CN108514045B - 一种具有水质净化和提高免疫活性的锦鲤菌剂饵料及其制备方法 - Google Patents

一种具有水质净化和提高免疫活性的锦鲤菌剂饵料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水产养殖领域，具体涉及一种具有水质净化和提高免疫活性的锦鲤菌剂饵料及其制备方法。该饵料组成包括：发酵豆粕粉30‑60％，鱼粉10‑40％，麸皮粉10‑20％，玉米粉5‑10％，小麦面粉5‑10％。本发明以发酵豆粕为原料，制作一种锦鲤菌剂饵料。该发酵豆粕采用混合芽孢杆菌发酵，使得饵料更容易被锦鲤吸收和利用。本发明提供的锦鲤饵料可显著提高锦鲤增重、锦鲤免疫活性等，同时具有良好的水质净化作用，是一种理想的锦鲤养殖的微生物饵料。

Description

一种具有水质净化和提高免疫活性的锦鲤菌剂饵料及其制备 方法
技术领域
本发明涉及水产养殖领域，具体涉及一种具有水质净化和提高免疫活性的锦鲤菌剂饵料及其制备方法。
背景技术
随着我国水产养殖规模的不断扩大，有两个明显的问题急需解决：一、抗生素的滥用不仅导致耐药菌株的比率不断增加，同时抗生素的滥用也严重影响着我国水产品安全；二、全球鱼粉的减少，使得水产养殖成本不断攀升，研制一种能替代鱼粉的原料逐渐成为热点。
锦鲤是最普遍的观赏鱼类，有着巨大的市场需求，但是有关益生菌在锦鲤养殖中应用的研究却很少。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种以豆粕为原料，添加枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G1和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis D1益生菌制备适合锦鲤养殖的微生物饵料。
本发明采用如下技术方案：
一种具有水质净化和提高免疫活性的锦鲤菌剂饵料，该饵料组成包括：发酵豆粕粉30-60％，鱼粉10-40％，麸皮粉10-20％，玉米粉5-10％，小麦面粉5-10％。
发酵豆粕粉的制备方法为：将磨碎的豆粕粉装于三角瓶中，121℃灭菌30min然后65℃烘干，以接菌量2-5％接种G1与D1混合菌，料水比1:1，于25-35℃固态发酵培养48-60h。所述G1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G1，所述D1为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis D1。
所述的G1与D1的体积比为(1-2)：(1-2)。优选的G1与D1体积比为1:2，固态发酵豆粕粉的最佳培养条件为：接菌量2％、48h、30℃、料水比1:1。
优选的，发酵豆粕粉40％，鱼粉30％，麸皮粉15％，玉米粉8％，小麦面粉7％。
种子培养基：LB液体培养基。用接菌环挑取活化后的菌株G1、D1接菌于LB液体培养基中，30℃、150rpm培养24h，用血小板计数法测得两菌株种子液菌体量分别是，G1：8.3×108cuf/mL、D1：7.7×108cuf/mL。
本发明同时请求保护上述饵料的制备方法，包括以下步骤：
(1)用接菌环挑取活化后的菌株G1、D1接菌于LB液体培养基中，30℃、150rpm培养24h，得G1、D1种子液；
(2)将磨碎的豆粕粉装于三角瓶中，121℃灭菌30min然后65℃烘干，以接菌量2-5％接种G1与D1混合菌，料水比1:1，于25-35℃固态发酵培养48-60h得发酵豆粕；
(3)将发酵豆粕粉30-60％，鱼粉10-40％，麸皮粉10-20％，玉米粉5-10％，小麦面粉5-10％混合，加入1:1(g/mL)的水制成饵料。
