experto habitual en la tecnica es inusual y sorprendente que una cepa de Bacillus tenga tanto actividad antimicrobiana como un alto porcentaje de esporulacion.

Figuras

La figura 1 muestra esquematicamente la actividad antimicrobiana de 261 cepas de Bacilli. Es sorprendente que muchas cepas de Bacillus amyloliquefaciens tienen efecto antimicrobiano.

Descripcion detallada de la invencion

La retirada progresiva de promotores del crecimiento antibioticos en la Union Europea en 2006 ha dado como resultado una necesidad creciente de aditivos de piensos rentables con alta eficacia y por tanto la necesidad de nuevos probioticos. Los aditivos de piensos probioticos basados en Bacillus se conocen por sus efectos positivos sobre la salud y la produccion en cerdos y aves. Estos productos son relevantes para la industria alimentaria porque las esporas son termoestables y pueden sobrevivir al procedimiento de granulacion a temperaturas de hasta 90-95°C.

Es necesario que los probioticos para cerdos sean seguros para los animales, los seres humanos y el entorno y deben aumentar el crecimiento y la utilizacion de pienso en el animal. El objetivo de la presente invencion era examinar en tres etapas una amplia variedad de bacterias aerobias formadoras de endoesporas (AEB) procedentes de diferentes fuentes para determinar su efecto probiotico en cerdos. Las AEB se aislaron de alimentos fermentados (entrantes Kantong y Gergoush), heces de cerdo, suelo y diferentes extracciones de cultivo. Se identificaron 261 aislados de AEB secuenciando genes de ADNr 16S, y se investigaron para determinar la resistencia a antibioticos relevante mediante la determinacion de la concentracion inhibidora minima (MIC) de varios antibioticos relevantes. Los analisis adicionales incluyeron tolerancia a bilis y acido, inhibicion de patogenos, crecimiento en diferentes medios, esporulacion asf como interacciones con lmeas celulares animales para evaluar la probabilidad de efectos positivos positive sobre uniones estrechas en el sistema intestinal. Los resultados muestran una alta diferencia tanto entre especies como entre cepas. Las especies aisladas fueron principalmente del genero Bacillus incluyendo B. amyloliquefaciens, B. subtilis y B. safensis de fuentes de alimentos, B. subtilis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. megaterium de heces y B. licheniformis y B. simplex del suelo.

Muchos de los aislados mostraron resistencia a antibioticos indeseable por encima de los valores cnticos definidos por EFSA y se desecharon debido a problemas de seguridad. Se observo un buen crecimiento para la mayona de las cepas cuando se hicieron crecer durante la noche en caldo de infusion de ternera, mientras que el 16% tuvo un crecimiento insatisfactorio en un medio adecuado para la fermentacion. En la etapa 2 del procedimiento de examen, se identificaron 32 cepas seleccionadas sin resistencia a antibioticos secuenciando el gen de gyrB, y la obtencion de huellas mediante PFGe . Ademas, se sometio a prueba su efecto antimicrobiano sobre patogenos seleccionados y se observo una variacion considerable entre aislados. Varios de los aislados mostraron inhibicion de Clostridium perfringens, mientras que solo algunos aislados inhibieron E. coli. Los resultados de la presente invencion confirman por tanto que la inhibicion del crecimiento tanto de Clostridium perfringens como de E. coli solo se combinan en casos poco frecuentes. La etapa 3 del procedimiento de examen implico 10 cepas con alta inhibicion de patogenos e incluyo la determinacion de la termoestabilidad de las esporas, la secuenciacion del genoma y estudios in vitro adicionales que mostraron su efecto sobre las uniones estrechas.

La presente invencion proporciona cepas de Bacillus caracterizadas por (i) sensibilidad a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol.

Mediante el termino “sensibilidad a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol” quiere decirse que una cepa, que va a considerarse sensible a un antibiotico particular, no debe crecer al nivel de valor cntico facilitado por EFSA (EFSA, 2008) explicado resumidamente en la tabla 1.

Los valores de MIC explicados resumidamente en la tabla 1 se basan en las directrices publicadas por EFSA (Technical guidance prepared by the Panel on Additives and Products or Sustances used in Animal Feed (FEEDAP) on the update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human and veterinary importance. The EFSA Journal (2008) 732, 1-15), que proporciona una lista de antibioticos y valores de puntos de corte aceptables para el genero Bacillus. EFSA no facilita ningun valor critico para ampicilina para Bacillus, sin embargo, existe un valor critico para otras diversas bacterias, es decir, Lactobacillus spp. Por tanto, esta sensibilidad de cepas de Bacillus contra ampicilina se ha elegido como valor critico para la presente invencion.

Tabla 1. Valores cnticos de EFSA para diversos antibioticos usados comunmente para seres humanos

Tipo de antibiotico Antibiotico Valor critico de EFSA, mg/l

B-lactamico Ampicilina 4

Glucopeptfdico Vancomicina 4

Gentamicina 4

Aminoglucosido Kanamicina 8

Estreptomicina 8

Macrolido Eritromicina 4

Lincosamida Clindamicina 4

Tetraciclina Tetraciclina 8

Cloramfenicol Cloramfenicol 8

Para que este dentro del alcance de la presente invencion la cepa tiene que ser sensible a todos los antibioticos anteriores. En la practica, esto significa que no se observe crecimiento de la cepa en el nivel de valor cntico cuando se somete a prueba mediante un metodo de microdilucion (concentracion inhibidora minima (MIC)).

Segun la presente invencion, la MIC se mide mediante un metodo de microdilucion en caldo tal como se explica resumidamente por la norma de CLSI (Instituto de normas clmicas y de laboratorio, M07-A8 y M45-A2) realizado tal como sigue:

Se inocula una suspension de un crecimiento durante la noche de la cepa que va a someterse a prueba en caldo ISO-SENSITEST (Oxoid CM0473) en placas de microtitulacion a una concentracion aproximada de 105ufc/ml (unidades formadoras de colonias/ml) en diluciones en serie dos veces del antibiotico que va a someterse a prueba (volumen total 100 jul/pociilo) y se incuba de manera aerobia durante 20-24 horas a 37°C. Pueden usarse los paneles prefabricados VetMIC Lact-1 & Lact-2 que comprenden los antibioticos ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol. Se registran los resultados tras 24 horas como la concentracion mas baja del antibiotico que inhibe el crecimiento visible.

La primera parte del aspecto (ii) de la invencion se refiere a una cepa de Bacillus que presenta actividad antimicrobiana contra E. coli. Segun la presente invencion, esta se mide mediante la prueba de manchas en agar de E. coli realizada tal como sigue:

Se inoculan 9 ml de caldo de infusion de ternera (VIB) con el cultivo de Bacillus que va a someterse a prueba y se incuban a 37°C y 175 rpm durante la noche. Simultaneamente, se inoculan 9 ml de caldo de infusion de cerebrocorazon (BHI) con una cepa de E. coli seleccionada de E. coli O149 (O149:k91,k88a), E. coli O147 (O147:K89 F4), y E. coli o 101 (O101, F5) y se incuban durante la noche a 37°C.

Se anaden cultivos de E. coli incubados durante la noche en un volumen de 2 ml cada uno en 200 ml de agar VIB lfquido a 50°C, y se vierten en cada placa de bioensayo. Las placas se secan en una mesa de laboratorio esteril. El cultivo de Bacillus incubado durante la noche que va a someterse a prueba se dispone en manchas sobre la superficie del agar VIB mezclado con E. coli y se incuba a 37°C durante 2 dfas. Se registran los radios de las zonas de inhibicion alrededor de las manchas y los diametros de las manchas.

Se considera que una cepa de Bacillus presenta actividad antimicrobiana hacia E. coli si la zona de inhibicion es de al menos 1,5 mm. Preferiblemente, la zona de inhibicion es de al menos 2,0 mm, tal como al menos 2,5 mm, mas preferiblemente al menos 3 mm, lo mas preferiblemente al menos 3,5 mm e incluso mas preferiblemente al menos 4 mm. La zona de inhibicion puede ser diferente para las diversas cepas de E. coli. Para que se considere que una cepa presenta actividad antimicrobiana contra E. coli segun la presente invencion debe presentar una zona de inhibicion de al menos 1,5 mm para todas las cepas de E. coli sometidas a prueba. Preferiblemente, la zona de inhibicion de dos o incluso mas, preferiblemente la zona de inhibicion de las tres cepas de E. es de al menos 2 mm. Una cepa de Bacillus de la invencion se caracteriza por inhibicion del crecimiento de E. coli, en particular inhibicion del crecimiento de las especies sometidas a prueba. Tal como se pone de manifiesto por la tecnica anterior y se confirma por los presentes inventores, la ausencia de inhibicion del crecimiento de una especie de E. coli a menudo se combina con ausencia de inhibicion del crecimiento de otra especie de E. coli (tabla 5, Barbosa et al., 2005) y viceversa, es decir, la actividad inhibidora de una especie de E. coli a menudo se combina con la actividad inhibidora de otra especie de E. coli (tabla 1, Guo et al., 2006).

