CN101684450B - 一种饲料预混料及其专用枯草芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种饲料预混料及其专用枯草芽孢杆菌。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006，其保藏号为CGMCC No.2434。本发明提供的饲料预混料，它的活性成分是用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434发酵底物得到的培养物；所述底物为豆粕、蚕豆粕、棉籽粕、菜籽粕、豆粉和玉米粉中的至少一种。本发明提供的预混料具有无毒、无抗药性、无残料、无副作用的特点，可添加入多种动物饲料中，显著促进动物生长、提高饲料转化率、增强动物的免疫功能。本发明提供的预混料制备方法简单、成本较低。本发明具有巨大的经济价值和社会意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种饲料预混料及其专用枯草芽孢杆菌。
背景技术
一般能被动物食用又能给动物某种或多种营养的物质统称为饲料。随着人口逐年增多及人类饮食习惯改变，对动物性食物需求量增加，使动物饲料需求也不断提升。根据《国际饲料》估计，2002年全球饲料工业产量达6亿4百万吨。但畜牧业和饲料业的高速发展同时也带来一些副作用，滥用抗生素就是其中之一。抗生素的滥用容易引起畜禽内源性感染或二重感染；饲料中使用抗生素导致畜产品中的药物残留，直接威胁人类健康；动物产生的耐药性转移给人类，使人类的用药效果降低，各种疾病蔓延；有些药物通过粪便排泄出来，造成环境污染。
抗生素在食品中的残留已成为全世界人们关注的热点。养殖业面临的形势，一方面是全社会对动物肉品安全、绿色的要求，另一方面是养殖农民面对猪、鸡、水产动物等动物疾病的困扰。寻找一种无毒副作用、无残留、无耐药性的新型抗菌剂是当前科学界的重大课题和紧迫任务。根据欧盟70-524号令，从2006年1月起全面禁止在饲料中添加抗生素，目前我国农业部也颁布了禁用药物的法令。生物科技饲料是解决畜产品安全问题的一把钥匙，唯有开发生物科技饲料替代抗生素可以满足出口市场对绿色肉品的需求。
全价配合饲料也称全日粮配合饲料，能直接用于饲喂对象，全面满足饲喂对象的营养需要，主要包括能量饲料、蛋白质饲料和矿物质等营养物质。预混料是全价配合饲料的一种重要组分。预混料是添加剂预混合饲料的简称，它是将一种或多种微量组分(包括各种微量矿物元素、各种维生素、合成氨基酸、某些药物等添加剂)与稀释剂或载体按要求配比，均匀混合后制成的中间型配合饲料产品。
绿色饲料添加物，广义来讲，指无污染、无残留、抗疾病和能促进生长的天然添加物，近年来先后已开发的种类包括微生物制剂、酵素制剂、酸化剂、调味剂、中草药制剂和纯天然萃取物等。微生物制剂就是生菌剂，又可称为益生菌，活菌制剂在国外已被广泛应用，1989年美国食品与药物管理局(FDA)公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物种名单，共有41种，年使用量在8000吨以上。
我国对绿色添加物的研究和应用一直高度重视，中央一号文件连续三年提出要大力推广健康养殖方式。在此政策引导下，我国益生菌的研究方兴未艾，许多科研单位和企业都在积极探索，有的已取得了突破性的进展，研究出的益生菌不仅完全可替代抗生素，而且大幅提高饲料蛋白的转化率，为农户节省饲料成本，并缩短动物饲养时间，改善肉蛋奶品性，科技水平居于世界领先。益生菌必将对提高我国养殖技术水平、增加农民养殖收入、去除畜产品中有害物质以及养殖过程的污染具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种饲料预混料及其专用枯草芽孢杆菌。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，名称为Bs006，是从土壤中分离得到的，已于2008年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2434。
本发明所提供的饲料预混料，它的活性成分是用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Bs006CGMCC No.2434发酵底物得到的培养物；所述底物为豆粕、蚕豆粕、棉籽粕、菜籽粕、豆粉和玉米粉中的至少一种。
所述饲料预混料中枯草芽孢杆菌Bs006的含量为2×104-4×107CFU/kg，优选为2×106CFU/kg。
