CN115181685B - 一种抗逆境富含亚铁离子的凝结芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗逆境富含亚铁离子的凝结芽孢杆菌,所提供的富含铁的凝结芽孢杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.24223。本发明提供一种高耐受铁的菌种。本发明驯化后的菌能够耐受高浓度的Fe2+离子,减少Fe2+抗氧化,并且能够稳定的生长,且具有明显的抗高温和耐酸特性,适合畜禽颗粒饲料加工中的耐高温的要求。所获得菌株具有补铁和促进饲料利用率双重功效。本发明的菌株能够将无机铁大部分转化成有机铁,不仅能够达到畜禽补铁的效果,更能提高生长发育,改善肉蛋颜色,增加饲料利用率。所获得的菌株具有抗高温和耐酸特性,能够有效提升消化酶类,如淀粉酶、脂肪酶和小肽的含量。
Description
技术领域
本发明属于动物微生态制剂生产技术领域,具体涉及一种富含铁的凝结芽孢杆菌及其应用。
背景技术
铁是动物体内的必需微量元素之一,对维护动物机体正常生理功能具有重要作用。铁是血红蛋白的重要组成部分。铁元素在动物机体内参与造血,并形成血红蛋白、肌红蛋白,参与氧的携带和运输的整个过程。动物补铁是通过饲料或专用营养剂为机体额外补充适量的无机铁或有机铁化合物,从而补充铁元素以达到保障生长发育、促进健康和改善产品品质的功能。
凝结芽孢杆菌通过产生凝固素和乳酸抑制致病菌的生长,凝固素是一种抗菌肽,能够与靶细胞膜相互作用,导致靶细胞膜穿孔,细胞内容物外流,最终靶细胞死亡。而乳酸能够降低肠道内的pH,而低pH的肠道环境不仅能抑制很多致病菌和腐败菌的生长,还能减少酚、氨、细菌毒素、甾类代谢物等对机体健康有害的物质产生。
凝结芽孢杆菌不同于其它的益生菌,由于菌体在肠道上皮细胞的粘附性较弱,所以在自然条件下一般很难在肠道中存在。因此,凝结芽孢杆菌只能在肠道内做短暂的停留。在发酵过程中,能够迅速消耗外环境或动物肠道中的游离氧,造成环境或动物肠道低氧,大大减少二价铁(Fe2+)在有氧环境中被氧化成三价铁(Fe3+),保持二价铁(Fe2+)的吸收活性。目前,富含亚铁离子的凝结芽孢杆菌的研究还处于空白。
畜禽饲料中益生菌常用有乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、丁酸梭菌、双歧杆菌等,它们对促进畜禽生长、提高饲料营养利用率、维持肠道菌群平衡和增强健康水平都具有重要作用。然而,在饲料制粒过程中由于蒸汽或机械挤压而产生80℃左右高温,酵母菌和乳酸菌等菌种由于不耐高温,常常会全部被杀死,无法在消化道发挥作用,因此不适合做热加工型饲料添加剂。目前,饲料加工常用的芽孢杆菌、丁酸梭菌、双歧杆菌由于缺乏抗逆境(抗高温、抗酸、抗高渗透压)驯化,加工的成品颗粒饲料活菌数也很不稳定,畜禽动物饲养应用效果也不一致。因此,培育抗逆境、具有一定特异性和作用效果好的益生菌得到了饲料行业普遍关注。
畜禽饲料中的无机铁离子(Fe2+)90%排除体外,有机铁排出率仅为10%左右,后者比前者明显减少。尤其是现代规模化畜禽养殖中,排放到环境中铁离子的含量很高,日积月累后很容易造成水体富营养化,并也会导致畜禽和农产品残留Fe2+含量高,从而危及食品安全和整个生态环境。因此,探究一种既满足促进动物生长发育、维护肠道健康和提高畜禽肉质量,又能够减少铁排放量和防止水体富营养化的方法,对畜牧业营养精准化和维护生态良好循环具有重大社会价值。
畜禽和肠道益生菌菌群是一个复合体,饲料中单一添加酵母菌或乳酸菌会造成菌群失调,酸度过高,影响益生菌效果,因此驯化具有特异性多个益生菌,然后按照肠道优势菌群结果进行复配应用,能够大大提高复合制剂的使用效果。
迄今为止,畜禽饲料规模化生产缺乏抗高温、耐酸和抗高渗透压益生菌添加剂,既能够抗高温、抗酸又能够抗逆境富含亚铁离子凝结芽孢杆菌菌株还处于空白。为此,获得多功能凝结芽孢杆菌菌,对畜禽饲料生产具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗逆境富含亚铁离子的凝结芽孢杆菌及应用,该菌株作为畜禽饲料添加剂,既能满足畜禽对铁的需要量,又能提高饲料利用率,增加饲料制粒抗高温能力,减少饲料中铁添加量与排泄量。
