BR112014025119B1 - Composição de bacillus e métodos para a produção de uma ração para animal ou uma pré- mistura e para a alimentação de um animal - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE SELEÇÃO DE CEPAS DE BACILLUS SENSÍVEIS A ANTIBIÓTICOS, APRESENTANDO INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE E. COLI E CLOSTRIDIUM PERFRINGENS E TENDO ALTA CAPACIDADE DE ESPORULAÇÃO, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO AS MESMAS, BEM COMO MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA RAÇÃO E PARA A ALIMENTAÇÃO DE UM ANIMAL. A invenção refere-se a uma cepa de Bacillus caracterizada por (i): sensibilidade para ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol; (ii) atividade antimicrobiana contra E. coli e Clostridium perfringens; e (iii) uma percentagem de esporulação de pelo menos 80 quando medida após 2 dias de incubação. A invenção refere-se ainda a um método para a seleção de tais cepas. Muitas das cepas identificadas de acordo com a invenção são as da espécie Bacillus amyloliquefaciens. Alguns dos Bacillus amyloliquefaciens foram ainda identificados como Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens enquanto outros foram identificados como amyloliquefaciens subsp. plantarum. Uma cepa de Bacillus da invenção pode ser utilizada como um aditivo para rações para animais, nas quais têm um efeito probiótico.

Description

[0001] CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] Bacillus ssp são usados para soluções probióticas na indús tria de rações para animais, e efeitos positivos dos probióticos com base em Bacillus com relação à produção e à saúde em animais de produção são bem conhecidos (Spiehs et al., 2008; Cutting, 2011). O uso dos mesmos está relacionado com a capacidade de Bacillus de substituir ou reduzir o uso de antibióticos que são usados como promotores de crescimento na indústria de rações para animais.

[0003] No entanto, existe uma necessidade não satisfeita com rela ção a cepas de Bacillus que não tenham resistência antibiótica contra antibióticos que são comumente usados por seres humanos. A presente invenção proporciona cepas de Bacillus isoladas, que são caracterizadas através da sensibilidade com relação à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, te- traciclina e cloranfenicol e que também tem atividade antimicrobiana contra os patógenos principais, tais como a E.coli e Clostridium perfrin- gens. As cepas tem também uma percentagem de esporulação de pelo menos 80 por cento quando medidas no dia 2, tornando possível a produção com eficiência de esporos de Bacillus seguros e úteis para a produção de ração para animais.

[0004] A invenção também se refere ao uso dos esporos das cepas de Bacillus da invenção para a produção de aditivos para rações de animais, especificamente produtos para porcos e aves domésticas, em que as cepas têm um efeito probiótico (saúde, utilização e ração e promoção de crescimento).

[0005] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0006] Porcos, especialmente leitões, sofrem de diarreia neonatal, isto é, diarreia que pode ser causada através de bactérias tais como a Escherichia coli (E.coli) e Clostridium perfringens Tipos A e C (C. per- fringens). As diarreias neonatais podem causar mortes e graves perdas na produção, incluindo a perda de peso, se deixadas sem tratamento.

[0007] A E. coli é a causa primária da diarreia em leitões, e de 50 a 75% dos antibióticos usados nas fazendas é usado contra a diarreia do desmame, causada primariamente pela E. coli. A diarreia é o maior dos problemas em desmamados e em crescimento (até 40 kg) e a E. coli é o patógeno mais importante que causa a diarreia (Klose et al., 2010).

[0008] Infecções entéricas em suínos por Clostridium ocorrem pre dominantemente no período de pré-desmame, mas também estão associadas com a síndrome da hemorragia intestinal que afeta porcos no período de acabamento. Embora a imunização contra a C.perfringens do tipo C tenha reduzido grandemente a mortalidade pré-desmame, não existem vacinas correntemente disponíveis para a C.perfringens do tipo A. As infecções por C.perfringens do tipo A são agora reconhecidas com uma frequência crescente em porcos pré-desmame e as abordagens com relação ao diagnostico e profilaxia são ambas diferentes e mais complexas do que aquelas com relação às infecções do tipo C.

[0009] Varias infecções e doenças em aves domésticas são cauda- das por bactérias patogênicas, incluindo as E. coli e Clostridium perfrin- gens. As infecções e doenças causadas por patógenos resultam em uma crescente mortalidade, um desempenho decrescente e um aumento nos custos de produção. Alem disso, muitos de tais patógenos podem ser transmitidos para seres humanos. A colibacilose aviária é uma infecção sistêmica causada por E. coli e ocorre mais comumente em frangos de corte e frangos.

[00010] Os probióticos são usados em aplicações de saúde para animais com a finalidade da manutenção da microflora saudável do intestino, incluindo a redução em bactérias prejudiciais, tais como as Clostridia e E. coli e um aumento nas bactérias benéficas, tais como a Lactobacillus e a Bifidobacterium. Os probióticos são bem adequados para a manutenção de um equilíbrio saudável entre as bactérias patogênicas e benéficas porque, ao contrario dos antibióticos, eles não destroem as bactérias de uma forma indiscriminada, nem eles levam a cepas resistentes de bactérias patogênicas. Existem muitos mecanismos através dos quais os probióticos são considerados como mantendo saudável a microflora dos intestinos: exclusão competitiva de bactérias patogênicas, redução de bactérias patogênicas através da produção de substâncias antimicrobianas, aumentando o crescimento e a viabilidade da microflora benéfica dos intestinos e estimulando uma resposta imune sistêmica no animal.

[00011] Em vista do precedente, seria desejável ter uma ou mais cepas de Bacillus para o tratamento ou a prevenção de doenças devidas à infecção com E. coli e/ou Clostridium em porcos e aves domesticas.

[00012] Guo et al., de 2006, descreve a triagem de cepas potenciais de Bacillus como probióticos e um teste de Bacillus subtilis MA139 em porcos. 124 amostras foram coletadas a partir de frangos de corte, porcos, solos, alimentos fermentados e ervas chinesas. 750 cepas forma-doras de esporos foram isoladas a partir dessas amostras. A atividade de inibição contra E. coli K88 e K99, Salmonella e Staphylococcus aureus foi testada com a utilização de uma análise de difusão de placa de disco. 6 Bacilli com a melhor atividade foram testados com relação à sobrevivência dos mesmos dentro de condições GIT simuladas (pH 2,0 e 0,3% de sal de bile). O B. subtillis MA 139 foi o melhor candidato e foi testado in vivo em leitões em um teste de alimentação de 28 dias com 90 leitões. A utilização de ADG e de ração foi aumentada. As bactérias do acido lático foram aumentadas, a E. coli nas fezes foi diminuída. No entanto, a atividade antimicrobiana contra a Clostridium perfringens e a sensibilidade com relação a antibióticos não foram testadas.

[00013] Barbosa et al., 2005, descreve o isolamento de 237 Bacillus a partir de fezes (contato com o solo) de frangos de corte criados organicamente. 31 isolados foram caracterizados. As B. subtilis e B. licheni- formis estavam entre as mesmas. Várias cepas de B. subtilis exibiram inibição a C. perfringens e S. aureus. B. licheniformis também mostrou efeito contra C. perfringens. No entanto, nenhum dos isolados de Bacillus selecionados exibiu atividade antimicrobiana contra E.coli, como definida no presente pedido de patente. Um isolado de Bacillus exibiu uma redução na intensidade de crescimento, porem não uma inibição com-pleta contra a cepa 078:K80 da E.coli e nenhum efeito contra a outra cepa de E. coli testada (ver a tabela 5). Nenhum dado é provido com relação à percentagem de esporulação depois de 2 dias de incubação ou na sensibilidade à vancomicina, canamicina e clindamicina.

[00014] Chaiyawan et al., de 2010, divulga uma cepa de Bacillus sp. T3-1, que é suscetível aos antibióticos utilizados em tratamentos médicos e que exibe a atividade antimicrobiana contra C. perfringens ATCC 15191. A cepa não tem atividade antimicrobiana contra E. coli O157. Não existem dados sobre o percentual de esporulação após 2 dias de incubação providos.

[00015] Benitez et al., 2011, divulgou recentemente que a presença de E. coli intacto ou desativado melhorou a síntese de peptídios antimi- crobianos pela cepa LBM 5006 do Bacillus amyloliquefaciens.

[00016] A U.S. 7.754.469 se refere a micro-organismos e a métodos para o tratamento de aves domesticas e a U. S. 8.021.654 se refere a métodos de tratamento de porcos com as cepas de Bacillus.

[00017] No entanto, em nenhum desses artigos ou patentes existe qualquer descrição ou sugestões com relação à seleção de cepas de Bacillus que sejam sensíveis com relação aos antibióticos que são co- mumente usados para seres humanos, que tenham atividade antimicrobiana contra ambas as Clostridium perfringens e E. coli e que tenham um alta percentagem de esporulação com a finalidade de tornar a cepa útil para a esporulação eficiente e, dessa forma, na produção de Bacillus probióticos.

[00018] Nenhum dos documentos da técnica precedente como, por exemplo, Barbosa et al., 2005, Chalyawan et al., 2010, e Guo et al., 2006, descrevem cepas que tenham sensibilidade com relação a antibióticos que sejam comumente usados para seres humanos, atividade antimicrobiana no sentido de inibição do crescimento contra ambas a Clostridium perfringens e E. coli e uma alta percentagem de esporula- ção.

[00019] Em resumo, a técnica precedente com relação à triagem de cepas de Bacillus que não proporcionem as três características distintas da presente invenção, isto é, sensibilidade com relação a antibióticos que sejam comumente usados pra seres humanos, atividade antimicro- biana contra Clostridium perfringens e E. coli e uma alta percentagem de esporulação. A técnica anterior também não proporciona cepas de Bacillus que satisfaçam estes três critérios.