本发明还提供了制备所述预混料的方法，包括如下制备活性成分的步骤：以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434发酵底物得到的培养物作为活性成分；所述底物为豆粕、蚕豆粕、棉籽粕、菜籽粕、豆粉和玉米粉中的至少一种。
所述发酵条件为：30-45℃培养18-48小时。
枯草芽孢杆菌Bs006在进行所述发酵前可先进行活化。活化时可采用如下培养基：每升培养基中含有肉膏提取物3g，蛋白胨5g；蒸馏水配制，pH7.0。
还可以将活化的枯草芽孢杆菌Bs006先进行扩增再发酵。
扩增枯草芽孢杆菌Bs006可采用如下培养基：每升培养基中含有20-30g脱脂奶粉、5-15g焦糖蜜；蒸馏水配制，pH7.0；可采用如下扩增条件：30-45℃培养18-48小时。
扩增枯草芽孢杆菌Bs006具体可采用如下培养基：每升培养基中含有25g脱脂奶粉和10g焦糖蜜。
本发明提供的预混料具有无毒、无抗药性、无残料、无副作用的特点，并且可以添加入多种动物饲料中，显著促进动物生长、提高饲料转化率、增强动物的免疫功能。本发明提供的预混料制备方法简单、成本较低。本发明具有巨大的经济价值和社会意义。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434的获得
一、菌种的获得
1、自台湾省台中县取一克土壤，加入10ml TrypticaseTMSoy Broth(TSB培养液；每升含胰蛋白胨20.0g，右旋糖1.0g，磷酸氢二钠2.0g，硝酸钾1.0g，将pH调至7.0，固态培养基加入1.5％琼脂)中震荡混合均匀后，以常规巴氏德消毒法消毒。
2、将TSB培养液进行10倍梯度稀释至10-4，每个梯度稀释液于37℃温度培养24小时，进行芽孢化菌株的初步增菌筛选。
3、再自各稀释管取100μl至TSA(胰酶大豆琼脂，Difco，Sparks，U.S.A.)平板上，并以L型玻棒涂抹均匀，同样37℃培养24小时，再以随机选取方式挑取单一菌落至一个新的TSA平板上，并以三步法划开，重复纯化继代三次以后，得到一株具有芽孢化特性和蛋白酶活性的菌株，将其命名为Bs006。
二、菌种的特性
1、形态特征：菌落外观型态呈圆形或不规则状，表面黯淡，不透明，有皱折，为淡黄色或褐色。革兰氏染色阳性，产单孢杆菌，大小约(0.6-0.8μm)×(1.5-3μm)，通常利用周生鞭毛移动。
2、生理特性：化学异营，有氧代谢，接触酶(catalase)为阳性；具水解淀粉的能力，在20-45℃生长良好；具耐压、耐热、耐酸、耐碱特性。
3、热稳定性
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434的热稳定性见表1。
表1 枯草芽孢杆菌Bs006CGMCC No.2434的热稳定性
4、耐酸碱性
分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434在不同pH值的缓冲液中(pH2-7缓冲液为使用0.2M的Na2HPO4溶液与0.2M HCl进行调剂，pH8-10缓冲液为使用0.2M的磷酸氢二钠盐溶液与0.2M NOH进行调剂)，静置三小时，然后统计存活率，结果见表2。
表2 枯草芽孢杆菌Bs006CGMCC No.2434的耐酸碱性
| pH2 | pH3 | pH4 | pH5 | pH6 | pH7 | pH8 | pH9 | pH10 | |
| 存活率 | 69％ | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ |
5、最适培养基成份
培养基A的组成为：每升培养基中含有肉膏提取物3g，蛋白胨5g；蒸馏水配制，pH7.0。
6、最适培养温度
最适培养温度为42℃。
实施例2、本发明的预混料对肉鸡生长性能的影响
本实施例通过对432只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡公雏进行试验，阐明本发明提供的预混料的有益效果。
本实施例中进行了6次重复试验，每次重复试验具体如下：
一、预混料的制备
1、第一次扩大发酵
将活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434接入如下培养基A中，37℃发酵12小时。
培养基A的组成为：每升培养基中含有肉膏提取物3g，蛋白胨5g；蒸馏水配制，pH7.0。
2、第二次扩大发酵
将步骤1的发酵液以10％(体积比)的接种量接入如下培养基B中，37℃发酵18小时。
培养基B的组成为：每升培养基中含有25g脱脂奶粉、10g焦糖蜜；蒸馏水配制，pH7.0。
3、固态发酵
将步骤2的发酵液加入豆粕中(加入量为300mL发酵液/kg豆粕)，37℃发酵24小时，每隔6小时搅拌10分钟。
将步骤3得到的培养物烘干至干粉，得到饲料预混料。
