CN113604402A - 一种特异性的乳酸菌培养基及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性的乳酸菌培养基及其培养方法和应用，该培养基包括：每1L自来水中加入胰蛋白胨8～12g、牛肉膏10～15g、酵母提取物8～12g、麦芽提取物30～60g、葡萄糖10～15g、柠檬酸氢二铵1.5～2.5g、磷酸氢二钾1.5～2.5g、一水硫酸锰0.1～0.2g、七水硫酸镁0.5～0.7g、吐温80 1～2mL、L‑半胱氨酸盐酸盐1～2g、维生素B₂ 1～3mg，最后加入乙酸调节至4～6g/100mL。本发明的培养基配方和培养方法具有专一性强、培养效率高、培养效果稳定、成分简单、成本低廉、易于商业化，可以快速高效培养乳酸菌HSLZ‑75^T和HSCY 2073。

Description

一种特异性的乳酸菌培养基及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异性的乳酸菌培养基及其培养方法和应用。

背景技术

研究发现自然界中尚存在90％以上未有合适培养方法的微生物，使用传统的细菌培养方法仅能培养其中的一小部分细菌。应用传统方法培养出的微生物都是已知微生物，对新的微生物物种的培养基成分、分离、培养方法的研究和报道较少。微生物培养困难是与抵制培养的特殊原因，包括温度、pH、氧气、营养等众多因素有关，微生物新种的培养具有众多的技术挑战。

乳酸菌泛指一大类能够发酵糖类产生大量乳酸的细菌，在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，目前约有200余种。乳酸菌具有调节胃肠道菌群、改善胃肠道功能、提高食物消化率和生物效价、降低血清胆固醇、控制内毒素、抑制肠道内腐败菌生长、提高机体免疫力等多种生理功能。

传统酿造食醋采用开放式发酵、原辅料不经过灭菌处理，酿造过程中微生物种类及其丰富，许正宏等学者对镇江香醋醋醅中微生物群落结构进行解析发现该过程中有上百种微生物参与发酵。乳酸菌普遍存在于食醋发酵过程中，尤其是传统固态酿造食醋，乳酸菌占比可达到60％以上，对产品品质具有重要影响。深入研究不同类型乳酸菌培养基、分离和培养方法及其应用对食醋酿造行业具有重要意义。因此，创新培养基配方和培养方法，更好的培养乳酸菌具有重要意义。

目前，许多不同的乳酸菌对培养基和培养方法具有独特的需求，即使同一种乳酸菌的不同菌株之间，在培养基和培养方法上也具有较大的差异。如专利CN202010877453.8公开了一种乳酸菌分离培养基配方及培养方法，虽然其所培养目的乳酸菌与新种乳酸菌HSLZ-75^T的16S rRNA序列具有100％的一致性，但其目的乳酸菌在论文(Lactobacillusjinshani sp.nov.,isolated from solid-state vinegar culture of Zhenjiangaromatic vinegar.Antonie van Leeuwenhoek)公开的乳酸菌HSLZ-75^T的培养基配方上无法生长。且专利CN 202010877453.8中目的乳酸菌在其固体平板上需培养7-14天，培养时间较长；培养基配方极其复杂、操作不便、成本高，液体培养中需要添加30余种物质，其中仅维生素就有9种；含有酒醅浸出液且用量大，易导致培养基的稳定性差，酒醅浸出液一般人员难以获得，整体应用性不强。专利CN 202011227512.3公开了一种乳酸菌Z-1的培养基配方和分离方法，但其培养时间较长，固体平板上需要7天后形成肉眼可见菌落；培养基成分复杂，液体培养中需要添加近20种物质；操作复杂，需要单独配制含有大量复合维生素B的溶液，使用前需过膜除菌，且需要乳酸和乙酸2种酸调节pH值；需要自制麸皮浸出液，培养基稳定性差。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新型特异性的乳酸菌培养基，本发明的培养基主要针对新型乳酸菌，是一种专一、高效、稳定、方便的新型乳酸菌培养基配方，可以快速高效培养乳酸菌。