[00020] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00021] O problema a ser resolvido através da presente invenção é o de prover uma cepa de Bacillus que seja caracterizada pela sensibilidade com relação à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol; atividade antimicrobiana contra Clostridium perfringens e E. coli; e uma percentagem de esporulação de pelo menos 80 quando medida no dia 2.

[00022] A solução é baseada em um método de seleção desenvolvido pelos presentes inventores, com relação à identificação de cepas de Bacillus aperfeiçoadas que tenham essas propriedades melhoradas.

[00023] Uma primeira etapa essencial do método de seleção é a triagem de forma específica com relação às cepas de Bacillus que sejam sensíveis com relação a antibióticos que são comumente usados por seres humanos. Mais especificamente, as cepas são submetidas à triagem com relação à sensibilidade por ampicilina, vancomicina, gentami- cina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol.

[00024] Além disso, as cepas são submetidas à triagem com relação à atividade contra E. coli e Clostridium perfringens e que tenham uma percentagem de esporulação de pelo menos 80 quando medida no dia 2.

[00025] Entre os 261 isolados a partir de solo e de fezes e de fontes de alimentação investigados pelos presentes inventores, 161 isolados foram resistentes a antibióticos no teste de pré-triagem descrito nos exemplos. Entre os 100 isolados que foram sensíveis a antibióticos, 56 tiveram efeito antimicrobiano contra a Clostridium perfringens e somente 22 tiveram efeito contra ambas a E. coli e a Clostridium perfrin- gens. Entre esses, havia 12 isolados a partir da espécie B. amylolique- faciens. Outras cepas representativas foram a partir das espécies B. subtilis e B. mojavensis. As Tabelas 2 e 3 resumem os resultados das cepas proprietárias Chr. Hansen (22 das 32 cepas selecionadas com relação à triagem secundária).

[00026] O processo de seleção focalizado em (i) segurança, (ii) efeito e (iii) alta esporulação em meios adequados para a produção. O aspecto de segurança se baseia principalmente na ausência de resistência a antibióticos, que é importante devido ao aumento dos casos de bactérias resistentes em seres humanos. Essas bactérias têm resultado em doenças bem conhecidas que já não podem ser tratadas com antibióticos, à medida que as bactérias patogênicas se tornaram resistentes.

[00027] É bem conhecido que a Bacillus pode produzir substâncias que podem ter atividade antimicrobiana, isto é, tal como bacteriocinas, enzimas bacteriolíticas ou surfatinas. O segundo critério de seleção, efeito contra E. coli e Clostridium perfringens é importante à medida que ambos os patógenos são as causas principais de diarreia em porcos e em aves domésticas. O efeito é testado contra três cepas de E. coli e contra Clostridium perfringens do tipo A, porém é contemplado que os resultados são indicativos com relação a um efeito geral contra E.coli e por um efeito também contra outros tipos de Clostridia, tal como a Clostridium perfringens do tipo C.

[00028] O terceiro critério de seleção é importante para a produção do probiótico. O processo de produção é realizado em fermentadores de crescimento de Bacillus e, no final do processo, uma elevada taxa de esporulação é necessária para uma eficácia de produção elevada. O processo de esporulação do Bacillus tem sido investigado durante muitos anos, porém ainda existe uma grande quantidade de questões. E por esse motivo ainda bem conhecido das pessoas versadas na técnica, que estão trabalhando com a produção e o desenvolvimento de proces-sos do Bacillus, que algumas cepas de Bacillus tem uma taxa de espo- rulação muito baixa. Tem sido sugerido que o Bacillus se diferencie em subpopulações de células especializadas, isto é, comunidades que es- porulam, comunidades que produzam enzimas para a degradação de nutrientes complexos e comunidades que morram (Lopez e Kolter, 2010). Esta diferenciação parece ser regulada através de sinais extra- celulares, a maioria dos quais produzidos pelo próprio Bacillus. Também tem sido levantada a hipótese de que uma alta produção de enzimas ou de substâncias antimicrobianas pode resultar em uma baixa eficácia na esporulação. Para a pessoa versada na técnica, é por esse motivo não usual e surpreendente que uma cepa de Bacillus tenha ambas a atividade antimicrobiana e uma alta percentagem de esporulação.

[00029] FIGURAS

[00030] A figura 1 mostra de forma esquemática a atividade antimicrobiana de 261 cepas de Bacillus. É surpreendente que muitas cepas de Bacillus amyloliquefaciens tenham efeito antimicrobiano.

[00031] DESCRIÇÂO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00032] A eliminação progressiva dos antibióticos promotores de crescimento na União Europeia, em 2006, resultou em um aumento da necessidade com relação a aditivos para rações de baixo custo com alta eficácia e, por esse motivo, a necessidade de novos probióticos. Os aditivos de ração probióticos com base em Bacillus são conhecidos com relação aos efeitos positivos dos mesmos sobre a saúde e a produção em porcos e aves domésticas. Esses produtos são relevantes para a indústria de rações porque os esporos são estáveis ao calor e podem sobreviver ao processo de peletização em temperaturas de até 90 - 95°C.

[00033] Os probióticos para porcos necessitam ser seguros para os animais, seres humanos e o meio ambiente, e devem aumentar o crescimento e a utilização em rações para o animal. O objetivo da presente invenção foi de submeter à triagem, em três etapas, uma ampla faixa de bactérias de endoformação de esporos (AEB) a partir de fontes diferentes com relação aos efeitos probióticos das mesmas em porcos. As AEB foram isoladas a partir de alimentos fermentados (iniciadores primários Kantong e Gergous), fezes de porcos, solo e coleções de culturas dife-rentes. 261 isolados foram identificados através de sequenciação de 165 genes de rDNA e investigados com relação à resistência relevante antibiótica através da determinação da concentração inibidora mínima (MIC) de diversos antibióticos relevantes.

[00034] Outras análises incluíram bile e tolerância a ácidos, inibição de patógenos, crescimento em meio diferente, esporulação, bem como interações com linhas de células animais para a avaliação da possibilidade de efeitos positivos sobre as junções apertadas do sistema intestinal. Os resultados mostraram uma elevada diferença entre ambas as espécies e cepas. As espécies isoladas foram primariamente do gênero Bacillus, incluindo a B. amyloliquefaciens, B, subtilis e B.safensis a partir de fontes de alimentos, B. subtilis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B.li- cheniformis, B. megaterium a partir de fezes e B. licheniformis e B. simplex a partir do solo.

[00035] Muitos dos isolados exibiram resistência não desejada a antibióticos acima dos pontos de rompimento definidos pela EFSA e foram descartados devido às preocupações com a segurança. Um bom crescimento foi observado com relação à maioria das cepas, quando cultivadas de um dia para o outro em calda de infusão de vitela, enquanto que 16% não tiveram um crescimento satisfatório em um meio adequado para a fermentação. Na etapa 2 do processo de triagem, 32 cepas selecionadas sem resistência a antibióticos foram identificadas através de sequenciação do gene gyrB e identificação PFGE. Além disso, o efeito antimicrobiano das mesmas sobre patógenos selecionados foi testado e foram observadas consideráveis variações entre os isolados. Vários dos isolados exibiram inibição do Clostridium perfringens, enquanto que somente uns poucos isolados inibiram a E. coli. Os resultados da presente invenção confirmam, dessa forma, que a inibição do crescimento de ambas a Clostridium perfringens da E. coli somente se combinam raramente. A etapa 3 do processo de triagem envolveu 10 cepas com elevada inibição de patógenos e incluiu a determinação da estabilidade ao calor dos esporos, sequenciação do genoma e estudos adicionais in vitro, mostrando os efeitos dos mesmos em junções apertadas.

[00036] A presente invenção proporciona cepas de Bacillus caracterizadas por (I) sensibilidade com relação à ampicilina, vancomicina, gen- tamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraci- clina e cloranfenicol.

[00037] Através da frase “sensibilidade com relação à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol”, é significado que uma cepa, para ser considerada como sensível a um antibiótico especifico, não deve crescer até o nível do ponto de interrupção dado pela EFSA (EFSA 2008), esboçado na Tabela 1.

[00038] Os valores MIC esboçados na Tabela 1 são baseados nas diretrizes estabelecidas pela EFSA (Diretrizes técnicas preparadas pelo Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP) sobre a atualização dos critérios usados na avaliação de resistência de bactérias a antibióticos de importância humana e veterinária. The EFSA Journal (2008) 732, 1-15) proporciona uma relação de antibióticos e valores de corte do gênero Bacillus. Não existe ponto de quebra dado pela EFSA com relação à ampicilina para a Bacillus, no entanto existe um ponto de quebra com relação à várias outras bacté-rias, isto é, Lactobacillus ssp. Dessa forma, esta sensibilidade das cepas de Bacillus contra a ampicilina foi escolhida como o ponto de quebra para a presente invenção.

[00039] Tabela 1. Ponto de quebra EFSA para diversos antibióticos comumente usados para seres humanos.

[00040] A fim de estar dentro do âmbito da presente invenção, a cepa tem que ser sensível com relação a todos os antibióticos acima. Na prática, isso significa que o não crescimento da cepa é observado no nivel do ponto de quebra quando testada através de um método de microdi- luição (concentração inibidora mínima (MIC)).

[00041] De acordo com a presente invenção, o MIC é medido através de um método de calda de microdiluição, como delineado pelo padrão do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute M07-A8 and M45- A2), executado como se segue.

[00042] Uma suspensão de um cultivo de um dia para o outro da cepa a ser testada é inoculada em ISO-SENSITEST Broth (Oxoid CM0473) em placas de microtitulação em uma concentração aproximada de 105 cfu/ml (unidades de formação de colônia/ ml) em diluições em série de duas vezes do antibiótico a ser testado (volume total 100 μl/ cavidade) e incubado de forma aeróbica durante 20 a 24 horas, a 37°C. Os painéis pré-fabricados VetMIC Lact-1 & Lact-2, que compreendem os antibióticos ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, es- treptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol, podem ser usados. Os resultados são registrados depois de 24 horas como a concentração mais baixa do antibiótico para a inibição do crescimento visível.