每千克预混料中含有2×106CFU的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434。
二、添加剂的制备
1、添加剂A
将100g综合酵素、50g综合维他命、200g海藻矿物质和250g综合氨基酸混合，得到添加剂A。
2、添加剂B
在添加剂A中加入林可霉素，使每千克添加剂中含有0.22g林可霉素。
3、添加剂C
在添加剂A中加入步骤一制备的预混料，使每千克添加剂中含有1g预混料。
4、添加剂D
在添加剂A中加入步骤一制备的预混料，使每千克添加剂中含有2g预混料。
三、肉鸡的饲喂
将72只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡公雏随机分为4组，每组18只。肉鸡分两阶段饲养：第一阶段为1-21日龄、第二阶段为22-42日龄。4组肉鸡饲养过程中所用的日粮及其营养水平见表3。第1组为阴性对照组，在日粮中添加了1％的添加剂A；第2组的日粮中加入了1％的添加剂B；第3组的日粮中加入了1％的添加剂C；第4组的日粮中加入了1％的添加剂D。各组的营养水平均符合中国2004版“鸡饲养标准”。试验各组营养水平均为等能量、等蛋白。试验在中国农业大学家禽代谢室进行，肉鸡采用三层笼养，喂给干粉料，自由采食和饮水，温度20-26℃，相对湿度45％-55％，按照正常免疫程序免疫。
表3 4组肉鸡的日粮配方及营养水平(％)
四、肉鸡生长性能的评价
每日观察鸡群健康情况与精神状况。分别在试验的1日龄、21日龄、42日龄称重并记录耗料量，计算日采食量(ADFI)、日增重(ADG)、饲料转化效率(FCR)和死亡率。试验数据均采用6次重复试验的平均结果，用平均值±标准差表示。试验数据用SPSS12.0软件中One-way ANOVA程序处理，用Duncan比较。
饲料转化效率(FCR)＝日增重(ADG)/日采食量(ADFI)。
试验过程中，各组肉鸡的生长性能结果见表4，死亡率见表5。
表4 肉鸡的生产性能
注：同一行中，具有不同大写字母肩注的平均值差异极显著(P<0.01)，具有不同小写字母肩注的平均值差异显著(P<0.05)。
表5 各阶段的肉鸡死亡率(％)
| 日龄 | 第1组 | 第2组 | 第3组 | 第4组 | P值 |
| 1-21 | 0.00 | 0.93±2.27 | 1.85±4.54 | 0.93±2.27 | 0.724 |
| 22-42 | 0.93±2.27 | 1.85±2.87 | 0.00 | 3.70±4.54 | 0.186 |
| 1-42 | 0.93±2.27 | 2.78±3.04 | 1.85±4.54 | 4.63±5.46 | 0.446 |
由表4和表5，可得出结论如下：
1、采食量(ADFI)
1-21日龄、22-42日龄、1-42日龄，各组间差异不显著；各阶段均表现为第1组的采食量最高；1-21日龄、22-42日龄，第4组的采食量最低；1-42日龄，第3组采食量最低。
2、日增重(ADG)
1-21日龄，第3组日增重最高，第1组日增重最低，第3组的日增重极显著的高于第1组(p<0.01)，与第2组差异不显著，其它各组间差异不显著；22-42日龄、1-42日龄，第2组日增重最高，第4组日增重最低，各组间差异不显著。
3、饲料转化效率(FCR)
1-21日龄，第3组饲料转化效率最高，第1组饲料转化效率最低，第3组与第1组之间差异显著(p<0.05)，其它各组间差异不显著；22-42日龄，第2组饲料转化效率最高，第1组饲料转化效率最低，各组间差异不显著；1-42日龄，第2组饲料转化效率最高，第1组饲料转化效率最低，各组间差异不显著。
4、死亡率
1-21日龄、22-42日龄、1-42日龄，各组间差异不显著。
试验结果表明：在饲料中添加0.1％的本发明提供的预混料饲喂的肉鸡的各项成长性能与在饲料中添加抗生素饲喂的肉鸡的各项成长性能相似，显著高于不加预混料的对照组，而本发明提供的预混料不含有抗生素。
实施例3、本发明的预混料对奶牛生产性能的影响
本实施例中通过对60头荷斯坦泌乳母牛进行试验，阐明本发明提供的枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂的有益效果。
一、预混料的制备
1、第一次扩大发酵
将活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434接入如下培养基A中，37℃发酵12小时。
培养基A的组成为：每升培养基中含有肉膏提取物3g，蛋白胨5g；蒸馏水配制，pH7.0。
2、第二次扩大发酵
将步骤1的发酵液以10％(体积比)的接种量接入如下培养基B中，45℃发酵48小时。
