CN109730198B - 一种利用响应面实验提高豆粕发酵效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种利用响应面实验提高豆粕发酵效率的方法。本发明首次利用响应面实验对豆粕的发酵条件进行优化，以大豆肽转化率和植酸降解率为双重响应值，优化得到最佳的发酵条件及发酵菌株。该方法拟合度好，实验结果可靠。相比于植物乳杆菌，西姆芽孢杆菌的大豆肽转化率效果更为显著，经优化后的发酵条件，固态发酵豆粕中的平均肽转化率为60.49％，植酸降解率为69.12％。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种利用响应面实验提高豆粕发酵效率的方法。
背景技术
豆粕是指以大豆为原料用预压浸提或浸提取法提取油脂后，经过适当热处理与干燥所得的产品。豆粕是目前使用最多、最广泛的饲料工业原料，与动物源性蛋白饲料相比，具有货源充足、含毒害物质概率低、安全系数高等特点。现今世界上饲料领域研究的热点之一为利用微生物发酵豆粕来生产小肽并同时降解大量的抗营养因子。微生物发酵豆粕不但提高了豆粕中小肽含量和降解了豆粕中的抗营养因子，而且促进了动物的生长和生产能力及减少疾病的发生率。同时改善了豆粕发酵生产对环境的污染，给动物养殖提供了全天然无公害高营养价值的豆粕饲料产品。为了得到优质的发酵豆粕饲料，选取高效发酵豆粕的菌种及优化发酵条件则至关重要。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供一种利用响应面实验提高豆粕发酵效率的方法，具体包括以下步骤：
S1.选取实验菌株，以豆粕作为基础发酵培养基，用单因素方法分别接菌量、培养时间、培养温度和料水比四个培养条件逐一进行单因素优化，测定不同的接菌量、培养时间、培养温度和料水比对大豆肽转化率的影响；所述的接菌量梯度为2％、5％、8％、11％、14％，比值是菌株种子液体积与培养基中豆粕质量之比(mL/g)；时间梯度为：24h、36h、48h、60h、72h；温度梯度为：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃；料水比(g/mL)梯度为1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4；
S2.根据步骤S1的测试结果，筛选出多肽转化率最好的菌株，优化其发酵条件；
S3.在步骤S1所得的单因素优化结果的基础上，以培养温度、培养时间、接菌量、料水比作为4个因素自变量，每个因素选取低、中、高3个水平，以大豆肽转化率和植酸降解率的对数值分别为双重响应值Y和X，设计响应面实验进行深度优化，得到最佳的发酵条件。
所述步骤S1中选取西姆芽孢杆菌和植物乳杆菌为实验菌株，所述的实验菌株均市售可得。本发明的西姆芽孢杆菌(Bacillussiamensis)购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 06497。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.568。
所述步骤S1中，初始设定培养条件为48h、35℃、料水比1:1，接菌量5％；根据每组单因素的条件替换掉初设培养条件。
所述的固态发酵豆粕培养基制备方法为：称取磨碎的且过60目的筛子的豆粕20g，分装于150mL锥形瓶中，121℃灭菌30min后，65℃烘干后，在接菌时添加一定的无菌水。
所述步骤S3中得到的优化条件为：采用固态发酵豆粕培养基，西姆芽孢杆菌接菌量11.2％，温度：34.89℃，时间60.42h，料水比1:1.06。
本发明选择西姆芽孢杆菌发酵豆粕可提高豆粕的应用范围。一方面，西姆芽孢杆菌具有良好的抑菌性和纤维素酶活性剂，同时其微藻溶藻效果好，可提高水体的免疫能力，有效防止赤潮，该菌株能够耐浓度10％的盐环境，耐盐性好，适宜用于海洋或高盐水环境的应用。采用本发明方法发酵的豆粕还可以用于制备水体表面石油凝聚产品的载体等。另一方面，西姆芽孢杆菌其单菌大豆肽的转化率高，达到出乎预料的技术效果。
