CN114540217B - 一种富含锰的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种富含锰的枯草芽孢杆菌及应用方法，所提供的富含锰的枯草芽孢杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.23751。本发明提供一种高耐受锰的菌种。本发明驯化后的菌能够耐受高浓度的Mn²⁺离子，并且能够稳定的生长，且具有明显的抗高温特性，适合畜禽颗粒饲料加工中的耐高温的要求。所获得菌株具有补锰和促进饲料利用率双重功效。本发明的菌株能够将无机锰大部分转化成有机锰，不仅能够达到补锰的作用，更能增强动物免疫力，提高饲料利用率。所获得的菌株具有能促进机体生长发育和提高饲料转化率的功能。所获得菌株具有促进其它益生菌生长、提高该益生菌产生多种酶类，如淀粉酶、脂肪酶和小肽。

Description

一种富含锰的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于畜禽微生态制剂生产技术领域，具体涉及一种富含锰的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

畜禽饲料中益生菌常用有酵母菌、芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌等，它们对促进畜禽生长、提高饲料营养利用率、维持肠道菌群平衡和增强健康水平都具有重要作用。然而，在饲料制粒过程中由于蒸汽或机械挤压而产生80℃左右高温，酵母菌和乳酸菌等菌种由于不耐高温，常常会全部被杀死，无法在消化道发挥作用，因此不适合做饲料加工添加剂。目前，饲料加工常用的芽孢杆菌、丁酸梭菌、双歧杆菌由于缺乏抗逆境(抗高温、抗酸、抗高渗透压)驯化，加工的成品颗粒饲料活菌数也很不稳定，畜禽饲养应用效果也很不一致。因此，培育抗逆性强、具有一定特异性和作用效果好的益生菌得到了饲料行业普遍关注。

饲料中适宜锰离子(Mn²⁺)能促进畜禽生长和骨骼发育，增强蛋禽蛋壳质量。但是饲料中添加的无机锰中Mn²⁺的吸收利用率较低，近95％左右的锰离子还是会排出到体外。尤其是现代规模化畜禽养殖中，排放到环境中锰离子的含量很高，日积月累后很容易造成水体富营养化，并也会导致畜禽和农产品残留Mn²⁺含量高，从而危及食品安全和整个生态环境。因此，探究一种既满足促进动物生长和骨骼发育、维护肠道健康和提高禽蛋壳强度，又能够减少锰排放量和防止水体富营养化的方法，对畜牧业营养精准化和维护生态良好循环具有重大社会价值。

迄今为止，畜禽饲料规模化生产缺乏抗高温益生菌添加剂，能够抗高温又能够富集锰的菌株还处于空白。为此，驯化出能够抗高温等逆境的益生菌，对畜禽饲料生产具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种富含锰的枯草芽孢杆菌及应用，该菌株作为畜禽饲料添加剂，既能满足畜禽对锰的需要量，又能提高饲料利用率，增加饲料制粒抗高温能力，减少饲料中锰添加量与排泄量。

本发明首先提供一种富含锰的枯草芽孢杆菌菌株，为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)耐锰枯草芽孢杆菌NT66株，于2021年11月8日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23751。

所提供的枯草芽孢杆菌NT66株可以用作制备富锰益生菌复合饲料添加剂。

本发明所提供的富含锰的枯草芽孢杆菌菌株用于制备饲料添加剂；

本发明还提供一种饲料添加剂，所述饲料中包含有上述的枯草芽孢杆菌NT66株。

本发明所提供的饲料添加剂，其中还添加有丁酸梭菌。

与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：

1、获得了一种高耐受锰的菌株，本发明驯化后的菌能够耐受高浓度的Mn²⁺，并且能够稳定的生长。

2、驯化的富锰枯草芽孢杆菌具有明显的抗高温特性，适合畜禽颗粒饲料加工中的耐高温的要求。

3、所获得菌株具有补锰和促进饲料利用率双重功效。本发明的菌株能够将无机锰大部分转化成有机锰，不仅能够达到补锰的作用，更能增强动物免疫力，提高饲料利用率。

4、所获得的菌株具有能促进机体生长发育和提高饲料转化率的功能。

5、所获得菌株具有促进其它益生菌生长、提高该益生菌产生多种酶类，如淀粉酶、脂肪酶和小肽。

附图说明

图1：驯化对枯草芽孢杆菌形态的影响图；

图2：驯化对枯草芽孢杆菌生长情况的影响图；

图3：驯化对枯草芽孢杆菌红外光谱吸收峰的影响图；

图4：驯化对枯草芽孢杆菌发酵产生的氨基酸影响图，其中A₁、A₂、A₃为驯化前枯草芽孢杆菌发酵液中氨基酸成分，B₁、B₂、B₃为驯化后枯草芽孢杆菌发酵液中氨基酸成分。