La segunda parte del aspecto (ii) de la invencion se refiere a una cepa de Bacillus que presenta actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens. Segun la presente invencion, esta se mide mediante la prueba de manchas en agar de Clostridium perfringens realizada tal como sigue:

Se inoculan 9 ml de VIB con el cultivo de Bacillus que va a someterse a prueba y se incuba a 37°C y 175 rpm durante la noche. Simultaneamente, se inoculan 9 ml de caldo BHI con Clostridium perfringens Tipo A, DSM 756, y se incuba durante la noche a 37°C en un frasco anaerobio.

Los cultivos de Bacillus se disponen en manchas sobre la superficie del agar VIB en placas de Petri y se incuban a 37°C durante la noche. Un cultivo de C. perfringens incubado durante la noche en un volumen de 2 ml se mezcla con 200 ml de agar BHI lfquido, y se vierte sobre agar VIB con manchas de Bacillus cultivados. Se incuban las placas anaerobicamente a 37°C durante 1 dfa. Se miden los radios de las zonas de inhibicion clarificadas alrededor de las manchas.

Se considera que una cepa de Bacillus presenta actividad antimicrobiana hacia Clostridium perfringens si la zona de inhibicion es de al menos 5 mm. Preferiblemente, la zona de inhibicion es de al menos 6 mm, mas preferiblemente al menos 7 mm. Una cepa de Bacillus de la invencion se caracteriza por inhibicion del crecimiento de Clostridium perfringens, en particular inhibicion del crecimiento de las especies sometidas a prueba. Tal como conoce el experto en la tecnica, la ausencia de inhibicion del crecimiento de una especie a menudo se combina con ausencia de inhibicion del crecimiento de otras especies de Clostridium perfringens y viceversa, es decir la inhibicion del crecimiento de una especie de Clostridium perfringens a menudo se combina con la inhibicion del crecimiento de otras especies de Clostridium perfringens.

Las celulas de Bacillus existen como celulas de esporas de Bacillus y celulas vegetativas de Bacillus. Cuando se hace referencia en el presente documento a celulas de Bacillus, se refiere a ambas.

El termino “espora de Bacillus" en relacion una celula de espora de Bacillus se refiere en el presente documento a una espora que segun la tecnica puede caracterizarse como una estructura latente, resistente, no reproductiva producida por las bacterias de Bacillus. La principal funcion de las esporas generalmente es garantizar la supervivencia de una bacteria a traves de periodos de estres medioambiental. Por tanto, son resistentes a la radiacion ultravioleta y gamma, la desecacion, las lisozimas, la temperatura, inanicion y desinfectantes qmmicos. Las esporas se encuentran comunmente en el suelo y el y agua, donde pueden sobrevivir durante periodos de tiempo prolongados. La cubierta de la espora es impermeable a muchas moleculas toxicas y tambien puede contener enzimas que estan implicadas en la germinacion. El nucleo tiene estructuras celulares normales, tales como ADN y ribosomas, pero es metabolicamente inactivo. Cuando una bacteria detecta que las condiciones medioambientales estan volviendose desfavorables, puede comenzar el proceso de esporulacion, que dura aproximadamente ocho horas.

El termino “celula vegetativa de Bacillus" se refiere a celulas de Bacillus vegetativas funcionales, que pueden dividirse para producir mas celulas vegetativas.

En el aspecto (iii), la invencion se refiere a una cepa de Bacillus que presenta un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide en el dfa 2. Segun la presente invencion, el porcentaje de esporulacion se somete a ensayo tal como sigue:

Se anade una cepa de Bacillus que va a someterse a prueba en un volumen de 50 |il a 700 |il de VIB en una placa de pocillos profundos (DW) y se incuba a 37°C y 175 rpm durante la noche. Se transfiere el cultivo de Bacillus incubado durante la noche en un volumen de 50 |il a 700 |il de un medio de esporulacion que comprende (p/p) el 95% de agua; el 1,5% de fuente de nitrogeno (es decir, levadura); el 3% de sacarosa; el 0,06% de microminerales; hidrogenofosfato de dipotasio al 0,1% en placas DW. La placa se incuba a 37°C y 175 rpm durante 3 dfas.

Se realiza un seguimiento de la esporulacion microscopicamente y se determina el porcentaje de esporas (numero de esporas en comparacion con el numero total de celulas de Bacillus) mediante evaluacion visual despues de 1 dfa (24 horas), 2 dfas (48 horas) y 3 dfas (72 horas) de incubacion. Mediante el termino “que tiene un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide en el dfa 2” quiere decirse que al menos el 80% de las celulas han esporulado despues de 2 dfas de incubacion. El porcentaje de esporulacion puede ser preferiblemente mayor, tal como al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99%. Un objeto importante de la presente invencion es seleccionar cepas de Bacillus que tienen celulas con un alto porcentaje de esporulacion con el fin de hacer que la cepa sea util para la produccion de pienso. Es necesario un alto porcentaje de esporulacion, que tambien puede denominarse alta tasa de esporulacion, para obtener una alta eficacia de produccion tal como se describio anteriormente.

Tal como se describio anteriormente, la tecnica anterior ha descrito metodos para seleccionar cepas de Bacillus, pero los metodos de examen de la tecnica anterior no se han centrado en el porcentaje de esporulacion. Por consiguiente, no es probable que las cepas de Bacillus seleccionadas de la tecnica anterior esporulen en un grado suficiente como para cumplir con el porcentaje de esporulacion tal como se describe en el presente documento.

Se han seleccionado y depositado tres cepas que tienen la capacidad combinada de altas propiedades de crecimiento y esporulacion, sin resistencia a antibioticos y alta actividad antimicrobiana. Pero tambien otras cepas, en particular cepas de la especie Bacillus amyloliquefaciens (vease las cepas D-J en las tablas 2 y 3) cumplen los criterios explicados resumidamente en las reivindicaciones y por tanto se incluyen dentro del alcance de la presente invencion.

Tal como resulta evidente a partir de la figura 1, en particular muchas cepas de la especie Bacillus amyloliquefaciens estan dentro del alcance de la presente invencion. Es sorprendente que muchas cepas de Bacillus amyloliquefaciens tienen un efecto antimicrobiano, ya que hasta la fecha se ha supuesto que el efecto antimicrobiano del genero Bacillus es espedfico de cepa y no esta relacionado con la especie.

Basandose en las descripciones de ensayo detalladas, el experto habitual en la tecnica puede repetir estos ensayos para determinar si una cepa espedfica de Bacillus cumple con la sensibilidad del punto (i), la actividad antimicrobiana del punto (ii) y el porcentaje de esporulacion del punto (iii) de los diversos aspectos de la invencion. De este modo, el experto habitual en la tecnica podra producir de manera sistematica cepas con las propiedades establecidas. Preferiblemente, el metodo de seleccion tambien incluira (iv) someter a ensayo para determinar la sensibilidad de las celulas vegetativas a pH 4, y (v) someter a ensayo para determinar la resistencia a la bilis para garantizar que las cepas pueden sobrevivir en un grado suficiente en el tracto gastrointestinal. Evidentemente, estos ensayos pueden realizarse en cualquier orden y algunas cepas pueden excluirse durante el procedimiento si no cumplen los criterios.

Se conoce a partir de la bibliograffa que la bilis tiene algunas influencias negativas en la supervivencia y la germinacion y el crecimiento de celulas de espora a celulas vegetativas de Bacillus en el GIT de los animales.

Por tanto, las bacterias probioticas generalmente podran sobrevivir y proliferar en el intestino de los animales al poder tolerar un pH bajo y resistir la sal biliar con el fin de ser utiles como composiciones probioticas de Bacillus para la adicion a pienso. Los ejemplos proporcionan pruebas utiles in vitro a este respecto. La prueba para determinar la sensibilidad a pH bajo (simulando las condiciones gastricas) se centran en la resistencia de las celulas vegetativas a pH 4. Se conoce bien que las esporas son resistentes a valores de pH de 2-3 y que las celulas vegetativas moriran a pH 2. Sin embargo, el pH gastrico puede tener valores de pH de hasta 4, especialmente en condiciones de alimentacion. Esto puede dar como resultado germinacion de las esporas y por tanto es relevante someter a prueba la sensibilidad de las celulas vegetativas a pH 4. Las cepas seleccionadas deben ser resistentes preferiblemente a pH 4. Los resultados para las cepas seleccionadas se presentan en la tabla 2.

El genero Bacillus comprende la especie Bacillus amyloliquefaciens, tal como Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens o Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum, Bacillus simplex, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Bacillus atrophaeus, Bacillus metilotrophicus, Bacillus siamensis, Bacillus vallismortis o Bacillus tequilensis.