培养基B的组成为：每升培养基中含有20g脱脂奶粉、5g焦糖蜜；蒸馏水配制，pH7.0。
3、固态发酵
将步骤2的发酵液加入棉籽粕中(加入量为300mL发酵液/kg棉籽粕)，45℃发酵48小时，每隔6小时搅拌10分钟。
将步骤3得到的培养物烘干至干粉，得到饲料预混料。
每千克预混料中含有：维他命A：180,000IU、维他命D3：10,000IU、维他命E：1,500mg、维他命K3：60mg、维他命B1：35mg、维他命B2：80mg、维他命B6：60mg、维他命B12：0.5mg、烟酸：500mg、泛酸钙：300mg、叶酸：16mg、生物素3mg、胆碱：7,500mg、硫酸铜：4g、硫酸亚铁：7g、硫酸锰：1.3g、碘酸钙：6.5mg、硫酸锌：10g、亚硒酸钠：9mg、4×107CFU的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCCNo.2434。
二、基础日粮的配制
将100g综合酵素、50g综合维他命、200g海藻矿物质和250g综合氨基酸混合，得到添加剂A。
基础日粮由混合精料和粗饲料组成。混合精料按照我国奶牛饲养标准配制而成，配方见表6。粗饲料由玉米青贮、青干苜蓿组成。采用中国国家标准饲料检验法(总号2770、类号N4024)测定干物质含量(105℃烘干恒重)；然后测定干物质中的粗蛋白含量(凯氏定氮法)、粗灰分含量(高温灰化法)、磷含量(钼黄法)、酸性洗涤纤维含量(范氏Van Soest法)、中性洗涤纤维含量(范氏Van Soest法)。日粮中各组分的营养物质(干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙、磷)含量见表7。
表6 混合精料日粮配方
| 原料 | 配比(％) | 原料 | 配比(％) |
| 玉米(Com) | 53.0 | 菜籽粕(Rapeseed meal) | 3.0 |
| 大豆粕(Soybean meal) | 9.0 | 食盐(NaCl) | 1.0 |
| 麦麸(Wheat bran) | 21.0 | 小苏打(NaHCO3) | 1.0 |
| 棉籽粕(Cottonseed meal) | 7.0 | 添加剂A | 5.0 |
表7 日粮营养成份
三、奶牛的饲喂
选年龄、体重、胎次、泌乳期、产奶量及生理状态一致或相近的健康荷斯坦泌乳奶牛60头，进行实验。整个实验包括预饲期(预饲期奶牛均饲喂普通饲料)和实验期，预饲期7天，实验期28天。在预饲期对奶牛进行防疫和驱虫，观察并调整牛群；预饲期结束时连续两天称重(两次称重误差在3％以内)后进入试验期，试验期内不进行免疫接种和预防性投药。本实施例中进行了4次重复试验，每次重复试验具体如下：
将15头奶牛随机分为3组，每组5头。第1组为阴性对照组，饲喂基础日粮；第2组在饲喂基础日粮的同时，每天饲喂步骤一制备的预混料，7克/天/头，饲喂时将预混料拌入混合精料混匀一起喂给；第3组在饲喂基础日粮的同时，每天饲喂步骤一制备的预混料，14克/天/头，饲喂时将预混料拌入混合精料混匀一起喂给。混合精料根据奶牛个体产奶量的多少来定量供给，粗饲料自由采食，精、粗比约为50：50。
实验过程中，奶牛集中在同一牛舍，同一饲养管理条件，派专人负责。饲喂方式采用单槽拴系饲喂，饲喂顺序是先精后粗，挤奶采用管道式挤奶机进行，自由饮水，日喂三次，分别在早晨4:00-6:00、中午11:00-13:00、晚上6:00-8:00。下槽后运动场自由活动，保证供给清洁饮水，保持圈舍清洁卫生，每天随时对牛群进行观察。
四、奶牛生产性能的评价
在试验期内逐日记料，试验期结束时连续两天称重(两次误差在3％以内)，称重按原来称重的顺序进行。
通过采食量、体增重、产奶量、乳成分4个指标对奶牛的生长性能和产奶性能进行评价。对试验所得的数据应用SPSS11.5统计分析软件进行单因素方差分析，在差异显著的基础上，进行邓肯氏多重比较，数据用平均值±标准差表示，以P<0.01(差异极显著)，P<0.05(差异显著)作为差异显著性判断标准。
1、采食量
每天记录每头试验奶牛各类饲料的供给量，次日早晨清槽时称出剩余量，两者之差即为每日实际采食量。结果见表8。
表8 试验奶牛的日均采食量
| 饲料 | 第1组 | 第2组 | 第3组 |
| 混合精料(Kg/d) | 7.00 | 7.00 | 7.00 |
| 玉米青贮(Kg/d) | 4.24 | 4.22 | 4.29 |
| 青干苜蓿(Kg/d) | 2.71 | 2.69 | 2.72 |
| 预混料(g/d) | 0 | 7 | 14 |
由表8可见，各组对混合精料的采食量均为7.00kg/天，对玉米青贮和青干苜蓿的采食量有微量的差异。添加预混料对奶牛的采食量无显著的影响。
2、体增重