本发明首先提供一种抗逆境富含亚铁离子的凝结芽孢杆菌菌株,为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)富铁凝结芽孢杆菌NT68株,于2022年1月2日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.24223。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)富铁凝结芽孢杆菌NT68株的红外光谱吸收峰如图3所示;
所提供的凝结芽孢杆菌NT68株可以用作制备富铁益生菌复合饲料添加剂。
本发明所提供的富含铁的凝结芽孢杆菌菌株用于制备饲料添加剂;
本发明还提供一种饲料添加剂,所述饲料中包含有上述的凝结芽孢杆菌NT68株。
与现有技术相比,本发明方法具有如下优点:
1、获得了一种高耐受铁的菌株,本发明驯化后的菌能够耐受高浓度的Fe2+,并且能够稳定的生长。
2、驯化的富铁凝结芽孢杆菌具有明显的抗高温、耐胆盐和抗酸特性,适合畜禽颗粒饲料加工中的耐高温的要求。
3、所获得菌株具有补铁和促进生长发育双重功效。本发明的菌株能够将无机铁大部分转化成有机铁,不仅能够达到补铁的作用,更能增强动物免疫力,提高饲料利用率。
4、所获得的菌株具有能促进机体生长发育和提高饲料转化率的功能。
5、所获得菌株具有促进其它益生菌生长、提高该益生菌产生多种酶类,如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和小肽。
附图说明
图1:驯化对凝结芽孢杆菌形态的影响图;
图2:驯化对凝结芽孢杆菌生长情况的影响图;
图3:驯化对凝结芽孢杆菌红外光谱吸收峰的影响图;
图4:驯化对凝结芽孢杆菌发酵产生的氨基酸影响图,其中A1、A2、A3为驯化前凝结芽孢杆菌发酵液中氨基酸成分,B1、B2、B3为驯化后凝结芽孢杆菌发酵液中氨基酸成分。
具体实施方式
本发明将益生菌凝结芽孢杆菌在含有高浓度Fe2+离子的培养基中进行培养,驯化筛选获得了能够富含高浓度铁离子的凝结芽孢杆菌菌株。所筛选获得的菌株在高Fe2+浓度条件下能够稳定的生长,提高凝结芽孢杆菌富集铁离子的能力;且在发酵过程中产生更高含量的酶、氨基酸以及小肽等活性物质。所筛选的菌株应用于畜禽饲料中,可以起到促进肠道消化、提高饲料利用率。
本发明筛选得到的凝结芽孢杆菌菌株不仅能够保证获得与常规的凝结芽孢杆菌所拥有的特性,同时菌体中还可以富集更高的有机铁。当培养基中铁离子添加量为300.0mg/L时,菌体中的铁离子的含量能够达到0.12g/L,菌体的有机铁含量为88.09mg/L。
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细描述。
实施例1:富含铁凝结芽孢杆菌的培养驯化
采用逐步提高培养基中Fe2+浓度、提高培养温度的方式进行驯化;将驯化后的菌种再连续培养若干代后,与驯化前的凝结芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等比较,进一步确定驯化后的凝结芽孢杆菌性质特点,并且能够稳定传代。
最终获得能够耐受高浓度硫酸亚铁(300mg/L)的凝结芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NT68株,于2022年1月2日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.24223。
(1)菌株结构变化:从图1可以看出,与原始菌种相比,经过革兰氏染色显微镜观察相同培养时间,未富铁的凝结芽孢杆菌多为单生或短链状,而富铁的凝结芽孢杆菌多呈长链状,且单个菌体形态较大。同等倍数下扫描电镜图片显示,富铁的凝结芽孢杆菌菌体表面纹理变粗糙。凝结芽孢杆菌为了抵抗高浓度铁离子环境,从而对自身形态做出改变,说明在铁离子的驯化作用下会对凝结芽孢杆菌的外表形态造成明显变化。
(2)菌株数量变化:从图2可以看出,凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),驯化前后均呈如下规律:在0~2h,是菌体适应的过程,菌体几乎不生长,处于延滞期;在4~28h,菌生长迅速呈指数型速度生长繁殖。在30~36h,由于培养基中营养物质减少,菌体趋于平稳。另外,驯化后的凝结芽孢杆菌要比未驯化的凝结芽孢杆菌提前进入指数生长期;同时驯化后凝结芽孢杆菌的对数期和稳定期延长,且生长期与稳定期时的菌数量增多。表明筛选的凝结芽孢杆菌经过高浓度铁离子多代驯化后生长和繁殖速度明显加快。