本发明还提供了一种新型乳酸菌的培养基的培养方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的特异性的乳酸菌液体培养基，所述培养基中包括以下原料：每1L自来水中加入胰蛋白胨8～12g、牛肉膏10～15g、酵母提取物8～12g、麦芽提取物30～60g、葡萄糖10～15g、柠檬酸氢二铵1.5～2.5g、磷酸氢二钾1.5～2.5g、一水硫酸锰0.1～0.2g、七水硫酸镁0.5～0.7g、吐温801～2mL、L-半胱氨酸盐酸盐1～2g、维生素B₂ 1～3mg，最后加入乙酸调节至总酸4～6g/100mL。

其中，所述乳酸菌为乳酸菌Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073。

本发明所述特异性的乳酸菌固体培养基，所述培养基中包括以下原料：每1L自来水中加入胰蛋白胨8～12g、牛肉膏10～15g、酵母提取物8～12g、麦芽提取物30～60g、葡萄糖10～15g、柠檬酸氢二铵1.5～2.5g、磷酸氢二钾1.5～2.5g、一水硫酸锰0.1～0.2g、七水硫酸镁0.5～0.7g、吐温80 1～2mL、L-半胱氨酸盐酸盐1～2g、维生素B₂ 1～3mg，加入琼脂粉20～25g，最后加入乙酸调节至总酸4～6g/100mL。

其中，所述乳酸菌为乳酸菌Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073。

本发明所述的特异性的乳酸菌液体培养基的培养方法，包括如下步骤：

在培养基中接种菌株后，在培养基的液面上方残留空气的高度＜0.5cm，且培养基的装液量＞90％，密封不漏气，培养温度30～35℃。

本发明所述的特异性的乳酸菌固体培养基的培养方法，包括如下步骤：

在培养基中接种菌株后，置于厌氧培养箱中培养，厌氧培养箱中氧气含量＜10ppm，培养湿度75～85％，培养温度30～35℃。

本发明所述的特异性的乳酸菌液体培养基或者所述的乳酸菌的固体培养基在快速大量培养乳酸菌中的应用。

本发明中乳酸菌Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T为商业菌株(CICC6269)，是一株乳酸菌新种(Lactobacillus jinshani sp.nov.,isolated fromsolid-state vinegar culture of Zhenjiang aromatic vinegar.Antonie vanLeeuwenhoek)。

乳酸菌Lactobacillus sp.HSCY 2073保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC NO.18982，保藏日期为2019年11月21日。其是一株乙酸和乙醇耐受性强、产不挥发酸效果优、产乙醛、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、3-甲基戊酸乙酯等5种果香类香气物质含量高的乳酸菌，可以适应食醋酿造的高酸、高醇、寡营养等恶劣环境，耐高酸的能力强，即能产不挥发酸以提高食醋滋味的柔和性，同时又能提高具有良好香气的醛类、酯类等香气物质，并且最终使食醋产品的整体风味品质大幅度。最高可耐受的总酸为8.0g/100mL；可耐受13％乙醇，能够在15℃的低温条件下代谢，最适生长温度为30。菌株HSCY 2073在食醋酿造的产业化应用效果显著，操作方便，成本低廉，能够显著提高食醋中不挥发酸和香气物质的含量。通过该菌株在镇江香醋酿造中的使用，可使醅卤中总酸含量提高4.71％，不挥发酸含量提高24.86％，产品出率提5.14％，具有果香味的5种风味物质乙醛含量提高9.05％、乙酸乙酯含量提高25.83％、乙酸异丁酯含量提高1.51％、乙酸异戊酯含量提高7.39％、3-甲基戊酸乙酯含量提高34.27％，显著提高了产品的滋味和香气，整体风味品质较高。同时在山西老陈醋造中的使用也可以有效强化山西老陈醋的风味品质。其16S rRNA基因序列，如SEQ ID NO.1所示。