预饲期最后两天和试验期末早饲前空腹称重，两者之差即为总增重。总增重除以实验天数即为平均日增重。结果见表9。
表9 试验奶牛的平均日增重
| 指标 | 第1组 | 第2组 | 第3组 |
| 始重(kg) | 588.66±45.00 | 592.13±59.43 | 573.44±50.77 |
| 末重(kg) | 586.52±40.45 | 592.13±59.43 | 574.44±48.47 |
| 平均日增重(kg) | 0.01±0.07 | 0.10±0.07 | 0.04±0.13 |
由表9可见，各组试验奶牛体重变化不大，维持在580kg左右，体重基本稳定。添加预混料对奶牛日增重无显著影响。
3、产奶性能
准确称重各试验奶牛每天的产奶量，用其平均值作为该阶段的日产奶量。产奶量的具体测量方法如下:该牛场采用的是管道式挤奶装置，挤奶时牛奶进入到玻璃缸中，用肉眼可按刻度读取产奶量。
试验期末，连续两天分别于早、午、晚三次按产奶量比例收集最后两天的奶样，分别放入带盖玻璃瓶中，每毫升乳样中加入0.6mg重铬酸钾防腐剂，送至河南省DHI测定中心，测定乳蛋白、乳脂率。
饲料转化效率(FCR)＝日增重(ADG)/日采食量(ADFI)。
结果见表10。
表10 试验奶牛的产奶性能
注：同行肩注有不同大写字母为差异极显著(P<0.01)，同行肩注有不同小写字母为差异显著(P<0.05)。
由表10可见，预饲期3组奶牛的日均产奶量分别为24.78±1.53kg、23.78±1.09kg、22.82±1.02kg，差异不显著。在正式试验期，第2组、第3组的非校正产奶量比第1组分别提高了4.82％、3.18％，且差异显著(P<0.05)，第2组、第3组间无显著差异；换算成4％乳脂校正乳后，第2组、第3组的非校正产奶量比第1组分别提高了3.58％、4.68％，差异仍然显著(P<0.05)，第2组、第3组间无显著差异；3个组的乳脂率无显著差异；从日均乳脂产量看，第2组、第3组比第1组提高了2.62％、4.57％，但差异不显著；3个组的乳蛋白率差异不显著；从乳蛋白产量看，第2组、第3组比第1组分别提高了7.12％、1.97％，但差异不显著；从饲料转化效率看，第2组比第1组提高了3.44％，但差异不显著，第3组比第1组提高了5.50％，差异显著(P<0.05)，但第2组、第3组间无显著差异。
4、结论
奶牛日粮中添加预混料对泌乳奶牛的体重、干物质采食量无显著的影响。日粮中添加7g/d、14g/d预混料后头目均产奶量显著增加(P<0.05)，换算成4％乳脂校正乳后，差异仍然显著(P<0.05)，说明预混料有增加奶牛产奶量的作用；另外添加预混料还使饲料转化效率有提高，说明预混料可显著提高泌乳奶牛的产奶性能。而添加7g/d和14g/d预混料处理组非校正产奶量、4％乳脂校正乳产奶量、饲料转化效率无显著差异，可见在泌乳奶牛日粮中添加7g/d预混料就可以起到显著提高泌乳奶牛的产奶性能的作用。
实施例4、本发明的预混料对罗非鱼养殖的影响
罗非鱼是联合国粮农组织向全世界推荐的水产养殖品种，目前在80多个国家与地区均有养殖，而奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×0.aureus)由于肉质鲜嫩、抗病力强、生长快及屠宰率高等特点，已成为中国罗非鱼的主导养殖品种，也是主要出口水产品，2003年产量达805，859吨。
一、预混料的制备
1、第一次扩大发酵
将活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434接入如下培养基A中，37℃发酵12小时。
培养基A的组成为：每升培养基中含有肉膏提取物3g，蛋白胨5g；蒸馏水配制，pH7.0。
2、第二次扩大发酵
将步骤1的发酵液以10％(体积比)的接种量接入如下培养基B中，30℃发酵18小时。
培养基B的组成为：每升培养基中含有30g脱脂奶粉、15g焦糖蜜；蒸馏水配制，pH7.0。
3、固态发酵
将步骤2的发酵液加入玉米粉中(加入量为300mL发酵液/kg玉米粉)，30℃发酵18小时，每隔6小时搅拌10分钟。
将步骤3得到的培养物烘干至干粉，得到饲料预混料。
每千克预混料中含有：维他命E：5,000mg、维他命K3：500mg、维他命B1：650mg、维他命B2：2,500mg、维他命B6：650mg、维他命B12：1.5mg、烟酸：9,500mg、泛酸钙：6,300mg、叶酸：190mg、维他命H：65mg、维他命C：13,000mg、胆碱：63,000mg/kg、肌醇：25,000mg、对氨基苯甲酸：5,000mg、硫酸铜：0.4mg、硫酸锌：3.8mg、硫酸锰：1.3mg、碘酸钙：0.04mg、硫酸亚铁：13g、硫酸镁：52g，2×104CFU的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434。