(3)富铁效果分析:在含300mg/L铁离子浓度的培养基中分别接种普通凝结芽孢杆菌种和富铁凝结芽孢杆菌,在45℃下培养24h后,将菌液离心洗脱烘干,进行菌体含量以及菌体有机铁含量测定,试验结果如表1。
表1:不同凝结芽孢杆菌富集铁效果分析表
表1结果表明,驯化的富铁凝结芽孢杆菌,当铁添加量为300.0mg/L时,菌体含量为1.75g/L,菌体的有机铁含量为88.09mg/kg,远远大于普通凝结芽孢杆菌的铁含量,证明驯化的菌种具有较好的富铁效果;而普通的凝结芽孢杆菌并不能达到本发明菌株的富铁效果。
(4)驯化对凝结芽孢杆菌红外光谱吸收峰的影响:从图3可以看出,驯化前后的凝结芽孢杆菌在400~4000cm-1波数范围内,红外光谱的峰型、峰位均发生了明显变化。驯化后凝结芽孢杆菌在3200~3750cm-1范围波数内,出现-OH和-NH键的交叉伸缩振动峰,驯化后凝结芽孢杆菌由3297.67cm-1移动到3291.98cm-1。在1656.07cm-1处的吸收峰转移到1658.96cm-1,此处为羰基C=O伸缩振动吸收;在1453.18、1235.97、1061.44cm-1处的吸收峰也分别发生偏移,此范围为CH面内弯曲振动;另外750~650cm-1为C-H面外弯曲振动,富铁凝结芽孢杆菌在537.56cm-1处的吸收峰移到539.49cm-1;表明驯化后菌体表面基团-CH3亲水脂分子以不同形式与Fe2+结合,铁离子与细胞表面的酰胺中氨基、羧基发生了化学反应,它们参与了铁离子的成键过程。表明铁离子驯化在一定程度上改变了凝结芽孢杆菌菌体表面基团结构。
(5)驯化对凝结芽孢杆菌发酵产生的氨基酸的影响:从图4可以看出,图形包含横纵坐标,横坐标代表试验分组,A代表驯化前的菌种;B代表驯化后的菌种;1、2、3表示的是同组的重复性试验。纵坐标代表氨基酸种类。图中每一格色键表示该样品某种氨基酸含量的高低,含量高呈深色,含量低呈浅色。
从图4中可以很直观的看到,每个分组里的三个平行组颜色相近,说明组内差异较小;同时组间差异较大,从图4中可知几种动物机体必需氨基酸含量都有升高的趋势,如谷氨酸(GLU)、胱氨酸(CYS)、甘氨酸(GLY)、缬氨酸(VAL)等。说明驯化后的凝结芽孢杆菌发酵液中氨基酸含量产生了显著变化,驯化后菌种发酵物更适合用于机体营养需求。
实施例2:驯化富铁凝结芽孢杆菌耐高温试验结果
将驯化的富铁凝结芽孢杆菌(保藏号:CGMCC No.24223)、普通凝结芽孢杆菌在45℃活化培养24h至稳定期,双歧杆菌菌种在37℃活化培养24h至稳定期,酵母菌菌种在28℃活化培养24h至稳定期,稀释后取100μL进行平板涂布计数,计算高温处理前活菌数。
将四种菌培养至稳定期的益生菌分别置于水浴锅中40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃温度下10min后,稀释后取100μL进行平板涂布计数,计算高温处理后活菌数。实验结果见表2显示。
表2:高温对不同益生菌存活率的影响表
注:存活率=高温处理10min活菌数/高温处理前活菌数×100%
活菌数=菌落数/0.1mL×稀释倍数
表2结果表明,40~50℃为凝结芽孢杆菌的适宜生长温度,在该温度条件下,凝结芽孢杆菌每隔20~30分钟繁殖一代。温度超过70℃,富铁凝结芽孢杆菌的生长速度受到抑制,但可以形成芽孢抵抗高温环境。在90℃以上的高温,富铁凝结芽孢杆菌可以存活,且存活率高于未驯化的普通凝结芽孢杆菌菌种。超过60℃酵母菌不能存活,超过70℃双歧杆菌不能存活,而本发明筛选的富铁凝结芽孢杆菌在110℃的温度下,可以存活10分钟左右。结果表明驯化的富铁凝结芽孢杆菌具有明显的抗高温特性,适合畜禽颗粒饲料加工添加益生菌应具备耐高温要求。
实施例3:驯化富铁凝结芽孢杆菌耐胆盐试验结果
将驯化的富铁凝结芽孢杆菌(保藏号:CGMCC No.24223)、普通凝结芽孢杆菌在45℃活化培养24h至稳定期,分别将两菌接种至胆盐含量为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%的培养基中45℃恒温培养6h后,计算成活率。
