CN103087967B - 一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用，该枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）pj101，该菌株已于2012年11月28日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.6897。本发明还提供了上述高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株在发酵生产β-葡聚糖酶中的应用。本发明枯草芽孢杆菌CGMCC 6897遗传稳定性好，产生的β-葡聚糖酶活力高且稳定，另外，本发明还优化了该菌株的发酵条件，取得了较好的产酶效果，可应用于工业化发酵生产β-葡聚糖酶。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
β-葡聚糖酶是一类能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶类的总称，主要包括4种酶，即内-β-1,3-葡聚糖酶、内-β-1,3-1,4-葡聚糖酶、外-β-1,3-葡聚糖酶和外-β-1,4-葡聚糖酶。作为一种特异性外源酶，β-葡聚糖酶被广泛应用于啤酒酿造工业和饲料工业中。β-葡聚糖酶可分解大麦及麦芽中β-葡聚糖凝胶，降低麦汁粘度，提高麦汁滤速及得率，有利于改善啤酒风味，保持成品酒非生物稳定性；将其添加于谷物类饲料可降低动物消化道内容物黏度，有效地改善单胃动物对营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，还可减少排泄物对环境的污染，有利于环境控制和疫病防治。
β-葡聚糖酶的产生途径主要有两种。一种是在植物萌芽早期过程中产生。大麦等谷类种子发芽过程中产生β-葡聚糖酶催化水解胚乳细胞壁中的β-葡聚糖，解除其对胚乳中其它营养物质的抗性作用，β-葡聚糖酶可以降低浸提物的粘度，在催化时表现出对底物的β-糖苷键极强的专一性。另一种是在微生物发酵过程中产生。很多细菌、真菌和瘤胃微生物都可以产生β-葡聚糖酶，细菌中典型的产酶菌株有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amvloliquefaciens)等，真菌中有黑曲霉(Aspergillus niger)等。
目前国内外主要采用微生物发酵的方法生产β-葡聚糖酶。微生物的种类不同，其产酶活力也有差异，通常提高微生物酶活力水平主要通过采取物理与化学多次交叉诱变以及构造基因工程菌的方法来实现。贺小贤等(黑曲霉β-葡聚糖酶菌株诱变选育研究[J]．食品科技，2005(11).)以黑曲霉FHI为出发菌株，采用物理与化学相结合的方法，诱变选育出一株β-葡聚糖酶活性较高的菌株FHl2，酶活性较出发菌株提高2.23倍。韩晶等(高产嗜热β-葡聚糖酶菌种的诱变选育研究[J].酿酒科技.2009(8).)以嗜热β-葡聚糖酶产生菌枯草芽孢杆菌X-5为出发茵株，采用紫外线和硫酸二乙酯复合诱变处理技术，选育出一株产嗜热β-葡聚糖酶性能稳定、活力较高的突变株AS35，酶活性较原始出发茵株提高了81.54％。孙军涛等（β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析[J].食品与生物技术学报.2011(30).）为了获得耐热的β-1,3-l,4-葡聚糖酶，利用PCR技术从解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)中扩增β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)，构建重组表达质粒pET30a-bgl转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酸(IPTG)诱导表达获得重组β-1,3-l,4-葡聚糖酶，并对纯化后的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行酶学特性研究。
尽管如此，诱变育种因其盲目性、随机性，导致工作量巨大，筛选时间漫长，且菌株的突变还面临回复现象的难题。原生质体融合技术可以扮演类似于有性生殖途径基因信息交流的作用，可使遗传物质传递更为完整，重组机率更大，有利于提高育种速度。