目前，Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillussp.HSCY2073暂没有专一性强、培养效率高、培养效果稳定、成分简单、使用方便、成本低廉的培养基配方和培养方法。Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T作为一个特殊的、新发现的乳酸菌新种，开发可商业化应用，专一、高效、稳定、方便的培养基配方和培养方法，是本领域亟待解决的技术难题。目前常见的乳酸菌分离和培养基多采用MRS或常规改良的MRS为主，但一般均不能对Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073进行分离或培养，这也是该乳酸菌作为新种迟迟未被发现的原因。同时现行的MRS或改良的MRS培养基可对常规的乳酸菌进行分离，但培养效果和选择性较差，分离效果易受其他乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等微生物的干扰。

而本发明特定的培养基对于特定的菌株Acetilactobacillus jinshanensisHSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073，可以快速高效培养，具有专一、高效、稳定、方便的有益效果。

本发明中由于特定的菌株Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073需要特定的培养基，本发明设定的特定的培养基，发现常规的乳酸菌在上面是不生长的，其中维生素B₂的添加及其添加量十分重要。此外，与改良MRS培养基相比，本发明特定增加了微量的维生素，有效减少麦芽提取物的使用量，并调整酸度，培养效果明显更好。本发明的培养基针对新型乳酸菌，是一种专一、高效、稳定、方便的新型乳酸菌培养基配方，可以快速高效培养乳酸菌。

有益效果：由现有技术相比较，本发明具有以下优点：

(1)本发明的培养基配方和培养方法可较好的满足Acetilactobacillusjinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073的分离和培养需求；

(2)本发明的培养基配方和培养方法在Acetilactobacillus jinshanensisHSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073培养上具有专一性强、培养效率高、培养效果稳定、成分简单、使用方便、成本低廉、易于商业化的有益效果。

(3)本发明从多维度的综合比较实验证明，本发明的培养基配方和培养方法，具有良好的专一性、高效性和稳定性。

附图说明

图1为本发明的HSCY 2073的菌体形态照片。

图2为HSLZ-75^T在本发明培养基的固体平板上的菌落形态。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中的原料和试剂如无特殊说明，均为商业化市售。

本发明中的模式菌以及常规乳酸菌均由相应菌种库购买或者市售可得。

改良MRS培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、麦芽提取物150g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、一水硫酸锰0.19g、七水硫酸镁0.58g、吐温80 1.0mL、L-半胱氨酸1g，琼脂20g，蒸馏水1L，115℃，25min灭菌，然后加入终浓度2％(v/v)乙酸。

MRS培养基配方1：酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g，吐温80 1g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH6.8，115℃，25min灭菌。

MRS培养基配方2：酪蛋白胨10g，牛肉粉8g，酵母提取物4g，葡萄糖20g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 5.0，115℃，25min灭菌。

MRS培养基配方3：西红柿汁400mL，葡萄糖10g，盐溶液A 5ml，盐溶液B 5ml，酵母膏10g，琼脂20g，蒸馏水600mL，pH 6.9，115℃，25min灭菌。盐溶液A配方：磷酸氢二钾2.5g，磷酸二氢钾2.5g，蒸馏水250mL；盐溶液B溶液配方：七水硫酸镁10g，硫酸铁5g，氯化钠5g，四水硫酸锰5g，蒸馏水250mL。

LB培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，水1L，115℃灭菌25min。

牛肉膏琼脂培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，水1L，115℃灭菌25min。

培养基配方100239：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，吐温801g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH6.2-6.5，115℃，20min灭菌。

培养基配方20203：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，吐温801g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH6.2-6.5，115℃，20min灭菌。

培养基配方15814：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物15g，葡萄糖20g，麦芽糖10g，吐温80 1g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH5.6，115℃，20min灭菌。

培养基配方20331：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，吐温801g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH5.2，115℃，20min灭菌。

上述所有培养基中不加入琼脂为对应的液体培养基。

1、菌株的活化培养

(1)菌株Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillussp.HSCY2073的活化培养。

将通过下述液体培养基将生长至对数期的HSLZ-75^T和HSCY 2073按照10％(v/v)的接种量，分别接入含有本发明液体培养基的可密封容器中，液体培养基配方如下：胰蛋白胨10g、牛肉膏12g、酵母提取物10g、麦芽提取物50g、葡萄糖13g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、一水硫酸锰0.15g、七水硫酸镁0.5g、吐温80 1.5mL、L-半胱氨酸盐酸盐1.5g、维生素B₂ 2mg，自来水1L，115℃，25min灭菌，然后加入乙酸调节至总酸5g/100mL。

