CN100448982C - 低温β-半乳糖苷酶菌株、低温β-半乳糖苷酶及其生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产生低温β-半乳糖苷酶的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)和利用此菌株生产低温β-半乳糖苷酶的生产工艺，同时还提供了低温β-半乳糖苷酶。通过利用短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)，建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺技术，经过培养基配方优化筛选及发酵工艺条件优化控制，使发酵周期缩短，确立了稳定的发酵工艺，生产的低温β-半乳糖苷酶具有良好的低温活性、高酶活。可广泛用于发酵乳、饮料、冰激凌糖等食品医药、环境检测等各个领域，有效改善乳制品的风味和营养，解除乳糖不耐受患者因食用乳制品引起的腹泻、腹涨等多种不良反应，能最大限度地保留其营养及风味物质方面具有重要意义。

Description

低温β-半乳糖苷酶菌株、低温β-半乳糖苷酶及其生产工艺

发明领域

本发明涉及微生物及微生物发酵领域。具体的说，本发明涉及一种产生低温β-半乳糖苷酶的短芽孢杆菌株、低温β-半乳糖苷酶及其生产工艺。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.和葡23)，又称乳糖酶，既能将乳糖水解为易吸收和甜味品质好的半乳糖与葡萄糖，又能在水解糖过程中还会发生转糖苷反应，生成具有多种生理功能的低聚半乳糖。该糖是双歧杆菌增值因子，难以被人体消化，它可用于生产低乳糖食品，改善乳制品的风味和营养，解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的腹泻、腹胀等多种不良反应。它还能改善便秘、降低血糖、促进钙的吸收、抗龋齿等，另外，在冷冻制品中乳糖会结晶，影响食品的加工性能。乳糖也是牛乳加工副产物----乳清的主要成分，目前乳清利用率不到50％，余下的被排放到环境中造成污染，因此如何将乳糖转化为对人体有益的物质，变废为宝，对发展乳制品工业，提高人民健康水平具有重要意义。

β-半乳糖苷酶主要来源于动物、植物、细菌、酵母、真菌或霉菌。国外已经商品化的β-半乳糖苷酶主要来源于大肠杆菌、黑曲霉、米曲霉、酵母、乳酸杆菌等。低温下催化反应可防止污染(同源的低温酶不活泼)，经过温和的热处理即可使它的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质等。而低温半乳糖苷酶可在兼备高乳糖水解水平的同时缩短水解时间，还可减少细菌污染的风险。因此，人们更重视低温β-半乳糖苷酶的研究。目前，国外的研究集中在产低温酶菌株的筛选鉴定及对低温β-D-半乳糖苷酶学性质研究及其基因的分析，纯β-半乳糖苷酶制剂已从大肠杆菌、酵母菌和真菌中提取得到，由酵母菌(Saccharomyces)制取的β-半乳糖苷酶在生产中应用最为广泛。而我国在此领域内研究尚属空白，目前使用的常温乳糖酶全部依赖进口，国内还未见有关此低温β-半乳糖苷酶的研究报道。

低温β-半乳糖苷酶可广泛应用于食品、医药、免疫、环境检测等各个领域。在食品工业，它能够解决目前奶业加工处理及储存中乳糖含量偏高的问题，所生成的低聚半乳糖具有良好的保湿性，可用于发酵乳、饮料、冰淇淋、糖果、奶粉、口服液等。利用β-半乳糖苷酶的糖苷转移作用人工合成糖苷化合物，对药品和其它生理活性物质的合成有潜在意义。免疫学方面，将β-半乳糖苷酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白，可作为Alzheimer病的免疫源，并进一步制备其单克隆抗体。在环境检测方面，通过β-半乳糖苷酶活性检测，可快速分析浴场和渔场地区海水水体受排泄污染程度。

由于乳糖是牛乳中主要的糖成分，其含量约为5％(w/v)左右，它没有甜味，溶解度较低，在肠道内不能被直接吸收。许多成人(因人种而异，亚洲、非洲占的比例较大)饮用牛奶后，乳糖到了肠道里，被肠道细菌分解发酵，产生大量二氧化碳气体，使肠道膨胀，收缩加强，造成肠鸣、腹胀、腹泻等，这种现象称作乳糖不耐受症，使相当一部分人无法充分消化吸收牛乳这一天然、具有良好平衡型的食品中的营养成份，成为阻碍我国乳品工业发展的主要障碍之一，而低乳糖牛奶和低乳糖乳制品是解决这一问题的最有效的方法。