El metodo inicial de identificacion de las 261 cepas se baso en 16S. Este metodo no puede distinguir entre algunas especies estrechamente relacionadas de Bacillus. Por tanto, una cepa puede identificarse como relacionada con el grupo que consiste en las especies Bacillus amyloliquefaciens/atrophaeus/metilotrophicus/siamensis/vallismortis o el grupo que consiste en las especies Bacillus mojavensis/subtilis/tequilensis. Ambos grupos contienen muchas cepas que cumplen los criterios de la invencion y estos grupos representan por tanto realizaciones importantes de la invencion.

Cuando se considero apropiado, las cepas se identificaron adicionalmente mediante un metodo mas detallado (gyr B)).Los datos mostrados en las tablas 2 y 3 se basan principalmente en Bacillus amyloliquefaciens (identificado mediante gyr B). Los aislados seleccionados de Bacillus amyloliquefaciens se identificaron adicionalmente mediante el analisis de secuencia genica mediante la subunidad beta de la ARN polimerasa (rpo B) y las subespecies se identifican y se presentan en las tablas 4, 5 y 6.

Es deseable que la cepa presente termoestabilidad. Los resultados para las cepas seleccionadas se presentan en la tabla 4. La termoestabilidad a 99,5°C se mide en ufc como reduccion despues de 2, 5 y 10 min en relacion con el tiempo 0 (log/log). Una reduccion por debajo de 2 se logra con formulaciones de esporas de Bacillus comerciales comunes. Para las cepas dentro del alcance de la presente invencion, la reduccion debe ser preferiblemente de 0,5 o menos tras 2 min, mas preferiblemente de 0,25 o menos, lo mas preferiblemente de 0,05 o menos. En realizaciones preferidas, la reduccion despues de 5 min debe ser preferiblemente de 2,5 o menos, mas preferiblemente de 1 o menos, lo mas preferiblemente de 0,5 o menos y despues de 10 min, la reduccion tambien debe ser preferiblemente de 2,5 o menos, mas preferiblemente de 1 o menos, lo mas preferiblemente de 0,5 o menos. Todas las cepas en la tabla presentan una termoestabilidad apropiada. Tal como resulta evidente a partir de la tabla, las cepas B, D y F tienen una termoestabilidad muy alta incluso despues de 10 min. Es significativo que tanto B como F son cepas de Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens lo que hace que esta subespecie sea una realizacion preferida de la presente invencion.

En el ejemplo 4 se ha investigado la produccion de enzimas. Los presentes hallazgos muestran, para todas las cepas investigadas, una actividad celulasa de 50 mU/ml o mas. Se contempla que una actividad de este tipo sera una propiedad beneficiosa para una cepa de Bacillus de la invencion. Para una realizacion determinada puede preferirse que la cepa tenga una actividad celulasa incluso mayor, tal como 100 mU/ml o mas, tal como se encuentra para las cepas de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum lo que hace que esta subespecie sea una realizacion preferida de la presente invencion. Para las cepas dentro del alcance de la presente invencion, la actividad celulasa debe ser preferiblemente de 50 mU/ml o mas, mas preferiblemente de 100 mU/ml o mas, lo mas preferiblemente de 250 mU/ml o mas, incluso mas preferiblemente de 400 mU/ml o mas.

Algunas cepas muestran una alta actividad xilanasa de 70 mU/ml o mas. La tabla 5 muestra que para las cepas investigadas, la alta actividad celulasa no se combina necesariamente con alta actividad xilanasa o alta actividad proteasa definida como 40000 RFU/DO o mas. Las cepas G, I y J que son todas ellas B. amyloliquefaciens subsp. plantarum son ejemplos de cepas que demuestran alta actividad para las tres enzimas.

Una cepa de Bacillus de la invencion se selecciona del grupo que consiste en (a) la cepa de Bacillus mojavensis con numero de registro DSM 25839; (b) las cepas de Bacillus amyloliquefaciens con numero de registro DSM 25840, numero de registro DSM 27032 o numero de registro DSM 27033, y (c) la cepa de Bacillus subtilis con numero de registro DSM 25841.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para obtener una cepa mutante de

(a) la cepa de Bacillus mojavensis con numero de registro DSM 25839;

(b) las cepas de Bacillus amyloliquefaciens con numero de registro DSM 25840, numero de registro DSM 27032 o numero de registro DSM 27033; o

(c) la cepa de Bacillus subtilis con numero de registro DSM 25841;

comprendiendo el metodo someter opcionalmente la cepa de (a), (b) o (c) a tratamiento de mutagenizacion y seleccionar las cepas mutantes de (a), (b) o (c) que tienen las propiedades siguientes

(i) : sensibilidad a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol;

(ii) inhibicion del crecimiento de E. coli y Clostridium perfringens, y

(iii) un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide en el dfa 2.

La cepa puede someterse a un tratamiento de mutagenizacion tal como se describe en mayor detalle a continuacion para obtener cepas mutantes y despues se realiza un procedimiento de seleccion. Alternativamente, se realiza una seleccion para mutantes que se produzcan espontaneamente.

El metodo para obtener una cepa mutante tambien puede incluir (iv) someter a ensayo para determinar la sensibilidad de las celulas vegetativas a pH 4, y (v) someter a ensayo para determinar la resistencia a la bilis para garantizar que las cepas pueden sobrevivir en un grado suficiente en el tracto gastrointestinal. Evidentemente, estos ensayos pueden realizarse en cualquier orden y algunas cepas pueden excluirse durante el procedimiento si no cumplen los criterios.

Una “cepa” bacteriana, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una bacteria que permanece sin cambiar geneticamente cuando crece o se multiplica. Se incluye la multiplicidad de bacterias identicas.

“Cepa de tipo silvestre” se refiere a la forma no mutada de una bacteria, tal como se encuentra en la naturaleza. Una “bacteria mutante” o una “cepa mutante” se refiere a una bacteria mutante natural (que se produce de manera espontanea o natural) o una bacteria mutante inducida que comprende una o mas mutaciones en su genoma (ADN) que estan ausentes en el ADN de tipo silvestre. Un “mutante inducido” es una bacteria donde la mutacion se indujo mediante tratamiento humano, tal como tratamiento con cualquier tratamiento de mutagenizacion usado convencionalmente incluyendo tratamiento con mutagenos qmmicos, tal como un mutageno qmmico seleccionado de (i) un mutageno que se asocia con o que llega a incorporarse en el ADN tal como un analogo de base, por ejemplo, 2-aminopurina o un agente interquelante tal como ICR-191, (ii) un mutageno que reacciona con el ADN incluyendo agentes alquilantes tales como nitrosoguanidina o hidroxilamina, o metilsulfonato de etano (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), radiacion UV o gamma, etc. En contraposicion, un “mutante espontaneo” o “mutante que se produce de manera natural” no se ha mutagenizado por el hombre.

Un mutante puede haberse sometido a varios tratamientos de mutagenizacion (un tratamiento individual debe entenderse como una etapa de mutagenizacion seguida por una etapa de examen/seleccion), pero se prefiere actualmente que no se lleven a cabo mas de 20, o no mas de 10, o no mas de 5, tratamientos (o etapas de examen/seleccion). En un mutante preferido actualmente, menos del 1%, menos del 0,1, menos del 0,01, menos del 0,001% o incluso menos del 0,0001% de los nucleotidos en el genoma bacteriano se han reemplazado por otro nucleotido, o se han delecionado, en comparacion con la cepa madre.

Las bacterias mutantes, tal como se describio anteriormente, no son OMG, es dedr, no estan modificadas por tecnolog^a de ADN recombinante. Como alternativa al metodo preferido anterior de proporcionar el mutante mediante mutagenesis al azar, tambien es posible proporcionar un mutante de este tipo mediante mutagenesis dirigida al sitio, por ejemplo, usando tecnicas de PCR disenadas de manera apropiada o usando un transposon que puede integrarse en los replicones bacterianos.

Cuando el mutante se proporciona como un mutante que se produce espontaneamente, la cepa de tipo silvestre anterior se somete a la etapa de seleccion sin ningun tratamiento de mutagenizacion anterior.

Varias especies de Bacillus tienen estado GRAS, es decir, se reconocen generalmente como seguras. Todas las cepas de B. subtilis son GRAS. Las cepas de Bacillus descritas en el presente documento son aerobias y formadoras de esporas facultativas. Las especies de Bacillus son las unicas formadoras de esporas que se consideran GRAS. Alimentar con microorganismos que tienen estado GRAS al ganado es una practica aceptable entre productores, veterinarios y otros en la industria del ganado.