可密封容器中培养基的液面上方残留空气的高度约0.3cm，培养基的装液量约95％，密封不漏气，置于30℃条件下培养5d。

重复上述方式，将菌株活化3次，其中最后一次培养时间为5d，备用。HSCY2073菌体形态如图1。

(2)4株16S rRNA与HSLZ-75^T相近的模式菌种的活化培养

选择相应的不添加琼脂的液体培养基进行活化3次，备用。

Lactobacillus caviae DSM 100239^T，采用培养基100239培养基配方，37℃，普通培养箱培养2天。

Lactobacillus fructivorans DSM 20203^T，采用培养基20203培养基配方，30℃，普通培养箱培养2天。

Lactobacillus rossiae DSM 15814^T，采用培养基15814培养基配方，30℃，普通培养箱培养2天。

Pediococcus damnosus DSM 20331^T，采用培养基20331培养基配方，26℃，普通培养箱培养2天。

(3)4株常规乳酸菌的活化培养

选择相应的不添加琼脂的液体培养基进行活化3次，备用。

Lactobacillus helveticus CICC 20243和Lactobacillus acidipiscis CICC10822，用MRS培养基配方1，37℃，普通培养箱培养1天。

Lactobacillus acetotolerans CICC10774，用MRS培养基配方2，37℃，普通培养箱培养1天。

Lactobacillus fermentum CICC 20176，用MRS培养基配方3，37℃，普通培养箱培养1天。

2、菌株的涂布

取上述步骤中活化3次的各个菌株的培养液，采用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取活菌数在1000～2000CFU/mL的稀释液0.1mL涂布于下述实施例1中相应的固体平板上。

实施例1

固体培养基配方：胰蛋白胨10g、牛肉膏12g、酵母提取物10g、麦芽提取物50g、葡萄糖13g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、一水硫酸锰0.15g、七水硫酸镁0.5g、吐温801.5mL、L-半胱氨酸盐酸盐1.5g、维生素B₂ 2mg，琼脂粉22g，自来水1L，115℃，25min灭菌，冷却至50～55℃，然后加入乙酸调节至总酸5g/100mL。

将上述培养基15mL倾注于直径9cm的培养皿中，待冷却后涂布上述相应稀释后的菌株菌液(1000～2000CFU/mL)0.1mL，置于厌氧培养箱中培养，厌氧培养箱中氧气含量约8ppm，培养湿度75％，培养温度33℃，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。

其中，涂布HSLZ-75^T组为实施例1-1，菌落形态如图2，涂布HSCY 2073为实施例1-2，涂布DSM 100239^T组为实施例1-3，涂布DSM 20203^T组为实施例1-4，涂布DSM 15814^T组为实施例1-5，涂布DSM 20331^T组为实施例1-6，涂布CICC 20243组为实施例1-7，涂布CICC10822组为实施例1-8，涂布CICC10774组为实施例1-9，涂布CICC 20176组为实施例1-10。

实施例2

培养基配方：胰蛋白胨8g、牛肉膏10g、酵母提取物8g、麦芽提取物60g、葡萄糖10g、柠檬酸氢二铵1.5g、磷酸氢二钾2.5g、一水硫酸锰0.1g、七水硫酸镁0.5g、吐温80 1mL、L-半胱氨酸盐酸盐1g、维生素B₂ 1mg，琼脂粉20g，自来水1L，115℃，25min灭菌，冷却至50～55℃，然后加入乙酸调节至总酸4g/100mL。

将上述培养基15mL倾注于直径9cm的培养皿中，待冷却后涂布上述相应稀释后的菌株菌液0.1mL，置于厌氧培养箱中培养，厌氧培养箱中氧气含量约8ppm，培养湿度85％，培养温度30℃，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。

其中，涂布HSLZ-75^T组为实施例2-1，涂布HSCY 2073为实施例2-2，涂布DSM100239^T组为实施例2-3，涂布DSM 20203^T组为实施例2-4，涂布DSM15814^T组为实施例2-5，涂布DSM 20331^T组为实施例2-6，涂布CICC 20243组为实施例2-7，涂布CICC 10822组为实施例2-8，涂布CICC10774组为实施例2-9，涂布CICC 20176组为实施例2-10。