具体实施方式

本发明将益生菌枯草芽孢杆菌在含有高浓度Mn²⁺离子的培养基中进行培养，驯化筛选获得了能够富含高浓度锰离子的枯草芽孢杆菌菌株。所筛选获得的菌株在高Mn²⁺浓度条件下能够稳定的生长，提高枯草芽孢杆菌富集锰离子的能力；且在发酵过程中产生更高含量的酶、氨基酸以及小肽等活性物质。所筛选的菌株应用于畜禽饲料中，可以起到促进肠道消化、提高饲料利用率。

本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌菌株不仅能够保证获得与常规的枯草芽孢杆菌所拥有的特性，同时菌体中还可以富集更高的有机锰。当培养基中锰离子添加量为40.0mg/L时，菌体中的锰离子的含量能够达到0.46g/L，菌体的有机锰含量为2521.26mg/kg。而已报到的富铜枯草芽孢杆菌或富锌枯草芽孢杆菌并不能达到本发明筛选菌株的富锰效果。

下面结合具体实施案例对本发明进行详细描述。

实施例1：富含锰枯草芽孢杆菌的培养驯化

采用逐步提高培养基中Mn²⁺浓度、提高培养温度的方式进行驯化；将驯化后的菌种再连续培养若干代后，与驯化前的枯草芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等比较，进一步确定驯化后的枯草芽孢杆菌性质特点，并且能够稳定传代。

最终获得能够耐受高浓度硫酸锰(300mg/L)的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NT66株，于2021年11月8日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC23751。

(1)菌株结构变化：从图1可以看出，与原始菌种相比，同等倍数下，富锰的枯草芽孢杆菌菌体变粗大，表面纹理清晰、光滑。枯草芽孢杆菌为了抵抗高浓度锰离子环境，从而对自身形态做出改变，说明在锰离子的驯化作用下会对枯草芽孢杆菌的外表形态造成明显变化。

(2)菌株数量变化：从图2可以看出，枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)驯化前后均呈如下规律：在0～6h，是菌体适应的过程，菌体几乎不生长，处于延滞期；在8～32h，菌生长迅速呈指数型速度生长繁殖。在34～38h，由于培养基中营养物质减少，菌体趋于平稳。另外，驯化后的枯草芽孢杆菌要比未驯化的枯草芽孢杆菌提前进入指数生长期；同时驯化后枯草芽孢杆菌的对数期和稳定期延长，且达到稳定期时的菌体数量增多。表明，筛选的枯草芽孢杆菌经过高浓度锰离子多代驯化后生长和繁殖速度明显加快。

(3)富锰效果分析：分别采用驯化的富铜枯草芽孢杆菌(保藏号：CGMCCNo.15329)、富锌枯草芽孢杆菌(保藏号：CGMCC No.15330)与本发明的富锰枯草芽孢杆菌(保藏号：CGMCC No.23751)进行富集锰离子发酵。在含40mg/L锰离子浓度的培养基中分别接种耐铜、耐锌和耐锰的枯草芽孢杆菌种，在37℃下培养24h后，将菌液离心洗脱烘干，进行菌体含量以及菌体有机锰含量测定，试验结果如表1。

表1：不同枯草芽孢杆菌富集锰效果分析表

表1结果表明，驯化的富锰枯草芽孢杆菌，当锰添加量为40.0mg/L时，菌体含量为0.46g/L，菌体的有机锰含量为2521.26mg/kg，远远大于富铜枯草芽孢杆菌和富锌枯草芽孢杆菌的锰含量，证明驯化的菌种具有较好的富锰效果。而以前驯化的富铜枯草芽孢杆菌或富锌枯草芽孢杆菌并不能达到本发明菌株的富锰效果。

(4)驯化对枯草芽孢杆菌红外光谱吸收峰的影响：从图3可以看出，驯化前后的枯草芽孢杆菌在400～4000cm^-1波数范围内，红外光谱的峰型、峰位均发生了明显变化。驯化后枯草芽孢杆菌分别在1168cm^-1、1375cm^-1处出现新的吸收峰，1168cm^-1为C＝O的伸缩振动峰，1375cm^-1为C-H伸缩振动峰；表明驯化后菌体表面基团-CH₃亲水脂分子以不同形式与Mn²⁺结合，锰离子与细胞表面的酰胺中氨基、羧基发生了化学反应，它们参与了锰离子的成键过程。在3200～3750cm-1范围波数内，出现-OH和-NH键的交叉伸缩振动峰，驯化后枯草芽孢杆菌由3439cm^-1移动到3414cm^-1，3299cm^-1移动到3273cm^-1；在3487cm^-1产生新的吸收峰，是基于-NH或者-OH键的伸缩振动作用。表明锰离子驯化改变了枯草芽孢杆菌菌体表面基团结构。