[00043] A primeira parte do aspecto (II) da invenção se refere à cepa de Bacillus que exibe atividade antimicrobiana contra E. coli. De acordo com a presente invenção, isso é medido através do teste de ponto de ágar de E.coli, realizado da forma que se segue.

[00044] 9 ml de Veal Infusion Broth (VIB) são inoculados com a cul tura de Bacillus a ser testada e incubados a 37°C e a 175 rpm de um dia para o outro. Ao mesmo tempo, 9 ml de calda de Brain Heart Infusion (BHI) são inoculados com uma cepa de E. coli selecionada a partir de E. coli O149 (O149:k91,k88a), E. coli O147 (O147:K89 F4), e E. coli O101 (O101, F5) e incubados de um dia para o outro.

[00045] As culturas de um dia para o outro de E. coli são adicionadas em um volume de 2 ml, cada um dentro de 200 ml de ágar VIB líquido, a 50°C e vertidos dentro de cada placa da bioanálise. As placas são secadas em um balcão estéril. A cultura de um dia para o outro de Bacillus a ser testada é sarapintada sobre a superfície do ágar VIB misturado com a E. coli e incubados a 37°C durante 2 dias. Os raios das zonas de inibição em torno dos pontos e os diâmetros dos pontos são registrados.

[00046] Uma cepa de Bacillus é considerada como exibindo uma atividade antimicrobiana com relação a E.coli se a zona de inibição for de pelo menos 1,5 mm. De preferência, a zona de inibição é de pelo menos 2,0 mm, tal como pelo menos 2,5 mm, mais preferência de pelo menos 3 mm, maior preferência de pelo menos 3,5 mm e ainda maior preferência de pelo menos 4 mm. A zona de inibição pode ser diferente com relação a diversas cepas de E. coli. Para uma cepa ser considerada como exibindo uma atividade antimicrobiana contra a E.coli, de acordo com a presente invenção, ela deve exibir uma zona de inibição de pelo menos 1,5 mm para todas as cepas de E. coli testadas, de preferência a zona de inibição de duas ou ainda mais de zonas de inibição de preferência de todas as três cepas de E.coli é de pelo menos 2 mm. Uma cepa de Bacillus da invenção é caracterizada pela inibição do crescimento de E. coli, de modo especifico a inibição do crescimento das espécies testadas. Como evidenciado pela técnica precedente e confirmado pelos presentes inventores, nenhuma inibição de crescimento de uma espécie de E. coli é quase sempre combinada com nenhuma inibição de crescimento de outra espécie de E. coli (Tabela 5, Barbosa et al., 2005) e vice-versa, isto é, a atividade inibidora de uma espécie de E coli é quase sempre combinada com a atividade de inibição de outra espécie de E. coli (Tabela 1, Guo et al., 2006).

[00047] A segunda parte do aspecto (II) da invenção se refere a uma cepa de Bacillus que exibe atividade antimicrobiana contra a Clostridium perfringens. De acordo com a presente invenção, isso é medido através do teste de ponto de ágar na Clostridium perfringens, executado da maneira que se segue.

[00048] 9 ml de VIB são inoculados com a cultura de Bacillus a ser testada e incubados a 37°C e a 175 rpm de um dia para o outro. Ao mesmo tempo, 9 ml de calda de BHI são inoculados com Clostridium perfringens do tipo A, DSM 756 e incubados de um dia para o outro a 37°C em um frasco anaeróbico.

[00049] Culturas de Bacillus são sarapintadas sobre a superfície do ágar VIB em placas de petri e incubadas a 37°C de um dia para o outro. Uma cultura de Clostridium perfringens em um volume de 2 ml é misturada com 200 ml de ágar BHI líquido e vertidos sobre o ágar VIB com os pontos cultivados de Bacillus. As placas são incubadas de forma ana- eróbica a 37°C durante 1 dia. Os raios das zonas de inibição clarificadas em torno dos pontos são medidos.

[00050] Uma cepa de Bacillus é considerada como exibindo uma atividade antimicrobiana com relação à Clostridium perfringens se a zona de inibição for de pelo menos 5 mm. De preferência, a zona de inibição é de pelo menos 6 mm, mais preferência de pelo menos 7 mm. Uma cepa de Bacillus da invenção é caracterizada através da inibição do crescimento da Clostridium perfringens, especificamente a inibição do crescimento da espécie testada. Como é do conhecimento da pessoa versada na técnica, nenhuma inibição de crescimento de uma espécie está quase sempre combinada com a não inibição do crescimento de outra espécie de Clostridium perfringens e vice versa, isto é, a inibição do crescimento de uma espécie de Clostridium perfringens é quase sempre combinada com a inibição do crescimento de outra espécie de Clostridium perfringens.

[00051] As células de Bacillus existem como células de esporos de Bacillus e células vegetativas de Bacillus. Quando é feita referência aqui neste pedido de patente às células de Bacillus, esta se refere à ambas.

[00052] A expressão “esporo de Bacillus” com relação às células de esporo de Bacillus se refere aqui, neste pedido de patente, a um esporo que, de acordo com a técnica, pode ser caracterizado como uma estrutura dormente, resistente, não reprodutiva produzida pela bactéria Bacillus. A função primária dos esporos é, em geral, de assegurar a sobrevivência de uma bactéria através de períodos de estresse ambiental. Eles são, por esse motivo, resistentes a radiação ultravioleta e gama, dessecação, lisozima, temperatura, inanição e desinfetantes químicos. Os esporos são comumente encontrados no solo e na água, onde eles podem sobreviver durante longos períodos de tempo. O revestimento do esporo é impermeável a muitas moléculas tóxicas e também pode conter enzimas que estão envolvidas na germinação. O núcleo tem uma estrutura de célula normal, tal como o DNA e ribossomos, porém é me- tabolicamente inativo. Quando uma bactéria detecta que as condições do meio ambiente estão se tornando desfavoráveis, ela pode iniciar o processo de esporulação, o que leva cerca de oito horas.

[00053] A expressão "célula vegetativa de Bacillus" se refere às células de Bacillus vegetativas funcionais, as quais podem se dividir para a produção de mais células vegetativas.

[00054] No aspecto (III), a invenção se refere a uma cepa de Bacillus que exibe uma percentagem de esporulação de pelo menos 80 quando medida no dia 2. De acordo com a presente invenção, a percentagem de esporulação é analisada da maneira que se segue.

[00055] Uma cepa de Bacillus a ser testada é adicionada a um volume de 50 μl, dentro de 700 μl de VIB, dentro de uma placa de cavidades fundas (DW) e incubada a 37°C e a 175 rpm de um dia para o outro. A cultura de Bacillus de um dia para o outro em um volume de 50 μl é transferida para 700 μl de um meio de esporulação que compreende (p/p) 95% de água; 1,5% de fonte de nitrogênio (isto é, levedura); 3% de sacarose, 0 06% de microminerais; fosfato de dipotássio hidrogênio 0,1% em placas DW. A placa é incubada a 37°C e a 175 rpm durante 3 dias.

[00056] A esporulação é seguida através da microscopia e a percentagem de esporos (número de esporos comparado com o número total de células de Bacillus) é determinada através de avaliação visual depois de 1 dia (24 horas), 2 dias (48 horas) e 3 dias (72 horas) de incubação. Através da expressão “tendo uma percentagem de esporulação de pelo menos 80 quando medida no dia 2”, é significado que pelo menos 80% das células haviam produzido esporos depois de dois dias de incubação. A percentagem de esporulação pode de preferência ser mais alta, tal como de pelo menos 85%; pelo menos 90%, pelo menos 95% ou de pelo menos 99%. Um objetivo importante da presente invenção é o de selecionar cepas de Bacillus que tenham células com uma alta percentagem de esporulação com a finalidade de tornar a cepa útil para a produção de rações para animais. Uma alta percentagem de esporulação, que também pode ser determinada como uma alta taxa de esporulação, é necessária para uma alta eficiência de produção, como descrito acima.

[00057] Como descrito acima, a técnica precedente descreveu métodos para a seleção de cepas de Bacillus, porém os métodos de triagem da técnica precedente não focalizaram a percentagem de esporulação. Por consequência, as cepas de Bacillus selecionadas através da técnica precedente não são prováveis de esporulação em um grau suficiente para cumprir a percentagem de esporulação descrita aqui neste pedido de patente.

[00058] Três cepas que têm a capacidade combinada de altas propriedades de crescimento e de esporulação, não resistência a antibióticos e alta atividade antimicrobiana foram selecionadas e depositadas. Porém, também outras cepas, especificamente cepas da espécie de Bacillus amyloliquefaciens (ver as cepas D - J nas tabelas 2 e 3), satisfazem os critérios delineados nas reivindicações e, por esse motivo, estão incluídas dentro do âmbito da presente invenção.

[00059] Como se torna evidente a partir da Figura 1, especificamente muitas das cepas da espécie Bacillus amyloliquefaciens estão dentro do âmbito da presente invenção. É surpreendente que muitas das cepas de Bacillus amyloliquefaciens têm efeito antimicrobiano, à medida que tem sido presumido até o presente que o efeito antimicrobiano do gênero Bacillus é especifica para a cepa e não relacionado com a espécie.