实施例3

培养基配方：胰蛋白胨12g、牛肉膏15g、酵母提取物12g、麦芽提取物30g、葡萄糖15g、柠檬酸氢二铵2.5g、磷酸氢二钾1.5g、一水硫酸锰0.2g、七水硫酸镁0.7g、吐温80 2mL、L-半胱氨酸盐酸盐2g，维生素B₂ 3mg，琼脂粉25g，自来水1L，115℃，25min灭菌，冷却至50～55℃，然后加入乙酸调节至总酸6g/100mL。

将上述培养基15mL倾注于直径9cm的培养皿中，待冷却后涂布上述相应稀释后的菌株菌液0.1mL，置于厌氧培养箱中培养，厌氧培养箱中氧气含量约8ppm，培养湿度80％，培养温度35℃，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。

其中，涂布HSLZ-75^T组为实施例3-1，涂布HSCY 2073为实施例3-2，涂布DSM100239^T组为实施例3-3，涂布DSM 20203^T组为实施例3-4，涂布DSM15814^T组为实施例3-5，涂布DSM 20331^T组为实施例3-6，涂布CICC 20243组为实施例3-7，涂布CICC 10822组为实施例3-8，涂布CICC10774组为实施例3-9，涂布CICC 20176组为实施例3-10。

对比例1

在下列培养基固体平板上，涂布HSLZ-75^T，其中改良MRS培养基为对比例4-1、MRS培养基配方1为对比例4-2、MRS培养基配方2为对比例4-3、MRS培养基配方3为对比例4-4、LB培养基配方为对比例4-5、牛肉膏琼脂培养基配方为对比例4-6、培养基100239为对比例4-7、培养基20203为对比例4-8、培养基15814为对比例4-9、培养基20331为对比例4-10。

在下列培养基固体平板上，涂布HSCY 2073，其中改良MRS培养基为对比例5-1、MRS培养基配方1为对比例5-2、MRS培养基配方2为对比例5-3、MRS培养基配方3为对比例5-4、LB培养基配方为对比例5-5、牛肉膏琼脂培养基配方为对比例5-6、培养基100239为对比例5-7、培养基20203为对比例5-8、培养基15814为对比例5-9、培养基20331为对比例5-10。

将上述培养基15mL倾注于直径9cm的培养皿中，待冷却后涂布上述相应稀释后的菌株菌液0.1mL，置于厌氧培养箱中培养，厌氧培养箱中氧气含量约8ppm，培养湿度75％，培养温度33℃，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。

对比例2

选择实施例1中的本发明培养基配方，但培养时放置于普通培养箱(非厌氧)，33℃培养，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。其中涂布HSLZ-75^T组为对比例6-1，涂布HSCY 2073为对比例6-2。

选择实施例2中的本发明培养基配方，但培养时放置于普通培养箱，33℃培养，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。其中涂布HSLZ-75^T组为对比例6-3，涂布HSCY 2073为对比例6-4。

选择实施例3中的本发明培养基配方，但培养时放置于普通培养箱，33℃培养，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。其中涂布HSLZ-75^T组为对比例6-5，涂布HSCY 2073为对比例6-6。

其中涂布方式同对比例1。

对比例3

选择实施例1中的本发明培养基配方，但培养时培养箱中氧气含量约20ppm，33℃培养，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。其中涂布HSLZ-75^T组为对比例7-1，涂布HSCY 2073为对比例7-2。

选择实施例2中的本发明培养基配方，但培养时培养箱中氧气含量约20ppm，30℃培养，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。其中涂布HSLZ-75^T组为对比例7-3，涂布HSCY 2073为对比例7-4。

选择实施例3中的本发明培养基配方，但培养时培养箱中氧气含量约20ppm，35℃培养，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况。其中涂布HSLZ-75^T组为对比例7-5，涂布HSCY 2073为对比例7-6。