目前，国际β-葡聚糖酶市场主要由几个酶制剂公司如丹麦NOVO、荷兰GIST、美国MILES等占有，并在中国市场占据着极大的份额，虽然我国国内针对β-葡聚糖酶开展了大量的相关研究，但因产酶菌株存在的酶活力不高，稳定性不强等原因，始终未能应用于大规模工业化生产，进口酶制剂垄断国内市场的局面始终未能打破。
发明内容
本发明提供了一种高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌，解决了传统产酶菌株的酶活力低、稳定性差的问题。
一种高产β-葡聚糖酶的菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），完整命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）pj101，该菌株已于2012年11月28日保存在位于北京市朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.6897。
本发明菌株属于硬（或厚）壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，单细胞，无荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性菌。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
本发明还提供了上述高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的诱变筛选方法，具体包括以下步骤：
(1)制备出发菌株的菌悬液；
(2)将出发菌株的菌悬液分别进行LiCl-紫外复合诱变和60Co-γ射线诱变，获得诱变株；
(3)在诱变株中筛选出β-葡聚糖酶酶活性高于出发菌株的LiCl-紫外复合诱变株和60Co-γ射线诱变株；
(4)将步骤(3)获得的LiCl-紫外复合诱变株和60Co-γ射线诱变株进行原生质体融合，得到融合子；
(5)筛选出产β-葡聚糖酶酶活性高的高产融合子；
(6)将所述的高产融合子进行至少两次的递归式原生质体融合，筛选出酶活力最高的菌株。
复合诱变具有协同效应，具有比单因子作用更好的诱变效果，而原生质体融合由于不受细胞壁的限制，杂交频率更高，遗传物质传递的更加完整。将两者结合起来有利于快速筛选稳定的目标菌株。
所述出发菌株可以为产酶活性较高的菌株或者应用于工业化生产的菌株，本发明的出发菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）QB-01，由浙江大学生命科学院保藏，邵建忠(浙江，杭州)赠送。
一般，所述菌悬液的浓度为105~107个/mL；更优选的，所述菌悬液的浓度为106个/mL。浓度过高则难以保证菌体均一的接受诱变，筛选过程中会长出大量且未经诱变的菌落，若浓度过低则会导致菌体致死多，不利于筛选有利突变。
所述LiCl-紫外复合诱变的方法为：在出发菌株的菌悬液中加入LiCl，LiCl的终浓度达到0.6%，混匀后，进行紫外诱变，诱变后涂布至筛选培养基培养获得LiCl-紫外复合诱变株。
紫外照射的诱变条件影响诱变效果，所述紫外照射的诱变条件为：15W紫外灯，距离30cm，处理75s。
60Co-γ射线诱变时，采用常规的诱变方法即可，诱变剂量控制在2000~4500Gy，更优选为3500Gy。
所述原生质体融合一般包括原生质体制备、原生质体灭活以及原生质体的融合与再生。
原生质体制备时，通常使用溶菌酶处理枯草芽孢杆菌的菌体，去除其细胞壁，一般，溶菌酶的终浓度为0.1~0.2g/L，处理时间为20~40min，处理温度为25℃~37℃。
所述递归式原生质体融合即每次将原生质体融合的后代筛选出的产β-葡聚糖酶酶活性高的高产融合子进一步制成原生质体，再以同样的方法再次融合，如此重复多次。
本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌CGMCC 6897在生产β-葡聚糖酶中的应用。
具体可以包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌CGMCC 6897接入液体种子培养基进行增殖培养，获得种子液；
(2)将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