利用β-半乳糖苷水解酶(β-D-galactoside galatohydrolase)(EC 3.2.1.23)处理加工牛乳及乳清，可生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品，它能将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，使其甜度达到蔗糖的80％，溶解度提高3～4倍，易被肠道吸收。鲜乳冷藏保鲜加工、生产低乳糖牛奶及低乳糖乳制品需要的是高活性低温β-半乳糖苷酶，但目前生产所用的β-半乳糖苷酶在低温下酶活都很低，难以满足市场及生产所需。由于利用低温乳糖酶进行鲜乳冷藏保鲜加工时，可最大限度地保留其营养及风味物质，真正达到了绿色有机食品的要求，因此低温β-半乳糖苷酶的研究是当今乳品业发展的迫切需要。

发明内容

针对常温乳糖酶反应温度高，低温酶活低的缺点，本发明根据生物与环境相适应的原理，在冷库与冷冻土壤中分离出一批耐低温的微生物菌株，通过进一步选育、驯化，获得稳定表达的菌株，利用符合本菌株的特性，设计出一套发酵生产工艺技术，获得能适应反应温度低，低温酶活高的乳糖酶。

本发明提供的一株产低温半乳糖苷酶的菌株，通过在冷库与冷冻土壤中分离出一批耐低温的微生物菌株，从中筛选出一株编号为L2004的菌株，从而提供了一种低温乳糖酶菌株，其具有生产低温乳糖酶的优良特性，经微生物学鉴定，定为短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)。

本发明在获得的短芽孢杆菌的基础上，提供了一种低温乳糖酶的生产工艺。

同时，本发明还提供了一种低温乳糖酶，通过利用本发明的菌株经过本发明确定的具体发酵工艺而获得。

本发明提供了一种低温乳糖酶菌株，命名为L2004，其能够以高产率产生低温乳糖酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期是2005年7月25日，保藏号是CGMCC.No.1424。经微生物学鉴定为短芽孢杆菌属(LacfococcusSchleifer et al，1984)，细胞杆状，0.7-0.9um×3-5um，革蓝氏阴性(-)，以周生鞭毛运动，在膨大孢子内含椭圆形芽孢，菌落平整、光滑，黄灰色，无可容性色素。该菌严格好氧，接触酶阴性；能利用葡萄糖产酸，也能利用L-阿拉伯糖，D-甘露糖，D-木糖，水解淀粉，液化明胶，分解酪素，能利用柠檬酸盐生长，不产生吲哚，并能在6％氯化钠盐度下生长。可在较大温度范围4℃-37℃内生长，最适生长温度为20℃，生长pH范围为5-8，最适生长范围为6-8。依照伯杰氏系统细菌学手册第二卷，L2004菌为芽孢杆菌属中的成员，定为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。

一、菌种保藏：菌种在矿物油和真空冷冻条件下进行了保藏试验。

其效果如表1所述：

表1不同保藏方法对菌株存活率的影响

处理方法	7天	1个月	6个月
				矿物油	99％	98％	80％
真空保藏	99％	99％	99％

二、菌种活化：取保存菌株，用接种针刮取或挑取少量接于固体LB上，在适合菌株生长的温度下培养一定时间后，连续活化数次，并进行菌株产酶能力的测定。

三、菌种复壮：在中试中，确定了一套保持产酶特性稳定菌株筛选的流程。

依次在液体培养基STA和固体培养基ST中接种活化好的菌并进行培养，检测该菌特性，选取优良菌株接种于斜面培养基上培养，并将此菌株用摇瓶进行发酵实验，以检测其产酶能力。检测其产酶能力未发生退化后，此菌株可作为生产菌株使用。