其中涂布方式同对比例1。

对比例4

选择上述改良MRS培养基，即源于参考文献中乳酸菌菌株所用培养基和培养方法，参考文献如下：YuYJ,LiX,Zhang JH,Chai LJ,Lu ZM,Xu ZH(2019)Lactobacillusjinshani sp.nov.,isolated from solid-state vinegar culture of Zhenjiangaromatic vinegar.113(1):43-54。参照上述文献条件，培养时间15天，每天观察平板上菌落的生长情况，其中涂布HSLZ-75^T组为对比例8-1，涂布HSCY 2073为对比例8-2。

其中涂布方式同对比例1。

对比例5

固体培养基配方：胰蛋白胨10g、牛肉膏12g、酵母提取物10g、麦芽提取物50g、葡萄糖13g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、一水硫酸锰0.15g、七水硫酸镁0.5g、吐温801.5mL、L-半胱氨酸盐酸盐1.5g，琼脂粉22g，自来水1L，115℃，25min灭菌，冷却至50～55℃，然后加入乙酸调节至总酸5g/100mL。

其中，涂布HSLZ-75^T组为实施例9-1，涂布HSCY 2073为实施例9-2。

其中涂布方式同对比例1。

实施例4

选择实施例1中培养基配方，制备成不添加琼脂的液体培养，将培养至对数期的菌株HSLZ-75^T按照10％(v/v)的接种量，接入含有液体培养基的可密封容器中。其中，可密封容器中培养基的液面上方残留空气的高度0.3cm，培养基的装液量95％，密封不漏气，置于33℃条件下培养，培养3天，为实施例10-1。培养基的液面上方残留空气的高度1.0cm，且培养基的装液量80％，密封不漏气，培养温度33℃，培养3天，为对比例10-2。

选择实施例1中培养基配方，制备成不添加琼脂的液体培养，将培养至对数期的菌株HSCY 2073按照10％(v/v)的接种量，接入含有液体培养基的可密封容器中。其中，可密封容器中培养基的液面上方残留空气的高度0.3cm，培养基的装液量95％，密封不漏气，置于33℃条件下培养，培养3天，为实施例10-3。培养基的液面上方残留空气的高度1.0cm，且培养基的装液量80％，密封不漏气，培养温度33℃，培养3天，为对比例10-4。

待培养结束后，摇匀，并采用梯度稀释法，梯度稀释后采用实施例1-1的培养基和培养方法培养后进行梯度稀释后计数。

实施例5

实施例5选择实施例2中培养基配方，制备成不添加琼脂的液体培养，将培养至对数期的菌株HSLZ-75^T或者菌株HSCY 2073按照10％(v/v)的接种量，接入含有液体培养基的可密封容器中。其中，可密封容器中培养基的液面上方残留空气的高度0.3cm，培养基的装液量95％，密封不漏气，置于30℃条件下培养，培养3天。

实施例6

实施例6选择实施例3中培养基配方，制备成不添加琼脂的液体培养，将培养至对数期的菌株HSLZ-75^T或者菌株HSCY 2073按照10％(v/v)的接种量，接入含有液体培养基的可密封容器中。其中，可密封容器中培养基的液面上方残留空气的高度0.3cm，培养基的装液量95％，密封不漏气，置于35℃条件下培养，培养3天。

将上述本发明中培养基配方和培养方法的效果比较，结果如表1和2所示。

表1固体平板培养效果对比表

通过实施例1-1～1-10、实施例2-1～2-10、实施例3-1～3-10可以看出，其他常规乳酸菌无法在本发明的培养基上生长，说明本发明培养基配方具有良好的专一性和稳定性。

通过对比例4-1～4-10、对比例5-1～5-10可以看出，本发明的目标乳酸菌Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073无法在上述常规培养基上生长，说明目标乳酸菌具有较强的特殊性。虽然目标乳酸菌可在改良MRS培养基上生长，但生长速度慢，第7天才能肉眼可见，生长菌落数偏少，说明本发明的培养基配方具有良好的高效性。