本发明以发酵豆粕为原料，制作一种锦鲤菌剂饵料。该发酵豆粕采用混合芽孢杆菌发酵，可减少抗营养因子，如植酸和脲酶的含量，使得饵料更容易被锦鲤吸收和利用。同时食用该饵料使锦鲤在体重、蛋白酶活和淀粉酶活、溶菌酶、总抗氧化能力都有明显提升。添加40％发酵豆粕时，实验组比对照组的锦鲤净增重多出39.9％；锦鲤食糜中的蛋白酶和淀粉活性分别比对照组高55.6％和57％，肝脏和肠道匀浆液中的蛋白酶活性增加了19.7％。添加50％发酵豆粕时，实验组锦鲤肝脏肠道匀浆液中的溶菌酶和总抗氧化能力分别比对照组高2.3倍和1倍；同时测定实验组饵料对水质的影响，结果表明实验组的饵料能显著的改善锦鲤养殖水体的水质。
有益效果
本发明提供的锦鲤饵料可显著提高锦鲤增重、锦鲤免疫活性等，同时具有良好的水质净化作用，是一种理想的锦鲤养殖的微生物饵料。本发明的制备方法简单、成本低、适用于规模化生产。
附图说明
图1为不同接菌量对肽转化率的影响；
图2为不同培养时间对肽转化率的影响；
图3为不同培养温度对肽转化率的影响；
图4为不同料水比对肽转化率的影响；
图5食糜中的淀粉酶活性(p<0.01)；
图6食糜中的蛋白酶活性(p<0.01)；
图7肝脏肠道匀浆液中的淀粉酶活性(p>0.05)；
图8肝脏肠道匀浆液中的蛋白酶活性(p<0.01)；
图9肝脏肠道匀浆液中的溶菌酶活性(p<0.01)；
图10肝脏肠道匀浆液中总抗氧化能力(p<0.01)；
图11亚硝酸盐含量；
图12硝酸盐含量；
图13氨氮盐含量；
其中，图1-4中G1、D1分别表示接种单菌G1、D1；1:2表示接种体积比1:2的G1D1混合菌；1:1表示接种体积比1:1的G1D1混合菌；2:1表示接种体积比2:1的G1D1混合菌；
图5-10中横坐标的1，2，3，4，5，6为鱼缸的编号，分别代表饲喂CK40，CK50，CK60，F40，F50，F60的鱼缸。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。本发明中涉及的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G1和地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis D1均为现有技术中已知菌种，且其符合我国饲料添加的要求，上述菌种可以从商业渠道获得。
实施例1
对G1、D1、G1:D1(1:2，v/v)、G1:D1(1:1，v/v)、G1:D1(2:1，v/v)的接菌量、培养时间、培养温度和料水比四个培养条件进行对比，得到生产大豆肽最佳的菌株或者菌株配比。接菌量梯度为2％、5％、8％、11％、14％，比值是菌株种子液体积与培养基中豆粕质量之比(mL/g)；时间梯度为：24h、36h、48h、60h、72h；温度梯度为：15℃、20℃、25℃、30℃、35℃；料水比(g/mL)梯度为1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4。先优化接菌量，初始培养条件为48h、30℃、料水比1:1。待接菌量优化结束。则以各自菌株和混菌的最佳接菌量为优化培养时间时的接菌量，其余培养条件不变。以此类推，逐一再对培养温度和料水比进行单因素优化。种子培养基为LB液体培养基。培养方法为：用接菌环挑取活化后的菌株G1、D1接种于LB液体培养基中，30℃、150rpm培养24h，用血小板计数法测得两菌株种子液菌体量分别是，G1：8.3×108cuf/mL、D1：7.7×108cuf/mL。
固态发酵培养基：20g磨碎的豆粕装于150mL三角瓶中，121℃灭菌30min然后65℃烘干，接菌时再加对应量的无菌水。
大豆肽的产量计算：肽转换率(％)＝酸溶性蛋白含量/粗蛋白含量。豆粕发酵结束后，经65℃烘干，然后参照《GB/T 22492-2008大豆肽粉》测定发酵豆粕中酸溶性蛋白的含量，参照《GB/T 5009.5-2003》测定发酵豆粕中粗蛋白的含量。