本发明首次利用响应面实验对豆粕的发酵条件进行优化，以大豆肽转化率和植酸降解率为双重响应值，优化得到最佳的发酵条件及发酵菌株。该方法拟合度好，实验结果可靠。相比于植物乳杆菌，西姆芽孢杆菌的大豆肽转化率效果更为显著，经优化后的发酵条件，固态发酵豆粕中的平均肽转化率为60.49％，植酸降解率为69.12％。
附图说明
图1接菌量对大豆肽转化率的影响；其中，S1为西姆芽孢杆菌；S2为植物乳杆菌。
图2培养时间对肽转化率的影响；其中，S1为西姆芽孢杆菌；S2为植物乳杆菌。
图3培养温度对肽转化率的影响；其中，S1为西姆芽孢杆菌；S2为植物乳杆菌。
图4料水比对肽转化率的影响；其中，S1为西姆芽孢杆菌；S2为植物乳杆菌。
图5发酵条件对发酵豆粕肽转化率的影响，其中A为时间与温度的关系；B为料水比与接种量的关系；C温度与料水比的关系；D料水比与时间的关系；E接种量与时间的关系；F接种量与温度的关系。
图6发酵条件对对发酵豆粕中的植酸降解率的影响，其中A为接菌量与时间的关系；B为温度与料水比的关系；C为温度与时间的关系；D为料水比与接种量的关系；E为接种量与温度的关系；F为料水比与时间的关系。
图7西姆芽孢杆菌活性粗提物对苹果炭疽病菌菌丝的抑制作用；
图8西姆芽孢杆菌对苹果炭疽病菌丝的抑制情况。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
下述实施例中，大豆肽的产量计算：肽转换率(％)＝酸溶性蛋白含量/粗蛋白含量*100％。
豆粕发酵结束后，经105℃烘干2h，然后参照《GB/T 22492-2008大豆肽粉》测定发酵豆粕中酸溶性蛋白的含量，参照《GB/T 5009.5-2003》测定发酵豆粕中粗蛋白的含量。
植酸含量测定方法详见《GB5009.153—2016》食品中植酸的测定。
植酸降解率(％)＝(初始豆粕植酸含量-实验组植酸含量)/初始豆粕植酸含量*(1-豆粕水分百分含量)*100％
实施例1
(1)活化菌株
选取西姆芽孢杆菌和植物乳杆菌为实验菌株。配置LB和MRS固体培养基，制作成斜面以及平板，于-80℃冰箱中取出实验菌株的甘油管自然解冻，用竹签在斜面上划线，30℃培养，3～7d培养结束后，均放在4℃冰箱中保存。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，酵母提取物5.0g。灭菌前pH为7.2。
MRS培养基(g/L)：牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO42.0g，K2HPO45.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温801.0g，柠檬酸三铵2.0g。灭菌前pH为6.2～6.6。
(2)扩繁菌株
将活化后的实验菌株用竹签挑取，西姆芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，30℃恒温摇床培养24h。植物乳杆菌接种在MRS液体培养基中，30℃恒温静置培养48h。
(3)菌悬液的制备
在无菌工作台中取液体培养基于灭好菌的250ML的离心管中，并在离心机中离心，条件为8000r/min，10min，此时沉淀为所需菌株，在无菌工作台中将沉淀菌株溶于无菌水中，用无菌水将其混匀，配置成分布均匀的菌悬液，利用血球板计数，得到两种菌的活菌数，此时西姆芽孢杆菌：6.6×108cuf/mL，植物乳杆菌:7.6×108cuf/mL。
选取实验菌株，以豆粕作为基础发酵培养基，用单因素方法分别接菌量、培养时间、培养温度和料水比四个培养条件逐一进行单因素优化，测定不同的接菌量、培养时间、培养温度和料水比对大豆肽转化率的影响；所述的接菌量梯度为2％、5％、8％、11％、14％，比值是菌株种子液体积与培养基中豆粕质量之比(mL/g)；时间梯度为：24h、36h、48h、60h、72h；温度梯度为：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃；料水比(g/mL)梯度为1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4。初始设定培养条件为48h、35℃、料水比1:1，接菌量5％。根据每组单因素的条件替换掉初设培养条件。