所述发酵培养基包括供微生物自身生长及发酵所需要的碳源、氮源、无机盐及微量元素，发酵培养基的pH一般为5.0~8.0，优选的，发酵培养基的pH为6.5~7.5，更优选的，发酵培养基的pH为6.5。
所述碳源可以为糊精、大麦粉、麸皮、可溶性淀粉、玉米粉、葡萄糖等。
所述氮源可以为豆粕、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。
优选的，所述发酵培养基为：糊精，40.0~80.0g/L；大麦粉，40.0~80.0g/L；豆粕，20.0~60.0g/L；MgSO4·7H2O，0.1~0.4g/L；K2HPO4，0.1~2.0g/L；FeSO4·7H2O，0.01~0.04g/L；CaCl2，0.1~2.0g/L。
最优选的，所述发酵培养基为：糊精，40.0g/L；大麦粉，60.0g/L；豆粕，20.0g/L；MgSO4·7H2O，0.3g/L；K2HPO4，1.0g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；CaCl2，1.5g/L。
发酵条件影响菌株的产酶能力和酶活，所述发酵培养条件为：温度为32~37℃，时间为24~60小时；更优选为：温度为37℃，时间为48小时。
所述发酵培养可以是摇床培养，也可以是利用发酵罐工业化大规模培养，当采用摇床培养时，摇床转速为200~300r/min，更优选为200r/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明枯草芽孢杆菌CGMCC 6897遗传稳定性好，产生的β-葡聚糖酶活力高且稳定。
本发明优化了该枯草芽孢杆菌的发酵条件，取得了较好的产酶效果，可应用于工业化发酵生产β-葡聚糖酶。
附图说明
图1发酵培养基中不同碳源对产β-葡聚糖酶的影响；
图2发酵培养基中不同有机氮源对产β-葡聚糖酶的影响；
图3发酵培养基中不同浓度的MgS04对产β-葡聚糖酶的影响；
图4发酵培养基中不同浓度的FeSO4·7H2O对产β-葡聚糖酶的影响；
图5发酵培养基中不同浓度K2HPO4对产β-葡聚糖酶的影响；
图6发酵培养基中不同浓度CaCl2对产β-葡聚糖酶的影响；
图7发酵时间对产β-葡聚糖酶的影响；
图8接种量对产β-葡聚糖酶的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的培养基及相关溶液配方如下：
保藏培养基/传代培养基：牛肉膏，5.0g/L；蛋白胨，10g/L；NaCl，5.0g/L；琼脂，20g/L；pH7.2。
液体种子培养基：牛肉膏，5.0g/L；蛋白胨，10g/L；NaCl，5.0g/L；pH7.0~7.2。
发酵培养基：糊精，40.0g/L；大麦粉，60.0g/L；豆粕，20.0g/L；MgSO4·7H2O，0.3g/L；K2HPO4，1.0g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；CaCl2，1.5g/L；pH7.0。
筛选培养基：β-葡聚糖，3.0g/L；酵母膏，2.0g/L；刚果红，0.2g/L；琼脂，18g/L，(NH4)2SO4，0.3g/L；K2HPO4，1.0g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；CaCl2，1.5g/L；KCl，0.5g/L；NaNO3，3.0g/L；pH7.0~7.2。
再生培养基：大麦粉，60.0g/L；玉米粉，40.0g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L；K2HPO4，1.0g/L，FeSO4·7H2O，0.01g/L；CaCl2，1.5g/L；NaCl，5.0g/L；琼脂，20g/L；pH7.0~7.2，用SMM高渗溶液配置。
LiCl溶液：准确称取1g LiCl溶于10mL蒸馏水中，过滤除菌。
SMM高渗溶液：蔗糖，5mol/L；顺丁烯二酸，0.02mol/L；MgCl2·6H2O，0.02mol/L；pH7.0；0.06~0.07MPa，30min，灭菌备用。
溶菌酶液：溶菌酶，100g/L；用SMM高渗溶液配制，过滤除菌，分装成小份，-20℃保存。
聚乙二醇(PEG6000)溶液：PEG6000，400g/L；pH9.0，用SMM高渗溶液配置。
新生磷酸钙：CaCl2，1mol/L；K2PO4，0.02mol/L；0.06~0.07MPa，30min，灭菌备用，用时将两者等体积混合。