表3:不同胆盐浓度对驯化前后凝结芽孢杆菌存活率的影响表
由表3结果表明,在胆盐含量为0.1%~0.3%时,富铁凝结芽孢杆菌可以正常生长存活,普通凝结芽孢杆菌的存活率受到影响,当胆盐含量超过0.3%,随着胆盐含量的增加,凝结芽孢杆菌的存活率下降,但经过驯化后的富铁凝结芽孢杆菌存活率始终高于未驯化的原始凝结芽孢杆菌。正常畜禽肠道胆盐含量范围为0.03%~0.3%,驯化后富铁凝结芽孢杆菌活力在肠道中胆盐环境不受影响。因此,采用富铁凝结芽孢杆菌适合作为肠道益生菌制剂,能够在生物体内存活繁殖,并维护肠道健康。
实施例4:驯化富铁凝结芽孢杆菌抗酸性试验结果
将驯化的富铁凝结芽孢杆菌(保藏号:CGMCC No.24223)、普通凝结芽孢杆菌在45℃活化培养24h至稳定期,分别将两菌接种至pH为7、6、5、4、3、2、1的等量培养基中45℃恒温培养6h,稀释后取100μL进行平板涂布计数,计算不同pH下的成活率。
表4:不同pH对驯化前后凝结芽孢杆菌存活率的影响表
由表4结果可知,凝结芽孢杆菌最适生长pH为6~7,当pH<6时,随着pH的降低,存活率也降低,但经过驯化后的富铁凝结芽孢杆菌在相同酸性pH下的存活率明显高于未驯化的普通凝结芽孢杆菌,说明驯化后的菌种具有一定的抗酸性,能更好地适应抵抗消化道的酸性环境,尤其是能够顺利到达肠道后段对慢性结肠炎会起到良好作用,适合作为畜禽保健生物添加剂。
实施例5:驯化前后富铁凝结芽孢杆菌理化性质分析
富铁凝结芽孢杆菌NT68株与驯化前的凝结芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等比较,进一步确定驯化后的凝结芽孢杆菌理化性质特点.
表5:驯化对凝结芽孢杆菌发酵液中酶及小肽的影响表
由表5结果可知,经过传代20次驯化后的凝结芽孢杆菌NT68株的发酵液中α-淀粉酶、蛋白酶以及小肽比驯化前显著增多(P<0.05),脂肪酶含量也提高(P>0.05)。说明凝结芽孢杆菌在经过驯化后,在产淀粉酶和蛋白酶等酶类以及小肽的能力方面明显升高,产脂肪酶能力也有所增加。
表6:驯化前后的凝结芽孢杆菌中氨基酸的影响表
注:∑(mg/100g)表示菌体发酵液中游离的总氨基酸含量,以单位mg/100g表示。
由表6可知,与驯化前相比,驯化后的凝结芽孢杆菌(保藏号:CGMCC No.24223)发酵液中游离氨基酸总含量显著升高(P<0.01),每100g菌液发酵液中含量由236.92mg上升到260.28mg;增长率为9.86%。并且几种动物机体必需氨基酸,如脯氨酸(PRO)、天冬氨酸(ASP)、丙氨酸(ALA)、苯丙氨酸(PHE)等含量都有升高的趋势。说明驯化后的凝结芽孢杆菌NT株发酵液所产生的氨基酸含量有显著变化,驯化后更适合用于畜禽机体营养需求。
综上,本发明采用的逐步提高培养基中铁离子(Fe2+)浓度、培养温度的方法驯化筛选获得的凝结芽孢杆菌NT68株不仅拥有凝结芽孢杆菌的优点,而且将无机铁转化成菌体有机铁的能力显著提高,防止铁离子(Fe2+)氧化,促进铁离子吸收。由于淀粉酶、蛋白酶和小肽的显著增加,畜禽对饲料转化率显著提高,更好地发挥了富铁凝结芽孢杆菌的生物学功能。
Claims (7)
1.一种凝结芽孢杆菌菌株,其特征在于,所述的凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.24223。
2.如权利要求1所述凝结芽孢杆菌菌株,其特征在于,所述的凝结芽孢杆菌菌株的红外光谱吸收峰如图3所示。
3.权利要求1所述凝结芽孢杆菌菌株在制备富含亚铁离子的菌剂中的应用。
4.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株在制备饲料添加剂中的应用。
5.一种饲料添加剂,其特征在于,所述的饲料添加剂中包含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株。
6.权利要求5所述的饲料添加剂在制备饲料中的应用。
7.一种饲料,其特征在于,所述的饲料中添加有权利要求1所述凝结芽孢杆菌菌株。
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