二、试验饲料的配制
1、基础饲料
试验基础饲料根据奥尼罗非鱼膨化料生产配方配制。
2、复合饲料I
在基础饲料中加入步骤一制备的预混料，加入量为1g/kg。
3、复合饲料II
在基础饲料中加入黄霉素，加入量为0.02g/kg。
4、复合饲料III
在基础饲料中加入海特宝(广东海大饲料公司提供)，加入量为0.5g/kg。
实验饲料制作时，先将原料粉碎，使原料粉末能全部通过60目筛，再按比例充分搅拌混匀，加适量水搅拌，由膨化机制成直径3mm的颗粒，充分干燥后于4℃冰箱密封保存备用。
饲料的常规营养成分(水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分)根据国家标准AOAC法进行，采用105℃烘干恒重法测定水分含量；凯氏定氮法测定粗蛋白(CP)含量；索氏抽提法测定粗脂肪(EE)含量；高温灰化法测定粗灰分(CAs)含量，常规营养成分见表11。
表11 饲料配方组成及化学成分(％)
| 化学成分 | 基础饲料 | 复合饲料I | 复合饲料II | 复合饲料III |
| 水分 | 5.92 | 7.29 | 8.72 | 7.90 |
| 粗蛋白 | 32.42 | 33.13 | 31.52 | 32.5 |
| 粗脂肪 | 9.24 | 8.48 | 9.05 | 9.04 |
| 粗灰分 | 9.27 | 8.12 | 7.81 | 7.47 |
三、罗非鱼的饲喂
试验用鱼为同一批健康、活泼、体型规格的奥尼罗非鱼鱼种(Oreochromisniloticus×0.aureus)(中国农业科学院饲料研究所浙江水产营养试验基地，浙江嘉兴市)。本实施例共用240尾奥尼罗非鱼进行试验。养殖设施为温室内养殖网箱，网箱规格为0.6×0.6×0.6m3，实验用水为充分曝气自来水。正式实验前对实验鱼驯养两周，使其适应实验饲料及养殖环境。共进行4次重复试验，每次重复试验具体如下：
将饥饿一天的奥尼罗非鱼60尾(初重87.64±2.46g)随机分成4组，每组15尾，整体称重后随机置入4个养殖网箱中，分别饲喂4种不同的饲料。CK组饲喂基础饲料，为对照组；T1组饲喂复合饲料I；T2组饲喂复合饲料II；T3组饲喂复合饲料III。
实验采用人工定时定量投喂，日投饲量按实验鱼体重的1％，分7：30、11：00、15：00和18：004次投喂，每周对投喂量进行调整(根据摄食最差的实验饲料组)。实验为期8周。实验期间定时对水质进行监控，养殖全程水温30±1℃、D0>5.0mg02/L、pH7.73±0.24、氨氮低于0.5mg N/L、亚硝酸盐氮低于0.05mg N/L。
四、罗非鱼生长性能的评价
采用SPSS10.0统计软件对实验数据进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，若组间差异显著，则进行Duncan’s多重比较，显著水平p设为0.05，实验数据采用平均值±标准误表示(mean±S.E)。
1、增重率、饲料系数、存活率、屠宰率及肝体比的测定
1)增重率、饲料系数、存活率的测定
实验结束，停饲一天后对各网箱实验鱼整体称重，计算其增重率(WG，％)、饲料系数(FCR)、存活率(SR，％)。计算公式如下：
增重率(WG，％)＝100×(平均末重—平均初重)/平均初重；
饲料系数(FCR)＝摄食饲料总量/鱼体增重量；
存活率(SR，％)＝100×实验结束时鱼体数量/实验开始时鱼体数量；
2)奥尼罗非鱼屠宰率及肝体比的测定
实验结束整体称重后，每网箱随机取10尾奥尼罗非鱼，逐个称重后解剖，取其肝脏并称重，测其肝体比。除去所有内脏后称重，测其屠宰率。计算公式如下：
屠宰率(％)＝100×胴体重/体重；
肝体比(％)＝100×肝脏重/体重；
不同饲料对奥尼罗非鱼的增重率、成活率、屠宰率和肝体比的影响结果见表12。
表12 罗非鱼增重率、成活率、屠宰率和肝体比
| 参数 | CK组 | T1组 | T2组 | T3组 |
| 平均初重(g) | 86.37±0.99a | 87.75±0.29a | 87.22±0.50a | 89.21±2.24a |
| 平均末重(g) | 195.62±15.84a | 215.54±15.92b | 208.97±20.37b | 208.57±18.15b |
| 增重率(％) | 126.49±18.49a | 145.79±18.83b | 139.60±23.67b | 134.46±22.42ab |
| 屠宰率(％) | 90.03±0.29a | 89.13±0.27a | 89.38±0.85a | 89.47±0.47a |