固态发酵豆粕培养基制备方法为：称取磨碎的且过60目的筛子的豆粕20g，分装于150mL锥形瓶中，121℃灭菌30min后，65℃烘干后，根据不同的培养条件在接菌时添加不同体积的无菌水。
(3.1)接菌量
将西姆芽孢杆菌和植物乳杆菌按照不同的接菌量在超净台中接种于灭好菌的豆粕中。设计接菌量梯度为2％、5％、8％、11％、14％，在48h、35℃、料水比1:1的条件下培养。
西姆芽孢杆菌在接菌量到8％时，肽转化率增加速率十分明显，至此以后，肽转化率增加趋势缓慢。植物乳杆菌在接菌量到5％时，肽转化率增加速率十分明显，至此以后，肽转化率增加速率稍有减缓。由图1可知，西姆芽孢杆菌的肽转化率一直高于植物乳杆菌，西姆芽孢杆菌的最佳接菌量为11％。
(3.2)培养时间
对西姆芽孢杆菌和植物乳杆菌进行培养时间的单因素优化。设计时间梯度为：24h、36h、48h、60h、72h、培养温度为35℃、料水比为1:1、接菌量为5％。
由图2可知，西姆芽孢杆菌的肽转化率在60h时达到最大值，而后肽转化率减小。在所选取时间范围内，植物乳杆菌在48h后肽转化率增加速度较之前比较缓慢。由图可得，西姆芽孢杆菌的肽转化率高于植物乳杆菌的肽转化率，且西姆芽孢杆菌的最佳发酵时间为60h。
(3.3)培养温度
对西姆芽孢杆菌和植物乳杆菌进行培养温度的单因素优化。设计温度梯度为：15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，料水比为1:1，时间为60h，接菌量为5％。
由图3可以看出西姆芽孢杆菌和植物乳杆菌的肽转化率随温度增加一直呈增大趋势，但西姆芽孢杆菌在35℃时肽转化率达到最大值，植物乳杆菌在30℃时肽转化率达到最大值，且西姆芽孢杆菌的整体肽转化率比植物乳杆菌的肽转化率高。
(3.4)料水比
对西姆芽孢杆菌和植物乳杆菌进行料水比的单因素优化。设计料水比(g/mL)梯度为1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4，接菌量5％、培养时间60h、培养温度35℃。
西姆芽孢杆菌是好氧菌，过低的料水比不利于菌株的繁殖，过高的料水比会降低固态发酵培养基中氧气的含量，也会抑制菌株的发酵效果。从图4可以看出西姆芽孢杆菌肽转化率在1:1的时候达到最高。植物乳杆菌为厌氧菌，从图中可以看到过高和过低的料水比也不利于植物乳杆菌的繁殖，植物乳杆菌的肽转化率也在1:1的时候达到最高。从图中可以看到，在相同条件下，西姆芽孢杆菌的肽转化率高于植物乳杆菌的肽转化率，西姆芽孢杆菌发酵豆粕的最佳料水比为1:1。
(4)响应面实验
在单因素实验的基础上，以培养温度(A)、培养时间(B)、接菌量(C)、料水比(D)为4个因素自变量，分别对每个因素选取低、中、高3个水平，西姆芽孢杆菌的大豆肽转化率和植酸降解率的对数值分别为响应值Y和X，通过Design-expert软件设计4因素3水平的BOX-Behnken试验。设计实验因素如表1所示。
表1响应面设计实验因素与水平表
根据响应面设计的实验组进行试验，共设计出29组实验。为确保实验的准确性，同时进行3组平行组对照实验。试验设计和结果如表2所示。
表2设计的响应面实验方案及其实验结果
肽转化率响应面分析
经Design expert 8.0.6拟合分析，得到的回归方程为：
肽转化率＝-484.03867+9.44727*A+2.16278*B+18.55600*C+413.10833*D+0.021792*A*B-0.046333*A*C+1.57750*A*D-0.067708*B*C+1.32917*B*D-1.58750*C*D-0.17578*A2-0.028694*B2-0.50883*C2-251.30000*D2
表3肽转化率响应面实验分析结果
回归方程中各变量对响应值Y(肽转化率)影响的显著性由F检验法来判定，概率P越小，则相应变量的显著性越高。由表3可知，当p值小于0.01时，表明实验所设置的模型非常显著；当p值小于0.05时，表明实验所设置的模型比较显著。由表3可知，在所设置的模型中，因素A(温度)，D(料水比)，A2(温度2)，B2(时间2)对肽转化率影响显著；因素C2(接种量)，D2(料水比)对肽转化率影响极显著，R2＝0.8652，说明方程拟合度较好。最佳发酵条件为：接菌量11.2％，温度；34.89℃，时间60.42h，料水比1:1.06。根据回归分析结果做响应面如图5A-F所示。从图中可以得到4个因素A(温度)，B(时间)，C(接种量)，D(料水比)对发酵豆粕肽转化率均存在极值。