(5)驯化对枯草芽孢杆菌发酵产生的氨基酸的影响：从图4可以看出，图形包含横纵坐标，横坐标代表试验分组，A代表驯化前的菌种；B代表驯化后的菌种；1、2、3表示的是同组的重复性试验。纵坐标代表氨基酸种类。图外围那些线条，是聚类分析的树形图。越靠下游的子目录中的个体关系越近，最先聚为一类，之后小类与小类又聚为一个大类，这些支线的长短代表了距离。图中每一格色键表示该样品某种氨基酸含量的高低，含量高的呈黑色，含量低的颜色则变浅。

从图4中可以很直观的看到，每个分组里的三个平行组颜色相近，说明组内差异较小；同时组间差异较大，从图4中可知几种动物机体必需氨基酸含量都有升高的趋势，如苯丙氨酸(PHE)、苏氨酸(THR)、丝氨酸(SER)、谷氨酸(GLU)、胱氨酸(CYS)等。说明驯化后的枯草芽孢杆菌发酵液中氨基酸含量产生了显著变化，驯化后菌种发酵物更适合用于机体营养需求。

实施例2：驯化富锰枯草芽孢杆菌耐高温试验结果

将驯化的富锰枯草芽孢杆菌(保藏号：CGMCC No.23751)、普通枯草芽孢杆菌、双歧杆菌菌种在37℃活化培养24h至稳定期，酵母菌菌种在28℃活化培养24h至稳定期，稀释后取100μL进行平板涂布计数，计算高温处理前活菌数。

将四种菌培养至稳定期的益生菌分别置于水浴锅中40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃温度下10min后，稀释后取100μL进行平板涂布计数，计算高温处理后活菌数。实验结果见表2显示。

表2：高温对不同益生菌存活率的影响

注：存活率＝高温处理10min活菌数/高温处理前活菌数×100％

活菌数＝菌落数/0.1mL×稀释倍数

试验结果表明，30～40℃为枯草芽孢杆菌的适宜生长温度，在该温度条件下，枯草芽孢杆菌每隔20～30分钟繁殖一代。温度超过50℃，富锰枯草芽孢杆菌的生长速度受到抑制，但可以形成芽孢抵抗高温环境。在60℃以上的高温，富锰枯草芽孢杆菌可以存活，且存活率大大高于未驯化的普通枯草芽孢杆菌菌种。超过60℃酵母菌不能存活，超过70℃双歧杆菌不能存活，而本发明筛选的富锰枯草芽孢杆菌在100℃的温度下，可以存活10分钟左右。结果表明驯化的富锰枯草芽孢杆菌具有明显的抗高温特性，适合畜禽颗粒饲料加工添加益生菌应具备耐高温要求。

实施例3：驯化前后富锰枯草芽孢杆菌理化性质分析

枯草芽孢杆菌NT66株与驯化前的枯草芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等比较，进一步确定驯化后的枯草芽孢杆菌理化性质特点，结果分别见表2和表3。

由表3可知，经过传代30次驯化后的枯草芽孢杆菌NT66株的发酵液中α-淀粉酶和脂肪酶比驯化前显著增多(P<0.05)，驯化后的枯草芽孢杆菌发酵液小肽含量也有增加。说明枯草芽孢杆菌在经过驯化后，在产淀粉酶和脂肪酶等酶类的能力方面明显升高，小肽含量也有增加趋势。

表3：驯化对枯草芽孢杆菌发酵液中酶及小肽的影响表

由表4结果可知，与驯化前相比，驯化后的枯草芽孢杆菌NT66株发酵液中游离氨基酸总含量显著升高(P<0.01)，每100g菌液发酵液中含量由175.67mg上升到206.10mg；增长率为17.32％。并且几种动物机体必需氨基酸，如脯氨酸(PRO)、精氨酸(ARG)、天冬氨酸(ASP)、丙氨酸(ALA)、甘氨酸(GLY)等含量都有升高的趋势。说明驯化后的枯草芽孢杆菌NT66株发酵液所产生的氨基酸含量有显著变化，驯化后更适合用于畜禽机体营养需求。

表4：驯化后的枯草芽孢杆菌中氨基酸的影响表

注：∑(mg/100g)表示菌体发酵液中游离的总氨基酸含量，以单位mg/100g表示。

综上，本发明采用的逐步提高培养基中Mn²⁺浓度、培养温度的方法驯化筛选获得的枯草芽孢杆菌NT66株不仅拥有枯草芽孢杆菌的优点，而且将无机锰转化成菌体有机锰的能力显著提高，由于淀粉酶、脂肪酶和小肽的显著增加，大大提高了畜禽对微量元素的利用率和饲料转化率，更好地发挥有机锰的生物学功能。

Claims (4)

1.一种富含锰的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.23751。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株在制备饲料添加剂中应用。

3.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料中包含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株。

4.如权利要求3所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂中还添加有丁酸梭菌。

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