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion de Bacillus que comprende celulas de una cepa de Bacillus de la invencion. La composicion puede comprender celulas de al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o incluso mas cepas de Bacillus elegidas de al menos una de las cepas de la invencion. Preferiblemente, las celulas de la composicion de Bacillus son celulas de esporas.

Las cepas de Bacillus relevantes de la composicion pueden estar presentes en una forma comercialmente relevante conocida por el experto. Por consiguiente, en una realizacion, las cepas de Bacillus de la composicion estan presentes como celulas secas (por ejemplo, secadas por pulverizacion) o como celulas congeladas. La composicion puede proporcionarse en cualquier forma adecuada tal como en la forma de un lfquido, una suspension, un polvo o un granulo.

En una realizacion preferida, la composicion de Bacillus comprende desde 105 hasta 1012 UFC/g, mas preferiblemente desde 106 hasta 1012 UFC/g, y lo mas preferiblemente desde 107 hasta 1012 UFC/g.

El termino “UFC/g” se refiere al peso en gramos de la composicion como tal, incluyendo aditivos relevantes adecuados presentes en la composicion. Tal como conoce el experto, una composicion bacteriana comercialmente relevante generalmente tambien comprende otros aditivos relevantes tales como por ejemplo un portador/componente del grupo que pertenece al suero de la leche, permeado de suero de la leche, carbonato de calcio/caliza y agentes antiapelmazantes tales como silicatos de aluminio y kieselgur (tierra de diatomeas). No incluye el peso de un recipiente adecuado usado para envasar la composicion de Bacillus. Una realizacion se refiere a una composicion envasada en un recipiente adecuado.

Las composiciones de la presente invencion pueden incluir una cepa de Bacillus de la invencion y portadores que hacen que esas composiciones sean adecuadas para alimentar a animales como aditivo de piensos o como aditivo para agua potable. Alternativamente, la cepa de Bacillus de la invencion puede formularse con componentes de pienso, incluyendo protema de pienso y/o hidratos de carbono de pienso. Tales combinaciones pueden estar en forma de granulos que se extruyen a traves de procedimientos de granulacion convencionales.

La composicion de Bacillus tal como se describe en el presente documento puede usarse como aditivo probiotico para pienso. La invencion tambien proporciona un metodo para producir un pienso o premezcla que comprende anadir una composicion de Bacillus de la invencion a un pienso.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “premezcla” se refiere a una cepa de Bacillus anadida a un portador para obtener una premezcla que entonces se anade al pienso a una tasa de inclusion deseada y se alimenta al animal.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para alimentar a un animal que comprende administrar una composicion de Bacillus de la invencion o un pienso o premezcla producido segun la invencion a un animal.

El ejemplo 5 describe ensayos de alimentacion con cepas B y C y muestra que ambos productos probioticos de cepas de Bacillus complementados a dietas para recien nacidos mejoraron numericamente el rendimiento productivo en comparacion con un grupo de control negativo. Pudo observarse un efecto significativo sobre los parametros de produccion durante el ensayo. El porcentaje de mortalidad se redujo en ambos grupos de Bacillus y en ambos ensayos.

En uno de los centros, el numero de animales tratados por pocilga con enrofluxacina para superar diarrea grave fue significativamente mayor (P>0,05) en los animales alimentados con la dieta de control que en los alimentados con Bacillus.

Por tanto, este ejemplo demuestra que la administracion de la composicion de Bacillus de la invencion puede usarse para tratar y prevenir enfermedades, por ejemplo, inhibiendo patogenos, tales como E. coli y Clostridium, en el animal. La composicion de Bacillus puede alimentarse como agente microbiano de alimentacion directa o como aditivo de pienso para el pienso. Las composiciones de la presente invencion se administran o se alimentan a un animal en una cantidad eficaz para disminuir el crecimiento de bacterias patogenas tales como Clostridia y Escherichia coli en el intestino del animal.

El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en aves, rumiantes, terneros, cerdos, conejos, caballos, pescado y mascotas. En una realizacion preferida, el animal es un animal de granja, que se cna para el consumo, tal como cerdos, o como productores de alimentos, tales como pollos de engorde y gallinas ponedoras de huevos. Tambien se proporcionan metodos de administrar una o mas cepas de Bacillus de la invencion a un lechon. Tales metodos pueden incluir alimentar una o mas cepas de Bacillus de la invencion a una madre de un lechon. La(s) cepa(s) puede(n) alimentarse durante la gestacion, la lactancia o ambas. La una o mas cepas de Bacillus tambien puede alimentarse a cerdos destetados y a cerdos en crecimiento-finalizacion.

Ha de considerarse que el uso de los terminos “un” y “una” y “el/la” y referentes similares en el contexto de describir la invencion (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Los terminos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” han de considerarse como terminos abiertos (es decir, que significan “que incluyen, pero sin limitarse a,”) a menos que se senale de otro modo. La mencion de intervalos de valores en el presente documento pretende unicamente servir como metodo resumido para referirse individualmente a cada valor individual que entra dentro del intervalo, a menos que se indique de otro modo en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los metodos descritos en el presente documento pueden llevarse a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente de otro modo por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) provisto en el presente documento, pretende unicamente aclarar mejor la invencion y no supone una limitacion sobre el alcance de la invencion a menos que se reivindique de otro modo. Nada del lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativo de cualquier elemento no reivindicado como esencial para la practica de la invencion.

Cepas depositadas

La cepa de Bacillus mojavensis CHCC 15510 se ha depositado en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) con el numero de registro DSM 25839 con una fecha de deposito de 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El deposito se ha realizado en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.

La cepa de Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 se ha depositado en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) con el numero de registro DSM 25840 con una fecha de deposito de 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El deposito se ha realizado en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.

La cepa de Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15536 se ha depositado en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) con el numero de registro DSM 27032 con una fecha de deposito de 21 de marzo de 2013 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El deposito se ha realizado en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.

La cepa de Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15539 se ha depositado en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) con el numero de registro DSM 27033 con una fecha de deposito de 21 de marzo de 2013 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El deposito se ha realizado en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.

La cepa de Bacillus subtilis CHCC 15541 se ha depositado en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) con el numero de registro DSM 25841 con una fecha de deposito de 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El deposito se ha realizado en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.

Para todos los microorganismos depositados identificados anteriormente, se aplican las siguientes indicaciones adicionales:

En lo que se refiere a las oficinas de patente respectivas de los estados designados respectivos, los solicitantes piden que una muestra del microorganismo depositado indicado anteriormente solo este disponible para un experto nombrado por el peticionario hasta la fecha en que la patente se conceda o la fecha en que la solicitud se rechace o se retire o se considere que ha de retirarse.

A continuacion se describen realizaciones de la presente invencion, a modo de ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Materiales:

Caldo de infusion de ternera (VIB) (Difco, 234420)

Agar de caldo de infusion de ternera (VIB) (VIB 1,5% de agar bacteriologico (Agar n.° 1), Oxoid LP0011)

Placas de agar T3 (por litro: 3 g de triptona, 2 g de triptosa, 1,5 g de extracto de levadura, hidrogenofosfato de sodio 0,05 M y 0,005 g de MnCh [pH 6,8], y 15 g de agar)

Caldo Laura-Bertani (LB) (g/l: triptona Bacto 10 (Difco 0123), extracto de levadura 5 (Oxoid L21), NaCl 10 (Merck n.° 106404))

Caldo de infusion de cerebro-corazon (BHI) (Oxoid CM225)

Agar de infusion de cerebro-corazon (BHI) (Oxoid CM375)

Sales biliares (extracto biliar, porcino; Sigma B8631)

Placas de bioensayo (Nunc 240845)

Placas de Petri (Procudan 140096, placa de Petri con estnas)

Medio de esporulacion: %(p/p) 95% de agua; 1,5% de fuente de nitrogeno (es decir, levadura); 3% de sacarido; 0,06% de microminerales; hidrogenofosfato de dipotasio al 0,1%.

Solucion salina fisiologica con peptona (cloruro de sodio al 0,9%, peptona al 1%) FKP VetMIC Lact-1 & Lact-2 (SVA, Uppsala, Suecia)

Caldo ISO-SENSITEST (Oxoid CM0473)

Cultivos:

Se aislaron cepas de Bacillus de heces, suelo, fuentes de alimentos y recogidas de colecciones de bancos de cepas, y se mantuvieron en VIB con glicerol al 20% en placas madre MTP a -80°C.