实施例1 高产菌株的获得
1、LiCl-紫外复合诱变
出发菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)QB-01，由浙江大学生命科学院保藏，邵建忠(浙江，杭州)赠送。
将出发菌株活化后用无菌生理盐水配制成浓度为106个/mL的单细胞悬液；取10mL单细胞悬液于带磁力转子的培养皿中，加入600μL10%LiCl溶液，混匀；打开培养皿的盖子，在距培养皿30cm处，用15W紫外灯照射75s；黑暗条件下将诱变后的单细胞悬液稀释103倍，涂布至筛选培养基平板上，37°C恒温培养箱中暗培养48h，得到LiCl-紫外复合诱变株。
以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率为85%，说明该LiCl-紫外复合诱变条件比较合理，有利于筛选有诱变株。
致死率的计算方法如下：
2、60Co-γ射线诱变
将出发菌株活化后用无菌生理盐水配制成浓度为106个/mL的单细胞悬液；取单细胞悬液于无菌试管中，送至浙江省农科院钴室进行60Co-γ射线诱变，诱变剂量为3500Gy；将诱变后的单细胞悬液稀释103倍，涂布至筛选培养基，37°C恒温培养箱中暗培养48h，得到60Co-γ射线诱变株。
3、筛选
将步骤1和步骤2得到的诱变株分别接种于筛选培养基上，筛选出β-葡聚糖酶酶活性高于出发菌株的若干诱变株。
4、原生质体制备
(1)将筛选出的菌株分别接种在新鲜的液体种子培养基培养；
(2)从培养成熟的液体种子培养基中取细胞悬液10mL，5000r/min离心10min，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤沉淀物两次，离心后即得菌体；
(3)将菌体用SMM高渗溶液洗涤1次，加入一定量的无菌水稀释菌体，再加入溶菌酶，溶菌酶的终浓度为0.1g/L，32℃水浴20min。水浴过程中随时用1mL枪头反复吸取酶解液促使原生质体的释放，同时用显微镜观察细胞形成原生质体的情况；
(4)酶解结束后，5000rpm离心10min，用SMM高渗溶液洗涤沉淀2次收集原生质体，用SMM高渗溶液稀释，得到浓度均为107个/mL的原生质体悬液Ⅰ(LiCl-紫外复合诱变株)和原生质体悬液Ⅱ(60Co-γ射线诱变株)。
原生质体计数方法：
将原生质体悬液放在血球计数器载玻片之间的计数室中，在40倍镜下进行计数。计数时，每个中方格中数四个小方格，记录五个中方格的总原生质体数，重复计数两次，取平均值。
计算公式：1mL的总原生质体个数=2×105×a×b；
其中，a为20个小方格中的总原生质体个数；b为悬液稀释倍数。
5、原生质体的灭活
原生质体悬液Ⅰ的灭活：采用热灭活的方法，将原生质体悬液Ⅰ沸水浴40min。
原生质体悬液Ⅱ的灭活：采用紫外灭火的方法，取5mL原生质体悬液于带磁力转子的培养皿中，开盖置于磁力搅拌器上，打开旋转按钮，黑暗中紫外照射60min。
6、原生质体融合与再生
(1)分别取灭活后的原生质体悬液Ⅰ和原生质体悬液Ⅱ各2mL，混匀后，3000r/min离心10min，弃上清；
(2)沉淀中加入0.4mL新生磷酸钙溶液，混匀，加入3.6mL PEG 6000溶液，37℃保温15min后，3000r/min离心10min，弃上清，用SMM高渗溶液洗涤沉淀两次；
(3)将步骤(2)所得的沉淀重悬于2mL SMM高渗溶液中，适当稀释后涂布于再生培养基上，37℃培养，所得菌株即为融合菌株。
原生质体形成率和再生率的计算：
其中，A为酶解前菌落总数；B为酶解后未脱壁细胞形成的菌落数；C为酶解后未脱壁细胞形成的菌落数加上原生质体再生细胞菌落数。
本实施例中原生质体形成率和再生率分别为91.02%和5.43%。
7、初筛选
挑选再生培养基上的融合菌株，纯化后接入保藏培养基中保存，挑取一环菌体，用三点法（即在等边三角形的三个顶点上接种，经培养后同一菌种可形成三个重复的单菌落）接种至筛选培养基上，37℃培养48h，测量透明圈直径和菌落直径，计算透明圈与菌落直径的比值，初步比较菌株产β-葡聚糖酶能力的大小。
8、菌株复筛
初筛后挑选透明圈较大的菌株，接种于液体种子培养基中培养24h，将种子培养液以10%(V/V)的接种量接入摇瓶的发酵培养基中，37℃，220r/min振荡培养48h，测定发酵液酶活力，选定产酶活力高的高产菌株。
9、递归式原生质体融合