[00060] Com base nas descrições detalhadas das análises, a pessoa de habilidade comum na técnica é capaz de repetir essas análises para a determinação se uma cepa especifica de Bacillus está em conformidade com a sensibilidade do item (I), a atividade antimicrobiana do item (II) e a percentagem de esporulação do item (III) dos vários aspectos da invenção. Dessa forma, a pessoa de habilidade comum na técnica será capaz de produzir de forma consistente cepas com as propriedades determinadas, de preferência, o método de seleção também irá incluir (iv) análise com relação à sensibilidade das células vegetativas em um pH 4 e (v) análise com relação à resistência da bile para assegurar que as cepas são capazes de sobreviver em um grau suficiente no trato gastrintestinal. Evidentemente, essas análises podem ser executadas em qualquer ordem e algumas cepas podem ser excluídas durante o processo se elas não satisfizerem os critérios.

[00061] A cepa da invenção é do gênero Bacillus, de preferência uma da espécie como Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens ou Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum, Bacillus simplex, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mojavensis, Bacillus pu- milus, Bacillus safensis, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Bacillus atrophaeus, Bacillus methylotrophicus, Bacillus siamensis, Bacillus val- lismortis or Bacillus tequilensis.

[00062] O método inicial de identificação das 261cepas foi baseado em 16S. Este método não consegue distinguir entre algumas espécies proximamente relacionadas de Bacillus. Desse modo, uma cepa pode ser identificada como relacionada ao grupo que consiste nas espécies Bacillus amyloliquefaciens/atrophaeus/methylotrophicus/siamensis/val- lismortis ou do grupo que consiste nas espécies Bacillus mojaven- sis/subtilis/tequilensis. Ambos os grupos contém muitas cepas que satisfazem os critérios da invenção e esses grupos, por esse motivo, representam modalidades importantes da invenção.

[00063] Quando considerado apropriado, as cepas podem também ser identificadas através de um método mais detalhado (gyr B). Os dados estão mostrados nas Tabelas 2 e 3 e são primariamente baseados em Bacillus amyloliquefaciens (identificados por gyr B). Os isolados de Bacillus amyloliquefaciens selecionados foram ainda identificados através da análise de sequência de gene por RMA polimerase subunidade beta (rpo B) e as subespécies identificadas e apresentadas nas Tabelas 4, 5 e 6.

[00064] É desejável que a cepa exiba estabilidade ao calor. Os resultados com relação às cepas selecionadas são apresentados na Tabela 4. A estabilidade ao calor a 99°C é medida em cfu como a redução depois de 2, 5 e 10 minutos em relação ao tempo 0 (log/log). Uma redução abaixo de 2 é conseguida com formulações comerciais comuns de esporo de Bacillus. Com relação às cepas, dentro do âmbito da presente invenção, a redução deve ser, de preferência, de 0,5 ou menos depois de 2 minutos, mais preferência de 0,25 ou menos, maior preferência de 0,05 ou menos. Em modalidades preferíveis, a redução depois de 6 minutos deve, de preferência, ser de 2,5 ou menos, mais preferência de 1 ou menos, maior preferência de 0,5 ou menos e depois de 10 minutos a redução também deve ser de preferência de 2,5 ou menos, mais preferência de 1 ou menos, maior preferência de 0,5 ou menos. Todas as cepas na tabela exibem uma estabilidade ao calor apropriada. Como se torna evidente a partir da tabela, as cepas B, D e F têm uma estabilidade ao calor muito alta, mesmo depois de 10 minutos. É de se notar que ambas B e F são Bacillus amyloliquefaciens subsp. As cepas de amylo- liquefaciens que fazem estas subespécies são uma modalidade preferencial da presente invenção.

[00065] A produção de enzima foi investigada no Exemplo 4. As presentes descobertas mostram, para todas as cepas investigadas, uma atividade de celulase de 50 mU/ml ou mais. É contemplado que essa tal atividade será uma propriedade benéfica com relação a uma cepa de Bacillus da investigação. Para determinada modalidade, pode ser de preferência que a cepa tenha uma atividade de celulase ainda mais alta, tal como 100 mU/ml ou mais, como encontrada com relação às cepas B.amyloliquefaciens subsp. plantarun, que fazem dessa subespécie uma modalidade preferencial da presente invenção. Com relação às cepas dentro do âmbito da presente invenção, a atividade de celulase deve de preferência ser de 50 mU/ml ou mais, mais preferência de 100 mU/ml ou mais, maior preferência de 250 mU/ml ou mais, ainda de maior preferência de 400 mU/ml ou mais.

[00066] Algumas das cepas exibem uma alta atividade de xilanase de 70 mU/ml ou mais. A Tabela 5 mostra que, com relação às cepas investigadas, a atividade de alta celulase não está necessariamente combinada com uma alta atividade de xilanase ou de protease definida como 40000 RFU/OD ou mais. As cepas G, I e J, que são todas da B.amyloliquefaciens subsp. plantarun, são exemplos de cepas que demonstram uma elevada atividade com relação às três enzimas

[00067] Em uma modalidade preferencial, a cepa de Bacillus é uma cepa de Bacillus subtilis, uma Bacillus mojavensis ou um Bacillus amyloliquefaciens. De maior preferência, a cepa é selecionada a partir do grupo que consiste na (a) cepa de Bacillus mojavensis com um número de acesso DSM 25839; (b) as cepas de Bacillus amyloliquefaciens com o número de acesso DSM 25840, número de acesso DSM 27032 ou número de acesso DSM 27033, e (c) cepa de Bacillus subtilis com o número de acesso DSM 25841 e as cepas mutantes das mesmas.

[00068] Outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma cepa mutante de (a) cepa de Bacillus mojavensis com um número de acesso DSM 25839; (b) as cepas de Bacillus amylolique- faciens com o número de acesso DSM 25840, número de acesso DSM 27032 ou número de acesso DSM 27033 ou (c) cepa de Bacillus subtilis com o número de acesso DSM 25841; o método compreendendo submeter de modo opcional a cepa a um tratamento de mutagenização e selecionando com relação às cepas mutantes que tenham as seguintes propriedades (i) sensibilidade com relação à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, te- traciclina e cloranfenicol; (ii) atividade antimicrobiana contra E. coli e Clostridium perfringens, (iii) uma percentagem de esporulação de pelo menos 80 quando medida no dia 2.

[00069] A cepa pode ser submetida a um tratamento para a mutagê- nese como descrito em mais detalhe abaixo, para obter cepas mutantes e em seguida é realizado um processo de seleção. Como alternativa, a seleção é realizada com relação a mutantes que ocorrem de forma espontânea.

[00070] O método para a obtenção de uma cepa mutante também pode incluir (iv) analisando com relação à sensibilidade das células ve- getativas no pH de 5, e (v) analisar, com relação à resistência à bile, para assegurar que as cepas são capazes de sobreviver em um grau suficiente no trato gastrintestinal. Evidentemente, essas análises podem ser executadas em qualquer ordem e algumas cepas podem ser excluídas durante o processo, se elas não satisfizerem os critérios.

[00071] Uma “cepa” bacteriana, na forma usada aqui neste pedido de patente, se refere a uma bactéria que permanece geneticamente não mudada quando cultivada ou multiplicada. A capacidade de multiplicação de bactérias idênticas está incluída.

[00072] “Cepa do tipo natural” se refere a uma forma não mudada de uma bactéria como encontrada na natureza.

[00073] Uma “bactéria mutante” ou uma “cepa mutante” se refere a uma bactéria mutante natural (espontânea, que ocorre na natureza) ou uma bactéria mutante induzida que compreende uma ou mais mutações no genoma da mesma (DNA), que estão ausentes no DNA do tipo natural. Um “mutante induzido” é uma bactéria na qual a mutação foi induzida através de tratamento humano, tal como o tratamento com qualquer tratamento para metagênese usado de forma convencional, incluindo o tratamento com agentes de metagênese químicos, tais como os agentes de metagênese química selecionados a partir de (i) um agente de mutagênese que se associa com ou que se torna incorporado dentro do DNA, tal como um análogo de base como, por exemplo, a 2-aminopurina ou um agente de interquelação, tal como o ICR-191, (ii) um agente de mutagênese que reage com o DNA incluindo agentes de alquilação, tais como a nitroso guanidina ou a hidroxilamina ou sulfonato de metil etano (SEM) ou N-metil-N’-nitro-N-nitroguanidina (NTG), radiação UV e gama, etc. Em contraste, um “mutante espontâneo” ou um “mutante de ocorrência natural” não foi submetido à metagênese pelo homem.

[00074] Um mutante pode ter sido submetido a vários tratamentos para a mutagênese (um tratamento único deve ser entendido como uma etapa de mutagênese seguida por uma etapa de triagem/ seleção), porém é presentemente de preferência que não mais do que 20 ou não mais do que 10 ou não mais do que 5 tratamentos ( ou etapas de tria- gem/ seleção) sejam executadas. Em um mutante presentemente de preferência, menos do que 1%, menos do que 0,1, menos do que 0,01, menos do que 0,001% ou mesmo menos do que 0,0001% dos nucleotí- deos no genoma da bactéria tenham sido substituídos com outro nucle- otídeo ou deletado, comparado com a cepa de origem.

[00075] As bactérias mutantes, como descrito acima, são não GMO, isto é, não modificadas através de tecnologia de DNA recombinante. Como uma alternativa ao método de preferência acima para a provisão de um mutante através da mutagênese aleatória, também é possível prover um tal mutante através da metagênese direcionada ao sítio, como por exemplo, através da utilização de técnicas de PCR projetadas de forma apropriada ou através da utilização de um elemento transpo- nível que possa ser integrado nos replicons da bactéria.

[00076] Quando um mutante é provido como um mutante de ocorrência espontânea, a cepa do tipo natural acima é submetida à etapa de seleção sem qualquer tratamento para a mutagênese precedente.

[00077] Varias espécies Bacillus tem um estado GRAS , isto é, são em geral reconhecidos como seguros. Todas as cepas de B. subtilis são GRAS. As cepas de Bacillus descritas aqui neste pedido de patente são aeróbicas e formadoras facultativas de esporos. As espécies de Bacillus que são somente formadoras de esporos são consideradas como GRAS. Os micro-organismos de alimentação que têm estado GRAS para pecuária é uma prática aceitável entre produtores, veterinários e outros na indústria da pecuária.