抗营养因子—植酸降解率响应面分析
经Design expert 8.0.6拟合分析，得到的回归方程为
植酸降解率＝-876.60463+22.14717*A+9.14611*B+15.76435*C+360.87500*D+0.012542*A*B+0.042500*A*C+5.80000*A*D-0.052500*B*C-1.90625*B*D+5.77083*C*D-0.41622*A2-0.058866*B2-0.88644*C2-242.22917*D2
表4植酸降解率响应面实验分析结果
分析方法与肽转化率分析法相同。由表4可知，在所设置的模型中，因素D(料水比)，A2(温度2)，B2(时间2)，C2(接种量)，D2(料水比)对植酸降解率的影响极显著，发酵温度与料水比(AD之间有干扰，干扰作用显著。R2＝0.8654，说明方程对实验的拟合度较好。最佳发酵条件为：接菌量11.2％，温度；34.89℃，时间60.42h，料水比1:1.06。根据回归分析结果做响应面如图6A-F。从图中可以得到4个因素A(温度)，B(时间)，C(接种量)，D(料水比)对发酵豆粕肽转化率均存在极值。
根据响应面实验可得以下优化结果
表5响应面优化结果
| 温度 | 时间 | 接菌量 | 料水比 | 肽转化率 | 植酸降解率 |
| 34.89℃ | 60.44h | 11.21％ | 1：1.06 | 63.69％ | 51.32％ |
为进一步检验响应面方法所得结果的可靠性，在响应面实验给出的最优发酵培养条件和预设结果后，根据最优发酵条件进行实验，同时设置3组平行对照。比较实际结果与预测结果是否在允许误差内。若在误差范围内，则试验成功。
西姆芽孢杆菌在11.2％的接菌量、34.89℃的温度、60.42h的时间、1:1.06的料水比下进行了3组平行试验，实验结果测得西姆芽孢杆菌固态发酵豆粕的肽转化率平均值为60.49％，实验值与理论值(63.69％)的相对误差为3.29％<5％，测得植酸降解率平均数值为69.12％，实验值与理论值(71.33％)的相对误差为3.29％<5％。实验数值与响应面计算数值较为吻合，表明用该模型来预测实际数值是可行的。
实施例2西姆芽孢杆菌对苹果炭疽病菌的抑菌活性测定
将西姆芽孢杆菌接种于ISP5液体培养基中，28℃培养4天，将带菌发酵液以8000r/min的转速离心20min去除菌体，后过0.22μm滤膜，得无菌发酵液，以苹果炭疽病为指示菌，取200μL发酵液牛津杯法测其抑菌活性。测定结果：对苹果炭疽病的抑菌圈直径为24mm。
实施例3西姆芽孢杆菌株活性粗提物对苹果炭疽病菌丝的抑菌率
制备菌株的活性提取物：用6mol/LHCl将ISP5液体发酵液pH调至2，静置12h，离心，将沉淀用50mL的无水乙醇分3次洗涤沉淀，挥干乙醇后即可得到活性粗提物。
活性提取物对苹果炭疽病菌丝的抑菌试验：将菌株的活性粗提物分别制成0.01、0.1、1、10、100mg/mL的水溶液，各取1mL加入到9mL的待凝固的PDA培养基中，以1mL无菌水加入9mL待凝固的液体PDA培养基为对照摇匀后倒平板，苹果炭疽病打成9mm的菌块，用无菌铲将菌块移到PDA培养基的中央，培养7d后观察苹果炭疽病菌落直径的大小，重复3次。
由图7可见，活性粗提物浓度在100mg/10mL时，对苹果炭疽病菌菌丝生长起着完全抑制作用，抑菌率为100％，而随着活性粗提物浓度的降低，苹果的病斑直径在逐渐增大，对苹果炭疽病菌的抑菌率逐渐降低。
用显微镜观察苹果炭疽病在被拮抗菌抑制前后菌丝生长的变化。从图8(a)中可以看出，对照菌丝生长正常且粗细均匀，而图8(b)中经拮抗菌抑制的菌丝畸形扭曲，局部膨大肿胀成球状，节间缩短且分支较多。由此可见，拮抗菌菌株N7(西姆芽孢杆菌Bacillussiamensis)能够使苹果炭疽病菌丝形态发生变化，从而影响其正常生长，最终达到抑菌的效果。
实施例4西姆芽孢杆菌对微藻的去除效果