本发明提供一种低温乳糖酶的生产工艺，其包括：

A：对短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)进行菌种活化培养步骤；

B：利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤；

发酵过程中，以选择低温乳糖酶酶产量最高的条件为优选条件。接种量为1％-15％，优选发酵温度20℃，通气量1∶0.2-0.5vvm，搅拌速度为150-200rpm，发酵周期24-32小时。

在发酵罐发酵工艺上，采用单批发酵工艺，发酵酶活达78.2u/ml-83.4u/ml。

在发酵过程中，培养基是发酵工艺的基础。本发明在实验中，利用摇瓶发酵对发酵培养基进行筛选与优化，并对菌种活性进行检测。本着高产率、低成本的原则，在实验室的基础上进行了工业化中试研究的培养基筛选和优化。本发明的短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)对培养基的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有常规的用于微生物培养的碳源、氮源。例如，短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)菌株可以葡萄糖、乳糖、麦芽糖、玉米粉、淀粉等作碳源，生长并产酶。其中，以乳糖为碳源菌体生长最快。可利用胰蛋白胨、豆蛋白胨等可作为氮源使用，但胰蛋白胨为最佳氮源，其获取、使用容易，且可使生产菌株达最大的产酶量。

通过实验证明，金属离子对发酵有一定的作用，Cu离子、Al离子、Fe离子对产酶具有不同的抑制作用，Na、Zn离子对产酶无显著作用，而Mg离子对产酶具有促进作用，K离子可使菌体生长加快，有益于产酶。优选0.01％-1％的Mg和K离子。

同时实验表明，乳糖对该菌株产酶有一定影响，3％乳糖发酵浓度与12％乳糖浓度相比，酶活提高了7.31％。优选发酵乳糖浓度为3％。

在发酵过程中，物料灭菌与菌体代谢都会使发酵液pH发生较大的变化，因此，在发酵培养基中本发明使用磷酸盐调节发酵过程的pH变化，使用碳酸盐控制物料灭菌过程带来的pH变化。

本发明同时提供了利用短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)获得的低温乳糖酶，其不仅具有一般乳糖酶特性，而且克服了常温乳糖酶反应温度高，低温酶活低的缺点，提供了一种具有良好低温活性、酶活高的低温乳糖酶，可使乳糖酶的应用温度降低20℃，且本产品已具备规模工业化生产能力。本领域普通技术人员已知，低温乳糖酶指乳糖酶的反应温度较低，一般反应温度0-50℃。本发明的低温乳糖酶是生产菌株(CGMCC.No.1424)的代谢产物，通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，在发酵醪液中富集低温乳糖酶分子，并利用酶分子的物化性质进行产物分离。本发明的低温乳糖酶反应温度0℃-40℃，与一般低温酶相比，本发明的低温酶具有反应温度范围较宽，酶活较高的优点。本低温酶最适反应温度为33℃，最适反应pH6.5；金属离子对酶的作用：Ca离子与Mg离子对酶分子有激活作用，而Cu离子、Fe离子、Al离子及Zn离子对酶分子的活性有不同程度的抑制作用；酶的半衰期：在20℃保温1小时，酶活力下降4％，在40℃下酶的半衰期30分钟。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

A、定向筛选到L2004低温乳糖酶高产菌株经鉴定为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)。利用本发明的菌株发酵获得的低温乳糖酶具有反应温度低，低温酶活高的特点。