[00078] Em consequência, em um outro aspecto, a invenção se refere a uma composição de Bacillus que compreende células de uma cepa de Bacillus da invenção. A composição pode compreender células de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mesmo mais cepas de Bacillus escolhidas a partir de pelo menos uma das cepas da invenção. De preferência, as células da composição de Bacillus são células de esporos.

[00079] As cepas relevantes de Bacillus da composição podem estar presentes em uma forma comercial relevante conhecida das pessoas versadas na técnica. Em consequência, em uma modalidade, as cepas de Bacillus da composição estão presentes como células secas (como por exemplo, secadas por pulverização) ou como células congeladas. A composição pode ser provida em qualquer forma adequada, tal como na forma de um líquido, uma suspensão espessa, um pó ou uma pélete.

[00080] Em uma modalidade preferencial, a composição de Bacillus compreende a partir de 105 até 1012 CFU/g, mais preferência a partir de 106 até 1012 CFU/g e maior preferência a partir de107 até 1012 CFU/g.

[00081] O termo “CFU” se refere ao peso em gramas da composição, tal como incluindo aditivos relevantes adequados presentes na composição. Como é conhecido da pessoa versada na técnica, uma composição bacteriana comercialmente relevante em geral também compreende outros aditivos relevantes, tais como, por exemplo, um veículo/ ingrediente do grupo pertencente a trigo, permeado de trigo, carbonato de cálcio/ pedra calcária e agentes antiaglutinação, tais como silicatos de alumínio e terra diatomácea. Não é incluído o peso de um recipiente adequado usado para a embalagem da composição de Bacillus. Uma modalidade se refere a uma composição embalada dentro de um recipiente adequado.

[00082] As composições da presente invenção podem incluir uma cepa de Bacillus da invenção incluindo mutantes e veículos que tornam essas composições adequadas para a alimentação de animais, tais como aditivos da ração ou como um aditivo para água potável. Alternativamente, a cepa de Bacillus da invenção, incluindo os mutantes, pode ser formulada com ingredientes de ração para animais, incluindo a proteína da ração e/ou os carboidratos da ração. Essas combinações podem estar na forma de péletes, que são extrudadas através de processos de peletização padrão.

[00083] A composição de Bacillus, como descrita aqui neste pedido de patente, pode ser usada como um aditivo probiótico para a ração de animais. A invenção também proporciona um método para a produção de uma ração para animal ou uma pré-mistura que compreende a adição de uma composição de Bacillus da invenção para uma ração para animal.

[00084] Na forma usada aqui neste pedido de patente, a expressão “pré-mistura” se refere a uma cepa de Bacillus adicionada a um veículo para fazer uma pré-mistura que é, em seguida, adicionada à ração em uma taxa de inclusão desejada e alimentada para o animal.

[00085] Outro aspecto da invenção se refere a um método para a alimentação de um animal que compreende a administração de uma composição de Bacillus da invenção ou uma ração para animal ou uma pré-mistura produzida, de acordo com a invenção, para um animal.

[00086] O Exemplo 5 descreve ensaios de alimentação com as cepas B e C e mostra que ambas as cepas de Bacillus em produtos pro- bióticos suplementados para dietas de berçário aumentaram numericamente o desempenho reprodutivo quando comparado com um grupo de controle negativo. Efeitos significativos sobre os parâmetros de produção puderam ser observados durante os ensaios. A porcentagem de mortalidade foi reduzida em ambos os grupos de Bacillus e em ambos os ensaios.

[00087] Em um dos sítios, o número de animais tratados por curral com Enrofluxacina para superar a diarreia grave foi significativamente mais alto ( p > 0,05) naqueles animais alimentados com uma dieta de controle do que aqueles alimentados com Bacillus.

[00088] Dessa forma, esse exemplo demonstra que a administração da composição de Bacillus da invenção pode ser usada para o tratamento e a prevenção de doenças, como por exemplo, através da inibição de patógenos, tais como a E. coli e Clostridium no animal. A composição de Bacillus pode ser alimentada como um microbiano de alimentação direta ou como aditivo de alimentação na ração do animal. As composições da presente invenção são administradas ou alimentadas a um animal em uma quantidade eficaz para a diminuição do crescimento de bactérias patogênicas, tais como a Clostridia e a Escherichia coli nos intestinos do animal.

[00089] O animal pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em aves domésticas, ruminantes, bezerros, porcos, coelhos, cavalos, peixes e animais de estimação. Em uma modalidade preferencial, o animal é um animal de fazenda, o qual é criado para consumo, tais como porcos, ou como produtores de alimentos, tais como frangos e galinhas para a produção de ovos.

[00090] Os métodos para a administração de uma ou mais cepas de Bacillus a um leitão também são providos. Esses métodos podem incluir a alimentação de um ou mais cepas de Bacillus da invenção à progenitora de um leitão. A cepa ou cepas podem ser alimentadas durante a gestação, lactação ou ambas. A uma ou mais cepas de Bacillus também podem ser alimentadas a porcos no viveiro e a porcos no final do crescimento.

[00091] O uso dos termos “um/uma” e “o/a” referentes similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações que se seguem) são para serem considerados como cobrindo ambos o singular e o plural, a não ser que indicado de outra forma aqui neste pedido de patente ou claramente contraditos pelo contexto. Os termos “compreendendo”, “tendo”, “incluindo” e “contendo” são para serem considerados como termos em aberto (isto é, significando “incluindo, porém não limitado a”) a não ser que observado de outra forma. A narração de faixas de valores aqui neste pedido de patente que são meramente destinadas a servir como um método de taquigrafia, se referindo de forma individual a cada valor separado que caia dentro da faixa, a não ser que indicado de outra forma aqui neste pedido de patente, e cada valor separado é incorporado dentro da especificação como se ele fora individualmente indicado aqui neste pedido de patente. Todos os métodos descritos aqui neste pedido de patente podem ser executados em qualquer ordem adequada, a não ser que indicado de outra forma aqui neste pedido de patente ou contradito claramente de outra forma pelo contexto. O uso de qualquer um ou de todos os exemplos ou de linguagem de exemplos (como por exemplo, “tal como”) provido aqui neste pedido de patente, é destinado meramente a iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação do âmbito da invenção, a não ser que reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem na especificação deve ser considerada como indicativa de qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00092] Cepas depositadas

[00093] A Bacillus mojavensis cepa CHCC 15510 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 25839 com a data de depósito de 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Denmark. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Fins de Procedimento de Patentes.

[00094] A Bacillus amyloliquefaciens cepa 15516 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 25839 com a data de depósito de 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Denmark. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Fins de Procedimento de Patentes.

[00095] A Bacillus amyloliquefaciens cepa 15536 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 27032 com uma data de deposito de 21 se março de 2013 por Chr. Hansen A/S, Denmark. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Fins de Procedimento de Patentes.

[00096] A Bacillus amyloliquefaciens cepa 15539 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 27033 com uma data de deposito de 21 de março de 2013 por Chr. Hansen A/S, Denmark. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Fins de Procedimento de Patentes.

[00097] A Bacillus subtilis cepa 15541 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhof- fenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 27033 com uma data de deposito de 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Denmark. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patentes.

[00098] Com relação a todos os micro-organismos depositados acima identificados, as indicações adicionais que se seguem se aplicam:

[00099] No que diz respeito aos respectivos Escritórios de Patentes dos respectivos estados designados, os requerentes solicitam que uma amostra dos micro-organismos depositados acima referidos só serão disponibilizadas para um especialista nomeado pelo solicitante até a data em que a patente for concedida ou a data em que o pedido de patente tenha sido recusado ou retirado ou seja considerado como retirado.

[000100] Modalidades da presente invenção estão descritas abaixo, a título de exemplos não limitativos.

[000101] EXEMPLOS

[000102] Materiais:

[000103] Veal Infusion Broth (VIB) (Difco, 234420)

[000104] Veal Infusion Broth (VIB) ágar (VIB + 1,5% de Ágar bacterio lógico (Ágar no. 1), Oxoid LP0011)

[000105] T3 placas de ágar (por litro: 3 g of triptona, 2 g de triptose, 1,5 g de extrato de levedura, 0,05 M de fosfato de sódio hidrogênio e 0,005 g de MnCl2 [pH 6,8], e 15 g de ágar)

[000106] Laura-Bertani (LB) calda (g/L: Bacto tryptone 10 (Difco 0123), Extrato de fermento 5 (Oxoid L21), NaCl 10 (Merck nr. 106404))

[000107] Brain Heart Infusion (BHI) Broth (Oxoid CM225)

[000108] Brain Heart Infusion (BHI) ágar (Oxoid CM375)

[000109] Sais de bile (Extrato de bile, porcino; Sigma B8631)

[000110] Placas de bioanálise (Nunc 240845)

[000111] Placas de Petri (Procudan 140096, placas de petri com nervuras)

[000112] Meio de esporulação: % (p/p) 95% de água; 1,5% de fonte de nitrogênio (isto é, levedura); 3% de sacarídeo; 0,06 % de micromine- rais; fosfato de dipotássio hidrogênio a 0,1%.

[000113] Solução salina fisiológica com peptona (0,9% de cloreto de sódio, 1% de peptona) FKP

[000114] VetMIC Lact-1 & Lact-2 (SVA, Uppsala, Sweden)

[000115] ISO-SENSITEST Broth (Oxoid CM0473).

[000116] Culturas

[000117] As cepas de Bacillus foram isoladas a partir de fezes, solo, fontes de alimento e coletadas a partir de coleções de banco de cepas e mantidas em VIB com 20% de glicerol em placas mestras MTP a - 80°C.