将步骤8中筛选出的β-葡聚糖酶酶活相对较高的几株融合株菌株继续进行步骤4~8的操作，每一轮操作结束后筛选出β-葡聚糖酶酶活相对较高的融合菌株再次重复步骤4~8，进行5轮递归式原生质体融合，最后筛选出β-葡聚糖酶酶活最高的一株，命名为pj101，酶活可达23015IU/mL。
10、稳定性测试
将步骤9选育出的pj101菌株，传代5次后接种于液体种子培养基中，37℃，220r/min，振荡培养24h，将种子培养液以10%(V/V)的接种量接入摇瓶的发酵培养基中，37℃，220r/min，培养48h，做三次平行试验，以出发菌株作为对照，用DNS比色法测定β-葡聚糖酶酶活。
β-葡聚糖酶酶活测定方法：
取5mL发酵液，8000r/min离心l0min，取上清液用0.2mol/L、pH5.0的乙酸缓冲液稀释适当倍数；取经40℃预热的此稀释液1mL，再加入经40℃预热的1%β-葡聚糖溶液1mL，混匀，40℃下恒温反应10min；然后加入3mLDNS停止反应，摇匀，100℃水浴5min，冷却至室温后用去离子水定容至5mL，测定OD520值。
酶活定义：在本试验条件下，每分钟分解β-葡聚糖产生相当于lμmol葡萄糖所需的酶蛋白的量定义为一个酶活单位。
酶活力单位[IU/mL]＝(A×Df)/(180×t)；
其中，A为通过OD值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的浓度(μg/mL)；Df为待测酶液的稀释倍数；t为反应时间(min)；180为葡萄糖的分子量。
以出发菌株作为对照，提取发酵液中的β-葡聚糖酶，测定β-葡聚糖酶酶活，β-葡聚糖酶酶活较稳定。融合菌株pj101酶活分别为：23059IU/mL，23120IU/mL，23036IU/mL；出发菌株酶活分别为：14303IU/mL，14279IU/mL，14267IU/mL。编号为pj101的融合菌株其β-葡聚糖酶平均酶活达到23104IU/mL，而亲本菌株的β-葡聚糖酶平均酶活为14283IU/mL。
该菌株pj101在保藏/传代培养基上，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基（液体种子培养基）中生长时，常形成皱醭。
该β-葡聚糖酶高产菌株于2012年11月28日保藏于位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）pj101，保藏号为CGMCC No.6897。
实施例2菌株的发酵培养及酶活测定
取实施例1中选育的枯草芽孢杆菌CGMCC 6897接种于液体种子培养基中37℃，220r/min，振荡培养24h，将种子培养液以10%(V/V)的接种量接入摇瓶的发酵培养基中，37℃，220r/min，培养48h，测β-葡聚糖酶酶活，β-葡聚糖酶酶活测定方法同实施例1。根据下面具体的试验条件对相应的因子进行修改。（一）发酵培养基配方的优化
1、碳源优化
碳源是发酵培养基的主要组成部分．可以为微生物生长和代谢提供能量。不同微生物生理特性不同，对各种碳源的利用能力有很大的差异。
以添加40.0g/L不同碳源的基础培养基1为发酵培养基；
其中，基础培养基1：豆粕，20.0g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；K2HPO4，1.5g/L；FeSO4·7H2O，0.02g/L；CaCl2，1.0g/L；pH7.0。
由图1可知，不同碳源对产酶的影响为：糊精＞大麦粉＞麸皮＞可溶性淀粉＞玉米粉＞葡萄糖。
2、有机氮源优化
为了研究有机氮源对菌体产酶的影响，对有机氮源进行单因素试验。
以添加20.0g/L不同氮源的基础培养基2为发酵培养基；
其中，基础培养基2：糊精，40.0g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；K2HPO4，1.5g/L；FeSO4·7H2O，0.02g/L；CaCl2，1.0g/L；pH7.0。
由图2可以看出，不同氮源对产酶的影响为：豆粕＞花生饼粉＞酵母粉＞蛋白胨。
3、不同浓度的MgS04对产酶的影响
对细胞来说，Mg2+是金属离子当中较为重要的一种，它是许多酶活性中心不可缺少的一部分。
以添加不同浓度的MgS04的基础培养基3为发酵培养基；
其中，基础培养基3：糊精，40.0g/L；豆粕，20.0g/L；K2HPO4，1.5g/L；FeSO4·7H2O，0.02g/L；CaCl2，1.0g/L；pH7.0。