Antibioticos:

Ampicilina (Sigma, A9518-5G)

Vancomicina (Sigma, V1764-250MG)

Gentamicina (Sigma, G1264-50MG)

Kanamicina (Sigma, K1377-1G)

Estreptomicina (Sigma, S6501-5G)

Eritromicina (Sigma E-5389)

Clindamicina (Sigma, C2569-10MG)

Tetraciclina (Sigma T-7660)

Cloramfenicol (Sigma, C0378-5G)

Patogenos:

E. coli O101 F5 (State Serum Institute, Copenhague, Dinamarca)

E. coli O147:K89 F4 (State Serum Institute, Copenhague, Dinamarca)

E. coli O149:k91,k88a (NCTC 10650) Coleccion Nacional de Cultivos Tipo

Las cepas de E. coli se mantuvieron en LB con glicerol al 20% en placas maestras MTP a -80°C

Clostridium perfringens Tipo A, DSM 756, se mantuvo en BHI con glicerol al 20% a -80°C

EJEMPLO 1: Antes del examen

Se sometieron a pre-examen 261 aislados de fuentes de suelo y heces y alimentos para determinar la sensibilidad a antibioticos, la inhibicion de patogenos, la resistencia a la bilis y la sensibilidad a pH bajo.

1.1 Sensibilidad a antibioticos

Se anadieron cepas de Bacillus en un volumen de 50 |il de placas madre MTP a 700 |il de VIB en placas DW y se incubaron a 37°C y 175 rpm durante la noche. Se anadieron muestras de prueba ISO, complementadas con los antibioticos enumerados en la tabla 1 a 2 concentraciones y controles ISO sin antibioticos a placas MTP en un volumen de 180 |il. Sediluyeron los cultivos de Bacillus incubados durante la 100 veces y se transfirieron en alfcuotas de 20 |il a muestras de prueba y controles ISO. Se incubaron las placas MTP a 37°C. Se midio la densidad optica (DO) a 620 nm en el inoculo y en las placas de prueba MTP despues de 24 y 48 horas de incubacion. Se estimo la sensibilidad a antibioticos de las bacterias como el porcentaje de DO en las muestras de prueba ISO con respecto a la DO en los controles ISO.

1.2 Examen de las cepas de Bacillus para determinar la inhibicion de patogenos

Se anadieron cepas de Bacillus en un volumen de 50 |il de placas madre MTP a 700 |il de VIB en placas DW y se incubaron a 37°C y 175 rpm durante la noche.

Antes del ensayo, se hicieron crecer cepas de E. coli en LB durante la noche a 30°C. Se hizo crecer C. perfringens CHCC14372 en BHI durante la noche en un frasco anaerobio a 37°C.

1.2.1 Inhibicion de E. coli mediante la prueba de manchas en agar

Se mezclaron 2 ml de cultivo de E. coli incubado durante la noche con 200 ml de agar VIB lfquido a 50°C, y se vertieron en cada placa de bioensayo. Se secaron las placas en una mesa de laboratorio esteril. Se dispusieron en manchas cultivos de Bacillus incubados durante la noche, 2 |i de cada uno, sobre la superficie del agar VIB mezclado con E. coli y se incubaron a 37°C durante 2 dfas. Se midieron los radios de las zonas de inhibicion clarificadas alrededor de las manchas y se registraron como “altas” - radio de mas de 2 mm, “medias” - radio de entre 0,5 - 2 mm y “bajas” - radio de menos de 0,5 mm.

1.2.2 Inhibicion de C. perfringens mediante la prueba de manchas en agar

Se vertio agar VIB en las placas de bioensayo (200 ml por placa) y se secaron completamente en una mesa de laboratorio esteril. Se dispusieron en manchas cultivos de Bacillus incubados durante la noche, 2 |il de cada uno, sobre la superficie de las placas de agar VIB y se incubaron a 37°C durante la noche. Se anadio C. perfringens Tipo A CHCC14372 en un volumen de 2 ml a 200 ml de agar BHI lfquido, se mezclo y se recubrieron suavemente las placas de bioensayo con manchas de Bacillus. Se incubaron las placas anaerobicamente a 37°C durante 1 dfa. Se midieron los radios de las zonas de inhibicion clarificadas alrededor de las manchas y se registraron como “altas” mas de 2 mm, “medias” - entre 1-2 mm, “bajas” - menos de 1 mm.

1.2.3 Inhibicion de C. perfringens mediante difusion en pocillo

Se mezclaron 2 ml de cultivo de C. perfringens CHCC14372 incubado durante la noche con 200 ml de agar BHI lfquido y se vertieron en cada placa de bioensayo. Tras la solidificacion, se realizaron los pocillos de 10 mm en agar BHI con un elemento de perforacion esteril y se transfirieron 80 |il de cultivos de Bacillus incubados durante la noche a cada pocillo. Se incubaron las placas anaerobicamente a 37°C durante 1 dfa. Se midieron los radios de las zonas de inhibicion clarificadas alrededor de los pocillos y se registraron como “altas” - mas de 2 mm, “medias” - entre 0,5 -2 mm y “bajas” - menos de 0,5 mm.

1.3 Ensayo de resistencia a bilis

Se anadieron cepas de Bacillus en un volumen de 50 |il de placas madre MTP a 700 |il de VIB en placas DW y se incubaron a 37°C y 175 rpm durante la noche. Se transfirieron cultivos de Bacillus incubados durante la noche en un volumen de 50 |il a 800 ml VIB complementado con el 0,3% de sales biliares (muestras de prueba) y VIB sin bilis (controles) en placas DW. Se incubaron las placas a 37°C y 175 rpm. Se midio la densidad optica a 620 nm (DO⁶²⁰) en los tiempos de 0, 6 y 24 horas en VIB con bilis y se resto de los valores de DO⁶²⁰ correspondientes en controles de VIB. Se clasificaron los cultivos segun las diferencias en los valores de DO⁶²⁰ en los grupos A (DO < 0,1), B (DO= 0,1-0,4) y C (DO > 0,4). Se considero que las cepas en el grupo A son mas resistentes a las sales biliares. Las cepas seleccionadas deben estar en el grupo A o B. Los resultados para las cepas seleccionadas se presentan en la tabla 2.

1.4 Sensibilidad a pH bajo (que simula las condiciones gastricas)

Se distribuyeron alfcuotas de VIB de 800 |il ajustadas a pH4 con acido clortndrico 1,0 M y controles de VIB (pH 7) en placas DW. Se anadieron cepas de Bacillus en un volumen de 50 |il de placas madre MTP a placas DW y se incubaron a 37°C y 175 rpm durante 24 horas. Se midio la densidad optica (DO⁶²⁰) en 200 |il de suspensiones celulares en los tiempos de 0 y despues de 24 horas de incubacion. El crecimiento bacteriano a pH 4 se definio restando los valores de DO⁶²⁰ antes de la incubacion de los valores correspondientes despues de la incubacion. Los cultivos que mostraron aumento en la DO⁶²⁰ de mas de 0,1 se consideraron resistentes a pH 4 (indicado con una R en la tabla 2), mientras que los cultivos con valores de DO⁶²⁰ de menos de 0,1 (sin crecimiento o valores negativos) se consideraron sensibles a pH 4 (indicado con una S en la tabla 2).

1.5 Resultados de pre-examen:

Basandose en la prueba de pre-examen, se seleccionaron 32 cepas para el examen secundario. Las cepas seleccionadas deben ser sensibles a los antibioticos descritos y mostrar efecto antimicrobiano tanto contra E. coli como contra Clostridium perfringens y comportarse de manera razonable en las otras pruebas realizadas.

De los 261 aislados de fuentes de suelo, heces y alimentos, 161 aislados eran resistentes a antibioticos en la prueba de pre-examen. De los 100 aislados que eran sensibles a antibioticos, 56 teman efecto antimicrobiano contra Clostridium perfringens y solo 22 teman efecto tanto contra E. coli como contra Clostridium perfringens. De ellos, 12 aislados eran de la especie B. amyloliquefaciens. Otras cepas representativas eran de las especies B. subtilis y B. mojavensis. Las tablas 2 y 3 resumen los resultados de cepas propiedad de Chr. Hansen (22 de las 32 cepas seleccionadas para el examen secundario).

EJEMPLO 2: Examen secundario

Basandose en los resultados del examen primario, se sometieron a prueba 40 aislados seleccionados y cepas de referencia para determinar la inhibicion de patogenos mediante la repeticion de las pruebas de manchas en agar y para determinar la esporulacion. Tambien se sometieron a prueba 32 cepas para determinar la sensibilidad a antibioticos mediante la prueba de MIC.

2.1 Examen de cepas de Bacillus para determinar la inhibicion de patogenos

Antes del ensayo, se inocularon 9 ml de VIB con cultivos de Bacillus y se incubaron a 37°C y 175 rpm durante la noche. Simultaneamente, se inocularon 9 ml de caldo BHI con cepas de E. coli, y se incubaron durante la noche a 37°C. Se hizo crecer Clostridium perfringens en las mismas condiciones en un frasco anaerobio.