B、通过本发明优选实施方案，通过确定培养基配方及发酵工艺条件的优化，确立了L2004生产菌株稳定的发酵工艺，发酵酶活达78.2u/ml-83.4u/ml。

以下是对本发明的整体方案的具体示例，并不以任何方式限定本发明。

附图说明

图1、显示本发明低温乳糖酶酶活力测定方法流程图。

图2、显示发酵流程图。

图3、显示3％乳糖对发酵产酶的影响。

图4、显示1.2％乳糖对发酵产酶的影响。

图5、显示0.3％、1.2％乳糖对发酵产酶的影响比较。

具体实施方式

实施例1：菌株L2004的保藏与复壮

在乌鲁木齐肉联厂冷库分离得到了一株低温乳糖酶产生菌L2004，经鉴定为短芽孢杆菌，所产生的低温乳糖酶最适反应温度33℃，40℃下酶的半衰期约50分钟。

采用两种方法进行菌种保藏，即液体石蜡保藏法和真空冷冻干燥法。前者用于菌种短期保存(3-6个月)，后者用于生产菌种的长期保藏(6个月-数年)。

保存菌种的活化：取保存菌株，用接种针挑取菌种接种装有2毫升无菌水的试管中，振荡10分钟。然后用无菌吸管取0.2毫升加到斜面培养基TSA(胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，磷酸氢二钾2.5g，酵母浸膏3g，乳糖2.5g，氯化钠5g，琼脂15g，水，1000ml；pH：6.5-7.2)平板培养基上，再用玻璃刮铲涂匀，置13℃温箱中培养24小时后取出培养基平板。

高产菌株的筛选：将活化好的菌种接种于液体TS培养基中，于10℃、150rpm下培养24小时，将此菌株用摇瓶进行发酵实验，以检测其产酶能力及大小。检测其产酶能力未发生退化者可作为生产菌株使用。液体发酵，用500mL三角瓶装入100mL发酵培养基里，120℃20min，冷却后接入普通培养菌种2mL，15℃，150rpm培养，测定乳糖酶活性进行复筛；

取纯化的菌株，在TSA平板上20℃涂布倒置培养24h，用8.5％生理盐水5ml洗涤1次，将其接种于含60ml摇瓶培养基的500ml摇瓶中，200r/min，20℃摇床培养24h。

实施例2：菌株L2004低温乳糖酶活力检测方法

以ONPG为底物进行测定，取1ml酶液于试管中30℃水浴预热10min，加入已在30℃水浴预热的0.5mL pH6.5 0.1mol/L磷酸钠缓冲液(1mol/L NaH₂PO₄ 70mL与1mol/L Na₂HPO₄ 30mL缓冲液混合稀释10倍配制)及0.2mL ONPG溶液(pH6.5. 0.1mol/L磷酸钠配制)反应5min，加入0.8ml 5％Na₂CO₃溶液终止酶反应，测定OD_420nm值。在上述条件下，每分钟水解ONPG生成1μmol邻硝基苯酚的酶量为1个ONPG酶活单位。

1.定义

1克固体酶粉(或1ml液体酶)，在一定温度下和pH条件下，1分钟水解ONPG(邻硝基苯酚半乳糖苷)产生1umol酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。

2.比色法

2.1原理

L2004低温乳糖酶在30℃，pH6.5条件下，水解ONPG底物，产生含有酚基的ONP，在碱性条件下，ONPG显黄色，用分光光度计测定，计算其酶活力。

2.2试剂与溶液

2.2.1磷酸钠缓冲液的制备

分别取1mol/LNa₂HPO₄与1mol/LNaH₂PO₄缓冲液30ml与70ml混合于容量瓶中，定容至1000ml，即0.1mol/L磷酸钠缓冲液，贮于棕色瓶内。

2.2.2碳酸钠溶液c(Na₂CO₃)＝0.5mol/L

称取无水碳酸钠(Na₂CO₃)50g，用水溶解并定溶至1000ml。

2.2.32.5g/L ONPG底物溶液

称取ONPG 0.250g，精确至0.001g，用70ml蒸馏水后，再加入适量的pH6.5的磷酸缓冲液约30ml，加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入25ml容量瓶中，用适量的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液于棕色试剂瓶中冰箱中保存，有效期为半年。

2.2.4 240umol/ml ONP标准溶液

2.2.4.1称取恒重的ONP3.3386g，精确至0.0002g，用蒸馏水70ml溶解后，再用30ml 0.1mol/L磷酸钠缓冲液定溶至100ml，即为240umol/ml ONP标准溶液。

2.2.4.2取240umol/ml ONP标准溶液10.00ml，用蒸馏水定溶至100ml，即得到24umol/ml。

2.3仪器和设备

2.3.1恒温水浴30±0.2℃、40±0.2℃。

2.3.2分光光度计应符合GB 9721的规定。

2.4.测定步骤

2.4.1标准曲线的绘制

2.4.1.1 ONP标准溶液按下表配制

表2ONP标准溶液配制

管号	ONP标准溶液浓度umol/ml	取400umol/ml ONP标准溶液体积ml	取水的体积ml
				0	0	0	10
1	25	0.5	7.5
				2	50	1	7
3	100	2	6
				4	160	3.2	4.8
5	240	4.8	3.2