[000118] Antibióticos:

[000119] Ampicilina (Sigma, A9518-5G)

[000120] Vancomicina (Sigma, V1764-250MG)

[000121] Gentamicina (Sigma, G1264-50MG)

[000122] Canamicina (Sigma, K1377-1G)

[000123] Estreptomicina (Sigma, S6501-5G)

[000124] Eritromicina (Sigma E-5389)

[000125] Clindamicina (Sigma, C2569-10MG)

[000126] Tetraciclina (Sigma T-7660)

[000127] Cloranfenicol (Sigma, C0378-5G)

[000128] Patógenos:

[000129] E. coli O101 F5 (State Serum Institute, Copenhagen, Denmark)

[000130] E. coli O147:K89 F4 (State Serum Institute, Copenhagen, Denmark)

[000131] E. coli O149:k91,k88a (NCTC 10650) National Collection of Type Cultures

[000132] As cepas de E. coli foram mantidas em LB com 20% de gli- cerol em placas máster MTP a -80°C

[000133] Clostridium perfringens Tipo A, DSM 756, foi mantida em BHI com 20% de glicerol a -80°C

[000134] EXEMPLO 1: Pré-triagem

[000135] 261 isolados a partir de solo, fezes e fontes de alimentos fo ram submetidos a uma pré-triagem com relação à sensibilidade a antibióticos, inibição de patógenos, resistência à bile e sensibilidade a pH baixo.

[000136] Sensibilidade a antibióticos.

[000137] Cepas de Bacillus foram adicionadas em um volume de 50 μl a partir de placas mestre MTP em 700 μl de VIB em placas DW e incubadas a 37°C e a 175 rpm de um dia para o outro. As amostras de teste ISO, suplementadas com os antibióticos nas concentrações relacionadas nas na Tabela 1 a 2 e os controles ISO sem antibióticos, foram adicionados em placas MTP num volume de 180 μl. As culturas de Bacillus de um dia para o outro foram diluídas 100 vezes e transferidas em alíquotas de 20 μl para amostras de teste ISO e com (DO) a 620 nm foi medida no inóculo e em placas de teste MTP depois de 24 e 48 horas de incubação. A sensibilidade aos antibióticos das bactérias foi calculada em percentagem de OD nas amostras de teste ISO com relação ao OD nos controles ISO.

[000138] Triagem das cepas de Bacillus com relação à inibição de pa- tógenos.

[000139] Cepas de Bacillus foram adicionadas em um volume de 50 μl a partir de placas mestre MTP em 700 μl de VIB em placas DW e incubados a 37°C e a 175 rpm de um dia para o outro.

[000140] Antes da análise, cepas de E. coli foram cultivadas em LB de um dia para o outro a 30°C. A C. perfringens CHCC 14372 foi cultivada em BHI de um dia para o outro em um frasco aeróbico a 37°C.

[000141] Inibição de E. coli através de teste de ponto de ágar.

[000142] 2ml de cultura de E. coli de um dia para o outro foram misturados com 200 ml de ágar VIB líquido a 50°C e vertidos dentro de cada uma das placas de bioanálise. As placas foram secadas em uma bancada estéril. Culturas de um dia para o outro de Bacillus, 2 μl de cada, foram pintalgadas sobre a superfície do ágar VIB misturado com a E. coli e incubadas a 37°C durante 2 dias. Os raios das zonas de inibição clarificadas em torno dos pontos foram medidos e registrados como “alto” - raios de mais do que 2 mm, “médio” - raios entre 0,5 - 2 mm e “baixo” - raios de menos do que 0,5 mm.

[000143] Inibição de C. perfringens através de teste de ponto de ágar.

[000144] Ágar VIB foi vertido dentro das placas de bioanálise (200 ml por placa) e foram secadas completamente em uma bancada estéril. Culturas de um dia para o outro de Bacillus, 2 ul cada uma, foram pintalgadas sobre a superfície das placas de ágar VIB e incubadas a 37°C de um dia para o outro. C. perfringens Tipo A CHCC14372 foi adicionada em um volume de 21 ml para 200 ml de ágar BHI líquido, misturadas e sobrepostas suavemente dentro das placas de bioanálise com os pontos de Bacillus. As placas foram incubadas de modo anaeróbico, a 37°C durante um dia. Os raios das zonas de inibição clarificadas foram medidos e registrados como “altos” mais do que 2 mm, “médios” - entre 1 e 2 mm, “baixos” - menos do que 1 mm.

[000145] Inibição de C. perfringens pelo teste de difusão em cavidade.

[000146] ml de cultura de um dia para o outro de C. perfringens Tipo A CHCC 14372 foram misturados com 200 ml de ágar BHI líquido e vertidos dentro de cada uma das placas de bioanálise. Depois da solidificação, cavidades de 10 mm foram feitas no ágar BHI com um perfurador estéril e 80 ul de culturas de um dia para o outro de Bacillus foram transferidos para dentro de cada cavidade. As placas foram incubadas de forma anaeróbica a 37/C durante um dia. Os raios das zonas de ini-bição clarificadas em tornos das cavidades foram medidos e registrados como “altos” mais do que 2 mm, “médios” - entre 0,5 e 2 mm e “baixos” - menos do que 0,5 mm.

[000147] 1.3 Análise de resistência à bile.

[000148] Cepas de Bacillus foram adicionadas em um volume de 50 ul a partir de placas mestres MTP em 700 μl de VIB em placas DW e incubadas a 37°C a 175 rpm de um dia para o outro. As culturas de um dia para o outro de Bacillus em um volume de 50 μl foram transferidas para 800 μl de VIB suplementado com 0,3% de sais de bile (amostras de teste) e VIB sem bile (controle) em placas DW. As placas foram incubadas a 37°C e 175 rpm. A densidade ótica a 620 nm (OD620) foi medida nos tempos 0, 6 e 24 horas no VIB com bile e subtraídas a partir dos valores OD620 correspondentes nos controles VIB. As culturas foram classificadas de acordo com as diferenças em valores OD620 em grupos A (OD < 0,1), B (OD = 0,1 -0,4) e C (OD > 0,4). As cepas nos grupos A foram consideradas como as mais resistentes aos sais de bile. As cepas selecionadas devem estar no grupo A ou B. Os resultados com relação às cepas selecionadas estão apresentados na Tabela 2.

[000149] 1.4 Sensibilidade ao pH baixo ( simulando condições gástri cas).

[000150] Alíquotas de 800 μl de VIB ajustadas para o pH 4 com 1,0 M de ácido clorídrico e controles VIB (pH 7) foram distribuídas em placas DW. As cepas de Bacillus foram adicionadas em um volume de 50 μl a partir de placas mestras MTP para dentro de placas DW e incubadas a 37°C e 175 rpm durante 24 horas. A densidade ótica (OD620) foi medida em suspensões de 200 μl de células nos tempos 0 e depois de 24 horas de incubação. O crescimento bacteriano no pH 4 foi definido através da subtração dos valores de OD620 antes da incubação a partir dos valores correspondentes depois da incubação. As culturas que exibiram um aumento em OD620 de mais do que 0,1 foram consideradas como resistentes ao pH 4 (indicado com um R na tabela 2),enquanto que as culturas com valores OD620 de menos do que 0,1 (nenhum crescimento ou valores negativos) foram consideradas como sensíveis ao pH 4 (indicadas com um S na tabela 2).

[000151] 1.5 Resultados da pré-triagem.

[000152] Com base nos testes de pré-triagem, 32 cepas foram selecionadas para uma segunda triagem. As cepas selecionadas devem ser sensíveis com relação aos antibióticos descritos e exibir um efeito anti- microbiano contra ambas E. coli e Clostridium perfringens e ter tido um desempenho razoável nos outros testes realizados.

[000153] Dos 261 isolados a partir do solo, fezes e de fontes de alimentos, 161 isolados foram resistentes a antibióticos no teste de pré- triagem. Entre os 100 isolados que foram sensíveis aos antibióticos, 56 tiveram um efeito antimicrobiano contra a Clostridium perfringens e somente 22 tiveram efeito contra ambos E coli e Clostridium perfringens. Entre esses estavam 12 isolados a partir da espécie B. amyloliquefaci- ens. Outras cepas representativas foram a partir da espécie B. subtilis e B. mojavensis. As Tabelas 2 e 3 resumem os resultados das cepas proprietárias Chr. Hansen entre as 32 cepas selecionadas para a segunda triagem.

[000154] EXEMPLO 2: Triagem secundária.

[000155] Com base nos resultados da primeira triagem 40, isolados selecionados e cepas de referência foram testados com relação à inibição de patógenos pela repetição dos testes de pontos de ágar e com relação à esporulação. 32 cepas também foram testadas com relação à sensibilidade a antibióticos através do teste MIC.

[000156] Triagem de cepas de Bacillus com relação à inibição de pa- tógenos.

[000157] Antes da análise, 9 ml de VIB foram inoculados com as culturas de Bacillus e incubados a 37°C e 175 rpm de um dia para o outro. Ao mesmo tempo, 9 ml de calda BHI foram inoculados com cepas de E. coli, e incubados a 37°C de um dia para o outro. Clostridium perfringens foi cultivado nas mesmas condições em um frasco anaeróbico.

[000158] Inibição de E. coli através do teste de ponto de ágar.

[000159] Culturas de um dia para o outro de patógenos foram adicionadas em um volume de 2 ml cada dentro de 200 ml de ágar VIB líquido a 50°C e vertidos dentro de cada placa de bioanálise. As placas foram secadas em uma bancada estéril. As culturas de um dia para o outro de bacillus foram pintalgadas sobre a superfície do ágar VIB misturado com os patógenos e incubadas a 37°C durante 2 dias. Os raios das zonas de inibição em torno dos pontos e os diâmetros dos pontos foram regis-trados.

[000160] Inibição de C. perfringens através do teste de ponto de ágar.