通过对比例6-1～6-6可以看出，本发明的目标乳酸菌无法在上述常规培养方法下生长；通过对比例7-1～7-6可以看出，本发明目标乳酸菌虽然可以在上述氧含量20ppm培养方法下生长，但其生长速度慢，第7-8天才能肉眼可见，同时生长菌落数偏少；结合对比例8-1～8-2、对比例9-1～9-2可以看出，本发明的培养基和培养方法，具有良好的高效性，此外对比例9-1～9-2可以看出，维生素B₂在本发明培养基中对于菌株的生长速度和菌落数也有较大的影响，而维生素B₂在一般的乳酸菌培养基中不额外添加，其他物质带入的含量低，额外添加与否不会影响常规菌株生长，同时本发明中微量维生素的添加，还可以大量减少麦芽提取物的使用量，并且培养效果明显更好。

因此，由上述表1多维度的综合比较可以看出，本发明的特异性的乳酸菌的培养基配方和培养方法，具有良好的专一性、高效性和稳定性。

表2液体培养效果对比表

序号	活菌数CFU/mL
		实施例10-1	6.3×10<sup>8</sup>
对比例10-2	1.5×10<sup>7</sup>
		实施例10-3	7.8×10<sup>8</sup>
对比例10-4	2.4×10<sup>7</sup>

由上述表2可以看出，本发明的特异性的乳酸菌培养基的培养方法，具有更好的生长适宜性。

实施例7

本发明培养基成分稳定，可将培养基中的物质混合，待使用时再加水制备成液体或固体培养基，应用更方便。

将胰蛋白胨100g、牛肉膏120g、酵母提取物100g、麦芽提取物500g、葡萄糖130g、柠檬酸氢二铵20g、磷酸氢二钾20g、一水硫酸锰1.5g、七水硫酸镁5g、吐温80 15mL、L-半胱氨酸盐酸盐15g、维生素B₂ 20mg混合均匀，至于-20℃冰箱中。当需要使用时，取125g上述混合物，加入1L自来水中，溶解后，115℃，25min灭菌，待冷却至50～55℃，然后加入乙酸调节至总酸5g/100mL，即快速的得到液体培养基。

将胰蛋白胨100g、牛肉膏120g、酵母提取物100g、麦芽提取物500g、葡萄糖130g、柠檬酸氢二铵20g、磷酸氢二钾20g、一水硫酸锰1.5g、七水硫酸镁5g、吐温80 15mL、L-半胱氨酸盐酸盐15g、维生素B₂ 20mg，琼脂粉220g，混合均匀，至于-20℃冰箱中。当需要使用时，取125g上述混合物，加入1L自来水中，溶解后，115℃，25min灭菌，待冷却至50～55℃，然后加入乙酸调节至总酸5g/100mL，即快速的得到固体平板培养基。

采集麸醋样品，参照专利CN 202011227512.3中实施例1的麸醋样品、培养基和方法，长出肉眼可见菌落的时间为7天，而采用本发明的培养基和培养方法(其中涉及的培养基和培养方法，固体和液体培养基分别采用实施例1固体培养基和液体培养基，培养方法采用实施例1的固体培养和实施例4的液体培养)，采用相似麸醋样品时长出肉眼可见菌落的时间为3天，且检出活菌数的总数量提高了8.3％，说明本发明的培养基和方法生长速度更快。

因此，本发明的培养基和培养方法具有良好的商业化应用可行性。

以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进，但所有的这些改进均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。

序列表

<110> 江苏恒顺醋业股份有限公司

<120> 一种特异性的乳酸菌培养基及其培养方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1540

<212> DNA

<213> 乳杆菌HSCY 2073(Lactobacillus sp. HSCY 2073)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggtgtgc ctaatacatg caagtcgcgc 60

gcactcccgt agatgatttt gatgctctgc atcaaatgat tctacattcg agtgagcggc 120

ggatgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttgagtct gggatagcat ctggaaacgg 180

ataataatac cggataacaa ctgaaaccac atggtttcag tttgaaaggc gcgtttgcgt 240

cgctcttgga gggacccgcg gtccattagt tagttggtaa gataaaggcc taccaagacg 300

atgatggata gccgaactga gaggttgatc ggccacattg gaactgagac acggtccaga 360

ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt tcacaatggg cgaaagcctg atgaagcaac 420