| 肝体比(％) | 2.55±0.18a | 2.93±0.24a | 2.80±0.25a | 2.82±0.20a |
| 饲料系数(％)* | 2.37±0.33a | 1.80±0.18b | 1.82±0.18b | 2.22±0.54ab |
| 成活率(％) | 100a | 100a | 98.33±1.67a | 100a |
*同行数据肩注不同者表示统计学差异显著(p<0.05)。
2、奥尼罗非鱼血液溶菌酶活性的测定
实验结束时尾静脉取3尾鱼血清。
1)以溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)冻干粉为底物，溶于0.1mg/LpH6.4的磷酸盐缓冲液中，调整菌悬液的0D值(0D540＝0.3)。
2)取200μl溶壁微球菌菌悬液加入96孔酶标板内，再加入20μl待测血清样品，溶菌酶标准品(酶活200U)，每组测6个平行。加样过程在冰水盒内进行。于540nm处测0D值A0。然后将酶标板置入37℃恒温培养箱内，反应15min，反应结束后立即置入冰水中终止反应，测其540nm处测0D值A。
按下列公式计算溶菌酶活性：样品溶菌酶活力(U)＝△A/△A标*200
△A样品反应前后吸光值差值；
△A标溶菌酶标准品反应前后吸光值差值。
摄食不同饲料对奥尼罗非鱼血液溶菌酶活性的影响见表13。
表13 摄食不同饲料后，奥尼罗非鱼血液溶菌酶活性的影响
*同行数据肩注不同者表示统计学差异显著(p<0.05)。
由表13可以发现，摄食不同饲料后，奥尼罗非鱼的血液溶菌酶活性均比对照组有显著提高(p<0.05)，而实验组之间无显著差异(p>0.05)。从数值看，T1组溶菌酶活性最高，较对照组高25％。这表明，预混料可以显著提高奥尼罗非鱼的免疫能力。
3、结论
饲料中添加预混料可以显著提高奥尼罗非鱼增重、改善饲料系数，提高血液的溶菌酶活力，即可以增强机体的免疫能力，这对奥尼罗非鱼的健康养殖具有非常重要的意义。
实施例5、本发明的预混料对猪养殖的影响
本实施例通过对88头健康(杜洛克×长白×大白)三元杂交仔猪(体重平均在12.6kg左右)进行试验，阐明本发明提供的枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂的有益效果。
一、预混料的制备
1、本发明的预混料的配制
1)第一次扩大发酵
将活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434接入如下培养基A中，37℃发酵12小时。
培养基A的组成为：每升培养基中含有肉膏提取物3g，蛋白胨5g；蒸馏水配制，pH7.0。
2)第二次扩大发酵
将步骤1的发酵液以10％(体积比)的接种量接入如下培养基B中，37℃发酵24小时。
培养基B的组成为：每升培养基中含有25g脱脂奶粉、10g焦糖蜜；蒸馏水配制，pH7.0。
3)固态发酵
将步骤2的发酵液加入豆粕中(加入量为300mL发酵液/kg豆粕)，37℃发酵36小时，每隔6小时搅拌10分钟。
将步骤3)得到的培养物烘干至干粉，得到饲料预混料。
每40g预混料含有如下组分：维生素A：10,000IU；维生素D：590IU；α-生育酚乙酸酯：27mg；维生素K3：0.65mg；核黄素：10.0mg；D-泛酸钙：9.7mg；烟酸：32.2mg；维生素B12：0.12mg；生物素：0.40mg；叶酸：4.9mg；维生素B6：7.9mg；硫胺素：5.8mg；锰：46.2mg；锌：135.5mg；铁：187.8mg；铜：205mg；碘：1.2mg；硒：0.35mg；食盐：0.3％(质量比)；氯化胆碱：590mg；2×104CFU的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434。
2、普通预混料的配制
1.0g综合酵素、0.5g综合维他命、2.0g海藻矿物质和2.5g综合氨基酸混合，得到普通预混料。
每40g预混料含有如下组分：维生素A：9000IU；维生素D：660IU；α-生育酚乙酸酯：32mg；维生素K3：0.70mg；核黄素：8.1mg；D-泛酸钙：11.7mg；烟酸：26.4mg；维生素B12：0.023mg；生物素：0.24mg；叶酸：3.1mg；维生素B6：5.0mg；硫胺素：7mg；锰：37.2mg；锌：120.0mg；铁：180.5mg；铜：210mg；碘：1mg；硒：0.25mg；食盐：0.3％(质量比)；氯化胆碱：525mg。
二、试验饲料的配制
1、基础日粮
基础日粮的配方见表14，含有除预混料外的所有组分。
2、复合饲料I
在基础日粮中加入步骤一的1制备的预混料，加入量为40kg/t。
3、复合饲料II