[000161] Culturas de Bacillus foram pintalgadas sobre a superfície do ágar VIB em placas de petri e incubadas a 37°C de um dia para o outro. Cultura de C. perfringens de um dia para o outro em um volume de 2 ml foi misturada com 200 ml de ágar BHI líquido e vertida dentro de ágar VIB com pontos de Bacillus cultivados. As placas foram incubadas de forma anaeróbica a 37°C durante 1 dia. Os raios das zonas de inibição clarificadas em torno dos pontos foram medidos.

[000162] Cultura em VIB e meio de esporulação.

[000163] Cepas de Bacillus foram adicionadas em um volume de 50 μl a partir de placas mestras MTP dentro de 700 μl de VIB ou de meio de esporulação em placas DW e incubadas a 37°C e 175 rpm durante 24 horas. O crescimento bacteriano foi determinado através de densidade ótica a 620 nm (OD620) em suspensões de 200 ml. Devido a uma alta turvação do meio de esporulação e as variações do mesmo entre as cavidades, os valores OD620 antes da incubação foram subtraídos a partir dos valores de OD620 nas cavidades correspondentes depois da incubação. As culturas que mostraram o OD620 de mais do que 0,4 foram classificadas como do grupo A (alto crescimento) e OD620 de menos do que 0,4 - como o grupo B (baixo crescimento).

[000164] Esporulação em meio de esporulação.

[000165] Cepas de Bacillus foram adicionadas em um volume de 50 μl a partir de placas mestre MTP dentro de 700 μl de VIB em placas DW e incubadas a 37°C e 175 rpm. As culturas de Bacillus de um dia para o outro em um volume de 50 μl foram transferidas para 700 μl de meio de esporulação (SM) em placas DW. As placas foram incubadas a 37°C e a 175 rpm durante 3 dias. A esporulação foi seguida através de microscópio e a percentagem de esporos (número de esporos em relação ao total de células) foi determinado através de avaliação visual depois de 1 dia (24 horas), 2 dias (48 horas) e 3 dias (72 horas) de incubação.

[000166] Sensibilidade a antibiótico medida através de MIC.

[000167] As cepas foram analisadas com relação à sensibilidade a antibióticos através da medição da concentração inibidora mínima (MIC) com relação a um número de antibióticos. O método usado foi um método de microdiluição da calda como delineado através do padrão do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute M07-A8 and M45-A2).

[000168] Uma suspensão de uma cultura de um dia para o outro da cepa a ser testada é inoculada em ISO SENSITEST Broth (Oxoid CM 04730 em placas de microtitulação e em uma concentração aproximada de 105 cfu/ml (unidades de formação de colônia/ ml) em diluições de duas vezes do antibiótico a ser testado (volume total 100 μl/ cavidade) e incubada de forma aeróbica durante de 20 a 24 horas a 37°C. Os painéis pré-fabricados VetMIC Lact-1 & Lact-2 compreendendo os antibióticos ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomi- cina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol podem ser usados. Os resultados são registrados depois de 24 horas na concentração mais baixa do antibiótico para inibir o crescimento visível. O teste foi executado duas vezes em dois replicados biológicos independentes.

[000169] Resultados.

[000170] Os resultados a partir das 32 cepas selecionadas mostraram que o Bacillus amyloliquefaciens teve as melhores propriedades combinadas de sensibilidade a antibióticos, efeito antimicrobiano e esporula- ção, conforme a tabela 2.

[000171] Tabela 2.

[000172] Dados básicos com relação às cepas de Bacillus selecionadas.

[000173] Fonte, espécie por gyrB, cultura em VIB e meio de esporula- ção bem como percentagem de esporulação.

[000174] Cepa A = 15510; Cepa B = 15516; Cepa C = 15541; Cepa H = 15536; Cepa I = 15539.

[000175] Tabela 3.

[000176] Inibição de E. coli e Clostridium perfringens (mm) bem como resistência contra bile e ácido pelas cepas de Bacillus selecionadas.

[000177] Cepa A = CHCC15510; Cepa B = 15516; Cepa C = 15541; Cepa H = 15536; Cepa I = 15539. O149, O147 e O101 são três patóge- nos suínos de E.coli mencionados sob Patógenos.

[000178] EXEMPLO 3. Estabilidade ao calor.

[000179] 3.1 Método para o teste de estabilidade ao calor

[000180] Cepas de Bacillus foram cultivadas de um dia para o outro em VIB a 37°C e 220 rpm. As culturas de um dia para o outro foram espalhadas em placas T3 de ágar (100 μl de 105 - 106 diluições) e incubadas a 37°C durante 1 a 2 dias até que a esporulação tinha se completado. Os esporos foram raspados a partir das placas, suspensos em uma solução de FKP e incubados a 80°C durante 15 minutos com a finalidade de desativar as células vegetativas. As suspensões de esporos foram colocadas no gelo imediatamente depois do aquecimento. As preparações de esporos foram lavadas duas vezes com FKP, ressus- pensas em FKP com 20% de glicerol e mantidas a 80°C antes de serem usadas. A resistência ao calor dos esporos bacterianos foi avaliada mantendo tubos de eppendorf com 500 μl de suspensões de esporos em FKP (em uma concentração de aproximadamente 1 x 106 CFU por ml) a 99,5°C durante 2,5 e 10 minutos. As contagens de CFU foram determinadas em diluições de suspensões aquecidas colocadas em placas sobre ágar VIB depois de incubação a 37°C de um dia para o outro.

[000181] 3.2 Resultados do teste de estabilidade ao calor

[000182] Tabela 4: Estabilidade ao calor a 99,5°C de cepas de Bacillus selecionadas; medidas em cfu como redução depois de 2, 5 e 10 minutos em relação ao tempo 0 (log/log).

[000183] Cepa B = 15516; Cepa C = 15541; Cepa H = 15536.

[000184] Em geral, uma redução de menos do que 2 (log/log) cfu depois de 2 minutos com relação ao tempo 0 é apropriada para esporos serem incluídos em rações para peletização e resultados abaixo de 2 são alcançados com preparações de esporos de Bacillus comerciais comuns. Dessa forma, todas as cepas testadas e mostradas na Tabela 4 têm uma boa estabilidade ao calor. Algumas cepas também mostraram uma boa estabilidade ao calor depois de 5 e 10 minutos, isto é, a cepa B e a cepa F, ambas B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens que não mostraram redução na cfu.

[000185] EXEMPLO 4: Produção de enzima.

[000186] 4.1 Método para a análise de celulase.

[000187] Cepas de Bacillus foram cultivadas em meio de carboximetil celulose (CMC) (Abou-Taleb et al.,2009) ((per l: 10.0 g carboximetil celulose (C9481), 2.0 g Bacto Tryptone (cat. 211705, Becton Dickinson A/S, Denmark), 4 g KH2PO4, 4.0 g Na2HPO4, 0.2 g MgSO4.7H2O, 0.001 g CaCl2. 2H2O, 0.004 g FeSO4.7H2O, pH 7) a 37°C e agitação magnética vigorosa durante 24 horas. A produção de celulase foi determinada com a utilização do kit EnzChek Cellulase Substrat (cat. E33953, Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os sobrenadantes de cultura foram colhidos por centrifugação e distribuído em MTPs (200 μl por cavidade) em diluições em série. Os sobrenadantes foram colhidos através de centrifugação e distribuídos em placas MTP (200 μl por cavidade) em diluições em série. As curvas padrão foram construídas com a utilização de celulase de Aspergillus niger (c1184) se iniciando a partir de 2 U ml-1. Solução de substrato EnzChek foi adicionada aos sobrenadantes da cultura em placas Fluo- roNunc Blacl Nunc de 96 cavidades (cat. 237105, Thermo Fisher Scientific, NUNC Inc.).A fluorescência foi registrada como a excitação a 360 nm/ emissão de 420 nm depois de 30 minutos de incubação (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer Inc.). A atividade de celulase foi calculada a partir das curvas padrão em dois experimentos independentes e expressas como médias (U ml-1)

[000188] 4.2 Método para a análise de xilanase.

[000189] Culturas de Bacillus foram cultivadas em meio que continha xilano de madeira de faia (Cordeiro et al., 2002) (per l: 5.0 g xilano (X4252), 2.0 g extrato de levedura (cat. 288620, Becton Dickinson A/S, Denmark), 5.0 g Bacto Peptone (cat. 211677, Becton Dickinson A/S, Denmark), 0.5 g NaCl, 0.5 g MgSO4. 7H2O, 0.15 g CaCl2. 2H2O, pH 7,5) a 37°C e com agitação magnética vigorosa durante 24 horas. A análise da xilanase foi executada com o uso de EnzChek Ultra Xylanase Assay Kit (cat. E33650, Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, os sobrenadantes da cultura foram coletados através de centrifugação, distribuídos em placas MTP (200 μl por cavidade) em diluições em série e adicionado substrato de solução de trabalho de xilanase. A fluorescência nos sobrenadantes de cultura foi medida com excitação a 360 nm/ emissão 420 nm depois de incubação durante 30 min (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer Inc.). A Thermomyces lanuginosis (X2753) foi utilizada como o padrão de enzima e carregada em MTP em diluições em série, partindo de 25 mU ml- 1. A atividade da xilanase das cepas de Bacillus foi calculada a partir das curvas padrão e expressas como médias (mU ml-1) de duas análises independentes.

[000190] 4.3 Método para a análise de protease

[000191] Culturas de um dia para o outro de Bacillus (cultivadas em VIB a 37°C) foram transferidas para uma mistura de reação com Fluo- resceína Isotiocianato - caseína (FIT-C) como o substrato (sigma C 3777) e incubadas a 37°C durante 3 horas. Depois da precipitação, a quantidade de peptídeos solúveis foi medida através de fluorescência em uma excitação de 497 nm, emissão de 515 nm. Essa análise detectou uma ampla faixa de proteases (serina, aspártico, cisteina e metaloproteases).