图3结果显示，随着MgS04浓度的升高，酶活力不断提高，当MgS04浓度达到0.3g/L时酶活力最高，为27403IU/mL，MgS04浓度超过0.3g/L酶活力急剧下降。因此，液体产酶培养基中MgS04的最佳浓度为0.3g/L。
4、不同浓度的FeSO4·7H2O对产酶的影响
铁是生命活动必需元素之一，也是一些酶的辅基，Fe2+过量或不足都会影响β-葡聚糖酶的活性。
以添加不同浓度的FeSO4·7H2O的基础培养基4为发酵培养基；
其中，基础培养基4：糊精，40.0g/L；豆粕，20.0g/L；MgSO4·7H2O，0.3g/L；K2HPO4，1.5g/L；CaCl2，1.0g/L；pH7.0。
图4显示了不同浓度FeSO4·7H2O对菌种产酶的影响，从图中可以看出，低浓度FeSO4·7H2O能够提高酶的活力，高浓度的FeSO4·7H2O对酶的活性有一定抑制作用，FeSO4·7H2O浓度为0.01g/L时β-葡聚糖酶活力最高，达到27425IU/mL。
5、不同浓度K2HPO4对产酶的影响
无机盐是微生物生命活动不可缺少的物质。K2HPO4浓度高低对β-葡聚糖酶的活性有一定影响。
以添加不同浓度的K2HPO4的基础培养基5为发酵培养基；
其中，基础培养基5：糊精，40.0g/L；豆粕，20.0g/L；MgSO4·7H2O，0.3g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；CaCl2，1.0g/L；pH7.0。
由图5可知，β-葡聚糖酶的活性随着K2HPO4浓度的增加而升高，当K2HPO4浓度为1.0g/L时，β-葡聚糖酶酶活最高，达到27441IU/mL。当K2HPO4浓度超过1.0g/L时，β-葡聚糖酶活性反而降低。因此，液体产酶培养基中K2HPO4的最佳浓度为1.0g/L。
6、不同浓度CaCl2对产酶的影响
Ca2+是多种酶的激活剂和稳定剂，同时也是作用环境中一个重要的pH缓冲元素之一，可以调节发酵液的pH值，而且可以调节细胞的通透性，对β-葡聚糖酶生产有一定的影响。
以添加不同浓度的CaCl2的基础培养基6为发酵培养基；
其中，基础培养基6：糊精，40.0g/L；豆粕，20.0g/L；MgSO4·7H2O，0.3g/L；K2HPO4，1.0g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；pH7.0。
由图6可知，培养基内不添加Ca2+，β-葡聚糖酶的活性较低，当CaCl2浓度为1.5g/L时，酶活显著增加，达到27445IU/mL，浓度继续升高时，β-葡聚糖酶活性变化不大。因此，液体产酶培养基中CaCl2的最佳浓度为1.5g/L。
7、正交试验确定最佳碳氮比及最佳培养基配方
碳源、氮源是发酵培养基的主要组成部分，现以影响产酶较大的糊精、大麦粉、豆粕三个因素进行三因素三水平正交试验，研究各种培养基成本的综合影响，其因素和水平设计如表1，以添加不同碳源、氮源的基础培养基7为发酵培养基；
其中，基础培养基7：MgSO4·7H2O，0.3g/L；K2HPO4，1.0g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；CaCl2，1.5g/L；pH7.0。
表1 试验因素与水平设计表
参照表2，根据R值大小可以看出这3种因素对pj101菌株产酶的影响为：B＞C＞A，即大麦粉＞豆粕＞糊精。同时比较同一因素在不同水平下对应的酶活大小，从而得到的各个因素的最有水平组合为：A1B2C1，即这四种因素的添加量分别为：糊精40g/L，大麦粉60g/L，豆粕20g/L。
表2 培养基配方正交试验结果
在最佳培养基组合下产酶，培养条件与初始产酶条件保持一致，即温度30℃，初始pH自然，200r/min，恒温培养3d后测定发酵液的酶活，平行试验得到的酶活平均值为27453IU／mL，是初始设计培养基的1.19倍。因此，最佳产酶的培养基（发酵培养基）的配方为：糊精，40g/L；大麦粉，60g/L；豆粕，20g/L；MgS04，0.3g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；K2HPO4，1.0g/L；CaCl2，1.5g/L。（二）发酵条件的优化
1、发酵培养基初始pH值的优化
本发明在改良的发酵培养基的基础上．将发酵培养基初始pH分别调为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0七个梯度，测定其发酵液的酶活，结果如表3。从表中可看出，pH6.5时，酶活性最高。由此可见，pj101菌株产酶最适初始pH为6.5。