实验结果如图1-4所示，以大豆肽的转化率为优化指标，单菌株G1菌株固态发酵豆粕的最佳培养条件为：接菌量11％、72h、30℃、料水比1:1；单菌株D1菌株固态发酵豆粕的最佳培养条件为：接菌量11％、72h、30℃、料水比1:0.8；混菌G1：D1(1:2，v/v)固态发酵豆粕的最佳培养条件为：接菌量5％、60h、30℃、料水比1:1；混菌G1：D1(1:1，v/v)固态发酵豆粕的最佳培养条件为：接菌量5％、60h、30℃、料水比1:1；混菌G1：D1(2:1，v/v)固态发酵豆粕的最佳培养条件为：接菌量2％、48h、30℃、料水比1:1。从实验结果还可以看出单菌株发酵时，G1比D1的大豆肽转化率更高，混菌G1：D1(2:1，v/v)和G1：D1(1:1，v/v)相较于单菌并没有显著地提高肽转化率，甚至还有降低，而混菌G1：D1(1:2，v/v)的肽转化率比起两种单菌以及两种混菌，能达到更高的大豆肽转化率。
发酵豆粕粉的制备方法为：将磨碎的豆粕粉装于三角瓶中，121℃灭菌30min然后65℃烘干，以接菌量2％接种混合菌，其中G1：D1(1:2，v/v)，料水比1:1，于30℃固态发酵培养48h，获得发酵豆粕。
实施例2
将锦鲤随机分为6组，每组6条鱼，称量重量后，分别饲养在6个40×20×30(cm)的鱼缸中，每个鱼缸中的水为12L，室温养殖，持续曝气。其中的3个鱼缸饲喂由实施例1优化得到的含大豆肽最多的发酵豆粕，饵料中的各组分按比例混合后，加入1:1(g/mL)的水制成基础日粮，分别标记为F40、F50、F60(40,50,60代表添加发酵豆粕的比例为40％、50％、60％)，另外三个鱼缸作为对照组，饲喂由未经处理的豆粕粉制成的基础日粮，分别标记为CK40、CK50、CK60(分别添加未发酵豆粕，含量分别为40％，50％和60％)。以鱼体质量的2％作为基础日粮的投喂量，具体在9:00和19:00进行饲喂。
根据《GB/T 23181-2008微生物饵料添加剂通用要求》中的规定，允许在饵料中添加有利于动物生长的安全的微生物，但没有数量上的硬性要求。而本实验还需研究两株芽孢杆菌对锦鲤养殖水体的净化作用，按照《GB/T 20287-2006农用微生物菌剂》的规定，用于改善农产品环境的微生物菌剂，益生菌数量下限为1×108cfu/g。因此在F组饵料中各成分混合后，把菌株G1和D1在芽孢培养基中30℃、150rpm培养4d，通过梯度稀释涂平板加上80℃的水浴处理测得G1和D1在该培养基中的芽孢数分别是2.1×108(芽孢率97％)和1.8×108(芽孢率95％)。将两单菌菌液按照1:2(v/v)混合后，饵料重量/培养液体积按照1:1(g/mL)加入发酵的豆粕中，65℃烘干，分别以保证饵料中的益生菌数量符合农用微生物菌剂的要求。三种饵料配方见表1(F40，F50，F60)。
表1 三种饵料配方
Figure BDA0001593734500000051
实施例3 饵料对锦鲤生长性能的影响
样品采集：实验结束后喂料3小时，将每个实验组中的6条锦鲤全部捞起。称量每条鱼的体重，并计算：
净增重(WG)＝Wt-W0；相对增重(Rw)＝(Wt-W0)/W0×100％
饵料系数(FC)＝I/Wt-W0，
其中，Wt——实验结束鱼湿重；W0——实验开始鱼湿重；I——饵料的重量
饲养一个月后，6个鱼缸中鱼体重变化用平均值±标准(mean±std)差来表示，以不添加菌剂的未发酵饵料配方作对比(CK40，CK50，CK60)。实验结果见表2。
表2 不同饵料喂养下锦鲤的生产性能
Figure BDA0001593734500000052
Figure BDA0001593734500000061
从锦鲤生产性能的数据可以得出的结论有：(1)饲喂发酵豆粕的鱼相较于其对照组均有更好的增重，40％发酵豆粕配比时，实验组比对照组的净增重多出39.9％，50％发酵豆粕配比时实验组比对照组的净增重多出44.3％，而60％发酵豆粕配比时实验组比对照组的净增重高出970％倍，因此可以看出含有发酵豆粕的饵料相较于含有未发酵豆粕的饵料能明显提高锦鲤体重。
实施例4 饵料对锦鲤消化系统
将称完湿重的鱼在冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏，剔除脂肪组织，用4℃冷却去离子水冲洗，然后用滤纸轻轻吸干水分，放入-21℃冰箱中冷却保存，淀粉酶活性的测定使用碘—淀粉比色法，以测酶活性之用。分别采用福林酚—试剂法测定肠道及肝胰脏中蛋白酶活性；采用碘—淀粉比色法测定淀粉酶活性。