在基础日粮中加入步骤一的2制备的预混料，加入量为40kg/t。
日粮参照NRC和我国猪的营养需要量进行配制，所用饲料原料均达到国标2级，试验日粮的主要营养指标力求达到一致，所有试验日粮为粉状饲料，其配方和营养成分见表14。营养指标依据NRC(1998)，并结合猪场具体情况进行配制。
表14 日粮组成
*1：步骤一的1制备的预混料；*2：步骤一的2制备的预混料。
三、仔猪的饲喂
选用88头健康(杜洛克×长白×大白)三元杂交仔猪(体重平均在12.6kg左右)进行试验，试验设2次重复，每次重复试验具体如下：
44头仔猪根据体重相近、公母各半的原则分为2组，每组22头。整个试验分为预饲期和正式期两个阶段，预饲期14天，正式期42天。仔猪直接从母猪舍转出(在母猪舍采食粉状人工乳)，预饲期14天，在此期间由人工乳逐渐转为复合饲料I，而后开始为期42天的正式期。正式期中，第1组用复合饲料I饲喂，第2组用复合饲料II饲喂。试验尽量使每个组的仔猪从地理位置、单个仔猪重量、采光和窝重等指标均匀地分布于猪舍。
试验仔猪在同一栋猪舍进行饲养，采用高床饲养(地面前部分是带有保温层的水泥地板，后半部分为漏缝地板)，自由采食、自由饮水(乳头式饮水器)。试验期内每天观察并记录腹泻、疾病情况。粪便清理和饲槽清刷以及光照等均按常规要求进行，所有试验仔猪处于相同的环境和管理条件。其它方法按常规进行，正式试验期为42天，所有试验猪只由专人负责饲喂和治疗。
四、仔猪生长性能的评价
1、仔猪的体重变化
试验期间仔猪体重变化见表15，可见本发明提供的预混料可以促进仔猪生长。
表15 仔猪体重(kg/头)变化情况
2、仔猪的平均日增重
仔猪的平均日增重见表16，由表16可知，应用本发明提供的预混料显著提高了仔猪的平均日增重，效果优于普通预混料。
表16 仔猪增重(g/头/日)的影响变化
3、对仔猪采食量的影响
预混料对仔猪进食量的影响见表17，可以看出与普通预混料相比，本发明提供的预混料提高了仔猪的采食量。
表17 预混料对仔猪采食量(g/头/日)的影响
4、对仔猪饲料转化率的影响
预混料对仔猪饲料转化率的影响见表18，可以看出与普通预混料相比，本发明提供的预混料在同样的饲料耗料下，仔猪的体重增加更高。
表18 预混料对仔猪饲料转化率(耗料/增重)的影响
综上所述：在日粮中添加4％的本发明的预混料不仅适口性佳，促进仔猪的日摄食量，而且改善了仔猪的平均日增重和饲料转化效率。
Claims (10)
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006，其保藏号为CGMCC No.2434。
2.一种饲料预混料，它的活性成分是用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434发酵底物得到的培养物；所述底物为豆粕、蚕豆粕、棉籽粕、菜籽粕、豆粉和玉米粉中的至少一种。
3.如权利要求2所述的饲料预混料，其特征在于：所述饲料预混料中枯草芽孢杆菌Bs006的含量为2×104-4×107CFU/kg。
4.如权利要求3所述的饲料预混料，其特征在于：所述饲料预混料中枯草芽孢杆菌Bs006的含量为2×106CFU/kg。
5.一种制备权利要求2至4中任一所述饲料预混料的方法，包括如下制备活性成分的步骤：以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs006CGMCC No.2434发酵底物得到的培养物作为活性成分；所述底物为豆粕、蚕豆粕、棉籽粕、菜籽粕、豆粉和玉米粉中的至少一种。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵条件为：30-45℃，18-48小时。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌Bs006进行所述发酵前进行活化。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将活化的枯草芽孢杆菌Bs006进行扩增的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：用于扩增枯草芽孢杆菌Bs006的培养基如下：每升培养基中含有20-30g脱脂奶粉、5-15g焦糖蜜；蒸馏水配制，pH7.0；扩增条件如下：30-45℃培养18-48小时。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：用于扩增枯草芽孢杆菌Bs006的培养基如下：每升培养基中含有25g脱脂奶粉和10g焦糖蜜。
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