[000192] 4.4 Métodos para a produção de película biológica.

[000193] Cepas de Bacillus foram adicionadas em VIB (cerca de 107 CFU ml-1) distribuídas em MTP de Propileno (PP) (96 Well Conical Btm PP Plt Natural; NUNC Inc., Denmark) e incubadas a 37°C durante 24 horas sem agitação. O crescimento foi controlado através de medições da densidade ótica (D) a 620 nm. A formação de película biológica foi avaliada através de manchamento com cristal violeta, como descrito anteriormente (Auger et al., 2009). Em resumo, depois da lavagem das cavidades com água destilada, uma solução de violeta cristal de 0,1% (w v-1) foi adicionada aos PP-MTP e as placas foram incubadas durante 30 minutos. Em seguida, o procedimento de lavagem foi repetido e eta- nol a 96% (v v-1) foi adicionado às placas. A absorção a 570 nm foi medida depois de 15 minutos de incubação (Wallac Victor 2 spectrophotometer, Perkin Elmer Inc.). As cepas de Bacillus ssp. foram classificadas tanto como altas (Abs579 nm > 2,0), média (Abs579 nm = 1,0 - 2, 0), ou baixa (Abs579 nm < 1,0), produtores de película biológica. A análise foi executada duas vezes em duplicata.

[000194] 4.5 Resultados para as análises de enzima.

[000195] Tabela 5 Produção de Enzima e de Película Biológica.

[000196] (RFU = unidade de fluorescência relativa)

[000197] Cepa A = 15510; Cepa B = 15516; Cepa C = 15541; Cepa H = 155; Cepa I = 15539.

[000198] A tabela mostra que as cepas E, G, H, I e J, que são todas B. amyloliquefaciens subsp. Plantarum, tiveram alta atividade de celu- lase enquanto que as cepas B e F, que são B. amyloliquefaciens subsp. Amyloliquefaciens, tiveram baixa atividade de celulase.

[000199] EXEMPLO 5: Testes com leitões.

[000200] Duas cepas de Bacillus selecionadas (Cepas B ou C) foram suplementadas em dietas de berçário para a avaliação do efeito das mesmas sobre o desempenho de crescimento e mortalidade de leitões depois do desmame. Como E. coli é um dos patógenos no período de berçário com o maior impacto sobre os parâmetros de produção e de mortalidade, esses testes podem dar informações acerca do efeito da inibição do E. coli nos animais. Os testes foram realizados em dois locais diferentes. O local 1 foi uma fazenda de pesquisa e o local 2 uma universidade. O conjunto de testes foi similar em ambos os locais. Tabela 6 Visão geral dos locais usados nos testes com leitões.

5.1.1 Arranjo experimental no local 1;

[000201] No dia do desmame, 576 leitões (28 dias de idade), de dois lotes consecutivos de desmame (288 leitões cada), originários da fazenda experimental, foram usados no experimento. Os leitões eram leitões de cruzamento (ACMC x Pletrain). Os leitões selecionados estavam saudáveis, com um bom aspecto geral e não tinham recebido nenhuma vacinação na fase de berçário. A fazenda experimental foi positiva com relação à Síndrome Reprodutiva & Respiratória (PRRS), porém sob controle, e tiveram alguns problemas de colibacilose na fase de pós- desmame. Os leitões foram classificados de acordo com o peso corporal e em seguida alocados àa 48 pocilgas em ambos os lotes de desmame (96 pocilgas no total), de tal forma que cada bloco de pocilgas continha 6 leitões, 3 machos inteiros e 3 fêmeas, de peso corporal similar em ambos os tratamentos. Os tratamentos foram alocados às pocilgas de leitões pesados e leves em blocos, de tal forma que cada um dos tratamentos foi aplicado à 24 pocilgas de 6 leitões (6 pocilgas por tratamento e salão; 12 pocilgas por tratamento e lote de desmame). Os produtos de Bacillus foram adicionados à ração a 400 g/tonelada de ração ou 1,8 *10 7 CFU/g de ração.

[000202] Os porcos foram pesados individualmente em dias 28 (dia 0; dia do desmame), 35, 42 e 62 dias de idade para o cálculo da média de ganho de peso diária (ADWG). A ingestão média diária de ração (ADFI) e a proporção de conversão da ração (FCR) foram medidas para cada pocilga nas mesmas fases (28 - 35; 35 - 42; 42 - 63) e com relação a períodos principais (pré-início,28 - 42 dias de idade; início: 42 - 63 dias de idade ; e período total de berçário). A mortalidade e a incidência de patologias foram controladas diariamente, incluindo o registro de tratamentos antibióticos individuais aplicados. Tabela 7

[000203] Parâmetros de produção no local 1

[000204] Valores de P comparados com controle (A: P = < 0,01; a = < 0,05)

[000205] Cepa B = 15516; Cepa C = 15514

[000206] SE - Erro padrão

[000207] 5.1.2 Resultados.

[000208] Ambos os produtos probióticos com cepas de Bacillus suplementados às dietas de berçário aumentaram numericamente o desempenho comparado com um grupo de controle negativo, sem exibir diferenças entre os mesmos. Efeito significativo em ambos ADG e F. A percentagem de mortalidade foi reduzida em ambos os grupos de Bacillus (% de mortalidade: Controle (3,47), Cepa B (1,39%), Cepa C (2,8)).

[000209] 5.2.1 Arranjo experimental no local 2.

[000210] Imediatamente depois do desmame, todos os leitões selecionados foram alojados em uma sala de desmame de 24 pocilgas com trinta animais por pocilga. A sala é equipada com aquecimento central e ventilação forçada com sistema de resfriamento e pavimentos de grelha. Cada pocilga foi equipada com um alimentador seco - molhado de paredes duplas para assegurar a alimentação ad libitum e livre acesso à água com capacidade para alimentação de três animais ao mesmo tempo. Rações foram distribuídas ad libitum durante toda a fase experi-mental.

[000211] Um total de setecentos e vinte leitões desmamados de cruzamento comercial [Pietrain x (Landrace x Large White)] foi usado. Os animais foram obtidos a partir de porcas da mesma fazenda no dia do desmame e movidas para a facilidade experimental (sem transporte). Leitões machos e fêmeas de 28 dias de idade de 7,0 kg SD = 1,64 kg de BW foram usados. Identificações de plástico nas orelhas com o número do animal foram usadas. Os animais foram distribuídos em três blocos por peso corporal inicial. Dentro de cada bloco os leitões foram distribuídos em pocilgas com relação a uma distribuição de peso corporal equilibrada. Por esse motivo, cada bloco consistia de 8 pocilgas de 30 animais, às quais as dietas experimentais foram atribuídas de forma aleatória.

[000212] O teste se iniciou no desmame com 28 dias de idade. Os animais foram pesados de forma individual nos dias 0 e 7 e pesados em grupo nos dias 21 e 35 no teste. O desaparecimento de ração a partir de cada comedouro foi medido durante todo o experimento. A ingestão média diária de ração (ADFI), ganho médio diário (ADG) e proporção de alimentação (FCR) de acordo com a ingestão total de ração foram, dessa forma, calculados. O estado de saúde dos leitões foi avaliado re-gularmente e quaisquer sinais anormais ou medicações dadas foram registrados. A taxa de mortalidade e a percentagem de abate também foram calculadas.

[000213] Tabela 8

[000214] Parâmetros de produção no local 2.

[000215] Médias de quadrados mínimos, Valores P comparados com o controle (A: P = < 0,1)

[000216] Cepas B = 15516; Cepa C = 15541

[000217] 5.2.2 Resultados

[000218] Ambas as cepas de Bacillus suplementadas às dietas de berçário aumentaram numericamente o desempenho de produção quando comparados com um grupo de controle negativo, sem exibir diferenças entre os mesmos. O efeito significativo em ambos ADG e FU pôde ser observado nos períodos de teste.

[000219] O número de animais tratados por pocilga com Enrofluxa- cina para superar uma diarreia grave foi significativamente mais alto (P > 0,05) naqueles animais alimentados com a dieta de controle do que com aqueles alimentados com Bacillus durante a primeira semana depois do desmame. Os mesmos resultados (P < 0,05) foram observados durante todo o período experimental (0 a 35 dias depois do desmame). A percentagem de mortalidade foi reduzida em ambos os grupos de Bacillus (% de mortalidade: Controle (4,17), Cepa B (0,04%), Cepa C (2,65)).

[000220] REFERÊNCIAS

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Claims (7)

1. Composição de Bacillus, caracterizada pelo fato de que compreende células de pelo menos uma cepa de Bacillus selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) cepa Bacillus mojavensis com o número de acesso DSM 25839; (b) cepas Bacillus amyloliquefaciens com o número de acesso DSM 25840, número de acesso DSM 27032 ou número de acesso DSM 27033; e (c) cepa Bacillus subtilis com o número de acesso DSM 25841 e aditivos e/ou veículos adequados para a alimentação de animais.

2. Composição de Bacillus, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende células de pelo menos duas cepas como definidas na reivindicação 1.

3. Composição de Bacillus, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende células de pelo menos três cepas como definidas na reivindicação 1.

4. Composição de Bacillus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as células da cepa ou das cepas de Bacillus são esporos.

5. Método para a produção de uma ração para animal ou uma pré-mistura, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar uma composição de Bacillus, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 a uma ração de animal.

6. Método para a alimentação de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição de Bacillus como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou uma ração para animal ou uma pré-mistura, produzida de acordo com o método como definido na reivindicação 5 a um animal.

7. Método para a alimentação de um animal, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal selecionado a partir do grupo que consiste em aves domésticas, ruminantes, bezerros, porcos, coelhos, cavalos, peixe e animais de estimação.

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