从图5中可以看出饲喂微生物饵料的三组锦鲤食糜中的淀粉酶活性高于对照组，且无论是实验组还是对照组，随着蛋白质含量的降低，食糜中的淀粉酶活性均有上升的趋势。图6表明实验组食糜中的蛋白酶活性明显高于对照组，而且差异极其显著；不论是在对照组，还是实验组，饵料中蛋白质含量越高，食糜中的蛋白酶活性越高。
图7可以看出肝脏肠道匀浆液中淀粉酶活性没有显著的差异(p>0.05)；图8所示对照组锦鲤肝脏肠道匀浆液中的蛋白酶活性低于实验组，对照组匀浆液中蛋白酶的活性随着饵料中蛋白质减少而降低的趋势。对比图6还能看出，食糜中蛋白酶活性显著的高于匀浆液中的蛋白酶活性。从图8的数据可分析得出40％发酵豆粕配比时，实验组锦鲤肝脏和肠道匀浆液中的蛋白酶活性增加了19.7％。50％发酵豆粕配比时，实验组锦鲤肝脏和肠道匀浆液中的蛋白酶活性增加了23.1％。60％发酵豆粕配比时，实验组锦鲤肝脏和肠道匀浆液中的蛋白酶活性增加了35％。三个实验组之间，对于肝脏和肠道匀浆液中的蛋白酶活性而言，F40比F50高出16％，比F60中的高出11％。因此得出结论，三种不同配比的微生物饵料相较于对照组，均能明显的提高肝脏和肠道中蛋白酶的活性。
实施例5 饵料对锦鲤免疫性能影响
采用试剂盒测定锦鲤溶菌酶和总抗氧化能力。从图9和图10可以看出实验组匀浆液中溶菌酶和总抗氧化能力相较于对照组都有明显的提高，但实验组和对照组内部溶菌酶和总抗氧化能力的差异不明显。这可能是因为芽孢杆菌和大豆肽的使用能提高锦鲤的这两项指标，但饵料之间蛋白质含量的差异对这两个指标却没有明显的影响。
实施例6 饵料对水质净化的作用
参考国家环保总局编著的《水和废水监测分析方法(第四版)》检测每一个鱼缸中每周的氨氮盐、亚硝酸盐和硝酸盐含量的变化情况。从图11、12和13可以看出，三种氮盐含量在喂养的第一周时非常少，在第二周时实验组和对照组里三种盐的含量开始出现明显的差异，对照组里三种氮盐含量急剧增加，只有CK60中的氨氮盐含量增长不明显，这可能是因为CK60中蛋白质含量最少导致的，而实验组中的仍然保持在较低的水平。第三周和第四周时，对照组中的三种氮盐含量出现缓慢变化，有持平的趋势，而实验组中的依然保持在较低的水平。40％发酵豆粕配比的鱼缸，实验组的亚硝酸盐、硝酸盐和氨氮盐比对照组分别降低了96.8％、97.3％和91％。50％发酵豆粕配比的鱼缸，实验组的亚硝酸盐、硝酸盐和氨氮盐比对照组分别降低了97.6％、99.4％和90％。可见，实验组的饵料能显著的改善锦鲤养殖水体的水质。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种具有水质净化和提高免疫活性的锦鲤菌剂饵料的制备方法，其特征在于，
(1)用接菌环挑取活化后的菌株G1、D1接菌于LB液体培养基中，30℃、150rpm培养24h，得G1、D1种子液；
(2)将磨碎的豆粕粉装于三角瓶中，121℃灭菌30min然后65℃烘干，以接菌量2％接种G1与D1混合菌，料水比1:1，于25-35℃固态发酵培养48-60h得发酵豆粕；所述的G1与D1的体积比为1：2；所述G1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G1，所述D1为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisD1；
(3)将以下质量分数原料发酵豆粕粉30-60％，鱼粉10-40％，麸皮粉10-20％，玉米粉5-10％，小麦面粉5-10％混合，加入1:1(g/mL)的水制成饵料。
2.根据权利要求1所述的锦鲤菌剂饵料的制备方法，其特征在于，G1与D1体积比为1:2，固态发酵豆粕粉的培养条件为：接菌量2％、48h、30℃、料水比1:1。
3.根据权利要求1所述的锦鲤菌剂饵料的制备方法，其特征在于，原料组成为：发酵豆粕粉40％，鱼粉30％，麸皮粉15％，玉米粉8％，小麦面粉7％。
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