西姆芽孢杆菌对铜绿微囊藻有明显溶藻作用。在初始叶绿素浓度约为3.6mg/L的藻液中加入西姆芽孢杆菌稳定期的菌悬液，共培养12h之后，铜绿微囊藻的生长便受到抑制，叶绿素a含量开始下降，共培养1天后，铜绿微囊藻的叶绿素a含量迅速下降，溶藻率达到32％，说明菌株对铜绿微囊藻的溶藻效果非常快；共培养4天后，藻液已完全黄化，西姆芽孢杆菌对铜绿微囊藻的去除率达到84.2％，说明西姆芽孢杆菌对铜绿微囊藻的溶藻效果很好。
实施例5西姆芽孢杆菌的纤维素酶活性测定
西姆芽孢杆菌在HM培养基培养30℃、3d后，4℃、8000r/min离心10min，上清液作为粗酶液，纤维素酶活性的测定采用DNS法.本实施例分别对滤纸酶活(FPA)、CMC酶活、纤维二糖酶活(β-G)的活性进行比较测定.滤纸酶活力的测定用Whatman1号滤纸(1cm×6cm)一条为底物，CMC酶的测定用1％羧甲基纤维素钠为底物，纤维二糖酶活的测定用2％水杨素为底物.各底物分别用pH值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2mol/L)配制.取酶液0.5mL与1mL上述底物及滤纸条充分混匀，在50℃水浴中温育30、40、60min后，加入DNS显色剂2mL，沸水浴显色10min，流水冷却，在540nm下测定OD值，每测定重复3次，取平均值，同时设空白对照。以试验条件下酶液蛋白含量(mg)在单位时间(min)内酶促反应产生的还原糖(葡萄糖)量(μmol)计算酶活性。
西姆芽孢杆菌在HM培养基中，30℃、150r/min条件下培养2d，测定滤纸酶活达到0.11U/mL，CMC酶活达到0.33U/mL，纤维二糖酶活达到0.09U/mL。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种利用响应面实验提高豆粕发酵效率的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1. 选取西姆芽孢杆菌（Bacillus siamensis）为实验菌株，西姆芽孢杆菌购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 06497，将活化后的实验菌株用竹签挑取，西姆芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，30 ℃恒温摇床培养24；在无菌工作台中取液体培养基于灭好菌的250ML的离心管中，并在离心机中离心，条件为8000r/min，10min，此沉淀为所需菌株，在无菌工作台中将沉淀菌株溶于无菌水中，用无菌水将其混匀，配置成分布均匀的菌悬液，利用血球板计数，得西姆芽孢杆菌：6.6×108cuf/mL；以豆粕作为基础发酵培养基，用单因素方法分别接菌量、培养时间、培养温度和料水比四个培养条件逐一进行单因素优化，初始设定培养条件为48h、35℃、料水比1:1，接菌量5%；根据每组单因素的条件替换掉初设培养条件，测定不同的接菌量、培养时间、培养温度和料水比对大豆肽转化率的影响；所述的接菌量梯度为2%、5%、8%、11%、14%，比值是菌株种子液体积与培养基中豆粕质量之比（mL/g）；时间梯度为：24h、36h、48h、60h、72h；温度梯度为：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃；料水比（g/mL）梯度为1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4；
S2. 根据步骤S1的测试结果，筛选出多肽转化率最好的菌株，优化其发酵条件；
S3. 在步骤S1所得的单因素优化结果的基础上，以培养温度、培养时间、接菌量、料水比作为4个因素自变量， 每个因素选取低、中、高3个水平，以大豆肽转化率和植酸降解率的对数值分别为双重响应值Y和X， 设计响应面实验进行深度优化，得到最佳的发酵条件；采用固态发酵豆粕培养基，西姆芽孢杆菌接菌量11.2%，温度：34.89℃，时间60.42h，料水比1:1.06；所述的固态发酵豆粕培养基制备方法为：称取磨碎的且过60目的筛子的豆粕20g，分装于150mL锥形瓶中，121oC灭菌30min后，65℃烘干后，在接菌时添加一定的无菌水。
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