2.4.1.2.分别取上述溶注液各0.5ml磷酸钠缓冲液(须做平行试验)，各加0.4mol/ml碳酸钠溶液0.80ml，置于30℃水浴中显色15分钟，取出用分光光度计于波长420nm，10mm比色皿，以不含ONP的0号管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。

根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的ONP的量(umol)，即为吸光常数K值。其K值应在100左右。

2.4.2待测酶样的制备与测定

2.4.2.1粗酶液的制备

取5ml培养菌悬液于50ml离心管中，在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min，使酶从菌体中释放出来。

2.4.2.2.测定

吸取0.2ml的0.25％ONPG溶液加入试管中，加入0.5ml的磷酸钠缓冲液，水浴5min，加入1ml适当稀释的酶液，保温15min，加入0.8ml的5％碳酸钠溶液终止反应，再加入蒸馏水定容至8ml，于420nm波长处比色，测定OD_420nm值。以煮沸失活的酶液同样处理为对照。

(*本实验的稀释倍数均为50倍)先将0.2ulONPG与0.5ml磷酸钠缓冲液放入30℃恒温水浴中，预热5分钟。并按如图1所述的程序操作：

2.4.2.3.计算

在此条件下，每分钟水解产生1umol邻硝基苯酚(ONP)的酶活力定义为1u单位。ONP浓度与OD_420nm值之间存在线性关系，如图1，根据测得的OD_420nm值，从图1中查出对应的ONP浓度，通过下式求得酶活力：

$U=\frac{C\×10}{1000\×15\×0.5}\×N\×4=\frac{2\mathrm{NC}}{375}(u/\mathrm{ml})$

其中：C为[ONP]，N为稀释倍数。本实验的稀释倍数均为50倍式中：U-样品的酶活力，u/ml(u/g)；

8-反应试剂的总体积，ml；

15-反应时间15分钟，以分钟计；

N-稀释倍数。

所测定的结果表示为整数。平行试验相对误差不超过3％。

实施例3：本发明菌株及其产酶的温度特性测定

培养基：胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，乳糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，水1000ml，pH6.5。

分别于4℃、20℃、42℃、200转/分钟、60ml物料/瓶(500ml摇瓶)、加棉塞，培养时间分别6d、2d、1d，取5ml培养菌悬液于50ml离心管中，在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min，使酶从菌体中释放出来。取出用分光光度计于波长420nm，10mm比色皿，以不含ONP的管为空白，分别测定其吸光度。同时用分光光度计于波长620nm，10mm比色皿，以未接菌培养基的管为空白，分别测定其吸光度。

结果表明，温度分别为4℃、20℃、42℃，200转/分钟、60ml物料/瓶(500ml摇瓶)、加棉塞，培养6d、2d、1d的酶活分别为32.5u、39.4、8.2，发酵原液620nm的吸光值分别为1.20。0.804、0.021。由此可见，本发明菌株L2004(Breibacillus sp.)的生长温度范围4℃-42℃，最适生长温度20℃及最适产酶温度为20℃。

表3发酵温度对菌株生长的影响

实施例4：本发明发酵培养基的筛选

培养基是发酵工艺技术的基础，本着高产酶率、低成本的原则，在实验室研究的基础上进行了工业化中试研究的培养基筛选和优化。碳源选择葡萄糖、乳糖，氮源为胰蛋白胨、豆蛋白胨，并加入一定量Na、K离子，促进菌体生产和产酶率的提高，并以磷酸盐调节培养基在发酵过程中pH的变化。

1.筛选培养基：胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15-20g，乳糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳吡喃糖苷)0.1g，水800ml，pH6.5。

2.摇瓶检测培养基：胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，乳糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，水1000ml，pH6.5。

于20℃、200转/分钟、60ml物料/瓶(500ml摇瓶)、加棉塞，培养48hr，取5ml培养菌悬液于50ml离心管中，在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min，使酶从菌体中释放出来。检测发酵液酶产量，当酶产量达50u/ml以上时，证明菌生产能力符合生产要求。