2.1.1 Inhibicion de E. coli mediante la prueba de manchas en agar:

Se anadieron cultivos de patogenos incubados durante la noche en un volumen de 2 ml cada a 200 ml de agar VIB lfquido a 50°C, y se vertieron en cada placa de bioensayo. Se secaron las placas en una mesa de laboratorio esteril. Se dispusieron en manchas cultivos de Bacillus incubados durante la noche sobre la superficie del agar VIB mezclado con patogenos y se incubaron a 37°C durante 2 dfas. Se registraron los radios de las zonas de inhibicion alrededor de las manchas y los diametros de las manchas.

2.1.2 Inhibicion de C. perfringens mediante la prueba de manchas en agar

Se dispusieron en manchas cultivos de Bacillus sobre la superficie del agar VIB en placas de Petri y se incubaron a 37°C durante la noche. Se mezclo cultivo de C. perfringens incubado durante la noche en un volumen de 2 ml con 200 ml de agar BHI lfquido, y se vertio en agar VIB con manchas de Bacillus cultivados. Se incubaron las placas anaerobicamente a 37°C durante 1 dfa. Se midieron los radios de las zonas de inhibicion clarificadas alrededor de las manchas.

2.2 Crecimiento en VIB y en medio de esporulacion

Se anadieron cepas de Bacillus en un volumen de 50 |il de placas madre MTP a 700 |il de VIB o medio de esporulacion en placas DW y se incubaron a 37°C y 175 rpm durante 24 horas. Se determino el crecimiento bacteriano mediante la densidad optica a 620 nm (DO⁶²⁰) en suspensiones de 200 |il. Debido a la alta turbidez del medio de esporulacion y a su variacion entre los pocillos, se restaron los valores de DO⁶²⁰ antes de la incubacion de los valores DO⁶²⁰ en los pocillos correspondientes despues de la incubacion. Los cultivos que mostraron una DO⁶²⁰ de mas de 0,4 se clasificaron en el grupo A (alto crecimiento) y los que mostraron DO⁶²⁰ de menos de 0,4, en el grupo B (bajo crecimiento).

2.3 Esporulacion en medio de esporulacion

Se anadieron cepas de Bacillus en un volumen de 50 |il de placas madre MTP a 700 |il de VIB en placas DW y se incubaron a 37°C y 175 rpm durante la noche. Se transfirieron cultivos de Bacillus incubados durante la noche en un volumen de 50 |il a 700 |il de un medio de esporulacion (SM) en placas DW. Se incubaron las placas a 37°C y 175 rpm durante 3 dfas. Se realizo un seguimiento de la esporulacion microscopicamente y se determino el porcentaje de esporas (numero de esporas en relacion con las celulas totales) mediante evaluacion visual despues de 1 dfa (24 horas), 2 dfas (48 horas) y 3 dfas (72 horas) de incubacion.

2.4 Sensibilidad a antibioticos medida mediante MIC

Se analizaron las cepas para determinar la sensibilidad a antibioticos midiendo la concentracion inhibidora minima (MIC) para varios antibioticos. El metodo usado fue un metodo de microdilucion en caldo tal como se explica resumidamente por la norma de CLSI (Instituto de normas clmicas y de laboratorio, M07-A8 y M45-A2).

Se inocula una suspension de un crecimiento durante la noche de la cepa que va a someterse a prueba en caldo ISO-SENSITEST (Oxoid CM0473) en placas de microtitulacion a una concentracion aproximada de 105 ufc/ml (unidades formadoras de colonias/ml) en diluciones en serie dos veces del antibiotico que va a someterse a prueba (volumen total 100 |il/pocillo) y se incuba aerobicamente durante 20-24 horas a 37°C. Pueden usarse los paneles prefabricados VetMIC Lact-1 y Lact-2 que comprenden los antibioticos ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol. Los resultados se registran despues de 24 horas a la concentracion mas baja del antibiotico para inhibir el crecimiento visible. La prueba se realizo dos veces como dos repeticiones biologicas independientes.

2.5 Resultados

Los resultados de las 32 cepas seleccionadas mostraron que Bacillus amyloliquefaciens tema las mejores propiedades combinadas de sensibilidad a antibioticos, efecto antimicrobiano y esporulacion, vease la tabla 2. Solo se incluyen los datos relacionados con las cepas propiedad de Chr. Hansen (22 de las 32 cepas).

Tabla 2

Datos basicos para cepas de Bacillus seleccionadas

Fuente, especie segun gyrB, crecimiento en VIB y medio de esporulacion, asf como porcentaje de esporulacion. Cepa A=15510; cepa B=15516; cepa C=15541; cepa H=15536; cepa I 15539

Crecimiento Esporulacion, % Cepas Fuente Especie Resistencia VIB SM Dfa 1 Dfa 2 Dfa 3 a

antibioticos

A Heces B. mojavensis Sensible A B 5 95 90 B Heces B. amyloliquefaciens Sensible A A 10 99 99 C Heces B. subtilis Sensible B A 0 80 95 D Heces B. amyloliquefaciens Sensible B A 40 99 99 E Heces B. amyloliquefaciens Sensible B A 20 99 99 F Heces B. amyloliquefaciens Sensible B A 50 99 99 G Heces B. amyloliquefaciens Sensible B A 95 95 95 H Heces B. amyloliquefaciens Sensible A A 99 99 99 I Heces B. amyloliquefaciens Sensible B A 80 99 99 J Heces B. amyloliquefaciens Sensible B A 50 99 99 K LMG B. amyloliquefaciens Sensible A A 2 99 99 L Heces B. licheniformis Sensible B A 90 99 ND M Suelo B. licheniformis Resistente B A 0 1 80 N Suelo B. megaterium Resistente B A 0 0 0 O Heces B. subtilis Sensible A B 0 60 10 P Heces B. pumilus Resistente A A 0 10 99 Q Heces B. licheniformis Resistente A A 0 1 5 R Heces B. licheniformis Resistente A A 0 poco 40 S Heces B. pumilus Sensible A A 0 10 95 T Suelo B. megaterium Resistente B A 0 0 0 U Suelo B. licheniformis Resistente A A 0 poco 70 V Heces B. subtilis Resistente A B 95 99 90 Tabla 3

Inhibicion de E. coli y Clostridium perfringens (mm) asf como resistencia contra bilis y acido mediante cepas de Bacillus seleccionadas

Cepa A=CHCC15510; cepa B=15516; cepa C=15541; cepa H=15536; cepa I=15539

O149, O147 y O101 son los tres patogenos de E. coli en cerdos mencionados en la seccion Patogenos

Bilis E. coli, mm de inhibicion Cl.

perfringens, mm Cepas Especies 6 h 24 h Acido O149 O147 O101 Mm A B. mojavensis C A S 1,5 1,7 2,3 7 B B. amyloliquefaciens A A S 2,5 2,3 3,5 8 C B. subtilis A B R 1,8 1,5 2,7 7 D B. amyloliquefaciens A A R 2 1,7 2,5 6 E B. amyloliquefaciens B A S 3 3 3,5 6 F B. amyloliquefaciens B A S 2,5 2,5 3,3 7 G B. amyloliquefaciens B B R 2 1,7 2 7 H B. amyloliquefaciens A A R 3,5 3 4,5 7 I B. amyloliquefaciens B A R 2 2 2 8 J B. amyloliquefaciens B A S 2 2,5 2,5 8 K B. amyloliquefaciens B A S 0,3 <1 1 4 L B. licheniformis A B S <1 <1 1,3 8 M B. licheniformis B A S 0 0 0 4 N B. megaterium B A S 0 0 0 0 O B. subtilis B A S 1 <1 1,3 7 P B. pumilus A A R 1 0 1,7 8 Q B. licheniformis B B S 0 0 0 2 R B. licheniformis B B S 0 0 0 2 S B. pumilus A A R <1 0 <1 6 T B. megaterium A A S 0 0 0 0 U B. licheniformis B B S 0 0 0 3 V B. subtilis C A S 2,5 1 2,5 10 EJEMPLO 3: Termoestabilidad

3.1 Metodo para prueba de termoestabilidad

Se hicieron crecer cepas de Bacillus durante la noche en VIB a 37°C y 220 rpm. Se extendieron los cultivos incubados durante la noche sobre placas de agar T3 (100 |il de diluciones 105 -106) y se incubaron a 37°C durante 1­ 2 d^as hasta que se completo la esporulacion. Se rasparon las esporas de las placas, se suspendieron en disolucion FKP y se incubaron a 80°C durante 15 min con el fin de inactivar las celulas vegetativas. Se colocaron las suspensiones de esporas en hielo inmediatamente despues del calentamiento. Se lavaron las preparaciones de esporas dos veces en FKP, se resuspendieron en FKP con glicerol al 20% y se mantuvieron a 80°C antes de su uso. Se obtuvo la termorresistencia de las esporas bacterianas manteniendo tubos Eppendorf con 500 |il de suspensiones de esporas en FKP (a una concentracion de aproximadamente 1x106 UFC por ml) a 99,5°C durante 2, 5 y 10 min. Se determinaron los recuentos de UFC en diluciones de suspensiones calentadas sembradas en placa sobre agar VIB despues de incubacion a 37°C durante la noche.