accgcgtgaa tgaagaaggg tttcggctcg taaaattctg ttgctagaga agaacgtacc 480

aagtaggaaa tggcttggta gtgacggtat ctggttagaa agtcacggct aactacgtgc 540

cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga 600

gcgcaggcgg ttgtttaagt ccgatgtgaa agccttcggc ttaaccgaag aagtgcattg 660

gaaactgagc gacttgagta cagaagagga cagtagaaca ccatgtgtag cggtgaaatg 720

cgtagatata tggtagaata ccagtggcga aagcggctgt ctggtctgtc actgacgctg 780

aggctcgaaa gcatgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccat gctgtaaacg 840

ttgagtgcta ggtgttagag gatttccgtc ctttagtgcc gaagttaaca cattaagcac 900

tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca 960

agtggtggag catgtggttt aattcgatgc tacgcgaaga accttaccag gccttgacat 1020

acttctgtta ggctaagaga ttagctgttc ccttcgggga cagatctaca ggtggtgcat 1080

ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggtcaagtc ccgcaacgag cacaaccctt 1140

gtgactagtt gccagcattc agttgggcac tctagtcaga ctgccggtga taaaccggag 1200

gaaggtgagg atgacgtctg atcatcatgc cccttatggc ctgggctaca cacgtgctac 1260

aatggacagt acaatgggtt gcgaaaccgc gaggtcaagc ttatcccata aagctgttct 1320

cagttcggac tgcagtctgc aactcgactg cacgaagctg gaatcactag taatcgtgga 1380

tcagcatgcc acggtgaata cgttcccggg tcttgtacat accgcccgtc acaccatgag 1440

agtccgtaac acccaaagat agtgcggcaa cctcttttga ggagccagct atctaaggtg 1500

ggacgaatga ttagggtgaa gtcgtaacaa cgtagccgta 1540

Claims (7)

1.一种特异性的乳酸菌液体培养基，其特征在于，所述培养基中包括以下原料：每1L自来水中加入胰蛋白胨8～12g、牛肉膏10～15g、酵母提取物8～12g、麦芽提取物30～60g、葡萄糖10～15g、柠檬酸氢二铵1.5～2.5g、磷酸氢二钾1.5～2.5g、一水硫酸锰0.1～0.2g、七水硫酸镁0.5～0.7g、吐温80 1～2mL、L-半胱氨酸盐酸盐1～2g、维生素B₂ 1～3mg，最后加入乙酸至4～6g/100mL。

2.根据权利要求1所述的特异性的乳酸菌液体培养基，其特征在于，所述乳酸菌优选为乳酸菌Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073。

3.一种特异性的乳酸菌固体培养基，其特征在于，所述培养基中包括以下原料：每1L自来水中加入胰蛋白胨8～12g、牛肉膏10～15g、酵母提取物8～12g、麦芽提取物30～60g、葡萄糖10～15g、柠檬酸氢二铵1.5～2.5g、磷酸氢二钾1.5～2.5g、一水硫酸锰0.1～0.2g、七水硫酸镁0.5～0.7g、吐温80 1～2mL、L-半胱氨酸盐酸盐1～2g、维生素B₂ 1～3mg，加入琼脂粉20～25g，最后加入乙酸至4～6g/100mL。

4.根据权利要求3所述的特异性的乳酸菌固体培养基，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸菌Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75^T和Lactobacillus sp.HSCY 2073。

5.一种利用权利要求1所述的特异性的乳酸菌液体培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

在培养基中接种菌株后，在培养基的液面上方残留空气的高度＜0.5cm，且培养基的装液量＞90％，密封不漏气，培养温度30～35℃。

6.一种利用权利要求3所述的特异性的乳酸菌固体培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

在培养基中接种菌株后，置于厌氧培养箱中培养，厌氧培养箱中氧气含量＜10ppm，培养湿度75～85％，培养温度30～35℃。

7.一种权利要求1所述的特异性的乳酸菌液体培养基或者权利要求3所述的乳酸菌固体培养基在快速大量培养乳酸菌中的应用。

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