表3 初始pH对产酶的影响
| 初始pH值 | 5.0 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 8.0 |
| 酶活（IU/mL） | 26865 | 26979 | 27452 | 27956 | 27420 | 27159 | 26313 |
2、培养温度的优化
不同培养温度(31℃，33℃，35℃，37℃，39℃，41℃，43℃)，培养基初始pH值为6.5，其他培养条件不变，在改良的发酵培养基上进行发酵，测定各培养温度下发酵液的酶活，结果如表4所示，从表中可以看出，当发酵温度低于35℃或高于39℃时，酶活性较低。37℃时酶活性最高，由此，确定菌株最适发酵温度为37℃。
表4 培养温度对产酶的影响
| 温度（℃） | 31 | 33 | 35 | 37 | 39 | 41 | 43 |
| 酶活（IU/mL） | 27869 | 27901 | 27986 | 28125 | 27974 | 27650 | 27588 |
3、培养时间的优化
不同微生物发酵有其特有的发酵周期，发酵时间短不利于酶的合成，发酵时间过长菌体会发生自溶，同样不利于产酶。本发明将摇床发酵的培养时间设置为12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，发酵培养基初始pH值为6.5，发酵温度为37℃，其他培养条件不变，测定发酵液的酶活，结果如图7，由图可知，产酶的最佳培养时间在48h左右，培养48h时发酵液的酶活最高，达到28957IU/mL。
4、接种量的优化
本发明将不同接种量（V/V）5%，10%，15%，20%，接种于改良后的发酵培养基中，发酵培养基初始pH值为6.5，发酵温度为37℃，其他培养条件不变，测定发酵液的酶活，结果如图8所示，随着接种量的增加，酶活有所提高，当接种量为10%时酶活最高，为29423IU／mL；但当接种量超过10%时，酶活降低，可能是由于接种量过大，菌种生长过旺，消耗大量的营养物质，导致培养基中营养物质缺乏，使菌体很快衰老。所以选择10%接种量为发酵的最佳接种量。
根据以上试验结果，得出该pj101菌株产酶的最佳发酵条件：发酵培养基的初始pH为6.5，发酵培养的温度为37℃，发酵培养的时间为48h，接种量为10%。在上述最适培养条件和改良后的发酵培养基上，枯草芽孢杆菌CGMCC 6897产酶是初始发酵培养基和培养条件下菌株产酶1.28倍之多，达29423IU／mL。
Claims (6)
1.一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）pj101，保藏编号为CGMCC No.6897。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在生产β-葡聚糖酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接入种子培养基进行增殖培养，获得种子液；
(2)将种子液接入发酵培养基进行发酵培养；
所述发酵培养基为：糊精，40.0～80.0g/L；大麦粉，40.0～80.0g/L；豆粕，20.0～60.0g/L；MgSO4·7H2O，0.1～0.4g/L；K2HPO4，0.1～2.0g/L；FeSO4·7H2O，0.01～0.04g/L；CaCl2，0.1～2.0g/L。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为：糊精，40.0g/L；大麦粉，60.0g/L；豆粕，20.0g/L；MgSO4·7H2O，0.3g/L；K2HPO4，1.0g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；CaCl2，1.5g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的温度为32～37℃，时间为24～60h，发酵培养基的初始pH为5.0～8.0。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的温度为37℃，时间为48h，发酵培养基的初始pH为6.5。
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