3.2 Resultados de la prueba para termoestabilidad

En la tabla 4 se muestran los datos de termoestabilidad.

Tabla 4. Termoestabilidad a 99,5°C de cepas de Bacillus seleccionadas; medida en ufc como reduccion despues de 2, 5 y 10 min en relacion con tiempo 0 (log/log)

Cepa B=15516; cepa C=15541, cepa H=15536

Cepas Especies Reduccion en ufc despues de

2 min 5 min 10 min B B. amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens 0,05 0 0 C B. subtilis 0,25 2,5 3,8 D B. amyloliquefaciens/relacionada con siamensis 0 0 0,05 E B. amyloliquefaciens subsp. plantarum 0,34 3,8 5,3 F B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens 0 0 0 H B. amyloliquefaciens subsp. plantarum 0,19 2,5 5 En general, una reduccion de menos de 2 (log/log) ufc despues de 2 min en relacion con tiempo 0 es apropiada para que las esporas se incluyan en el pienso para granulacion y se logran resultados por debajo de 2 con preparaciones comerciales comunes de esporas de Bacillus. Por tanto, todas las cepas sometidas a prueba y mostradas en la tabla 4 tienen buena termoestabilidad. Algunas cepas tambien mostraron buena termoestabilidad despues de 5 y 10 minutos, es decir la cepa B y la cepa F, ambas B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens, que no mostraron reduccion de ufc.

EJEMPLO 4: Produccion de enzimas

4.1 Metodo para ensayo de celulasa

Se hicieron crecer cepas de Bacillus en medio de carboximetilcelulosa (CMC) (Abou-Taleb et al. 2009) (por I: 10,0 g de carboximetilcelulosa (C9481), 2,0 g de triptona Bacto (cat. 211705, Becton Dickinson A/S, Dinamarca), 4 g de KH²PO⁴, 4,0 g de Na²HPO⁴, 0,2 g de MgSO4'7H2O, 0,001 g de C a C h ^ O , 0,004 g de FeSO4'7H2O, pH 7) a 37°C y agitacion magnetica vigorosa durante 24 horas. Se determino la produccion de celulasa usando el kit EnzChek Cellulase Sustrat (cat. E33953, Life Technologies) segun las instrucciones del fabricante. En resumen, se recogieron los sobrenadantes de cultivo mediante centrifugacion y se distribuyeron en MTP (200 |il por pocillo) en diluciones en serie. Se construyeron curvas patron usando celulasa de Aspergillus niger (C1184) partiendo de 2 U ml-1. Se anadio la disolucion de sustrato EnzChek a los sobrenadantes de cultivo en placas Black FluoroNunc de 96 pocillos de Nunc (cat. 237105, Thermo Fisher Scientific, NUNC Inc.). Se registro la fluorescencia a excitacion de 360 nm/emision de 420 nm despues de 30 min de incubacion (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer Inc.). Se calculo la actividad celulasa a partir de curvas patron en dos experimentos independientes y se expreso como medias (U ml-1).

4.2 Metodo para el ensayo de xilanasa

Se hicieron crecer cultivos de Bacillus en medio que contema xilano de madera de haya (Cordeiro et al. 2002) (por I: 5,0 g de xilano (X4252), 2,0 g de extracto de levadura (cat. 288620, Becton Dickinson A/S, Dinamarca), 5,0 g de peptona Bacto (cat. 2 ll677, Becton Dickinson A/S, Dinamarca), 0,5 g de NaCl, 0,5 g de MgSO4'7H2O, 0,15 g de CaCl2'2H2O, pH 7,5) a 37°C y agitacion magnetica vigorosa durante 24 horas. El ensayo de xilanasa se realizo con el uso del kit EnzChek Ultra Xilanase Assay (cat. E33650, Life Technologies) segun las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recogieron los sobrenadantes de cultivo mediante centrifugacion, se distribuyeron en MTP (200 |il por pocillo), en diluciones en serie y se anadio disolucion de trabajo de sustrato de xilanasa. Se midio la fluorescencia en los sobrenadantes de cultivo a excitacion de 360 nm/emision de 420 nm despues de la incubacion durante 30 min (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer Inc.). Se uso Thermomyces lanuginosis (X2753) como enzima patron y se cargo en MTP en diluciones en serie, partiendo de 25 mU ml-1. Se calculo la actividad xilanasa de las cepas de Bacillus a partir de las curvas patron y se expreso como medias (mU ml-1) de dos ensayos independientes.

4.3 Metodo para ensayo de proteasa

Se transfirieron cultivos de Bacillus incubados durante la noche (cultivados en VIB a 37°C) a una mezcla de reaccion con isotiocianato de fluorescema-casema (FITC-C) como sustrato (Sigma C3777) y se incubaron a 37°C 3 horas. Despues de la precipitacion, se midio la cantidad de peptidos solubles mediante fluorescencia, a excitacion de 497 nm, emision de 515 nm. Este ensayo detecta una amplia variedad de proteasas (serina, acido aspartico, cistema y metaloproteasas).

4.4 Metodos para la produccion de biopelicula

Se anadieron cepas de Bacillus en VIB (aproximadamente 107 UFC ml-1), se distribuyeron en MTP de polipropileno (PP) (96 Well Conical Btm PP Plt Natural; NUNC Inc., Dinamarca) y se incubaron a 37°C durante 24 horas sin agitacion. Se controlo el crecimiento mediante mediciones de la densidad optica (DO) a 620 nm. Se evaluo la formacion de biopelicula mediante tincion con cristal violeta tal como se describio anteriormente (Auger et al. 2009). Brevemente, tras lavar los pocillos con agua destilada, se anadio disolucion de cristal violeta del 0,1% (p v-1) a MTP de PP y se incubaron las placas durante 30 min. Entonces, se repitio el procedimiento de lavado y se anadio etanol el 96% (v v-1) a las placas. Se midio la absorbancia a 570 nm despues de 15 min de incubacion (espectrofotometro Wallac Victor2, Perkin Elmer Inc.). Se clasificaron las cepas de Bacillus spp. o bien como altos (Abs⁵⁷⁰ nm > 2,0), medios (Abs⁵⁷⁰ nm = 1,0 - 2,0) o bajos (Abs⁵⁷⁰ nm < 1,0) productores de biopelicula. El ensayo se realizo dos veces por duplicado.

4.5. Resultados para los ensayos de enzimas

Tabla 5. Produccion de enzimas y biopelicula

(RFU= Unidad de fluorescencia relativa)

Cepa A=15510; cepa B=15516; cepa C=15541; cepa H=15536; cepa I=15539

Cepas Especie Celulasa, Xilanasa, Proteasa, Biopelicula mU/ml mU/ml RFU/DO

A B. mojavensis 1734 50 142117

B B. amyloliquefaciens subsp. 67 47 599919

amyloliquefaciens

C B. subtilis 1037 24 445091

D B. 2196 70 291908 ++

amyloliquefaciens/relacionada

con siamensis

E B. amyloliquefaciens subsp. 612 28 381459 ++

plantarum

F B. amyloliquefaciens subsp. 54 57 400456 ++

amyloliquefaciens

G B. amyloliquefaciens subsp. 371 71 453158 ++ plantarum

H B. amyloliquefaciens subsp. 631 30 252377

plantarum

I B. amyloliquefaciens subsp. 466 121 411206 ++

plantarum

J B. amyloliquefaciens subsp. 469 72 421338 ++

plantarum

La tabla muestra que las cepas E, G, H, I y J que son todas ellas B. amyloliquefaciens subsp. plantarum tienen alta actividad celulasa, mientras que las cepas B y F que son B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens tienen baja actividad celulasa.

EJEMPLO 5: Ensayos con lechones

Se complementaron dietas para reden nacidos con dos cepas de Bacillus seleccionadas (cepa B o C) para evaluar su efecto sobre el rendimiento del crecimiento y la mortalidad de lechones tras el destete. Dado que E. coli es uno de los principales patogenos en el periodo de recien nacidos con un gran impacto en los parametros de produccion y la mortalidad, estos ensayos pueden dar informacion sobre el efecto en la inhibicion de E. coli en los animales. Los ensayos se realizaron en 2 centros diferentes: el centro 1 era una granja de investigacion y el centro 2 una universidad. La organizacion del ensayo fue similar en ambos centros.