3.种子培养基和发酵培养基

3.1.种子培养基：胰蛋白胨7.5g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，酵母浸膏6g，琼脂17g，乳糖3g，磷酸氢二钾2.5g，水800ml，pH6.5。

以摇瓶检测培养基为水平1，设计正交方案为5水平，4重复进行筛选优化培养基如下。

3.2.摇瓶发酵优选培养基：胰蛋白胨7.5g，豆蛋白胨5g，酵母浸膏6g，氯化钠5g，乳糖3g，磷酸氢二钾2.5g，水1000ml，pH6.5。

实施例5：本发明的摇瓶发酵工艺研究

首先，在菌株筛选培养基上活化菌株L2004于20℃培养箱中12h，然后挑取一单菌落用无菌水稀释，吸取0.2mL涂于筛选培养基上，倒置于20℃培养箱中12h，加入5mL无菌水用接种环刮下菌苔接入发酵摇瓶培养基中(优选发酵培养基：胰蛋白胨7.5g，豆蛋白胨5g，酵母浸膏6g，磷酸氢二钾2.5g，乳糖3g，氯化钠5g，pH值6.5)，于200rpm恒温摇床20℃培养36h在摇瓶，收集发酵液用于酶制剂的生产。试验中发现摇床温度和三角瓶装料量对该酶的产率有较大影响，在一定范围内降低摇床温度可使酶的产率提高(见表1)；500ml三角瓶装60ml培养基较装100ml培养基的产酶率高(见表2)。因此，优化发酵工艺为：发酵温度20℃、通气量1∶8.2、搅拌速度为200rpm、发酵周期32h。实验表明，发酵培养基中乳糖浓度对菌株L2004产酶有一定影响，3％乳糖发酵浓度与12％乳糖浓度相比，酶活提高了7.31％。因此优选发酵乳糖浓度为3％(见图1、图2、图3)。

表4发酵温度对产酶的影响

表5发酵摇瓶装料量对该酶的产率的影响(20℃发酵)

以上说明L2004菌株的产酶率与溶氧量和温度在一定范围内成正相关；装料量决定发酵摇瓶发酵培养基的容氧量。

实施例6：本发明酶制剂的制备

液体酶制剂的制备过程简单，直接将发酵预处理液取5ml摇瓶培养菌悬液于50ml，在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min，使酶从菌体中释放出来。加入防腐剂低温密封即可。

Claims (8)

1、一种具有产生低温β-半乳糖苷酶的短芽孢杆菌CGMCC.No.1424。

2、一种低温β-半乳糖苷酶的生产工艺，其包括：

A：对短芽孢杆菌CGMCC.No.1424进行菌种活化培养步骤；

B：利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤。

3、如权利要求2所述的生产工艺，其特征在于发酵步骤中，接种量为1％-15％，发酵温度4℃-37℃、生长pH范围为5-8、通气量1∶0.20-0.5vvm、搅拌速度为150-200rpm、发酵周期24-32小时，还原糖0.5％以下时，发酵结束。

4、如权利要求3所述的生产工艺，其特征在于发酵培养基中加入0.01％-1％的Ca、Mg和K离子，并以磷酸盐调节或碳酸盐调节维持发酵过程中pH的稳定。

5、如权利要求3所述的生产工艺，其特征在于发酵中，乳糖对该菌株产酶有影响，发酵乳糖浓度为3％，最适生长温度为20℃，最适生长pH范围为6-8。

6、一种低温β-半乳糖苷酶，其利用权利要求1所述的短芽孢杆菌CGMCC.No.1424，由权利要求2所述的生产工艺制备而成。

7、如权利要求6所述的低温β-半乳糖苷酶，其特征在于，利用权利要求1所述菌株发酵获得，在发酵过程中，低温β-半乳糖苷酶反应温度0℃-40℃，通气量1∶0.20-0.5vvm，搅拌速度为150-200rpm，发酵周期24-32小时，发酵酶活达78.2u/ml-83.4u/ml。

8、如权利要求7所述的低温β-半乳糖苷酶，其特征在于，发酵过程中，低温β-半乳糖苷酶最适反应温度为33℃，最适pH6.5。

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