Tabla 6

Vision general de los centros usados en los ensayos con lechones

N.° total de cerdos N.° de repeticiones Pesaje Dfas en el ensayo Centro 1 576 96 28, 35, 42, 63 35

Centro 2 720 24 28, 35, 49, 63 35

5.1.1 Organizacion experimental en el centro 1

El dfa del destete, se usaron en el experimento 576 lechones (de 28 dfas de edad) procedentes de dos lotes de destete consecutivos (288 lechones cada uno), que se originaron a partir de la granja experimental. Los lechones eran lechones cruzados (ACMC x Pietrain). Los lechones seleccionados estaban sanos con buen aspecto general y no recibieron ninguna vacunacion en la fase de recien nacidos. La granja experimental fue positiva para el srndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), pero bajo control, y tuvo algunos problemas de colibacilosis en la fase tras el destete. Los lechones se clasificaron segun el peso corporal y luego se asignaron a 48 pocilgas en ambos lotes de destete (96 pocilgas en total) de manera que cada bloque de pocilgas conterna 6 lechones, 3 machos y 3 hembras, de peso corporal similar en ambos tratamientos. Los tratamientos se asignaron a las pocilgas de lechones de poco y mucho peso por bloque, de modo que cada tratamiento se aplico a 24 pocilgas de 6 lechones (6 pocilgas por tratamiento y sala; 12 pocilgas por tratamiento y lote de destete). Se anadieron productos de Bacillus al pienso a 400 g/ton de pienso o 1,28 *107 UFC g/pienso.

Los cerdos se pesaron individualmente a los 28 (dfa 0; dfa de destete), 35, 42 y 63 dfas de edad para calcular el aumento de peso diario promedio (ADWG). Se midieron la ingesta de pienso diaria promedio (ADFI) y la razon de conversion de pienso (FCR) por pocilga en las mismas fases (28-35; 35-42; 42-63) y durante periodos principales (primera edad: 28-42 dfas de edad; segunda edad: 42-63 dfas de edad; y periodo de recien nacido total). Se controlaron diariamente la mortalidad y la incidencia de patologfas, incluyendo el registro de tratamientos antibioticos individuales aplicados.

Tabla 7

Parametros de produccion en el centro 1

Valores de P en comparacion con control (A: P=< 0,1; a =<0,05)

Cepa B= 15516;cepa C=15541

SE= Error estandar

| SE | 0,150 | 0,254 | 0,007 | 0,006 | 0,024 | 0,010 | 0,010 | 0,008 | 0,007 | 0,007 | 0,009 5.1.2 Resultados

Los productos probioticos de ambas cepas de Bacillus complementados a dietas de reden nacidos mejoraron numericamente el rendimiento productivo en comparacion con un grupo de control negativo, sin mostrar diferencias entre ellos. Pudo observarse un efecto significativo tanto en ADG como en FU en la fase de primera edad (28-42 dfas de edad). El porcentaje de mortalidad se redujo en ambos grupos de Bacillus (% de mortalidad: control (3,47), cepa B (1,39%), cepa C (2,08))

5.2.1 Organizacion experimental en el centro 2

Justo tras el destete, todos los lechones seleccionados se alojaron en una sala de destete de 24 pocilgas con treinta animales por pocilga. La sala estaba equipada con calefaccion central y ventilacion forzada con sistema de refrigeracion y suelos completamente de listones. Cada establo estaba equipado con un comedero de dos lados en humedo-seco comercial para garantizar la alimentacion a voluntad y el acceso libre al agua, con capacidad para alimentar a tres animales al mismo tiempo. El pienso se distribuyo a voluntad a lo largo de toda la fase experimental. Se uso un total de setecientos veinte lechones recien destetados cruzados comerciales [Pietrain x (Land-race x Large White)]. Los animales se obtuvieron de las cerdas de la misma granja en el dfa del destete y se trasladaron a la instalacion experimental (sin transporte). Se usaron lechones machos y hembra de 26 d de edad de 7,0 kg DE=1,64 kg de peso corporal. Se uso identificacion con etiqueta de plastico en la oreja con el numero del animal. Los animales se distribuyeron en tres bloques por el peso corporal inicial. Dentro de cada bloque los lechones se distribuyeron en pocilgas para una distribucion de peso corporal equilibrada. Por tanto, cada bloque consistio en 8 pocilgas de 30 animales a los que se asignaron aleatoriamente dietas experimentales.

El ensayo comenzo en el destete a los 28 dfas de edad. Los animales se pesaron individualmente en los dfas 0 y 7 y se pesaron en grupo en los dfas 21 y 35 dfas en el ensayo. Se midio la desaparicion de pienso de cada deposito a lo largo de todo el experimento. Asf se calculo la ingesta de pienso diaria promedio (ADFI), el aumento de peso diario promedio (ADG) y la razon de pienso:aumento de peso (FCR) segun la ingesta total de pienso. Se evaluo regularmente el estado de salud de los lechones y se registro cualquier signo anomalo o medicacion administrada. Tambien se calcularon la tasa de mortalidad y el porcentaje de sacrificios.

Tabla 8

Parametros de produccion en el centro 2

Medias por mmimos cuadrados, valores de P en comparacion con control (A: P=< 0,1)

Cepa B= 15516; cepa C=15541

5.2.2 Resultados

Ambas cepas de Bacillus complementadas a dietas de recien nacidos mejoraron numericamente el rendimiento productivo en comparacion con un grupo de control negativo, sin mostrar diferencias entre ellos. Pudieron observarse efectos significativos tanto en ADG como en FU en los periodos de ensayo.

El numero de animales tratados por pocilga con enrofluxacina para superar una diarrea grave fue significativamente mayor (P>0,05) en aquellos animales alimentados con la dieta de control que en los alimentados con Bacillus durante la primera semana tras el destete. Se observaron los mismos resultados (P<0,05) durante todo el periodo experimental (de 0 a 35 dfas tras el destete). El porcentaje de mortalidad se redujo en ambos grupos de Bacillus (% de mortalidad: control (4,17), cepa B (0,04%), cepa C (2,65))

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Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Cepa de Bacillus seleccionada del grupo que consiste en

(a) la cepa de Bacillus mojavensis con numero de registro DSM 25839;

(b) las cepas de Bacillus amyloliquefaciens con numero de registro DSM 25840, numero de registro DSM 27032 o numero de registro D^s M 27033; y

(c) la cepa de Bacillus subtilis con numero de registro DSM 25841.

2. Metodo para seleccionar una cepa de Bacillus que tiene

(i) : sensibilidad a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol;

(ii) inhibicion del crecimiento de E. coli y Clostridium perfringens; y

(iii) un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide despues de 2 dfas de incubacion, comprendiendo el metodo las etapas siguientes:

(i) : seleccionar y aislar de un conjunto de cepas de Bacillus una cepa de Bacillus que es sensible a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol,

(ii) seleccionar y aislar de un conjunto de cepas de Bacillus una cepa de Bacillus que inhibe el crecimiento de E. coli y Clostridium perfringens,

(iii) seleccionar y aislar de un conjunto de cepas de Bacillus una cepa de Bacillus que tiene un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide despues de 2 dfas de incubacion,

(iv) someter a ensayo un conjunto de cepas de Bacillus para determinar la sensibilidad de las celulas vegetativas a pH 4, y

(v) someter a ensayo un conjunto de cepas de Bacillus para determinar la resistencia a la bilis.

3. Metodo para obtener una cepa mutante de

(a) la cepa de Bacillus mojavensis con numero de registro DSM 25839;

(b) las cepas de Bacillus amyloliquefaciens con numero de registro DSM 25840, numero de registro DSM 27032 o numero de registro D^s M 27033; o

(c) la cepa de Bacillus subtilis con numero de registro DSM 25841;

comprendiendo el metodo

someter opcionalmente la cepa de (a), (b) o (c) a tratamiento de mutagenizacion, y

seleccionar una cepa mutante de (a), (b) o (c) que tiene las propiedades siguientes

(i) : sensibilidad a ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloramfenicol;

(ii) inhibicion del crecimiento de E. coli y Clostridium perfringens, y

(iii) un porcentaje de esporulacion de al menos 80 cuando se mide despues de 2 dfas de incubacion.

4. Composicion de Bacillus que comprende celulas de al menos una cepa de Bacillus segun la reivindicacion 1.

5. Composicion de Bacillus segun la reivindicacion 4, que comprende celulas de al menos dos cepas segun la reivindicacion 1.

6. Composicion de Bacillus segun la reivindicacion 4 o 5, que comprende celulas de al menos tres cepas segun la reivindicacion 1.

7. Composicion de Bacillus segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que las celulas de la cepa o cepas de Bacillus son esporas.

8. Metodo para producir un pienso o premezcla que comprende anadir una composicion de Bacillus segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 a un pienso.

9. Metodo para alimentar a un animal que comprende administrar una composicion de Bacillus segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 o un pienso o premezcla producido segun el metodo segun la reivindicacion 8 a un animal.

10. Metodo para alimentar a un animal segun la reivindicacion 9, en el que el animal es un animal seleccionado del grupo que consiste en aves, rumiantes, terneros, cerdos, conejos, caballos, pescado y mascotas.